DK163839B - Fremgangsmaade til bestemmelse af antigener ved hjaelp af tre eller flere monoklonale antistoffer, og et proeveudstyr til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i

DK 163839 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af antigener ved hjalp af en immunokemisk reaktion, ved hvilken antigenet skal indgå i en binding med antistofmolekyler, hvoraf mindst et er market, og et prøveudstyr til brug ved fremgangs-5 måden.

I mange år har det været kendt, at der kan udvikles følsomme og specifikke metoder til bestemmelse af mange stoffer, som er baseret på en immunokemisk reaktion, dvs. en reaktion mellem 10 to eller flere immunokomponenter, f.eks. mellem antigen og antistof.

Et antigen er et stof, som, hvis det injiceres i et dyr, hvor det pågældende antigen er fremmed for legemet, giver anledning 15 til dannelse af en immunologisk forsvarsreaktion, og et antistof er et proteinmolekyle (et immunoglobulin), som dannes af dyret, i hvis blod det findes, som reaktion på indtrængning af antigenet, og som kan indgå en specifik binding med antigenet, mod hvilket det er rettet. Selv om denne mekanisme i princip-20 pet betragtes som en forsvarsmekanisme mod skadelige stoffer, der trænger ind i en levende organisme (f.eks. en virusinfektion), kan den anvendes til at skabe antistoffer mod ethvert vilkårligt antigen.

25 Graden af skadeligheden af antigenet spiller ingen rolle her. Blodserumet fra et sådant dyr eller fraktioner deraf, indeholdende antistoffer, kan anvendes som reagens for antigenet. Et meget stort antal stoffer med forskellige strukturer kan fungere som antigener. I forsøgsdyr skabes antistoffer således 30 af næsten alle slags proteinmolekyler mod glycoproteiner, mod visse kulhydrater, lipider og - efter anvendelse af visse kunstgreb - også mod lavmolekylære stoffer såsom steroidhormoner og prostaglandiner.

35 Dette betyder, at for alle disse klasser af stoffer kan der udvikles immunokemiske metoder til bestemmelse.

2

DK 163839 B

Omend der selv på basis af simpel udfældning af antigener med antistoffer kan udvikles en immunokemisk metode til bestemmelse af antigenet, benytter man sig normalt af mere raffinerede metoder for at få de fulde fordele af de muligheder, som den 5 immunokemiske reaktion frembyder med hensyn til specificitet og følsomhed. I denne forbindelse bliver antigenet eller antistofmolekylet hyppigt forsynet med et mærke, som gør forekomsten af antigen/antistof-bindingen synlig eller målelig på en simpel måde.

10

Som mærker er bl.a. blevet anvendt følgende: Røde blodceller (hæmagglutineringsreaktion), polystyrenlatexkugler (latex-ag-glutineringsreaktion), metalsolpartikler, fint suspenderede farvestofpartikler og - hyppigt kombineret med antistofmole-15 kyler, der er blevet gjort uopløselige - radioisotoper, enzymer og fluorescerende stoffer.

Det almene ejendommelige træk ved den type immunokemiske bestemmelser, der er tale om her, anses for at være den 20 omstændighed, at antigenmolekylet, som skal bestemmes, danner en binding med mindst to antistofmolekyler.

Den klassiske metode til at skabe antistoffer, nemlig injektion af antigener i forsøgsdyret, resulterer normalt i en 25 yderst heterogen immunreaktion. Han kan antage, at under denne fremgangsmåde bliver der i forsøgsdyrene stimuleret forskellige populationer af anti stofdannende celler (lymfocyter), der hver producerer deres egen slags antistof med enestående struktur, affinitet og specificitet. Endvidere viser det sig, 30 at i et forsøgsdyr kan forskellige populationer af lymfocyter i tidens løb blive dominerende. Resultater heraf er, at det ikke blot er meget vanskeligt fra forskellige forsøgsdyr at opnå blodsera (antisera), indeholdende antistoffer af sammenlignelig kvalitet, men også at antiserumprøver, opnået fra 35 samme forsøgsdyr på forskellige tidspunkter, kan være meget forskel lige.

