CN104764878A - 一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条，包括样品垫a、结合垫b、硝酸纤维素膜c、吸水垫d和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫a、结合垫b、硝酸纤维素膜c、吸水垫d；所述的结合垫b上包被有青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜c上分别包被有青霉噻唑酸抗原构成的检测线e和羊抗兔二抗构成的质控线f。本发明还公开了这种试纸条的制备方法。发明具有以下突出的优点：1、特异性高，灵敏度好；2、检测成本低。3、操作简便；4、储存方便，在室温下可保存2个月。

Description

一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测牛奶中青霉素降解物的方法，特别是一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术

目前，关于乳及乳制品的安全问题的报道日渐增多，其中比较突出的问题即牛奶中的抗生素残留，特别是青霉素类抗生素的残留。青霉素类抗生素由于价廉、高效、低毒广泛用于治疗奶牛和其他动物疾病。然而由于使用和操作的不规范导致青霉素类抗生素残留现象十分严重。一些不法商贩向牛奶中掺加β-内酰胺酶使牛奶中残留的青霉素降解，主要产物为青霉噻唑酸，造成“无抗奶”假象从而逃避安全检测。然而研究发现，青霉素致敏反应时主要的抗原决定簇是青霉噻唑蛋白。青霉素极易降解成青霉噻唑酸，在体内与组织蛋白结合形成青霉噻唑蛋白，引发速发型过敏反应。

目前国内外对青霉素检测的研究比较多，但世界各国针对青霉素降解产物的检测方法的报道却很少。传统方法有碘量法、高效液相色谱法等，而且这些方法各有其优缺点，但都操作复杂不能实现青霉素降解物的现场快速检测。目前关于青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条分析方法未见相关报道。

胶体金免疫层析技术(Gold Immunochromatography Assay，GICA)是二十世纪八、九十年代在酶联免疫分析方法的基础上发展的新型快速免疫检测技术。该技术操作简单快速、结果容易判定、安全无污染等诸多优点使其在世界各国应用十分广泛，成为体外快速诊断领域发展的趋势性方法。

发明内容

有鉴于此，本发明创造旨在提出一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背板，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有青霉噻唑酸抗原构成的检测线e和羊抗兔二抗构成的质控线，两条线间隔距离为5mm。

本发明还公开了上述免疫胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤：

(1)青霉噻唑酸抗血清纯化，得到青霉噻唑酸多克隆抗体；

(2)制备青霉噻唑酸抗原；

(3)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；

(4)将步骤(1)纯化的抗体加入到步骤(3)制备的胶体金中，制备青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物；

(5)将步骤(4)制备的青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物包被于结合垫上；(6)将步骤(2)制备的青霉噻唑酸抗原包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，并将羊抗兔二抗包被于硝酸纤维素膜上构成质控线；

(7)在PVC背板上按顺序依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，得到所述的青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条。

上述材料中样品垫和硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司，结合垫、吸水垫和PVC背板购自上海金标生物科技公司。

本发明纯化了青霉噻唑酸抗血清，得到了青霉噻唑酸多克隆抗体，备用。制备青霉噻唑酸抗原作为检测线的包被抗原，采用购买的羊抗兔二抗作为质控线的捕获抗体。利用竞争法来检测青霉噻唑酸，根据检测线条带的深浅判断待测样品中是否含有青霉噻唑酸。若质控线条带无颜色，则该试纸条失效。

与现有国内外检测青霉噻唑酸的方法相比，本发明具有以下突出的优点：1、本发明的青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条是利用抗原抗体的特异性反应实现的，因此特异性高，灵敏度好。2、本发明的检测试纸条检测时间快速(10分钟)且不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。3、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。4、本发明的检测试纸条储存方便，在室温下可保存2个月。

附图说明

构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为本发明检测试纸条的组装示意图。

图2为检测结果的判定。

图3为青霉素降解物试纸条特异性的确定(从左至右：空白，青霉噻唑酸、青霉素、氯霉素、三聚氰胺、四环素、沙丁胺醇、诺氟沙星、氧氟沙星、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪，青霉噻唑酸浓度为100μg/L，其他药物浓度均为1000μg/L)。

图4为青霉噻唑酸检测限的确定(青霉噻唑酸的浓度从左到右分别为0、5、10、50μg/L)

图5为青霉噻唑酸试纸条在室温下的稳定性。(a)室温放置两周，(b)室温放置四周，(c)室温放置六周，(d)室温放置八周。每组青霉噻唑酸的浓度分别为0、10、50μg/L。

图6为添加BPA的牛奶样品检测结果(青霉噻唑酸的浓度从左到右分别为0、10、50、100μg/L)。

图7为添加BPA的奶粉样品检测结果(青霉噻唑酸的浓度从左到右分别为0、40、100、200μg/kg)。

附图标记说明：

1、样品垫、2、结合垫、3、硝酸纤维素膜、4、吸水垫

5、检测线、6、质控线、7、PVC板

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例l(制备实施例)

