NL8004308A - Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoclonale antilichamen. - Google Patents

Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoclonale antilichamen. Download PDF

Info

Publication number
NL8004308A
NL8004308A NL8004308A NL8004308A NL8004308A NL 8004308 A NL8004308 A NL 8004308A NL 8004308 A NL8004308 A NL 8004308A NL 8004308 A NL8004308 A NL 8004308A NL 8004308 A NL8004308 A NL 8004308A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
antigen
monoclonal antibodies
different
monoclonal
antibody
Prior art date
Application number
NL8004308A
Other languages
English (en)
Other versions
NL185309C (nl
NL185309B (nl
Original Assignee
Akzo Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
Application filed by Akzo Nv filed Critical Akzo Nv
Priority to NL8004308A priority Critical patent/NL185309C/nl
Priority to NL8004308 priority
Publication of NL8004308A publication Critical patent/NL8004308A/nl
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=19835673&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NL8004308(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NL185309B publication Critical patent/NL185309B/nl
Publication of NL185309C publication Critical patent/NL185309C/nl
Application granted granted Critical

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/539Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
    • G01N33/541Double or second antibody, i.e. precipitating antibody
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81Protease inhibitors
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914Hydrolases (3)
    • G01N2333/948Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968Plasmin, i.e. fibrinolysin

Description

£ S - V

oa/8062-081 Douma

Akzo N.V. te Arnhem.

Methode voor het bepalen van antiqenen met behulp van twee of meer monoclonale antilichamen.

Het i-s sinds veie jaren bekend dat gevoelige en specifieke bepalingsmethoden voor vele stoffen kunnen worden ontwikkeld die berusten op een immunochemische reaktie, d.w.z. een reaktie tussen twee of meer immunocomponenten, zoals bijvoorbeeld tussen antigeen en antilichaam.

Hierbij is een antigeen een stof die, indien ingespoten in een dier, waarvoor het antigeen in kwestie lichaams-vreemd is, aanleiding geeft tot het ontstaan van een immunologische afweerreaktie, en een antilichaam een eiwitmolecuul (een zgn. immunoglobuline) dat als reaktie op het binnendringen van het antigeen wordt gevormd door het dier, dat in het bloed voorkomt en dat een specifieke binding kan aangaan met het antigeen waartegen het is gericht. Hoewel dit mechanisme in principe is bedoeld als afweermechanisme tegen schadelijke stoffen die een levend organisme binnendringen (bv. een virusinfectie), kan het worden gebruikt voor het opwekken van antilichamen tegen elk willekeurig antigeen. De mate van schadelijkheid van het antigeen doet niet terzake. Het bloedserum van zulk een dier, of antilichamen houdende fracties daarvan, kan worden gebruikt als een reagens voor het antigeen.

Zeer veel stoffen van verschillende structuur kunnen als antigeen fungeren.

Zo zijn in proefdieren antilichamen opgewekt tegen vrijwel alle soorten eiwitmoleculen, tegen glycoproteinen, tegen bepaalde koolhydraten, lipiden en, na het toepassen van bepaalde kunstgrepen, zelfs tegen laagmoleculaire stoffen als steroidhormonen en prostaglandines.

Dit betekent dat voor al deze stofklassen immunochemische bepalingsmethoden kunnen worden ontwikkeld.

8004308 4 » ’ \ - 2 -

Hoewel reeds op basis van een simpele precipatie van antigeen door antilichaam een immunochemische bepalingsmethode voor het antigeen kan worden ontwikkeld, wendt men zich gewoonlijk tot verfijndere methoden om ten volle profijt te kunnen trekken van de mogelijkheden die de immunochemische reaktie biedt qua specifiteit en gevoeligheid. Veelal wordt hierbij het antigeen of antilichaam molecuul voorzien van een merker, die het optreden van de antigeen-antiliChaam binding op een eenvoudige wijze zichtbaar of meetbaar maakt.

Als merkers zijn onder meer gebruikt rode bloedlichaampjes (haemagglutinatie reaktie), polystyreen latex bolletjes (latex agglutinatie reaktie), metaalsol deeltjes, fijn gesuspendeerde kleurstofdeeltjes, en - veelal in combinatie met onoplosbaar gemaakte antilichaammoleculen - radioisotopen, enzymen en fluorescerende stoffen.

Als algemeen kenmerk van het bedoelde soort immunochemische bepalingen wordt gezien dat het te bepalen antigeenmolecuul een binding aangaat met tenminste twee antilichamenraoleculen.

De klassieke wijze van opwekken van antilichamen - het injecteren van een proefdier met antigeen — leidt gewoonlijk tot een zeer heterogene immuunrespons. Men mag aannemen dat bij deze procedure in het proefdier verschillende populaties antilichaamvormende cellen (lymfocyten) worden gestimuleerd, die elk hun eigen soort antilichaam met unieke structuur, affiniteit en specifiteit produceren. Het blijkt bovendien dat in een proefdier in de loop der tijd verschillende populaties lymfocyten de overhand kunnen krijgen. Dit leidt ertoe dat het niet alleen uiterst moeilijk is uit verschillende proefdieren antilichaamhoudende bloedsera (antisera) van vergelijkbare kwaliteit te verkrijgen, maar dat ook antiserum-monsters, verkregen uit hetzelfde proefdier op verschillende tijdstippen, zeer verschillend van elkaar zullen zijn.

