CN101881773A - 一种检测囊型包虫病的免疫层析试条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测囊型包虫病的免疫层析试条及其制备方法。该试条包括滤血膜样品垫、紧密连接于所述滤血膜样品垫的含有抗棘球蚴抗原优势特异抗体亚类的抗体标记胶体金探针的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫;所述纤维素膜上设有一条检测线和一条指控线;所述检测线含有针对囊型包虫病的粗抗原,所述质控线含有能与所述抗棘球蚴抗原优势特异抗体亚类的抗体特异结合的抗抗体。本发明的免疫层析试条具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点,适于临床和现场使用。
Description
技术领域
本发明涉及寄生虫疾病检测领域,尤其涉及囊型包虫病的检测试条及其制备方法。
背景技术
棘球蚴病(echinococcosis)又称包虫病(Hydatid disease或Hydatidosis),是由棘球属绦虫的幼虫寄生于人、畜体内引起的一种人畜共患寄生虫病,能感染人类的棘球属绦虫有4种:细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)、少节棘球绦虫(E.oligarthrus)和伏氏棘球绦虫(E.vogeli)。这4种棘球绦虫的成虫和幼虫期形态不同,可引起不同类型的棘球蚴病。我国有两种棘球蚴病即细粒棘球蚴病(cystic echinococ-cosis,CE)又称囊型包虫病,和多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis,AE)又称泡型包虫病。
包虫病是一个重要的世界性公共卫生问题,广泛流行于欧、亚、非和地中海区域沿岸国家,以及澳洲和南美。在我国包虫病主要流行于西部的农牧区,其中新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏、内蒙和四川西部最为严重,是世界上包虫病患病率最高的地区。此外,吉林、陕西、云南、贵州和河南等省局部地区也有小范围流行。包虫病流行区受威胁人口约7000万。新近完成的全国寄生虫病调查结果表明流行区人群包虫病的患病率平均为1.084%。据此推算,目前流行区约有病人38万人。由于B超诊断结果有一定的漏检率,实际患病病人数可能达60万人以上。血清学检查发现人群的感染率平均为11.98%,感染人数约为700万人。在四川甘孜洲普查人群5414人,查出感染者1624人,感染率达30.5%;包虫病患者709人,患病率为13.1%。
包虫病需要手术或长期服药治疗,其中泡型包虫病被称为“虫癌”,10-15年的病死率高达90%以上。漏诊的包虫病患者失去治疗时机而危及生命。包虫病不但给患者带来极大的痛苦和沉重的经济负担,且发病的高峰为20-50岁的青壮年,给社会带来极大的压力,系西部农牧区群众因病致贫,因病返贫的重要原因。此外,由于包虫病在牛羊的感染率相当高(可达90%),每年因包虫病也给我国畜产品造成的经济损失达数十亿。因此包虫病不但严重危害人民的生命健康,而且严重影响社会和经济发展、边疆稳定。
我国政府对包虫病严重威胁我国西部人民健康的问题密切关注,已在四川设立了中央支持地方包虫病防治项目。在政府的重视下,包虫病的防治工作将全面开展,为满足包虫病诊断和现场流行病学调查的需要,研制合适的包虫病检测方法是当务之急。
目前对包虫病的诊断极大地依赖影像学方法,如X光检查、B型超声诊断、CT扫描、核磁共振等物理诊断方法。虽然影像学技术已广泛应用,且能对包块损害的部位、大小和物理性状等做出较为明确的判断,但不能进行早期诊断(影像学诊断出的包虫病人已不太适合药物治疗),且对有些囊肿、脓肿或肿块不能进行有效鉴别而误诊。由于影像检查设备携带不便,加之昂贵,且对操作人员的技术要求较高,在疾病诊断与流行病学调查中(特别在边远地区连电力供应都受到限制)的应用受到限制。
