NL8004308A - Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van twee of meer monoclonale antilichamen. - Google Patents

Description

£ S - V

oa/8062-081 Douma

Akzo N.V. te Arnhem.

Methode voor het bepalen van antiqenen met behulp van twee of meer monoclonale antilichamen.

Het i-s sinds veie jaren bekend dat gevoelige en specifieke bepalingsmethoden voor vele stoffen kunnen worden ontwikkeld die berusten op een immunochemische reaktie, d.w.z. een reaktie tussen twee of meer immunocomponenten, zoals bijvoorbeeld tussen antigeen en antilichaam.

Hierbij is een antigeen een stof die, indien ingespoten in een dier, waarvoor het antigeen in kwestie lichaams-vreemd is, aanleiding geeft tot het ontstaan van een immunologische afweerreaktie, en een antilichaam een eiwitmolecuul (een zgn. immunoglobuline) dat als reaktie op het binnendringen van het antigeen wordt gevormd door het dier, dat in het bloed voorkomt en dat een specifieke binding kan aangaan met het antigeen waartegen het is gericht. Hoewel dit mechanisme in principe is bedoeld als afweermechanisme tegen schadelijke stoffen die een levend organisme binnendringen (bv. een virusinfectie), kan het worden gebruikt voor het opwekken van antilichamen tegen elk willekeurig antigeen. De mate van schadelijkheid van het antigeen doet niet terzake. Het bloedserum van zulk een dier, of antilichamen houdende fracties daarvan, kan worden gebruikt als een reagens voor het antigeen.

Zeer veel stoffen van verschillende structuur kunnen als antigeen fungeren.

Zo zijn in proefdieren antilichamen opgewekt tegen vrijwel alle soorten eiwitmoleculen, tegen glycoproteinen, tegen bepaalde koolhydraten, lipiden en, na het toepassen van bepaalde kunstgrepen, zelfs tegen laagmoleculaire stoffen als steroidhormonen en prostaglandines.

Dit betekent dat voor al deze stofklassen immunochemische bepalingsmethoden kunnen worden ontwikkeld.

8004308 4 » ’ \ - 2 -

Hoewel reeds op basis van een simpele precipatie van antigeen door antilichaam een immunochemische bepalingsmethode voor het antigeen kan worden ontwikkeld, wendt men zich gewoonlijk tot verfijndere methoden om ten volle profijt te kunnen trekken van de mogelijkheden die de immunochemische reaktie biedt qua specifiteit en gevoeligheid. Veelal wordt hierbij het antigeen of antilichaam molecuul voorzien van een merker, die het optreden van de antigeen-antiliChaam binding op een eenvoudige wijze zichtbaar of meetbaar maakt.

Als merkers zijn onder meer gebruikt rode bloedlichaampjes (haemagglutinatie reaktie), polystyreen latex bolletjes (latex agglutinatie reaktie), metaalsol deeltjes, fijn gesuspendeerde kleurstofdeeltjes, en - veelal in combinatie met onoplosbaar gemaakte antilichaammoleculen - radioisotopen, enzymen en fluorescerende stoffen.

Als algemeen kenmerk van het bedoelde soort immunochemische bepalingen wordt gezien dat het te bepalen antigeenmolecuul een binding aangaat met tenminste twee antilichamenraoleculen.

De klassieke wijze van opwekken van antilichamen - het injecteren van een proefdier met antigeen — leidt gewoonlijk tot een zeer heterogene immuunrespons. Men mag aannemen dat bij deze procedure in het proefdier verschillende populaties antilichaamvormende cellen (lymfocyten) worden gestimuleerd, die elk hun eigen soort antilichaam met unieke structuur, affiniteit en specifiteit produceren. Het blijkt bovendien dat in een proefdier in de loop der tijd verschillende populaties lymfocyten de overhand kunnen krijgen. Dit leidt ertoe dat het niet alleen uiterst moeilijk is uit verschillende proefdieren antilichaamhoudende bloedsera (antisera) van vergelijkbare kwaliteit te verkrijgen, maar dat ook antiserum-monsters, verkregen uit hetzelfde proefdier op verschillende tijdstippen, zeer verschillend van elkaar zullen zijn.

Sinds enkele jaren is het nu mogelijk volstrekt homogene antilichamen te verkrijgen in practisch ongelimiteerde hoeveelheden.