Sinds enkele jaren is het nu mogelijk volstrekt homogene antilichamen te verkrijgen in practisch ongelimiteerde hoeveelheden.

8004308 - 3 - * * * %

Hiertoe wordt gebruik gemaakt van een celvrij systeem of een gemodificeerd organisme, waarbij genetisch materiaal, coderend voor de gewenste antigeenspecifieke globulines, tot expressie wordt gebracht, bijvoorbeeld door: a) Celfusie

Hiertoe wordt een antilichaam-producerende cel samengebracht met een continu-groeiende cellijn,bijvoorbeeld een lymfocytcel, die tot tumorcel is verworden (myeloma cellijn). Zowel spontaan als onder invloed van bepaalde stoffen, zoals polyethyleenglycol of lecithine, vindt celfusie plaats, waardoor als fusieproduct een zgn. hybridoma ontstaat, die zowel het vermogen heeft van antilichaamproductie van de ene cel, als het continue groeipotentieel van de andere samenstellende cel.

b) Transformatie 1. antilichaam-producerende cellen, al dan niet door trans-duktie, worden tot continue groei gebracht.

2. geïsoleerde en/of geheel dan wel gedeeltelijk synthetisch bereide nucleinezuurvolgordes worden in de gewenste gastheercel gebracht.

c) Mutatie

Door chemische of fysische behandeling van de antilichaam-producerende cel.

Eventueel kunnen ook combinaties van bovengenoemde methoden worden toegepast.

Voor elke afzonderlijke cellijn zijn de geproduceerde antilichamen a*lle gelijk aan die, geproduceerd door de oorspronkelijke antilichaam-producerende cel. Ze zijn dus volstrekt homogeen. Daar ze zijn ontstaan uit de ene, ' oorspronkelijke antilichaam-producerende cel, spreekt men van monoclonale antilichamen.

Monoclonale antilichamen zijn door hun homogeniteit en door de eenvoudige manier waarop ze in "onbeperkte" hoeveelheden kunnen worden geproduceerd in principe bijzonder gecshikt als reagens in de eerder beschreven immunochemische bepalingsmethoden.

8004308 - 4 - , , * 1 >

Het is echter gebleken dat monoclonale antilichamen vaak niet reageren in testmethoden waarin "klassieke" antilichamen wel werkzaam .zijn; monoclonale antilichamen vormen geen precipitaafc Wet hun corresponderend antigeen; met monoclonale antilichamen bedekte deeltjes (erythrocyten, latexbolletjes, metaal-deeltjes) agglutineren niet in aanwezigheid van corresponderend antigeen; monoclonale antilichamen gemerkt met een radioisotoop, een enzym, een metaaldeeltje, enz. binden niet aan een vaste fase die bedekt is met de monoclonale antilichamen in aanwezigheid van het corresponderend antigeen. Dit alles staat in tegenstelling tot het gedrag van “klassieke" antilichamen.

Gevonden werd nu een methode voor het bepalen van een antigeen met behulp van een immunochemische reactie, waarbij het antigeen een binding moet aangaan met tenminste twee antilichaam-moleculen, daardoor gekenmerkt, dat hierbij twee of meer verschillende soorten monoqlonale antilichamen, gericht tegen hetzelfde, antigeen, worden gebruikt.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op testkitten, die voor de hiervoor beschreven bepalingsmethoden gebruikt worden.

Cellijnen, die monoclonale antilichamen tegen hetzelfde antigeen produceren kunnen op diverse wijzen worden verkregen. Zo verkrijgt men bij celfusie gewoonlijk bij één fusie-experiment 10-100 hybridoma lijnen die elk een antilichaam van verschillende specifiteit en affiniteit produceren. Het is raadzaam deze cellijnen nader te karakteriseren, om een optimale combinatie voor een immunochemisch testsysteem te kunnen selecteren.

De monoclonale antilichamen kunnen op verschillende, bekende wijzen tot reagentia voor immunochemische bepalingsmethoden worden verwerkt. Zo kunnen ze bijvoorbeeld door fysische absorptie of door covalente binding worden gebonden aan'het oppervlak van geformaliniseerde erythrocyten of van polystyreen .latexbolletjes van verschillende diameters 8804308 * ί * - 5 - om zo als reagens te dienen in een omgekeerde passieve haemagglutinatietest of latexagglutinatietest. Ook kunnen:.ze door fysische absorptie of door insluiting worden gebonden aan deeltjes van een metaalsol voor gebruik in een homogene of heterogene soldeeltjes immuunbepaling* Daarnaast kunnen ze op analoge wijze worden gebruikt in een kleurstofdeeltjes immuunbepaling, die bovendien de mogelijkheid van covalente binding biedt.

Ook kunnen monoclonale antilichamen op bekende chemische of fysische wijze worden gebonden aan..vaste dragers, zoals de wand van een kunstof reageerbuis, kunststof knikkers of andere objecten, cellulose of sepharose deeltjes, etc. om te dienen als vaste fase in zgn. sandwich assays.

Daarbij dienen tevens monoclonale antilichamen te worden gebruikt die zijn gemerkt met bv* een radioisotoop, een enzym, een fluorofoor of een metaalsoldeeltje, om het ontstaan van een antigeen-antilichaam binding te kunnen vaststellen. Voor al deze procedures zijn talloze methoden in de vakliteratuur beschreven, die zonder meer voor monoclonale antilichamen kunnen worden toegepast.