免疫学方法在包虫病诊断上的应用越来越受到重视,最有效的免疫学诊断方法是应用纯化天然抗原或重组抗原检测包虫病人特异抗体,常用检测方法有间接血凝法(Indirect haemagglutination assay;IHA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫电转移印渍法(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay;EITBA),以及金标免疫点印渍法(Gold-labelled dot blotting;GDB;俗称膜法或渗滤法)。但这些方法或费时费力、或需要冷链系统保存试剂、或对仪器设备及操作人员的要求较高而不适合现场使用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一组用于免疫学方法检测囊型包虫病的试剂,用于检测包虫病以及病原体的种属。
本发明的另一目的是提供一种快速检测囊型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条(Immuno-Chromatographic Aassay,ICA)。
本发明的再一目的是提供一种快速检测囊型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条的制备方法。
本发明的第一方面,提供了一组用于免疫学方法检测囊型包虫病以及病原体种属的试剂,包括:(1)囊型包虫病的天然抗原,(2)抗人IgG的标记抗体;
其中囊型包虫病天然抗原按如下方法制备:取新鲜羊肝包囊液,以3000r/min离心20min,吸上清液入透析袋,用PBS溶液于4℃下透析过夜,将透析过夜的包囊液6000r/min离心20min,取上清,弃沉淀,即制得囊性包虫病天然抗原;
其中抗人IgG的标记抗体是利用人IgG免疫鼠、兔、羊或者其他动物获得的多抗或单克隆抗体,所说的标记酶标计、胶体金标记或者其他标记。优选的,所说的标记抗体是鼠抗人IgG的单克隆抗体。更优选的,所说的标记抗体是鼠抗人IgG4的单克隆抗体。
本发明的第二方面,提供了一种快速检测囊型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条,包括:
样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记抗体的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫;所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线,在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置检测线;
其中所述的检测线由囊型包虫病的天然抗原组成,所述的囊型包虫病的天然抗原为来源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液;所述的胶体金标记抗体为以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体;所述的质控线由特异性结合胶体金标记抗体的抗抗体组成。
在一个优选的方案中,所述标记抗体为以人IgG作为抗原免疫BALB/C小鼠获得的单克隆抗体,所述作为质控线的抗抗体为羊抗鼠抗体。
在一个优选的方案中,羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白浓度为1~10mg/mL,喷涂量为10μL/cm2;胶体金标记抗体浓度(以蛋白浓度计):1~5mg/15~20mL;羊抗鼠抗抗体溶液浓度为0.1~5mg/mL,喷涂量为10μL/cm2。
所述支持检测线和质控线的纤维素膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜;所属支持胶体金标记抗体的金标垫为玻璃纤维膜或聚脂膜;所述样品垫可以是滤血膜样品垫,所述的滤血膜是棉籽绒和纤维素的混合物或者玻璃纤维和纤维素的混合物,适合于全血样品;所述样品垫也可以是玻璃纤维或吸水纸样品垫,适合于血清样品;所述吸水垫由吸水材料制备,如吸水纸。
所述纤维素膜宽度控制在2.5~3.0mm;所述吸水垫可宽度为20~40mm,厚度为0.1~0.2mm;所述金标垫的宽度为5~10mm;所述样品垫宽度为20~40mm。
所述免疫层析试条背面可设置一个起支撑作用的背板,背板材料的选择是多种多样的,可以是塑料板,如聚氯乙烯板(PVC)等。
可将所述带有背板的免疫层析试条装入一个盒体中,该盒体对应于滤血膜样品垫的部位设有检测孔,对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。检测样品时将全血或血清加入检测孔中。
