CN104965089A - 新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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徐丹
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Abstract

本发明涉及一种新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括微柱凝胶卡、指示红细胞和血小板抗原，其制备方法包括微柱凝胶卡的制备和抗IgG致敏醛化红细胞的制备。本发明新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒灵敏度高，特异性好，质量稳定，检测过程耗时短，方法简便易行，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化，能够使血小板配型技术成为临床常规检测项目。

Description

新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒的组成、制备方法及其应用，适用于各种血小板抗体产生的临床综合症如输血后紫癜、血小板输用无效症等病症的诊断预防和治疗。
背景技术
临床输血中，随着成分输血地不断推广，血液治疗越来越受到人们的关注而成为研究热点，如何快速、安全、有效地输血常常关系到患者的生命，将成为今后的发展趋势。血小板输注可降低由于血小板减少所引起的严重出血，并已成为血液病及肿瘤患者放、化疗的有效支持疗法，其用量在全世界呈不断上升的趋势，但反复输血者可能产生血小板相关抗体及输血小板无效(RPT)，故血小板抗体的检测在疾病诊断和疗效判断方面非常重要。如何提高血小板输注的临床疗效或避免输注无效，成为令人关注的研究课题。虽然血小板抗体的检测技术和方法很多，但迄今为止还没有一种具有临床实用价值的血清学检测方法。
目前已存在的血小板血型检测技术有：血小板免疫荧光试验、酶联免疫吸咐试验；混合被动血凝技术、混合细胞粘附试验（固相技术）、特异的单克隆抗体对血小板抗原固定试验等，但这些试验的操作程序都比较复杂，需要时间长，有的所需设备仪器昂贵，所以血小板血型配型到目前还没有成为临床血小板输血的常规检测项目。临床普遍采用SEPSA和MACE的方法进行血小板抗体筛选，敏感性和特异性仅为30%和40%，在很多非免疫性疾病中PAIg均可见升高，免疫性血小板减少的诊断可靠性日益受到挑战。而在00105438的专利中提到微柱凝胶法中指示红细胞使用的是新鲜血液，并且指示红细胞保质时间较短，不利于试剂盒的长期稳定。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好且质量稳定的新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括微柱凝胶卡、指示红细胞和血小板抗原，所述微柱凝胶卡上有多个微柱管，每个微柱管中均包括若干个聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒；
所述试剂盒的制备包括以下步骤：
一、微柱凝胶卡的制备
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯（5. 0-6.5）×l0-4g／ml、对羟基苯甲酸丙酯（1. 2-1.5）×l0-4g／ml、甘氨酸（1. 6-1.9）×l0-2g／ml、氯化钠（1. 6-1.8）×l0-3g／ml、磷酸二氢钾（2. 0-2.4）×l0-4g／ml、磷酸氢二钠（4.5-4.8）×l0-4g／ml，以上试剂混合后用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8；
步骤二、凝胶的制备
选用大小为30-60纳米的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2：1～6：1的比例混合后配制成凝胶；
步骤三、分装
将步骤二配制的凝胶按照每管20-30微升的量，分别加入到微柱凝胶卡的多个微柱管中；
二、指示红细胞的配制
步骤一、红细胞醛化
1）O型红细胞洗涤：在离心机3000rpm下离心1min，然后弃上清，用0.9%的生理盐水洗涤6-8次后配制成5%红细胞；
2）红细胞醛化处理：在a所得的5%红细胞和2.5%戊二醛按照体积比5:1-2:1进行混合；
3）醛化后红细胞的洗涤：在离心机2500rpm下离心经过b醛化后的红细胞2.5分钟，并用0.9%的生理盐水溶液洗涤5-6次；
4）醛化红细胞的保存：用0.9%生理盐水溶液把红细胞浓度调成20%，然后在4℃下进行储存，有效期二年；
步骤二、抗IgG致敏醛化红细胞的制备
1）按常规方法配制pH为6.6-7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）；
2）用生理盐水洗涤上述步骤一所得醛化后的红细胞4次，PBS洗涤1次，在3000rpm下离心3分钟后弃上清液，将得到的红细胞悬浮于2mL PBS中；
3）加入2mL37°C的PBS/5mgTCA；
4）37°C水浴振荡15分钟；