8004308 - 3 - * * * %

Hiertoe wordt gebruik gemaakt van een celvrij systeem of een gemodificeerd organisme, waarbij genetisch materiaal, coderend voor de gewenste antigeenspecifieke globulines, tot expressie wordt gebracht, bijvoorbeeld door: a) Celfusie

Hiertoe wordt een antilichaam-producerende cel samengebracht met een continu-groeiende cellijn,bijvoorbeeld een lymfocytcel, die tot tumorcel is verworden (myeloma cellijn). Zowel spontaan als onder invloed van bepaalde stoffen, zoals polyethyleenglycol of lecithine, vindt celfusie plaats, waardoor als fusieproduct een zgn. hybridoma ontstaat, die zowel het vermogen heeft van antilichaamproductie van de ene cel, als het continue groeipotentieel van de andere samenstellende cel.

b) Transformatie 1. antilichaam-producerende cellen, al dan niet door trans-duktie, worden tot continue groei gebracht.

2. geïsoleerde en/of geheel dan wel gedeeltelijk synthetisch bereide nucleinezuurvolgordes worden in de gewenste gastheercel gebracht.

c) Mutatie

Door chemische of fysische behandeling van de antilichaam-producerende cel.

Eventueel kunnen ook combinaties van bovengenoemde methoden worden toegepast.

Voor elke afzonderlijke cellijn zijn de geproduceerde antilichamen a*lle gelijk aan die, geproduceerd door de oorspronkelijke antilichaam-producerende cel. Ze zijn dus volstrekt homogeen. Daar ze zijn ontstaan uit de ene, ' oorspronkelijke antilichaam-producerende cel, spreekt men van monoclonale antilichamen.

Monoclonale antilichamen zijn door hun homogeniteit en door de eenvoudige manier waarop ze in "onbeperkte" hoeveelheden kunnen worden geproduceerd in principe bijzonder gecshikt als reagens in de eerder beschreven immunochemische bepalingsmethoden.

8004308 - 4 - , , * 1 >

Het is echter gebleken dat monoclonale antilichamen vaak niet reageren in testmethoden waarin "klassieke" antilichamen wel werkzaam .zijn; monoclonale antilichamen vormen geen precipitaafc Wet hun corresponderend antigeen; met monoclonale antilichamen bedekte deeltjes (erythrocyten, latexbolletjes, metaal-deeltjes) agglutineren niet in aanwezigheid van corresponderend antigeen; monoclonale antilichamen gemerkt met een radioisotoop, een enzym, een metaaldeeltje, enz. binden niet aan een vaste fase die bedekt is met de monoclonale antilichamen in aanwezigheid van het corresponderend antigeen. Dit alles staat in tegenstelling tot het gedrag van “klassieke" antilichamen.

Gevonden werd nu een methode voor het bepalen van een antigeen met behulp van een immunochemische reactie, waarbij het antigeen een binding moet aangaan met tenminste twee antilichaam-moleculen, daardoor gekenmerkt, dat hierbij twee of meer verschillende soorten monoqlonale antilichamen, gericht tegen hetzelfde, antigeen, worden gebruikt.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op testkitten, die voor de hiervoor beschreven bepalingsmethoden gebruikt worden.

Cellijnen, die monoclonale antilichamen tegen hetzelfde antigeen produceren kunnen op diverse wijzen worden verkregen. Zo verkrijgt men bij celfusie gewoonlijk bij één fusie-experiment 10-100 hybridoma lijnen die elk een antilichaam van verschillende specifiteit en affiniteit produceren. Het is raadzaam deze cellijnen nader te karakteriseren, om een optimale combinatie voor een immunochemisch testsysteem te kunnen selecteren.

De monoclonale antilichamen kunnen op verschillende, bekende wijzen tot reagentia voor immunochemische bepalingsmethoden worden verwerkt. Zo kunnen ze bijvoorbeeld door fysische absorptie of door covalente binding worden gebonden aan'het oppervlak van geformaliniseerde erythrocyten of van polystyreen .latexbolletjes van verschillende diameters 8804308 * ί * - 5 - om zo als reagens te dienen in een omgekeerde passieve haemagglutinatietest of latexagglutinatietest. Ook kunnen:.ze door fysische absorptie of door insluiting worden gebonden aan deeltjes van een metaalsol voor gebruik in een homogene of heterogene soldeeltjes immuunbepaling* Daarnaast kunnen ze op analoge wijze worden gebruikt in een kleurstofdeeltjes immuunbepaling, die bovendien de mogelijkheid van covalente binding biedt.