本发明的第三方面,提供了一种制备上述检测囊型包虫病的免疫层析试条的方法,包括以下步骤:
(1)制备囊型包虫病的天然抗原,将来源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白浓度调整到1~10mg/mL;制备胶体金标记抗体,将1~5mg以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体加入100mL胶体金溶液,离心取沉淀,复溶到15~20mL;制备与胶体金标记抗体特异结合的抗抗体,将溶液浓度调整到0.1~5mg/mL;
(2)将囊型包虫病的天然抗原溶液喷到所述纤维素膜上形成检测线,将能与胶体金标记抗体特异结合的抗抗体溶液喷到所述纤维素膜的另一区域形成质控线;
将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记抗体溶液,制备金标垫;
(3)将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离检测线的一端,将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端,将样品垫粘贴于金标垫上与所述纤维素膜相对的一端,得到检测囊型包虫病的免疫层析试条。
在一个优选的方案中,上述纤维素膜在喷有检测线、质控线后,先在37℃下干燥0.5~2小时,再粘贴吸水垫。
在一个优选的方案中,为使胶体金标记抗体溶液与玻璃纤维膜或聚脂膜更好地结合,可向胶体金标记探针溶液中添加2%~10%的蔗糖;为使金标垫更易于纤维素膜粘贴,可将金标垫在37℃下干燥0.5小时,再与纤维素膜粘贴。
本发明的免疫层析试条具有以下优点:(1)敏感性及特异性高:实验室考核结果显示,本发明的免疫层析试条总的敏感性可达87.16%,特异性为97%;(2)检测方法简单、快速:检测过程中标本处理简单,血清或全血都可以直接使用,无需处理,不需要专门仪器和人员培训,非专业技术人员按照说明书即可操作,并可迅速观察结果,标本中的抗体经5分钟左右的纸层析后,即可出现肉眼可见的沉淀线,从而为包虫病人的治疗争取了时间,很适合现场和基层使用;(3)制备方法简单,成本低廉,易于进行工业化生产。本发明将在包虫病的检测及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作用,应用前景广阔。
附图说明
图1、检测囊型包虫病的免疫层析试条的正面结构示意图
图2、检测囊型包虫病的免疫层析试条的纵截面结构示意图
其中:
1为样品垫 2为金标垫 3为纤维素膜 4为吸水垫
5为检测线 6为质控线 7为背板
具体实施方式
样品与抗棘球蚴抗体
包虫病(Hydatid disease或Hydatidosis)又称棘球蚴病(echinococcosis)病,是由棘球属绦虫的幼虫寄生于人、畜体内引起的一种人畜共患寄生虫病,能感染人类的棘球属绦虫有4种:细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)、少节棘球绦虫(E.oligarthrus)和伏氏棘球绦虫(E.vogeli)。这4种棘球绦虫的成虫和幼虫期形态不同,可引起不同类型的棘球蚴病。包虫病患者体内血液中含有能特异性结合所感染的棘球蚴抗原的抗棘球蚴抗体,检测受试者体内血液中是否含有抗棘球蚴抗体,可作用受试者是否患有包虫病的指标。
本发明的的检测包虫病以及病原体种属的免疫层析试条适用于从囊型包虫病患者体内抽取的全血样品和血清样品。对于全血样品,本发明的检测囊型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条中的样品垫采用滤血膜样品垫;对于血清样品,本发明的检测囊型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条中的样品垫可采用玻璃纤维或吸水纸样品垫。
抗原与检测线
可以将棘球蚴抗原固定在纤维素膜等支持物上作为固相抗原,用以捕获受试者者血样中的抗棘球蚴抗体。本发明的一个优选的方案中,将我国常见的细粒棘球蚴的天然抗原(来源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液)固定在纤维膜上形成检测线,该固相抗原可以捕获受试者血样中相应的抗棘球蚴抗体,在检测线位置形成抗原抗体复合物沉淀。