5）生理盐水洗涤1次，PBS洗涤1次后悬浮于2mL PBS 中；
6）加入2mL IgG溶液；
7）37°C下水浴振荡60分钟；
8）快速用生理盐水洗涤5次，PBS洗涤1次。
本发明新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒包括试剂盒及其制备方法，2.5%戊二醛是用pH6.8-7.2的磷酸缓冲液将体积百分比为25%的戊二醛原液稀释而成，0.9%的生理盐水是将9g的氯化钠溶解于1L的纯化水中配制而成，PBS/5mgTCA是将5mgTCA溶于100mL PBS之中形成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒灵敏度高，特异性好，质量稳定，检测过程耗时短，方法简便易行，结果易于判定，可同时对大量样本进行检测，易于自动化，能够使血小板配型技术成为临床常规检测项目。
具体实施方式
本发明新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒主要包括：微柱凝胶卡、指示红细胞和血小板抗原，所述微柱凝胶卡上有多个微柱管，每个微柱管中均包括若干个聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒。
新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒的制备方法如下：
一、微柱凝胶卡的制备
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯（5. 0-6.5）×l0-4g／ml、对羟基苯甲酸丙酯（1. 2-1.5）×l0-4g／ml、甘氨酸（1. 6-1.9）×l0-2g／ml、氯化钠（1. 6-1.8）×l0-3g／ml、磷酸二氢钾（2. 0-2.4）×l0-4g／ml、磷酸氢二钠（4.5-4.8）×l0-4g／ml，以上试剂混合后用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8；
步骤二、凝胶的制备
选用大小为30-60纳米的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2：1～6：1的比例混合后配制成凝胶；
步骤三、分装
将步骤二配制的凝胶按照每管20-30微升的量，分别加入到微柱凝胶卡的多个微柱管中；
二、指示红细胞的配制
步骤一、红细胞醛化
A试剂配制：
2.5%戊二醛：用pH6.8-7.2的磷酸缓冲液将体积百分比为25%的戊二醛原液稀释稀释10倍至2.5%；
0.9%的生理盐水：称量9g的氯化钠溶液1L的纯化水中；
B红细胞醛化的具体操作如下：
1）O型红细胞洗涤：在离心机3000r下离心1min，然后弃上清，用0.9%的生理盐水洗涤6-8次，然后再用它配制成5%红细胞；
2）红细胞醛化处理：吸取上述a所得的5%红细胞加入2.5%戊二醛， 5%浓度红细胞和2.5%戊二醛按照体积比5:1-2:1进行混合。
3）醛化后红细胞的洗涤：在离心机2500r下离心经过b之后的红细胞2.5分钟，并用0.9%的生理盐水溶液洗涤5-6次；
4）醛化红细胞的保存：用0.9%生理盐水溶液把红细胞浓度调成20%，然后在4℃下进行储存，有效期二年；
步骤二、抗IgG致敏醛化红细胞的制备
1）按常规方法配制pH为6.6-7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）；
2）用生理盐水洗涤醛化后的红细胞4次，PBS洗涤1次，在3000rpm下离心3分钟后弃上清液，得到红细胞悬浮于2mL PBS中；
3）加入2mL37°C的PBS/5mgTCA（鞣酸）；（注：5mg鞣酸溶于100mL PBS）；
4）37°C水浴振荡15分钟；
5）生理盐水洗涤1次，PBS洗涤1次后悬浮于2mL PBS 中；
6）加入2mL IgG溶液；
7）37°C下水浴振荡60分钟；
8）快速用生理盐水洗涤5次，PBS洗涤1次；
三、新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒的使用
1）将抗IgG致敏醛化红细胞25μl与病人的血清25μl以及血小板抗原25μl加入到微柱管中，于37℃下反应10-15min；
2）将微柱凝胶卡在专用离心机离心，900rpm下离心2min，1500rpm 下离心3min，取出后肉眼判定结果，并作记录；
c.判定结果
阳性结果反应强度：红细胞位于凝胶的表面，为4+强阳性反应；红细胞悬浮在凝胶中则为1+～3+阳性反应，越靠近凝胶底部效价愈小；红细胞全部沉积在凝胶的底部则为阴性。
本发明新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系中各种成分的协同作用：微柱凝胶卡上排列有多个微柱管可以完成多次检测；缓冲体系可以维持微柱凝胶卡反应体系需要的pH；低盐浓度体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内；润滑体系可以保证凝胶颗粒之间适当的润滑能力；酯类防腐剂可以防止凝胶或抗体因为细菌繁殖而失效；丙烯酰化的凝胶可以保证凝胶颗粒之间合适的间隙。