Combinaties van twee of meer monoclonale antilichamen kunnen op diverse manieren worden verkregen. Zo kan bv. een reagens voor omgekeerde passieve haemagglutinatie worden bereid door antilichamen uit twee of meer hybridomas te mengen en vervolgens te gebruiken voor het bedekken van erythrocyten, zodat #lke erythrocyt verschillende anti-lichaam moleculen draagt, maar eveneens kunnen afzonderlijke partijen erythrocyten worden bedekt met elk één monoclonaal antilichaam, waarna deze partijen in een optimale verhouding worden gemengd. Zo ook kan bv. een "sandwich” radioimmunoassay worden verkregen door een vaste drager te bedekken met monoclonaal antilichaam A en een monoclonaal antilichaam 125 B te merken met I, maar ook door een mengsel van antilichamen A en B te gebruiken voor zowel het bedekken van 125 de vaste drager als voor het merken met I. Op soortgelijke manieren is een veelheid van mogelijkheden voor 80 0 4 3 08 - 6 - andere testmethodieken denkbaar.

Het selecteren van een werkzame combinatie van twee of meer monoclonale antilichamen voor gebruik in immunochemische bepalingsmethode) als eerder omschreven vereist enige zorg.

Niet alleen zal niet iedere willekeurige combinatie van twee of meer antilichamen voldoen aan redelijke eisen van gevoeligheid en specifiteit, het is zelfs mogelijk dat zo’n combinatie in het geheel niet werkzaam zal zijn.

Het vinden van de beste combinatie berust uitsluitend op > empirie. In het ideale geval beschikt men over een grote collectie monoclonale antilichamen tegen een beperkt antigeen. Deze wordt onderzocht in alle mogelijke combinaties, waarna men die combinatie uitkiest, die betrouwbare, gevoelige en specifieke resultaten oplevert.

De werkwijze volgens de uitvinding is ook in het bijzonder geschikt voor het screenen van monsters op de aanwezigheid van verschillende antigenen. Daartoe wordt een reagens samengesteld uit deeltjes, zoals erythrocyten, latexbolletjes of kunststofbolletjes, elk gecoat met verschillende monoclo- t nale antilichamen gericht tegen de verschillende, in het monster te detecteren antigenen, en uit deeltjes, elk gecoat met monoclonale antilichamen gericht tegen dezelfde antigenen, naar waarbij de laatstgenoemde antilichamen van een ander soort zijn dan de eerstgenoemde.

De beschreven combinaties van monoclonale antilichamen, al dan niet verwerkt tot reagentia (zoals met antilichaam bedekte deeltjes of oppervlakken, of met enzym gemerkte antilichamen), laten zich uitstekend verwerken tot immunochemische testkits: combinaties van reagentia die, mits gebruikt volgens het voorgeschreven protocol, leiden tot testmethoden van gespecificeerde gevoeligheid en betrouwbaarheid. Zulke kits kunnen bv. als volgt zijn samengesteld: een zwangerschapstestkit bestaande uit een mengsel van schape-erythrocyten bedekt met monoclonale antilichamen A tegen humaan choriongonadotrofine (HCG) en scfiape—ery throcy ten bedekt met monoclonale antilichamen B tegen HCG, gevriesdroogd 8004308 « ' * * : - 7 - in een glazen ampul met ronde bodem die tegelijk dienst doet als sedimentatiebuis voor de test, of een testkit voor de bepaling van humaan placentair lactogeen hormoon (HPL); bestaande uit een microtitratieplaat waarvan de wanden van de putjes zijn bedekt met monoclonaal antilichaam A tegen HPL; ampullen met een gevriesdroogd mengsel van antilichamen B en C tegen HPL, gemerkt met het enzym peroxidase; en voorts uit hulpstoffen als wasbuffer, enzymsubstraat, controles en standaarden.

In het algemeen heeft de uitvinding betrekking op een testkit bestaande uit: * 1. één monoclonaal antilichaam, of enkele verschillende soorten monoclonale antilichamen gericht tegen hetzelfde antigeen, dat gemerkt is, resp. zijn, met een bepaalde label.

2. één monoclonaal antilichaam verschillend van 1., of enkele verschillende soorten monoclonale antilichamen gericht tegen hetzelfde antigeen, dat ofwel onoplosbaar gemaakt is resp. zijn, ofwel gemerkt is resp. zijn, met een bepaalde label.

3. andere gebruikelijke reagentia.

De volgende voorbeelden zijn bedoeld ter illustratie, en geenszins ter beperking van de uitvinding;

Voorbeeld 1 Zwangerschapstest

1 a. Bereiding van monoclonale antilichamen tegen HCG

Muizen (stam Balb/C) werden geïmmuniseerd met humaan chorionsgonadotrofine (HCG) met een.zuiverheid van 10000 IU/mg. Na ca. 6 weken werd van de milt een 7 celsuspensie bereid, waarvan vervolgens 8 x 10 cellen 7 werden gefuseerd met 2 x 10 myeloomcellen (P^ x 63 Ag/8/653) onder in de literatuur beschreven omstandigheden (Kohier en Milstein, Nature 256 (1975) 495).