胶体金标记抗体探针
包虫病患者体内血液中含有的抗棘球蚴抗体的优势抗体类型为IgG抗体,优势亚类为IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4等亚类。胶体金标记抗体探针采用抗人IgG抗体或抗人IgG4抗体制备,该抗人IgG抗体或抗人IgG4抗体可以是购买的商品化抗体,或按照常规方法自行制备。本发明的一个优选的方案中采用胶体金标记的鼠抗人IgG4的单克隆抗体作为检测探针,该胶体金标记抗体附着于金标垫上。检测过程中,复溶的胶体金标记抗体可与受试者血样中的人IgG4抗体结合,从而当受试者血样中存在包虫病特异性抗体时在检测线位置形成色带。
胶体金标记抗体不限于鼠抗人IgG4的单克隆抗体,也可采用鼠抗人IgG的单抗或多抗,或者采用其他动物如兔抗人IgG抗体,同样能实现本发明的发明目的,这是领域的一般技术人员都知晓的。
质控线
可以将与胶体金标记抗体特异性结合的抗抗体固定在纤维素膜上作为质控线。在本发明一个优选的方案中,胶体金标记抗体是鼠抗人IgG4的单克隆抗体,相应的,质控线采用羊抗鼠的抗抗体。无论待检样品中是否含有抗棘球蚴抗体,本发明的检测囊型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条中质控线位置总能形成色带,该条色带是判定检测过程是否正常和免疫层析试条是否变质的标准。
质控线不限于羊抗鼠的抗抗体,只要能与选定的胶体金标记抗体特异性结合,同样能实现本发明的发明目的,这是领域的一般技术人员都知晓的。
免疫层析试条
如图所示,图1为检测囊型包虫病的免疫层析试条的正面结构图,图2为检测包虫病的免疫层析试条的纵截面结构图。检测囊型包虫病的免疫层析试条由吸水垫4、硝酸纤维素膜(NC膜)3、金标垫2和滤血样品垫1四部分粘贴在PVC底板7上组成;硝酸纤维素膜3上设有检测线5和质控线6。
检测原理与结果判断
测定时将样本血清或全血加在滤血膜样品垫1上,1分钟后滴一滴(约50μL)样本稀释液,稀释液带动样品按样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4的方向移动,流经金标垫2时使金标垫2上的胶体金标记抗体复溶,并带动其向硝酸纤维素膜3、吸水垫4移动。胶体金标记抗体(本发明实施例为鼠抗人抗体)可与样品中的抗体或抗体亚类结合,形成免疫复合物。此免疫复合物流至检测线5时,若标本中有待测抗体或抗体亚类(抗囊型包虫病抗原的抗体),即被检测线5的特异性固相抗原所捕获,在硝酸纤维素膜3上的检测线5位置显出红色检测线条;此免疫复合物流经质控线6时,即被质控线6的固相抗体(本发明实施例为羊抗鼠抗体)所捕获,在硝酸纤维素膜3上的质控线6位置显出红色质控线条。
阳性标本既显示检测线,又显示质控线;阴性标本没有检测线,仅显示质控线。
以下结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法;所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。
实施例1、包虫病人血清对粗抗原的反应分析及优势特异抗体亚类的分析
1、针对囊型包虫病的天然抗原的制备
取新鲜羊肝包囊液,以3000r/min离心20min,吸上清液入透析袋,用PBS溶液于4℃下透析过夜,将透析过夜的包囊液6000r/min离心20min,取上清,弃沉淀,即制得囊液粗抗原,冻干后低温储存备用。
2、方法:以ELISA法进行分析,以囊液粗抗原为包被抗原分别与包虫病人、非包虫病人和健康人血清进行反应,再以羊抗人IgG1抗体辣根过氧化物酶结合物(购自美国BD公司)、鼠抗人IgE抗体辣根过氧化物酶结合物(购自美国BD公司)、鼠抗人IgG4抗体辣根过氧化物酶结合物(购自美国BD公司)进行识别,在酶标仪上以490nm波长读取OD值。以20个非疫区健康人的酶标OD值均值加2个标准差(X+2SD)定为阳性阈值。
3、结果如表1所示,用抗人IgG4抗体作为酶标二抗检测包虫病人血清的敏感性和特异性都较好。
表1包虫病人血清对粗抗原的反应分析及优势特异抗体亚类的分析结果
实施例2、检测囊型包虫病的免疫层析试条的制备
1、针对囊型包虫病的天然抗原的制备同实施例1。
2、抗棘球蚴抗原的优势特异抗体亚类的单克隆抗体的制备