Claims (2)

1.一种新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒及其制备方法，其特征在于：所述试剂盒包括微柱凝胶卡、指示红细胞和血小板抗原，所述微柱凝胶卡上有多个微柱管，每个微柱管中均包括若干个聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒；
所述试剂盒的制备包括以下步骤：
一、微柱凝胶卡的制备
步骤一、凝胶悬浮介质的配制
所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯（5. 0-6.5）×l0-4g／ml、对羟基苯甲酸丙酯（1. 2-1.5）×l0-4g／ml、甘氨酸（1. 6-1.9）×l0-2g／ml、氯化钠（1. 6-1.8）×l0-3g／ml、磷酸二氢钾（2. 0-2.4）×l0-4g／ml、磷酸氢二钠（4.5-4.8）×l0-4g／ml，以上试剂混合后用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8；
步骤二、凝胶的制备
选用大小为30-60纳米的聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶颗粒与步骤一配制的凝胶悬浮介质按照体积比2：1～6：1的比例混合后配制成凝胶；
步骤三、分装
将步骤二配制的凝胶按照每管20-30微升的量，分别加入到微柱凝胶卡的多个微柱管中；
二、指示红细胞的配制
步骤一、红细胞醛化
1）O型红细胞洗涤：在离心机3000rpm下离心1min，然后弃上清，用0.9%的生理盐水洗涤6-8次后配制成5%红细胞；
2）红细胞醛化处理：在a所得的5%红细胞和2.5%戊二醛按照体积比5:1-2:1进行混合；
3）醛化后红细胞的洗涤：在离心机2500rpm下离心经过b醛化后的红细胞2.5分钟，并用0.9%的生理盐水溶液洗涤5-6次；
4）醛化红细胞的保存：用0.9%生理盐水溶液把红细胞浓度调成20%，然后在4℃下进行储存，有效期二年；
步骤二、抗IgG致敏醛化红细胞的制备
1）按常规方法配制pH为6.6-7.5的磷酸盐缓冲液（PBS）；
2）用生理盐水洗涤上述步骤一所得醛化后的红细胞4次，PBS洗涤1次，在3000rpm下离心3分钟后弃上清液，将得到的红细胞悬浮于2mL PBS中；
3）加入2mL37°C的PBS/5mgTCA；
4）37°C水浴振荡15分钟；
5）生理盐水洗涤1次，PBS洗涤1次后悬浮于2mL PBS 中；
6）加入2mL IgG溶液；
7）37°C下水浴振荡60分钟；
8）快速用生理盐水洗涤5次，PBS洗涤1次。
2.根据权利要求1所述的一种新型微柱凝胶法血小板抗体检测试剂盒及其制备方法，其特征是：2.5%戊二醛是用pH6.8-7.2的磷酸缓冲液将体积百分比为25%的戊二醛原液稀释而成，0.9%的生理盐水是将9g的氯化钠溶解于1L的纯化水中配制而成，PBS/5mgTCA是将5mgTCA溶于100mL PBS之中形成。
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