Hybridomas werden opgekweekt in Dulbecco modified Eagle's medium met 10% foetaal kalfsserum, en onderzocht op anti-HCG productie. Antilichaamproducerende hybridomas werden minstens tweemaal hercloond.

8004308

\ . * w C

,· ' - 8 -

Grote hoeveelheden monoclonale antilichamen werden verkregen door de hybridomas terug te spuiten in de buikholte van muizen (stam Balb/C) en na 2-3 weken de ascites vloeistof te winnen.

1 b. Bereiding van met monoclonaal anti-HCG bedekte schape-erythrocyten

Schhpe-erythrocyten werden gestabiliseerd door for-malinebehandeling (Wide: Acte endocrinol. Suppl. 70 (1962),20, zoals gemodificeerd door Schuurs etal:

Acta endocrinol.59 (1968)120) en bedekt met monoclonale antilichamen in een concentratie van 0,2 mg/ml.

1 c. Reaktie met monoclonaal anti-HCG bedekte schape-erythrocyten met HCG en LH

Aan 0,5 ml van een 0,4% erythrocyten suspensie werd 0,025 ml van een oplossing van HCG of luteiniserend hormoon (LH) toegevoegd in een glazen buis met ronde bodem. De buisinhoud werd geschud, waarna de buis gedurende 2 uur trillingsvrij werd weggezet. Indien geen agglutinatie optrad, werd een donkerbruine ring zichtbaar op de bodem van de buis(-); brij agglutinatie ontstond een effen lichtbruine laag op de bodem van de buis (+).

De resultaten van verschillende combinaties van antilichamen met HCG en het kruisreagerende hormoon LH zijn weergegeven in Tabel 1.

Terwijl geen enkele erythrocyt alleen tot agglutinatie leidde, leverden verscheidene combinaties gevoelige en specifieke zwangerschapstests op.

^SbOO 43 08 τ " « * · ' - 9 -

Tabel 1 antilichamen gevoeligheid voor gevoeligheid HCG (IU/1) voor LH (IU/1) •A;B;C;D;E; > 300000 niet getest afzonderlijk A+B 200 >2000 A+D 200 >2000 A+E 200 >2000 B+C 200 >2000 C+E 300 >2000

Voorbeeld 2 Enzym-immunoassay voor prolactine 2 a. Bereiding van monodlonale antilichamen tegen prolactine(PRL)

De gebruikte methode was identiek aan die beschreven in voorbeeld la, waarbij uiteraard met prolactine werd geïmmuniseerd.

2 b. Bereiding van koppelingsproducten van monoclonaal anti-PRL met peroxidase.

De Ig-fractie van monoclonaal anti-PRL gewonnen uit muize ascites vleoistof werd gekoppeld aan het enzym mierikswortel peroxidase (HRP) met behulp van natrium-perjodaat, zoals beschreven door Nakane en Wilson (in: Immunofluorescence and Related Staining Techniques; Knapp, Holubar, Wick (Editors); Elsevier, Amsterdam, 1978).

,80 0 4 3 08

.,1 -e V

- 10 - 2 c. Bereiding van met monoclonaal anti- PRL bedekte micro-put jes

De putjes van polystyreen microtitreerplaten werden gevuld met 0,1 ml van een oplossing van de Ig-fractie van muize ascitesvleoistof (zie 2a) met een concentratie van δμς/πιΐ en overnacht bij kamertemperatuur geincubeerd. Daarna werden de putjes gewassen met fosfaat-buffer, die eveneens 0,1 % Tween-20 bevatte, gedroogd aan.de lucht gedurende 24 uur, en nagedroogd boven fosforpentoxide.

2d. Bepaling van PRL

: In de putjes van een met monoclonaal anti-PRL behandelde microtitreerplaat (zie 2c) werd 0,1 ml van oplossingen met verschillende gehalte aan PRL gebracht, waarna de putjes werden afgedekt en de plaat geincubeerd gedurende 2 uur bij 37°C. Hierna werden de putjes leeggezogen en 4 x gewassen met fosfaatbuffer met Tween-20.

Vervolgens werden de putjes gevuld met 0,1 ml van een oplossing van een monoclonaal anti-PRL-HRP koppelings-product (zie 2b), afgedekt en geincubeerd gedurende 2 uur bij 37°C. Na opnieuw leegzuigen en wassen werden de putjes gevuld met een oplossing van o-phenyleendiamine, 2 HC1 en ureumperoxide (substraat voor het enzym HRP).

Na 30 minuten incubatie werd de enzymreaktie gestopt door toevoegen van 0,1 ml 2 mol/1 zwavelzuur, en de extinctie werd gemeten bij 492 nm. Tenslotte werden dosis-responsiekrommen geconstrueerd door de gemeten extincties uit te zetten tegen de logaritme van de PRL-concentratie in de als eerste in de putjes gebrachte oplossingen, Een aantal van deze krommen, verkregen met verschillende monoclonale anti-PRL preparaten, zijm weergegeven in figuur 1.