按常规方法用人IgG4抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0瘤细胞融合,融合成功能高效分泌特异抗体的杂交瘤细胞经3次克隆后注射小鼠生产腹水。采用常规的饱和硫酸铵盐析法对获得的单克隆抗体进行纯化,用免疫琼脂扩散法检测抗体效价,结果抗体滴度均大于1∶128,表明获得的单克隆抗体具有较好的特异性和亲和性。
3、制备免疫胶体金探针及金标垫
用下述方法制备鼠抗IgG4抗体标记的免疫胶体金探针及金标垫:
1)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒,具体方法为:将HAuCl4(沪试牌购于上海国药集团化学试剂有限公司)配制成0.01%水溶液,取100mL加热至沸腾,搅动下准确加入1.6mL的1%的柠檬酸三钠水溶液,待液体颜色稳定成葡萄酒红色,得到胶体金溶液。
2)确定胶体金偶联抗体饱和浓度
用0.2M K2CO3调节步骤1)制备的胶体金溶液的pH值至9.2,准备5支洁净试管,分别加入1mL胶体金溶液。将步骤1)制备的经纯化的抗IgG4抗体稀释为0.5mg/mL,分别向4支试管中加入20μL、25μL、30μL、35μL,另一支为空白对照,混匀后于室温下放置5分钟,加入10%NaCl水溶液,混匀,静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量即为稳定1mL胶体金溶液所需抗体的最适浓度,以此为基础增加20%抗体量即为胶体金偶联抗体饱和溶液。结果:维持胶体金溶液颜色不变的抗体量为25μL,即偶联抗体浓度为12.5μg/mL。
3)鼠抗人IgG4抗体标记的免疫胶体金探针及金标垫的制备
取50mL胶体金溶液,用0.2M K2CO3调节pH值为8.5(8-8.5均可),按12.5μg/mL加入已纯化的鼠抗IgG4抗体,得到含有浓度为12.5μg/mL鼠抗人IgG4抗体的免疫胶体金探针溶液50mL,搅拌1小时,再加入终浓度为0.05%PEG20000,搅拌1小时,10000rpm离心30分钟,弃上清,用20mM硼酸缓冲液洗涤沉淀,并将其保存于10mL含5%蔗糖的20mM硼酸缓冲液中,得到鼠抗人IgG4抗体标记的胶体金探针溶液。取5mL鼠抗人IgG4抗体标记的胶体金探针溶液均匀加在玻璃纤维膜上,37℃下干燥0.5小时,得到金标垫。
4、检测包虫病的免疫层析试条的制备
该试条的制备方法包括以下步骤:
1)NC膜的包被
羊肝棘球蚴包囊液抗原包被:用0.01M pH7.2PBS稀释实施例1制备的棘球蚴包囊液抗原至终浓度为2mg/mL,用于包被检测线;
质控抗体羊抗鼠IgG(购自捷宁生物公司)的包被:用0.01M pH7.2PBS稀释羊抗鼠IgG至终浓度为0.5mg/mL,用于包被质控线;
BIODOT公司XZ1000喷膜机将分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜(购自MILLIPORE公司)上,喷涂量为10μL/cm2,形成一条检测线和一条质控线,37℃下干燥1小时。
2)检测囊型包虫病的免疫层析试条的制备
用一块单面涂了不干胶的PVC背板,中间粘贴上处理好的NC膜;NC膜靠近质控线的一端紧密粘贴吸水垫(购于MILLIPORE公司);NC膜靠近质控线的一端紧密粘贴金标抗体垫;金标抗体垫另一端紧密粘贴滤血膜样品垫(购自WHATMAN公司)。得到检测包虫病的免疫层析试条,可按所需大小进行切割,加干燥剂后密封保存。
5、检测囊型包虫病的免疫层析试剂盒的制备
为了方便使用,将步骤3制备的检测包虫病的免疫层析试条装入试剂盒中,加干燥剂后密封保存。该试剂盒对应于样品垫的部位设有点样孔,对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
实施例3、检测囊型包虫病的免疫层析试条的制备
用购买自美国BD公司的鼠抗人IgG4单克隆抗体(货号555881)制备胶体金标记抗体作为检测探针,其他步骤同实施例2。
实施例4、检测囊型包虫病的免疫层析试条的实验室考核
1、检测方法
于实施例1制备的免疫层析试条的滤血膜样品垫加入待测血清,1分钟后加入样本稀释液(PBS)1滴(约50μL),2分钟后开始观察结果,15分钟观察终止。结果判定:如果检测线5和质控线6均出现红色条带,即判为囊型包虫病,如果仅有质控线6出现红色条带,即判为阴性。