(一)青霉噻唑酸抗血清的纯化

本实验所用青霉噻唑酸抗血清由实验室自制，采用Protein A－Sepharose 4B作亲合层析介质纯化青霉噻唑酸抗血清，可一次性获得接近纯度较高的特异性抗体。具体操作步骤为(1)平衡：用平衡缓冲液(0.2mol/L的磷酸缓冲液)冲洗管路，平衡柱子，至基线平稳。(2)上样：用平衡缓冲液将青霉噻唑酸特异性抗血清等体积稀释后上柱。(3)洗杂：用平衡缓冲液洗杂至杂蛋白的紫外吸收峰出现后继续冲洗至基线平稳。(4)洗脱收集：用0.1mol/L pH 2.7的甘氨酸缓冲液洗脱特异性IgG抗体。当紫外吸收曲线呈上升趋势，收集特异性抗体。并迅速用Tris-HCl中和抗体至中性。(5)封柱：抗体收集完成后迅速用醋酸缓冲液酸化纯化柱后，用平衡缓冲液中和纯化柱，最后用20％乙醇饱和封柱。将纯化收集的抗体，用pH7.4的磷酸缓冲液4℃透析三天后取出，添加0.1％(w/v)的叠氮钠，用磷酸缓冲液将浓度稀释成1mg/mL，备用。利用该抗体与胶体金结合制备青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物。

(二)青霉噻唑酸抗原的制备

采用活化酯法制备青霉噻唑酸抗原。称取10mg青霉噻唑酸、5mg NHS和10mg EDC粉末，分别加至试管中，加入200μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 5.7)溶解混合后置于旋涡混合器上振荡至试管中出现浑浊，再加入5mg EDC，置于摇床上反应5h。将上述反应液取出置于离心管中，3000rpm，4℃离心1-2min，将上清取出，即活化酯液。

称10mg鸡卵白蛋白(OVA)溶于2mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 5.7)，冰浴下加入反应液后4℃过夜反应，反应产物于pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中4℃透析三天，然后精确量取反应溶液的体积，测定浓度后，加入0.1％(w/v)的叠氮钠，4℃保存备用。

利用该抗原包被硝酸纤维素膜上的检测线。

实施例2(制备实施例)

青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条组装及制备方法

1、试纸条组装：

本发明的试纸条组成如下：样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4和PVC板8，在PVC板8上按顺序依次粘附有样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4；所述的结合垫2上包被有青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜3上分别包被有青霉噻唑酸抗原构成的检测线5和羊抗兔二抗构成的质控线6。

2、胶体金的制备：

采用柠檬酸三钠法制备胶体金。先取200mL去离子水倒入用于制备胶体金的三角瓶中，于恒温电磁搅拌器上加热至沸腾一分钟进一步清洗之后，小心倒掉沸水。取浓度为0.01％HAuCl₄水溶液(已过0.22μm水系膜)100mL倒入三角瓶，加热到沸腾。沸腾后，快速小心加入2.25mL 1％的柠檬酸三钠水溶液(已过0.22μm水系膜)，2分钟内可观察到明显的颜色变化。当胶体金溶液呈现稳定的颜色不再变化时继续煮沸15分钟。室温冷却后用去离子水定容至100mL，转移至清洗过的玻璃瓶中4℃保存备用。制备好的胶体金溶液清亮透明，呈酒红色，表面无漂浮物。

3、青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物的制备：

磁力搅拌下，按每mL胶体金加入10μL 0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值，然后按每mL胶体金加入36μg青霉噻唑酸抗体，轻微振摇使其混匀，4℃静置60分钟。然后按每mL胶体金中加入20μL 20％的BSA以封闭胶体金表面多余的残基。室温静置30分钟后，再向其中加入10μL 20％的PEG20000(聚乙二醇20000)后室温静置30分钟。4℃条件下2000rpm低速离心15分钟弃沉淀取上清。将上清于4℃条件下10000rpm高速离心30分钟。弃去上清液，向得到的沉淀中加入200μL胶体金标记抗体稀释液稀释5倍，4℃保存备用。

4结合垫的制备

将结合垫2浸泡于0.01M pH 7.4磷酸缓冲液(配方及制备：2g BSA，500μL TritonX-100，5g蔗糖，0.1g聚乙烯基吡咯烷酮，0.02g叠氮钠，0.02g磷酸二氢钠，0.29g磷酸氢二钠，用超纯水定容至100mL)中5min后，烘干。然后30μL/cm青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物包被于结合垫上，真空干燥。

5硝酸纤维素膜的包被

用上海金标的双维平面划膜仪将制备的青霉噻唑酸抗原(含3％甲醇)包被于硝酸纤维素膜3上作为检测线5，包被量为0.9μL/cm；将购买的羊抗兔二抗(浓度mg/ml)包被于硝酸纤维素膜3上作为质控线6，包被量为0.9μL/cm，37℃烘干，封装备用。