3

DK 163839 B

I nogle år har det nu været muligt at opnå absolutte homogene antistoffer i praktisk taget ubegrænsede mængder. Til dette formål gøres brug af et cellefrit system eller en modificeret organisme, hvori genetisk materiale, som koder for de ønskede 5 antigenspecifikke globuliner, udtrykkes f.eks. ved: a) Cellefusion.

Til dette formål bringes en antistofproducerende celle 10 sammen med en kontinuerligt voksende cellelinie, f.eks. en lymfocytcelle, der er blevet til en tumorcelle (myeloma cellelinie). Cellefusion finder sted både spontant og under indflydelse af visse stoffer såsom polyethylenglycol eller lecithin, og som funktionsprodukt dannes en "hybri-15 doma", der både har evne til at producere antistoffer fra den ene celle og kontinuerlig vækstevne fra den anden celle.

b) Transformation.

20 1. Antistofproducerende celler bringes til at vokse kontinuerligt, enten ved eller uden transduktion.

2. Isolerede og/eller helt eller delvis syntetisk frem- 25 stillede nukleinsyresekvenser indføres i den ønskede værtscelle.

c) Mutation.

30 ved kemisk eller fysisk behandling af den antistofproduce rende celle.

Også kombinationer af de ovennævnte metoder kan benyttes, hvis det ønskes.

For hver enkelt cellelinie er de producerede antistoffer alle identiske med dem, der produceres af den oprindelige antistof- 35 4

DK 163839 B

producerende celle. De er således fuldstændigt homogene. Oa de er dannet af den ene oprindelige antistofproducerende celle, kaldes de monoklonale antistoffer.

5 På grund af deres homogenitet og den simple måde, hvorpå de kan produceres i ubegrænsede mængder, er monoklonale antistoffer i princippet særligt egnede som reagenser under de foran beskrevne immunokemiske bestemmelsesmetoder.

10 Det har imidlertid vist sig, at monoklonale antistoffer hyppigt ikke reagerer ved de prøvemetoder, ved hvilke "klassiske" antistoffer er helt effektive: Monoklonale antistoffer danner ikke et bundfald med deres tilsvarende antigener. Partikler (erythrocyter, latexkugler, metalpartikler) belagt med mono-15 klone antistoffer agglutinerer ikke i nærværelse af tilsvarende antigener. Monoklonale antistoffer mærket med en radioisotop, et enzym, en metalpartikel etc. bindes ikke til en fast fase, som er belagt med de monoklone antistoffer, i nærværelse af det tilsvarende antigen. Alt dette er i modsætning til op-20 førselen af "klassiske" antistoffer.

Der er nu fundet frem til en fremgangsmåde til bestemmelse af et antigen ved hjælp af en immunokemisk reaktion, ved hvilken antigenet skal indgå en binding med antistofmolekyler, og som 25 er ejendommelig ved, at der anvendes tre eller flere forskellige slags monoklone antistoffer rettet mod samme antigen, og et prøveudstyr til brug ved fremgangsmåden.

Prøveudstyret ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det 30 omfatter en blanding af tre portioner partikler, der hver er belagt med et forskelligt monoklonalt antistof mod et særligt antigen. Det kan også omfatte partikler, som hver er belagt med en blanding af tre forskellige slags monoklonale antistoffer mod et særligt antigen.

Cellelinier, der producerer monoklonale antistoffer mod samme antigen, kan fås på forskellige måder. Ved cellefusion under 35

DK 163839 B

5 et fusionsforsøg fås der normalt 10 - 100 hybridomalinier, der hver producerer et antistof med forskellig specificitet og affinitet. Det er hensigtsmæssigt at karakterisere disse cellelinier i større enkeltheder for at være i stand til at ud-5 vælge en optimal kombination til et immunokemisk prøvesystem.