2、实验结果
用本发明实施例2制备的检测囊型包虫病的免疫层析试条进行实验室考核结果如表2所示。由表2可以看出本发明的免疫层析试纸的敏感性可达87.16%,特异性可达97%。上述检测结果表明本发明的免疫层析试条可用于囊型包虫病的快速检测。
表2本发明检测囊型包虫病的免疫层析试条的实验室考核结果
血清来源 | 试验例数 | 阳性例数(P%) |
新疆囊型包虫病 | 100 | 87(87%) |
青海囊型包虫病 | 98 | 85(86.73%) |
血清来源 | 试验例数 | 阳性例数(P%) |
甘肃囊型包虫病 | 20 | 18(90%) |
囊虫病 | 30 | 3(10%) |
血吸虫病 | 5 | 0 |
弓形虫病 | 5 | 0 |
肺吸虫病 | 5 | 0 |
肝吸虫病 | 5 | 0 |
健康人 | 50 | 0 |
用本发明实施例3制备的检测囊型包虫病的免疫层析试条进行实验室考核,结果与表2所示结果没有统计学差异。
实施例4、检测包虫病的免疫层析试条的滤血效果考核
1、样品制备
取确诊包虫病人血清10份,正常人血清10份,正常人全血10份,确诊囊型包虫病人全血5份。用部分正常人全血离心去除血清,加入同样量的包虫病人血清混合,成为包虫抗体阳性混合全血血样。
2、试验方法
按实施例3的方法检测囊型包虫病人血清10份,包虫抗体阳性混合全血血样10份,正常人血清10份,正常人全血10份,确诊囊型包虫病人全血5份。其中检测血清用量20μL,检测全血用量40μL。
3、试验结果
全血检测在规定时间内和血清检测结果完全一致,包虫抗体阳性混合全血血样的反应强度与加入的包虫病人血清的反应强度完全一致。上述检测结果表明本发明的免疫层析试条可用于囊型包虫病人全血血样的快速检测。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制,所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子,本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上,除了本文所述的内容外,本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进,所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
Claims (12)
1.一种用于免疫学方法检测囊型包虫病的试剂,包括以下组分:
(1)囊型包虫病的天然抗原;(2)抗人IgG的标记抗体;
所述的囊型包虫病天然抗原按如下方法制备:取新鲜羊肝包囊液,以3000r/min离心20min,吸上清液入透析袋,用PBS溶液于4℃下透析过夜,将透析过夜的包囊液6000r/min离心20min,取上清,弃沉淀,即制得囊型包虫病天然抗原;
所述的抗人IgG的标记抗体是利用人IgG免疫鼠、兔、羊或者其他动物获得的多抗或单克隆抗体,所说的标记包括酶标记、胶体金标记或者其他标记。
2.根据权利要求1的检测包虫病的试剂,其特征在于,其中所述的标记抗体是鼠抗人IgG的单克隆抗体。
3.根据权利要求1的检测囊型包虫病的试剂,其特征在于,其中所述的标记抗体是鼠抗人IgG4的单克隆抗体。
4.一种快速检测囊型包虫病的免疫层析试条,包括以下组分:
样品垫、紧密连接于所述样品垫的含有胶体金标记抗体的金标垫、与所述金标垫紧密连接的纤维素膜和紧密连接于所述纤维素膜另一端的吸水垫;所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线,在质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置一条检测线;
所述的检测线由囊型包虫病的天然抗原组成,所述的囊型包虫病的天然抗原为来源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液;所述的胶体金标记抗体为以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体;所述的质控线由特异性结合胶体金标记抗体的抗抗体组成。
5.根据权利要求4的检测囊型包虫病的免疫层析试条,其特征在于,所述金标垫的胶体金标记抗体为以人IgG作为抗原免疫小鼠获得的单克隆抗体,所述质控线为羊抗鼠抗抗体。