\ \ \ 800 4 3 08 ' -if. 5»

V

- 11 -

Fl^u.ua. 1 3 - «g Π PRL-Eit) / 7 %ó m" / / (,0 ~ = — . ' * o--AA/Ui-1_: I_l-—I-!--- /0 2,0 *fo 3#t>

PRL- ίί^ΟΛύβι^αΛ^ίΑ, {/70.^ !syvtJl J

curve anti-PRL in anti-PRL in koppelingsproduct putje

1 A A

2 A B

3 B A

4 B B

Voorbeeld 3 Solpartiele immunoassay voor PAG

3 a. Bereiding van monoclonale antilichamen tegen PAG

De gebruikte methode was identiek aan die beschreven in voorbeeld la, waarbij uiteraard met pregnancy-associated glycoprotein (PAG) werd geïmmuniseerd.

3 b. Bereiding van een goudsol bedekt met monoclonaal anti-PAG

Goudsolen met een gemiddelde deeltjesgrootte van 60 nm werden bereid volgens de methode beschreven \ \ door Frens (Nature Phys. Sci. 241 (1973), 20) en j vervolgens bedekt met de Ig-fractie van muizeascites- 800 4 3 08 vloeistof (zie 3a) zoals beschreven door Leuvering, V .j'· w - 12 -

Thai, van der Waart en Schuurs (J. Immunoassay 1 (1980) 77). 3 c. Bepaling van PAG

Van de onder 3b bereide, met anti-PAG bedekte goudsol werd 0,9 ml gemengd met 0,1 ml van oplossingen met een verschillend gehalte aan PAG. De mengsels werden ge-incubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, waarna de extinctie werd gemeten bij S40 nm.

Dosis-responsiecurven werden verkregen door de gemeten extincties uit te zetten tegen de logaritme van de PAG-concentratie. Een aantal van deze krommen zijn weergegeven in figuur 2.

ÖPL ötUtA· %o" Ρββ-sp/fi o--VV>-*-1-1-h-I-- OA 0,3 t,d T>A 6>\ O C /'VK-Z) curve "

1 goudsol bedekt met anti-PAG A

2 goudsol bedekt met anti-PAG B

3 goudsol bedekt met mengsel van anti-PAG a en

anti-PAG B

% 4 mengsel van goudsol bedekt met anti-PAG A en goud- \ sol bedekt met anti-PAG B.

8004308 £· Γ - 13 -

Voorbeeld 4 latex aqqlutinatletest voor PAP 4 4 a. Bereiding van monoclonale antilichamen tegen humaan plasmine-antiplasminecomplex (PAP) werden bereid volgens de methode beschreven in voorbeeld la.

Alleen die monoclonale antilichamen werden gebruikt in de hierna beschreven experimenten die wel met het PAP-complex, maar niet met de afzonderlijke samenstellende delen(piasmine; antiplasmine) kunnen reageren.

4 b. Bereiding van latex bedekt met monoclonaal anti-PAP

Polystyreenlatex met een deeltjes diameter van 0,8μ werd bedekt met de Ig-fractie van muizeascitesvloeistof-fen die monoclonaal anti-PAP bevatten (zie voorbeeld 4a) volgens de methode van Singer en Plotz (Amer J. Med. 21 (1956) 888).

4 c. Bepaling van PAP

Op een glazen testplaatje van 4x4 cm werden 1 druppel anti-PAP latexsuspensie (zie voorbeeld 4b) en 1 druppel normaal humaan plasma(NHP) of met urokinase behandeld normaal humaan plasma(UNHP) gemengd en verspreid over een zo groot mogelijk oppervlak, waarna de vloeistof gedurende 3 minuten in rustige, gelijkmatige beweging werd gehouden. Zichtbare korreling van de latexsuspensie werd aangemerkt als een positief resultaat, het glad blijven van de suspensie als negatief. Een PAP-titer in een plasmamonster kon worden bepaald door een verdunningsreeks te testen, waarbij de hoogste verdunning die nog een positief resultaat gaf als de titer geldt.

. Voor het goede begrip diene dat NHP weinig of geen PAP bevat, en dat UNHP een maximale hoeveelheid PAP bevat. Een groot verschil tussen NHP-titer en UNHP-\ -titer is dus het gewenste resultaat.

8004308 - 14 - V ^

De resultaten met een aantal monoclonale antilichamen zijn weergegeven in Tabel 2. Hierin zijn weergegeven de resultaten van de mengsels van latex·»suspensies die elk zijn gecoat met slechts één monoclonaal anti-PAP, maar ook die van latex-suspensies die zijn gecoat met mengsels van 2 of 3 monoclonale anti-PAP's.

Tabel 2 PAP-latex agglutinatie A. Mengsel van latex suspensies die met één mnoclonaal anti-PAP zijn bedekt.

latex A latex B latex C

latex A NHPC16 NHP<16 NHP<16 U-NHPC16 U-NHP 128 U-NHP 128 latex B NHP<^16 nhp<16 U-NHP<1/16 U-NHP 256 latex C NHP<16 U—NHP<16

Een mengsel van gelijke delen latex A,B en C gaf een NHP toter van <16, terwijl de UNHP titer 512 bedroeg: B. Latex bedekt met mengsels van monoclonaal anti-PAP.

anti-PAP A B C

anti-PAP A NHP<16 NHP<16 NHP<16 UNHP<16 UNHP 256 UNHP 256 B NHP<16 NHP<16 UNHP<16 UNHP 256 \ c NHP<16 • UNHP<16 8004308 - 15 - . —^ λ"

Latex bedekt met een mengsel van anti-PAP's A,B en C ΐ leverden een UNHP titer van 512-1024 op, terwijl de , NHP titer < lé bleef.