6试纸条的组装

将样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4按图1所示的顺序依次粘附在PVC板8g上，切成3.7mm宽的小条，真空封装。常温保存，有效期2个月。

实施例3(应用实施例)

青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条使用方法

1、牛奶样品的预处理

取牛奶样品经10000rpm离心30min后，取中间层加入0.5％聚乙烯比咯烷酮做掩蔽剂进行测定。

取奶粉配成复原乳，经10000rpm离心30min后，取中间层加入0.5％聚乙烯比咯烷酮做掩蔽剂进行测定。

2、检测步骤

用吸管吸取100μl待检牛奶缓慢滴加在胶体金试纸条的加样孔上，10分钟后观察结果。

3、结果判定

如图2所示，若待测样品试纸条检测线颜色与质控线颜色基本一致，则判断为阴性样品，即不含青霉噻唑酸；若待测样品试纸条检测线颜色明显浅于质控线颜色或检测线颜色消失，则判断为阳性样品，即待测样品中含有青霉噻唑酸，说明是人为的添加了β—内酰胺酶的牛奶，阳性结果和阴性结果，质控线均显红色条带，若质控线红色条带消失，则试纸条检测失效。

实施例4(应用实施例)

本发明的应用效果举例

本实施例中所指的青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条检测方法参照实施例3所述的操作步骤，其检测结果如下。

1、特异性试验

如图3所示，按实施例3所述方法进行试验，检测青霉素、氯霉素、三聚氰胺、四环素、沙丁胺醇、诺氟沙星、氧氟沙星、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪(均购自美国sigma公司)，除了与青霉噻唑酸结构十分相似的青霉素在浓度为1000μg/L时检测线颜色略浅于质控线，有一定的交叉反应，其余8种药品检测线均与质控线颜色基本一致，说明本发明的试纸条与其他常检的药品无交叉反应，显示本发明青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条具有好的特异性。

2、灵敏度试验

如图4所示，按实施例3所述方法进行试验。当青霉噻唑酸标准品浓度低于10μg/L时，试纸条检测线显色结果与质控线颜色目测比较无差别；当青霉噻唑酸标准品浓度为10μg/L时，试纸条检测线显色结果与质控线颜色目测比较有明显区别；当青霉噻唑酸标准品浓度继续增大，检测线逐渐变浅；青霉噻唑酸标准品浓度为50μg/L时，检测线基本消失。因此确定方法的目视检测限为10μg/L。

3、稳定性试验

如图5所示，将本发明研制的试纸条置于室温条件下，按实施例3所述方法进行实验，分别定期检查试纸条的有效性。观察颜色条带结果显示，试纸条室温下保存时，八周内平均温度在20℃左右。由图可见，八周后检测时，检测线颜色明显，灵敏度仍然很好，检测结果准确可靠。因此，试纸条可于室温下至少保存2个月，检测结果仍然准确可靠。

4、加标样品的检测

如图6所示，向牛奶阴性样品中添加青霉噻唑酸标准品，样品中最终浓度为10μg/L、50μg/L、100μg/L，10000rpm离心30min后，取中间层加入0.5％聚乙烯比咯烷酮做掩蔽剂，进行检测。按实施例3所述方法进行实验，检测结果如图6。

如图7所示，将奶粉配成复原乳，分别添加青霉噻唑酸标准品使样品最终浓度为40μg/kg、100μg/kg、200μg/kg。离心后，加入0.5％聚乙烯比咯烷酮做掩蔽剂，进行检测。按实施例3所述方法进行实验，检测结果如图7。

按实施例3所述方法进行实验。并与酶联免疫吸附法(ELISA)检测结果进行比较。

表1各种样品不同添加水平的ELISA与GICA测定结果的比较

注：ND：未检测，+：阳性结果，-：阴性结果，±：弱阳性结果。

实验表明本发明的试纸条准确性好、灵敏度高、特异性好，而且样品前处理方法简单，整个检测过程不超过10min，适用于大量样品的品的快速筛选，可作为是青霉噻唑酸残留现场快速检测的有效筛检手段。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫d和PVC背板，其特征在于，在PVC背板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有青霉噻唑酸抗原构成的检测线e和羊抗兔二抗构成的质控线f，两条线间隔距离为5mm。

2.权利要求1所述的一种检测青霉噻唑酸的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)青霉噻唑酸抗血清纯化，得到青霉噻唑酸多克隆抗体；

(2)制备青霉噻唑酸抗原；

(3)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；

(4)将步骤(1)纯化的抗体加入到步骤(3)制备的胶体金中，制备青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物；

(5)将步骤(4)制备的青霉噻唑酸抗体—胶体金标记物包被于结合垫上；

(6)将步骤(2)制备的青霉噻唑酸抗原包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，并将羊抗兔二抗包被于硝酸纤维素膜上构成质控线；

(7)在PVC背板上按顺序依次粘附样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，得到所述的青霉噻唑酸胶体金免疫层析试纸条。