6.根据权利要求5的检测囊型包虫病的免疫层析试条,其特征在于,羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白浓度为1~10mg/mL,喷涂量为10μL/cm2;胶体金标记抗体浓度以蛋白浓度计为1~5mg/15~20mL;羊抗鼠抗抗体溶液浓度为0.1~5mg/mL,喷涂量为10μL/cm2。
7.根据权利要求4-6中的任一项的检测囊型包虫病的免疫层析试条,其特征在于,所述支持检测线和质控线的纤维素膜选自硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜;所述支持胶体金标记抗体的金标垫选自玻璃纤维膜或聚脂膜;所述样品垫选自滤血膜、玻璃纤维或吸水纸,其中滤血膜是棉籽绒和纤维素的混合物或者玻璃纤维和纤维素混合物;所述吸水垫为吸水纸。
8.根据权利要求7的检测囊型包虫病的免疫层析试条,其特征在于,其中所述的纤维素膜宽度为2.5~3.0mm;吸水垫宽度为20~40mm,厚度为0.1~0.2mm;金标垫的宽度为5~10mm;样品垫宽度为20~40mm。
9.根据权利要求8的检测囊型包虫病的免疫层析试条,其特征在于,所述免疫层析试条背面设置一个起支撑作用的背板,背板材料为塑料。
10.根据权利要求9的检测囊型包虫病的免疫层析试条,其特征在于,将所述带有背板的免疫层析试条装入一个盒体中,该盒体对应于样品垫的部位设有检测孔,对应于检测线和质控线的部位设有观测窗。
11.根据权利要求4的检测囊型包虫病的免疫层析试条的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备囊型包虫病的天然抗原,将来源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白浓度调整到1~10mg/mL;
制备胶体金标记抗体,将1~5mg以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体加入100mL胶体金溶液,离心取沉淀,复溶到15~20mL;
制备与胶体金标记抗体特异结合的抗抗体,将溶液浓度调整到0.1~5mg/mL;
(2)将囊型包虫病的天然抗原溶液喷涂到所述纤维素膜上形成检测线,将能与胶体金标记抗体特异结合的抗抗体溶液喷涂到所述纤维素膜的另一区域形成质控线;
将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记抗体溶液,制备金标垫;
(3)将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离检测线的一端,将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端,将样品垫粘贴于金标垫上与所述纤维素膜相对的一端,得到检测囊型包虫病的免疫层析试条。
12.根据权利要求11的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备囊型包虫病的天然抗原,将来源于羊肝棘球蚴包囊液的上清液蛋白浓度调整到1~10mg/mL;
制备胶体金标记抗体,将1~5mg以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体加入100mL胶体金溶液,离心取沉淀,复溶到15~20mL,加入蔗糖使蔗糖的终浓度为2%~10%;
制备与胶体金标记抗体特异结合的抗抗体,将溶液浓度调整到0.1~5mg/mL;
(2)将囊型包虫病的天然抗原溶液喷到所述纤维素膜上形成检测线,将能与胶体金标记抗体特异结合的抗抗体溶液喷到所述纤维素膜的另一区域形成质控线;将喷涂有检测线、质控线的纤维膜在37℃下干燥0.5~2小时;
将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记抗体溶液,制备金标垫;将金标垫在37℃下干燥0.5小时;
(3)将吸水垫粘贴在所述纤维素膜的远离检测线的一端,将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端,将样品垫粘贴于金标垫上与所述纤维素膜相对的一端,得到检测囊型包虫病的免疫层析试条。
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