j i 800 4 3 08

Claims (7)

1. Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van een immunochemische reactie, waarbij het antigeen een binding moet aangaan met tenminste twee anti-lichaam-moleculen, daardoor gekenmerkt, dat hierbij twee of meer verschillende soorten monoclonale antilichamen, gericht tegen hetzelfde antigeen, worden gebruikt.
2. Methode volgens conclusie 1, met als ke$erk dat gebruik wordt gemaakt van een reagens bestaande uit een mengsel van twee of meer partijen deeltjes, die elk zijn bedekt met een ander monoclonaal antilichaam tegen het te bepalen antigeen, en dat agglutineert in aanwezigheid van het antigeen.
3. Methode volgens conclusie 1, met als kenmerk dat gebruik -wordt gemaakt van een reagens bestaande uit deeltjes die zijn bedekt met een mengsel van twee of meer monoclonale antilichamen tegen het te bepalen antigeen en dat agglutineert in aanwezi gheid van het antigeen.
4. Methode volgens conclusie 1, met als kenmerk dat als reagentia zowel een onoplosbaar gemaakt monoclonaal antilichaam als een gemerkt monoclonaal antilichaam worden gebruikt, waarbij deze monoclonale antilichamen niet van dezelfde oorsprong zijn, en waarbij het te bepalen antigeen een binding teweegbrengt tussen de beide reagentia.
5. Methode volgens conclusie 1, met als kenmerk dat als h reagentia zowel een onoplosbaar gemaakt mengsel van 2 \ of meer verschillende monoclonale antilichamen, als een gemerkt mengsel van 2 of meer verschillende 8004308 ,*v ^ ---£ - 16 - monoclonale antilichamen worden gebruikt, waarbij het te bepalen antigeen een binding teweeg brengt tudsen de t beide reagentia.
6. Testkit, bestaande uit: a. één monoclonaal antilichaam, of enkele verschillende soorten monoclonale antilichamen, gericht tegen hetzelfde antigeen, dat gemerkt is resp. zijn met een bepaalde label. b. één monoclonaal antilichaam verschillend van a., of enkele verschillende soorten monoclonale antilichamen gericht tegen hetzelfde antigeen, dat ofwel onoplosbaar gemaakt is resp.zijn, ofwel gemerkt is resp. zijn met een bepaalde label. c. andere gebruikelijke reagentia.
7. Testkit, bestaande uit: a. een partij deeltjes, elk bedekt met verschillende monoclonale antilichamen, gericht tegen de verschillende, in het monster te bepalen antigenen, b. een partij deeltjes, elk bedekt met monoclonale antilichamen, gericht tegen dezelfde antigenen, waarbij deze antilichamen van een andere soort zijn dan die, genoemd onder a., c. andere gebruikelijke reagentia. f- . 800 4 3 08
NL8004308A 1980-07-28 1980-07-28 Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoklonale antilichamen alsmede immuunreagens. NL185309C (nl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8004308A NL185309C (nl) 1980-07-28 1980-07-28 Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoklonale antilichamen alsmede immuunreagens.
NL8004308 1980-07-28

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8004308A NL185309C (nl) 1980-07-28 1980-07-28 Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoklonale antilichamen alsmede immuunreagens.
DE8181200768T DE3167698D1 (en) 1980-07-28 1981-07-06 Method for the determination of antigens with the aid of two or more monoclonal antibodies
EP81200768A EP0045103B1 (en) 1980-07-28 1981-07-06 Method for the determination of antigens with the aid of two or more monoclonal antibodies
DK315081A DK163838B (da) 1980-07-28 1981-07-15 Fremgangsmaade til bestemmelse af antigener ved hjaelp af to monoklonale antistoffer og et proeveudstyr til brug ved denne fremgangsmaade
AU73078/81A AU549077B2 (en) 1980-07-28 1981-07-17 Determination of antigens with monoclonal antibodies
JP56116313A JPH0340341B2 (nl) 1980-07-28 1981-07-24
ES504285A ES504285A0 (es) 1980-07-28 1981-07-24 IMPROVEMENTS IN A METHOD AND ITS CORRESPONDING TEST EQUIPMENT TO DETERMINE ANTIGENS THROUGH AN IMMUNO-CHEMICAL REACTION
NLAANVRAGE8702777,A NL186407C (nl) 1980-07-28 1987-11-20 Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van drie verschillende soorten monoklonale antilichamen alsmede testverpakking voor deze bepaling.
NLAANVRAGE8702776,A NL188869B (nl) 1980-07-28 1987-11-20 Methode voor het bepalen van antigenen, alsmede testkit daarvoor.
DK61890A DK163840C (da) 1980-07-28 1990-03-08 Fremgangsmaade til bestemmelse af antigener ved hjaelp af to eller flere monoklonale antistoffer og proeveudstyr til brug ved fremgangsmaaden
DK61990A DK163839C (da) 1980-07-28 1990-03-08 Fremgangsmaade til bestemmelse af antigener ved hjaelp af tre eller flere monoklonale antistoffer, og et proeveudstyr til brug ved fremgangsmaaden
JP11417491A JPH06258325A (ja) 1980-07-28 1991-02-22 異なる2又は3種類のモノクローナル抗体を使用する 抗原測定法及び該モノクローナル抗体を利用した試験 キット
US08/164,581 US6391563B1 (en) 1980-07-28 1993-12-08 Method for the determination of antigens with the aid of three or more monoclonal antibodies