De monoklonale antistoffer kan forarbejdes på forskellige kendte måder til dannelse af reagenser til immunokemiske bestemmelsesmetoder. De kan således f.eks. kombineres ved fysisk 10 absorption eller ved covalent kombination til overfladen af formalinbehandlede erythrocyter eller af polystyrenlatexkugler med forskellige diametre og således tjene som reagens i en omvendt passiv hæmagglutineringsprøve eller latexagglutine-ringsprøve. De kan også kombineres ved fysisk absorption eller 15 ved indeslutning sammen med partikler af en metalsol til brug ved immunobestemmelse af en homogen eller heterogen solpartikel. Endvidere kan de anvendes på analog måde ved en farvestofpartikel immunobestemmelse, der yderligere frembyder fordelen ved covalent binding. Monoklonale antistoffer kan også 20 kombineres på kendt kemisk eller fysisk måde med faste substrater såsom væggen af et plastreagensglas, plastkugler eller andre genstande, cellulose- eller sepharosepartikler etc., for at tjene som den faste fase i sandwich-bestemmelser. Her bør samtidig gøes brug af monoklonale antistoffer, der er blevet 25 mærket med f.eks. en radioisotop, et enzym, en fluorophor eller en metalsolpartikel, således at dannelsen af en anti-stof/antigen-binding kan iagttages. Talrige metoder er blevet beskrevet i den relevante litteratur for alle disse fremgangsmåder, der kan anvendes direkte til monoklonale antistoffer.

30

Kombinationer af tre eller flere monoklonale antistoffer kan fås på forskellige måder. For eksempel kan et reagens til omvendt passiv hemagglutination fremstilles ved at blande antistoffer fra tre eller flere hybridomaer og derefter anvendes 35 til belægning af erythrocyter, således at hver erythrocyt bærer forskellige antistofmolekyler, men på lignende måde kan adskilte portioner af erythrocyter belægges hver med et mono- klonalt antistof, hvorefter disse portioner blandes i et opti malt mængdeforhold.

DK 163839 B

6

Der kræves nogen omhu ved valget af en effektiv kombination af 5 tre eller flere monoklone antistoffer til brug i immunokemiske bestemmelsesmetoder, som beskrevet i det foregående.

Ikke enhver vilkårlig kombination af tre eller flere antistoffer vil tilfredsstille rimelige krav med hensyn til følsomhed 10 og specificitet, og det er endog muligt, at en sådan kombination slet ikke vil være effektiv. Etablering af den bedste kombination afhænger udelukkende af erfaringen. I det ideelle tilfælde er der et bredt interval af monoklonale antistoffer til rådighed over for et givet antigen. Dette interval under-15 søges under alle mulige kombinationer, hvorefter der vælges den kombination, som giver pålidelige, følsomme og specifikke resultater.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særligt egnet til sorte-20 ring af prøver efter tilstedeværelse af forskellige antigener.

Til dette formål sammensættes et reagens, bestående af partikler såsom erythrocyter, latexkugler eller plastkugler, hver belagt med forskellige monoklonale antistoffer rettet mod de forskellige antigener, der skal påvises i prøven, og af par-25 tikler, der hver er belagt med monoklonale antistoffer rettet mod de samme antigener, men hvor de sidstnævnte antistoffer dog er af en anden slags end de førstnævnte.

