CN109932514A - 血小板醛化试剂的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明血小板醛化试剂的制备方法及应用，它包括血小板获得、醛化和活性检测三个步骤。本发明血小板醛化试剂的制备方法及应用，提高了血小板制备的质量和产品的稳定性。

Description

血小板醛化试剂的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种血小板醛化试剂的制备及应用。

背景技术

随着肿瘤、血液系统疾病患者的显著增加及临床输血医学的快速发展，血小板输用量逐年攀升。血小板输血作为提升血小板计数，防止出血，保障患者生命安全的有效措施，其安全、科学、有效的输注已成为临床输血技术发展的必然要求。然而，目前我国大多数血小板输血仍然采用随机输注(即“盲输”)，不相合的血小板输入患者体内后迅速被机体免疫系统破坏清除，导致血小板输注无效症频繁发生，不仅浪费了宝贵的血小板资源，而且延误了患者的最佳治疗时机，还增加了患者痛苦和经济负担。目前血小板抗体主要有血小板同种异体抗体，包括HLA抗体，HPA抗体及其它血小板反应性抗体。血小板自身抗体，包括患者自身血小板结合抗体和自身游离抗体。血小板抗体主要在肿瘤患者、白血病、再生障碍性贫血、溶血性贫血、特发性血小板减少症、新生儿血小板减少症、骨髓异常综合症﹑妊娠史等血小板输注无效疾病患者中存在，同时会存在各种血小板抗体产生的临床综合症。

为改善这一现状，提高患者血小板输血效果，国内部分临床医院新增开展了血小板抗体检测项目。目前已存在的血小板血型检测技术有：血小板免疫荧光试验、酶联免疫吸咐试验；混合被动血凝技术、混合细胞粘附试验(固相技术)、特异的单克隆抗体对血小板抗原固定试验等，但这些试验的操作程序都比较复杂，需要时间长，有的所需设备仪器昂贵，所以血小板血型配型到目前还没有成为临床血小板输血的常规检测项目，部分项目在临床开展过程中因准确性和灵敏度达不到安全输血要求，操作过于繁琐，逐渐被临床淘汰。

单克隆特异的血小板抗原固定试验(monoclonal antibody-specificimmobilization of platelet antigens assay,MAIPA),MAIPA技术原理为血小板先结合人的同种抗体，然后与不同的抗血小板膜糖蛋白的(抗GPIb、GPIIb、GPIIIa、GPIX、HLA等)鼠抗人血小板单克隆抗体孵育。经洗涤后裂解血小板，将产物移至包被的羊抗鼠IgG微孔板内，通过辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG，经酶底物显色可以检测血小板膜糖蛋白特异的同种抗体。以上方法进行血小板抗体定性检测时，其灵敏度和特异性仅有30％-40％，结果判读存在人为误差，约几个小时才能完成检测，不能满足了临床医生的快速需求，同时该技术也没有相应的质控技术。目前国内只有少部分临床开展了该方法的血小板抗体检测，部分也只是试用阶段。为了克服临床上其他血小板抗体检测方法灵敏度低，特异性差，临床操作复杂，检测时间过长，结果判读困难、缺乏相应的试剂质控等实际问题；

目前临床常用的固相红细胞吸附试验技术(solid-phase red cell adherence,SPRCA),SPRCA技术原理为在反应板中包被抗血小板单克隆抗体，血小板悬液经离心洗涤后可在反应孔底部形成血小板单层。加入血清或血浆，在孔中经过孵育后，若该血清或血浆中含有血小板抗体，则该抗体与反应孔中的血小板单层结合，未结合的成分通过洗涤被去除。加入抗人IgG及人IgG致敏红细胞(指示红细胞)，经离心后指示红细胞通过抗人IgG的桥连与血小板单层上的血小板抗体结合，因此阳性反应为指示红细胞平铺在反应孔底部表面,而阴性反应为指示红细胞在离心力的作用下聚集于反应孔底部中央。操作方便，结果易于分辨。

然而血小板悬液试剂的质量严重影响该技术的实验结果，因此血小板悬液试剂对该技术试验的成败至关重要。目前血小板悬液试剂有临床医药自制或商品化试剂两种方式：其中临床制备方法困难、且含量不一，难以保障试验的结果；商品化的试剂保存时间短、批间稳定性差、质量良莠不齐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术提供一种血小板醛化试剂的制备方法及应用，从而提高了血小板制备的质量和产品的稳定性。

本发明的目的是这样实现的：

血小板醛化试剂的制备方法，包括以下几个步骤：

（1）采用新鲜枸橼酸抗凝全血分离获得富含血浆的血小板或机采血小板，细胞计数测定血小板浓度；

（2）于上述血小板中加入0.2-10%浓度的多聚甲醛溶液至终浓度为1%，室温（22-26℃）静置10min，完成后300g室温离心5min，弃上清，加入2mlpH7.4的PBS混匀，300g室温离心5min，弃上清；如此反复洗涤2-5次后，将血小板沉淀重浮PBS缓冲液中，调节血小板浓度至所需检测浓度，备用；

（3）检测血小板抗原活性。

其中0.2-10%多聚甲醛的制备方法如下：

在通风橱中，用0.1M的PBS（pH7.4）配制，100ml PBS加入0.2g-10g多聚甲醛，加热56度搅拌溶解，如不溶解加入1N NaOH，溶解后用1N HCl调节pH至7.4。

Claims (1)

1.一种血小板醛化试剂的制备方法及应用，其特征在于：

所述制备方法及应用包括以下几个步骤：

（1）采用新鲜枸橼酸抗凝全血分离获得富含血浆的血小板或机采血小板，细胞计数测定血小板浓度；

（2）于上述血小板中加入0.2-10%浓度的多聚甲醛溶液至终浓度为1%，室温（22-26℃）静置10min，完成后300g室温离心5min，弃上清，加入2mlpH7.4的PBS混匀，300g室温离心5min，弃上清；如此反复洗涤2-5次后，将血小板沉淀重浮PBS缓冲液中，调节血小板浓度至所需检测浓度，备用；

（3）检测血小板抗原活性

其中0.2-10%多聚甲醛的制备方法如下：

在通风橱中，用0.1M的PBS（pH7.4）配制，100ml PBS加入0.2g-10g多聚甲醛，加热56度搅拌溶解，如不溶解加入1N NaOH，溶解后用1N HCl调节pH至7.4。