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NL8004308A true NL8004308A (nl) 1982-03-01
NL185309B NL185309B (nl) 1989-10-02
NL185309C NL185309C (nl) 1990-03-01

Family

ID=19835673

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8004308A NL185309C (nl) 1980-07-28 1980-07-28 Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoklonale antilichamen alsmede immuunreagens.
NLAANVRAGE8702777,A NL186407C (nl) 1980-07-28 1987-11-20 Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van drie verschillende soorten monoklonale antilichamen alsmede testverpakking voor deze bepaling.
NLAANVRAGE8702776,A NL188869B (nl) 1980-07-28 1987-11-20 Methode voor het bepalen van antigenen, alsmede testkit daarvoor.

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NLAANVRAGE8702777,A NL186407C (nl) 1980-07-28 1987-11-20 Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van drie verschillende soorten monoklonale antilichamen alsmede testverpakking voor deze bepaling.
NLAANVRAGE8702776,A NL188869B (nl) 1980-07-28 1987-11-20 Methode voor het bepalen van antigenen, alsmede testkit daarvoor.

Country Status (8)

Country Link
US (1) US6391563B1 (nl)
EP (1) EP0045103B1 (nl)
JP (2) JPH0340341B2 (nl)
AU (1) AU549077B2 (nl)
DE (1) DE3167698D1 (nl)
DK (3) DK163838B (nl)
ES (1) ES504285A0 (nl)
NL (3) NL185309C (nl)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2952816A (en) * 1955-10-21 1960-09-13 Gen Electric Limiting amplifier
GB2107053A (en) * 1980-06-20 1983-04-20 Unilever Plc Processes and apparatus for carrying out specific binding assays
EP0146654A3 (en) * 1980-06-20 1986-08-20 Unilever N.V. Processes and apparatus for carrying out specific binding assays
US6406920B1 (en) 1980-06-20 2002-06-18 Inverness Medical Switzerland Gmbh Processes and apparatus for carrying out specific binding assays
JPH0421819B2 (nl) * 1981-06-24 1992-04-14 Hybritech Inc
US4486530A (en) * 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4879219A (en) * 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US4837167A (en) * 1981-01-30 1989-06-06 Centocor, Inc. Immunoassay for multi-determinant antigens using high-affinity
JPH0370185B2 (nl) * 1982-01-26 1991-11-06 Green Cross Corp
GB2118300B (en) * 1982-02-12 1985-06-19 Corning Glass Works Method of immunoassay
US4511662A (en) * 1982-06-18 1985-04-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Simultaneous assay for T and B lymphocyte populations and subpopulations
JPS5954966A (en) * 1982-09-22 1984-03-29 Mochida Pharmaceut Co Ltd Immunological measuring reagent
JPS6080768A (en) * 1983-10-12 1985-05-08 Eisai Co Ltd Method and reagent for measuring basic fetal protein
US4595661A (en) * 1983-11-18 1986-06-17 Beckman Instruments, Inc. Immunoassays and kits for use therein which include low affinity antibodies for reducing the hook effect
US4690890A (en) * 1984-04-04 1987-09-01 Cetus Corporation Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay
US5011771A (en) * 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
JPH0736016B2 (ja) * 1984-05-11 1995-04-19 和光純薬工業株式会社 免疫グロブリンの定量方法
US4707438A (en) * 1984-08-22 1987-11-17 Tel Aviv University Immunoassay for breast cancer employing monoclonal antibodies
US4654298A (en) * 1984-10-05 1987-03-31 Abbott Laboratories Method for detection of peritoneal inflammation or infection
US4845197A (en) * 1985-09-09 1989-07-04 Agri-Diagnostics Associates Monoclonal antibodies and methods for fungal pathogen detection
JPH07119762B2 (ja) * 1986-04-09 1995-12-20 和光純薬工業株式会社 補体の定量方法
JP2591750B2 (ja) * 1986-06-26 1997-03-19 オ−ソ・ダイアグノステイツク・システムズ・インコ−ポレ−テツド 免疫分析システム
EP0271810B1 (en) * 1986-12-15 1994-03-09 Teijin Limited Immunological determination of free human protein s and c4bp-protein s complex
US5187067A (en) * 1986-12-15 1993-02-16 Teijin Limited Immunological determination of free human protein S and C4bp-protein S complex
US5179000A (en) * 1987-07-24 1993-01-12 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Method for assaying basic fetoprotein in urine and assay kit therefor
JPH01163661A (en) * 1987-10-02 1989-06-27 E I Du Pont De Nemours & Co Immunoassay using immuno-globulin g capturing antibody and multiple monoclonal antibody detection system
US4859612A (en) * 1987-10-07 1989-08-22 Hygeia Sciences, Inc. Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite
JPH01301165A (en) * 1988-05-30 1989-12-05 Sekisui Chem Co Ltd Immunoassay
DE3929119A1 (de) * 1989-09-01 1991-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis von analyten
JPH03118472A (en) * 1989-09-29 1991-05-21 Sekisui Chem Co Ltd Insulin assay and reagent therefor
US5447846A (en) * 1992-07-17 1995-09-05 Fuji Photo Film C., Ltd. Homogeneous Immunoassay process using covalent conjugate of enzyme and plural monoclonal antibodies for different epitopes on analyte
JP2709296B2 (ja) * 1996-05-27 1998-02-04 オリンパス光学工業株式会社 免疫学的分析方法
JP3652029B2 (ja) * 1996-10-16 2005-05-25 積水化学工業株式会社 高感度免疫測定法
EP2042870A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-01 Fujifilm Corporation Method of high sensitive immunoassay
GB0820999D0 (en) * 2008-11-17 2008-12-24 Menon Johansson Anatole S Pregnancy testing