De beskrevne kombinationer af monoklonale antistoffer, der er 30 forarbejdet eller ikke forarbejdet til dannelse af reagenser (såsom overfladedele belagt med antistoffer eller enzymmærkede antistoffer) kan oparbejdes med udmærkede resultater til dannelse af immunokemiske prøveudstyr, som er kombinationer af reagenser, der, forudsat at de anvendes i overensstemmelse med 35 den foreskrevne fremgangsmåde, giver prøvemetoder med nærmere angivet følsomhed og pålidelighed. Sådanne udstyr kan f.eks. fremstilles som følger: 7

DK 163839 B

Et svangerskabsprøveudstyr, bestående af en blanding af fåre-erythrocyter belagt med monoklonale antistoffer A mod human choriongonadotrophin (HHG) og fåre-erythrocyter belagt med monoklonale antistoffer B mod HHG, frysetørret i en glasampul 5 med rund bund, der samtidig tjener som bundfældningsglas ved prøven, eller et prøveudstyr til bestemmelse af human placenta lactogent hormon (HPL), bestående af en mikrotitreringspla-de, hvori grubernes vægge er belagt med monoklonalt antistof A mod HPL, ampuller med en frysetørret blanding af antistoffer B 10 og C mod HPL, market med enzymet peroxidase, og endvidere af hjælpestoffer såsom vaskestødpude, enzymsubstrat, kontroller og standarder.

Generelt angår opfindelsen et prøveudstyr, bestående af føl-15 gende: 1. Et monoklonalt antistof eller nogle forskellige typer monoklonale antistoffer rettet mod samme antigen og mærket med et vist mærke.

20 2. Et monoklonalt antistof, som er forskelligt fra 1, eller nogle forskellige typer monoklonale antistoffer rettet mod samme antigen, der enten er uopløselige eller er blevet gjort uopløseligt, eller som er mærket med eller vil blive 25 mærket med et vist mærke.

3. Andre egnede reagenser.

Oe følgende eksempler skal illustrere opfindelsen.

30 35

DK 163839 B

8 EKSEMPEL 1. (Svangerskabsprøve) la. Fremstilling af monoklonale antistoffer mod HCG.

5

Mus (stamme Balb/C) blev immuniseret med human chorionisk gonadotropin (HCG) med en renhed på 10.000 IU pr. mg. Efter ca. 6 uger blev en cellesuspension fremstillet af milten, hvorefter 8 x 10? celler deraf blev sammensmeltet med 10 2 x io? myclomaceller (P3 x 63 Ag/8/653) under betingel ser, der er beskrevet i litteraturen (Kbhler & Milstein, Natur 256 (1975) 495). Hybridomaer blev dyrket i Dulbecco-modificeret Eagle's medium med 10% kalvefosterserum og undersøgt for anti-HGC-produktion. Antistofproducerende hy-15 bridomaer blev genklonet mindst to gange. Store mængder monoklonale antistoffer fremkom ved at geninjicere hybri-domaerne i bughulen på mus (stamme Balb/C) og udvinde ascitesvæsken efter 2-3 uger.

20 lb. Fremstilling af fåre-erythrocyter dækket med monoklonalt anti-HCG.

Fåre-erythrocyter blev stabiliseret ved formalinbehandling 25 (Wide: Acta endocrinol., Suppl. 70 (1962), 20, som modifi ceret af Schuurs m.fl.: Acta endocrinol., 59 (1968) 120) og blev dækket med monoklonale antistoffer ved at inkubere dem i 2 1/2 time med antistofferne i en koncentration på 0,2 mg pr. ml.

30 lc. Reaktion af fåre-erythrocyter, dækket med monoklonalt anti-HCG, med HCG og LH.

35 0,025 ml af en opløsning af HCG eller luteiniserende hor mon (LH) blev sat til 0,5 ml af en 0,4% erythrocyt-suspen-sion i et rundbundet glas. Glassets indhold blev rystet, 9

DK 163839 B

hvorefter det blev lagret, fri for vibrationer, i 2 timer.

Hvis der ikke skete nogen agglutination, blev en mørkebrun ring synlig på bunden af glasset (**}. Hvis der skete agglutination, dannedes et javnt lysebrunt lag på bunden af 5 glasset (+).

Resultaterne af forskellige kombinationer af antistoffer med HCG og det kryds-reagerende hormon LH er vist i tabel 1.

