CN101710121A

CN101710121A - 一种检测青霉素的免疫胶体金试剂板的制备方法

Info

Publication number: CN101710121A
Application number: CN200910154206A
Authority: CN
Inventors: 张少恩; 桑丽雅; 卜令杰; 邵伟
Original assignee: HANGZHOU NANKAI BIOTECH CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU NANKAI BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2009-11-06
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2010-05-19

Abstract

本发明涉及一种检测青霉素药物残留的免疫胶体金试剂板的制备方法。该试剂板由上下两块塑料模板和试纸条组成。在试纸条背衬上依次紧密粘贴有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，相邻各部分间有1-2mm的重叠。胶体金结合垫上包被有抗青霉素单克隆抗体与胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有青霉素G-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。该试剂可半定量直观检测样品中的青霉素G、氨苄青霉素和羟氨苄青霉素残留，整个检测过程仅需5分钟左右，且无需任何实验设备，利于大规模样本筛选，适合于广大基层部门对乳制品中的青霉素进行大规模快速检测。

Description

一种检测青霉素的免疫胶体金试剂板的制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测乳制品中抗生素残留试剂板的制备方法，具体涉及一种检测青霉素药物残留的免疫胶体金试剂板的制备方法。

背景技术

青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称，因为价廉、方便、低毒、高效等特点，被广泛应用于实际生产。青霉素广泛应用于治疗奶牛疾病、促进奶牛生长、降低发病率、提高饲料利用率，带来乳业增产的同时，也不可避免的造成了原料奶抗生素残留问题，最终导致青霉素在人体内的残留。由此可引起过敏反应，造成人体内环境平衡的紊乱和菌群失调，同时在进行药物治疗时会产生耐药性，另外青霉素残留会导致牛乳的发酵不能正常完成，对乳品生产企业造成巨大经济损失，对进出口贸易造成一定影响。我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定青霉素G和普鲁卡因青霉素在奶类中残留限量标准为4ng/mL。

目前，对于青霉素类药物残留的检测方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化分析法，如HPLC及LC-MS，具有特异性好、准确率高的特点，是各大检测机构对检测样本进行确证的首选方法，但存在对设备、环境、操作技能等要求，不利于大规模样本筛选，因而不适合广大基层部门。免疫分析法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，具有检测量大，操作相对简单等优点，越来越多地被用于动物性食品中抗生素残留的检测，但是ELISA法整个操作时间仍需要1-2h，且需用到特殊仪器设备，具有一定局限性。

发明内容

本发明的目的在于针对上述方法的不足，提供一种灵敏度高、操作简单、检测时间短、不需要特殊仪器设备、生产成本低的原奶中青霉素免疫胶体金快速检测试剂板。

本发明试剂板由上下两块塑料模板、背衬及粘附在背衬上依次紧密相连的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成。

其中样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有1-2mm的重叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。

胶体金结合垫上包被有抗青霉素单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有青霉素G-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。偶联青霉素G的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)等。抗青霉素单克隆抗体为可以识别青霉素G、氨苄青霉素和羟氨苄青霉素的免疫球蛋白或其片段。

本发明试剂板的各部分组成成分与功能如下：

塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。

背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液pH值的作用。

胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上标记有抗青霉素单克隆抗体与胶体金的结合物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。

硝酸纤维素膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。

本发明试剂板具有如下有益效果：

(1)特异性好。本发明试剂板对青霉素类药物中的青霉素G、氨苄青霉素及羟氨苄青霉素的交叉反应率分别为100％、70％及60％，对其他种类的抗生素包括氯霉素、喹诺酮类、四环素类、庆大霉素、链霉素、磺胺类药物等无交叉反应，可见，本发明对青霉素类药物反应均有高度专一性。

(2)灵敏度高。本发明试剂板对原奶中青霉素G的检出限为4ng/mL，可以满足我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中对青霉素G和普鲁卡因青霉素在奶类中最高残留限量4ng/mL的规定要求。

(3)操作简单快捷，不依赖任何实验设备，不需任何专业培训。本发明试剂板将反应所需的大部分原料整合到试剂条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短了检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后3-5分钟内即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和质控线的颜色深浅读取结果，检测过程无需特殊仪器辅助，普通人员均可操作，不需要专业培训，极易推广使用。

(4)成本低，效益好。本发明试剂板生产工艺成熟、流程简单，生产成本低廉，投资少，收效快。

附图说明

图1为青霉素免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC板。

图2为青霉素免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。

图3为青霉素免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。

具体实施方式

本发明试剂板的制备包括青霉素-BSA偶联物的制备，抗青霉素单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗青霉素单克隆抗体的制备和青霉素免疫胶体金快速检测试剂板的组装。