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3654090B1 (nl) 1968-09-24 1982-07-20
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
FI64952C (fi) * 1977-06-15 1984-02-10 Wistar Inst Foerfarande foer framstaellning av genetiskt stabila cellinjer
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4115535A (en) * 1977-06-22 1978-09-19 General Electric Company Diagnostic method employing a mixture of normally separable protein-coated particles
US4191739A (en) * 1977-10-17 1980-03-04 General Electric Company Antigen-antibody reaction assay employing particle aggregation and resistive pulse analysis
US4244940A (en) * 1978-09-05 1981-01-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Single-incubation two-site immunoassay
EP0038642B1 (en) * 1980-04-09 1989-02-08 National Research Development Corporation A monoclonal antibody against hepatitis b and its production, a hybridoma producing the monoclonal antibody and compositions containing it, the propagation of the hybridoma and the monoclonal antibody for use as an antiviral agent against hepatitus b and in isolating hepatitus b surface antigen from a sample
CH642458A5 (en) * 1980-04-25 1984-04-13 Hoffmann La Roche Immunological method
US4361647A (en) * 1980-05-22 1982-11-30 Palo Alto Medical Research Foundation Sandwich immunoassay and compositions for use therein
GB2107053A (en) * 1980-06-20 1983-04-20 Unilever Plc Processes and apparatus for carrying out specific binding assays
US4486530A (en) * 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
NL185309B (nl) 1989-10-02
DK61890A (da) 1990-03-08
ES504285A0 (es) 1982-08-16
NL185309C (nl) 1990-03-01
JPH0340341B2 (nl) 1991-06-18
DK61990A (da) 1990-03-08
DK163840C (da) 1992-08-24
JPH06258325A (ja) 1994-09-16
JPS5786051A (en) 1982-05-28
DE3167698D1 (en) 1985-01-24
NL186407B (nl) 1990-06-18
DK61890D0 (da) 1990-03-08
NL8702776A (nl) 1988-03-01
EP0045103A3 (en) 1982-02-10
NL8702777A (nl) 1988-03-01
DK163840B (da) 1992-04-06
ES8206856A1 (es) 1982-08-16
DK163838B (da) 1992-04-06
ES504285D0 (nl)
DK61990D0 (da) 1990-03-08
DK163839B (da) 1992-04-06
NL186407C (nl) 1990-11-16
US6391563B1 (en) 2002-05-21
AU549077B2 (en) 1986-01-16
AU7307881A (en) 1982-02-04
EP0045103B1 (en) 1984-12-12
NL188869B (nl) 1992-05-18
DK163839C (da) 1992-08-24
DK315081A (da) 1982-01-29
EP0045103A2 (en) 1982-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Uotila et al. Two-site sandwich enzyme immunoassay with monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein
Crowther ELISA: theory and practice
US4474892A (en) Two-site immunoassays using monoclonal antibodies of different classes or subclasses and test kits for performing same
US4690890A (en) Process for simultaneously detecting multiple antigens using dual sandwich immunometric assay
ES2103803T5 (es) Metodo inmunocromatografico.
JP2701949B2 (ja) 試験方法およびそのための試薬キツト
FI91566C (fi) Laite solumateriaaliin liittyneen kohdeligandin määrittämiseksi
US5610077A (en) Processes and apparatus for carrying out specific binding assays
EP0349215B1 (en) Method and cell for detection
JP3479100B2 (ja) 免疫化学的簡易半定量方法および装置
JP2977616B2 (ja) 免疫化学的検査装置
EP0250137B1 (en) Colloidal gold immunoassay
US6699722B2 (en) Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes
EP0299428B2 (en) Process for immunochromatography with colloidal particles
US5006464A (en) Directed flow diagnostic device and method
US4378344A (en) Method and apparatus for performing multiple, simultaneous in vitro diagnostic tests using a solid phase system
US4469787A (en) Immunoassay involving soluble complex of second antibody and labeled binding protein
JP2562194B2 (ja) 数種の被検物質の環境内濃度の定量
JP4559729B2 (ja) 妊娠検出方法
Kingan A competitive enzyme-linked immunosorbent assay: applications in the assay of peptides, steroids, and cyclic nucleotides
CA1128856A (en) Simultaneous heterogeneous specific binding assay of different ligands in a single sample
JP4744147B2 (ja) アフィニティー精製抗体を用いた甲状腺刺激ホルモン受容体自己抗体の同定
US4228237A (en) Methods for the detection and determination of ligands
JP3364537B2 (ja) 非競合結合検定方法
CA1261745A (en) Methods of assay

Legal Events

Date Code Title Description
A1B A search report has been drawn up
A85 Still pending on 85-01-01
BC A request for examination has been filed
V4 Lapsed because of reaching the maximum lifetime of a patent

Free format text: 20000728