10

Selvom intet enkelt erythrocyt alene førte til agglutination, gav forskellige kombinationer følsomme og specifikke svangerskabsprøver.

15 TABEL 1.

Følsomhed for Følsomhed for Antistoffer HCG (IU/1) LH (IU/1) 20 _ A, B, C, D, E, hvert forsøg > 300.000 Ikke prøvet A + B 200 > 2.000 A + D 200 > 2.000 25 A + E 200 > 2.000 B + C 200 > 2.000 C + E 300 > 2.000 30 35

DK 163839 B

10 EKSEMPEL 2. (Latex-agglutineringsprøve for PAP).

2a. FremstiTIing af monoklonale antistoffer mod human plas-min antiplasmin-kompleks (PAP) i overensstemmelse med S metoderne beskrevet i eksempel la.

I de i det følgende beskrevne forsøg blev kun anvendt de monoklonale antistoffer, som kunne reagere med PAP-kom- 10 plekset, men ikke med de separate indgående dele (plas- min, antiplasmin).

2b. Fremstilling af latex dækket med monoklonalt anti-PAP.

15

Polystyrenlatex med en partikeldiameter på 0,8 blev dækket med IG-fraktionen af muse-ascitesvæsker, som indeholdt monoklonalt anti-PAP (se eksempel 2a), i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Singer & Plotz (Amer.

20 J. Med. 21 (1956) 888).

2c. Bestemmelse af PAP.

25 På en glasprøveplade med størrelsen 4 x 4 cm blev én dråbe anti-PAP latexsuspension (se eksempel 2b) og én dråbe normal human plasma (NHP) eller normal human plasma behandlet med urokinase (UNHP) blandet og derefter udspredt over et så stort overfladeareal som muligt, hvor- 30 efter væsken blev holdt i konstant ensartet bevægelse i 3 minutter. Synlig granulering af latexsuspensionen blev noteret som et positivt resultat, medens det blev betragtet som negativt, hvis suspensionen forblev jævn.

35 Det var muligt at konstatere en PAP-titer i en plasma prøve ved at afprøve en række fortyndinger, hvorved den højeste fortynding, der stadig gav et positivt resultat,

Claims (5)

1. 20 UNHP<16 UNHP 256 UNHP 256 Anti-PAP B NHP<16 NHP<16 UNHP<16 UNHP 256 Anti-PAP C NHP<16 UNHP<16

   25 Latex belagt med en blanding af anti-PAP A, B og C gav en UNHP-titer på 512-1.024, medens NHP-titeren var mindre end 16.

   30 Patentkrav. 1 Fremgangsmåde til bestemmelse af antigener ved hjælp af en immunokemisk reaktion, ved hvilken antigenet skal indgå i en 35 binding med antistofmolekyler, hvoraf mindst et er mærket, kendetegnet ved, at der herved anvendes mindst tre forskellige slags monoklonale antistoffer rettet mod det samme antigen. DK 163839 B
2. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes et reagens bestående af en blanding af tre portioner partikler, der hver er belagt med et forskelligt monoklonalt antistof mod antigenet, der skal bestemmes, og som 5 agglutinerer i nærværelse af antigenet.
3. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes et reagens bestående af partikler, som er belagt med en blanding af tre forskellige slags monoklonale an- 10 tistoffer mod antigenet, der skal bestemmes, og som agglutinerer i nærværelse af antigenet.
4. 4. Prøveudstyr, der kan anvendes til udførelse af fremgangsmåden ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det 15 omfatter en blanding af tre portioner partikler, der hver er belagt med et forskelligt monoklonalt antistof mod et særligt antigen.
5. 5. Prøveudstyr, der kan anvendes til udførelse af fremgangs-20 måden ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det omfatter partikler, som hver er belagt med en blanding af tre forskellige slags monoklonale antistoffer mod et særligt antigen. 25 30 35