1.青霉素G与载体蛋白的偶联

采用戊二醛法将青霉素G钠盐与载体蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原。称取48mg青霉素G钠盐溶于2mL水中，用10mL PB缓冲液(0.1mol/L PH 6.0)溶解50mg牛血清白蛋白，加入到上述溶液中，再缓慢加入1mL 10％戊二醛溶液，将混合溶液室温下搅拌2h，双蒸水透析5天，滤膜过滤后，收集。

2.抗青霉素单克隆抗体的制备

取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的青霉素G-载体蛋白偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100μg/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行：将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶10的比例混合，在50％PEG作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10mg/L青霉素载体蛋白偶联物(此处载体蛋白与作为免疫原的载体蛋白应为不同种类)包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用青霉素G-载体蛋白偶联物(同初筛)包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2×10^-3mol/L青霉素溶液等量混合，37℃感作1h，加入已包被的酶标板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH7.4)替代青霉素溶液作对照，其余步骤同上。若青霉素阻断后的OD值降至对照孔的50％以下，则判为阳性孔。经2～3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。

体外培养：将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5×10⁵mL^-1时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水：给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株10⁷个细胞，7天后抽取腹水。

3.胶体金溶液的制备

胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在100mL去离子水中加入1mL 1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1mL 1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。

4.胶体金标记抗青霉素单克隆抗体的制备

取已制备好的100mL胶体金溶液，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入1.5mg抗青霉素单抗，搅拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000(PEG 20000)，搅拌15min。20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7.4PBS缓冲液(含0.4mol/LPEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2％BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。

5.青霉素免疫胶体金快速检测试剂板的组装

参照图1，用点膜机把适当浓度的青霉素G-载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37℃烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记青霉素单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。

检测试剂组成为一个PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

6.青霉素免疫胶体金快速检测试剂板检测原理

当待检样品溶液滴入试剂板加样孔后，样品溶液因硝酸纤维素膜载体的毛细管作用向另一端扩散。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫胶体金的颜色显示出来。如果样品溶液含有青霉素类药物残留，青霉素类药物先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的青霉素类药物占据而无法与检测线上青霉素G特异性抗原结合；当样品中的青霉素类药物含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性。反之，当样品中青霉素类药物含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。

7.青霉素免疫胶体金快速检测试剂板检测实施例操作方法

7.1样品制备

取2mL原奶加入5mL离心管中，再加入60μL 3mol/L HCl溶液，振荡30秒。加入4mL乙酸丁酯，剧烈振荡1分钟，静置分层。取3mL上层溶液到另一离心管中，加入250μL PB缓冲液(0.1mol/L PH 7.4)，振荡1分钟，静置分层。吸取至少100μL下层溶液滴板。

7.2检测步骤

从包装袋中取出试剂板，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100μL)，加样后开始计时，结果应在3～5分钟读取，其他时间判读无效。

7.3结果判断

读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。

阴性(-)：T线显色比C线深或一样深，表明样品中青霉素类药物浓度低于4ng/mL或无青霉素类药物残留。如图3.a所示。

阳性(+)：T线显色比C线浅，或T线无显色，表明样品中青霉素类药物浓度高于4ng/mL；T线比C线越浅，表明样品中青霉素类药物浓度越高。如图3.b所示。

无效：未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新试剂板重新测试。如图3.c所示。

Claims

1.一种青霉素免疫胶体金试剂板的制备方法，其特征在于醋酸纤维膜上的胶体金结合垫上包被有抗青霉素单克隆抗体-胶体金标记物，从样品垫到吸水垫方向依次是检测线和质控线，包被有青霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG。

2.如权利要求1所说的标记物，其特征在于将胶体金与抗青霉素单克隆抗体按一定比例混匀，使胶体金与抗青霉素单克隆抗体形成稳定的胶体金颗粒，通过浓缩形成抗青霉素单克隆抗体-胶体金标记物。

3.如权利要求书1所说的检测线，其特征在于偶联青霉素的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)等。

4.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于样品中的青霉素含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线浅甚至无显色，判定为阳性；反之，当样品中青霉素含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色与控制线相近或偏深，判定为阴性。

5.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于工艺流程包括制备青霉素-BSA偶联物、制备抗青霉素单克隆抗体、制备胶体金溶液、制备胶体金标记抗青霉素单克隆抗体和组装青霉素免疫胶体金快速检测试剂板。