Ook kunnen monoclonale antilichamen op bekende chemische of fysische wijze worden gebonden aan..vaste dragers, zoals de wand van een kunstof reageerbuis, kunststof knikkers of andere objecten, cellulose of sepharose deeltjes, etc. om te dienen als vaste fase in zgn. sandwich assays.

Daarbij dienen tevens monoclonale antilichamen te worden gebruikt die zijn gemerkt met bv* een radioisotoop, een enzym, een fluorofoor of een metaalsoldeeltje, om het ontstaan van een antigeen-antilichaam binding te kunnen vaststellen. Voor al deze procedures zijn talloze methoden in de vakliteratuur beschreven, die zonder meer voor monoclonale antilichamen kunnen worden toegepast.

Combinaties van twee of meer monoclonale antilichamen kunnen op diverse manieren worden verkregen. Zo kan bv. een reagens voor omgekeerde passieve haemagglutinatie worden bereid door antilichamen uit twee of meer hybridomas te mengen en vervolgens te gebruiken voor het bedekken van erythrocyten, zodat #lke erythrocyt verschillende anti-lichaam moleculen draagt, maar eveneens kunnen afzonderlijke partijen erythrocyten worden bedekt met elk één monoclonaal antilichaam, waarna deze partijen in een optimale verhouding worden gemengd. Zo ook kan bv. een "sandwich” radioimmunoassay worden verkregen door een vaste drager te bedekken met monoclonaal antilichaam A en een monoclonaal antilichaam 125 B te merken met I, maar ook door een mengsel van antilichamen A en B te gebruiken voor zowel het bedekken van 125 de vaste drager als voor het merken met I. Op soortgelijke manieren is een veelheid van mogelijkheden voor 80 0 4 3 08 - 6 - andere testmethodieken denkbaar.

Het selecteren van een werkzame combinatie van twee of meer monoclonale antilichamen voor gebruik in immunochemische bepalingsmethode) als eerder omschreven vereist enige zorg.

Niet alleen zal niet iedere willekeurige combinatie van twee of meer antilichamen voldoen aan redelijke eisen van gevoeligheid en specifiteit, het is zelfs mogelijk dat zo’n combinatie in het geheel niet werkzaam zal zijn.

Het vinden van de beste combinatie berust uitsluitend op > empirie. In het ideale geval beschikt men over een grote collectie monoclonale antilichamen tegen een beperkt antigeen. Deze wordt onderzocht in alle mogelijke combinaties, waarna men die combinatie uitkiest, die betrouwbare, gevoelige en specifieke resultaten oplevert.

De werkwijze volgens de uitvinding is ook in het bijzonder geschikt voor het screenen van monsters op de aanwezigheid van verschillende antigenen. Daartoe wordt een reagens samengesteld uit deeltjes, zoals erythrocyten, latexbolletjes of kunststofbolletjes, elk gecoat met verschillende monoclo- t nale antilichamen gericht tegen de verschillende, in het monster te detecteren antigenen, en uit deeltjes, elk gecoat met monoclonale antilichamen gericht tegen dezelfde antigenen, naar waarbij de laatstgenoemde antilichamen van een ander soort zijn dan de eerstgenoemde.

De beschreven combinaties van monoclonale antilichamen, al dan niet verwerkt tot reagentia (zoals met antilichaam bedekte deeltjes of oppervlakken, of met enzym gemerkte antilichamen), laten zich uitstekend verwerken tot immunochemische testkits: combinaties van reagentia die, mits gebruikt volgens het voorgeschreven protocol, leiden tot testmethoden van gespecificeerde gevoeligheid en betrouwbaarheid. Zulke kits kunnen bv. als volgt zijn samengesteld: een zwangerschapstestkit bestaande uit een mengsel van schape-erythrocyten bedekt met monoclonale antilichamen A tegen humaan choriongonadotrofine (HCG) en scfiape—ery throcy ten bedekt met monoclonale antilichamen B tegen HCG, gevriesdroogd 8004308 « ' * * : - 7 - in een glazen ampul met ronde bodem die tegelijk dienst doet als sedimentatiebuis voor de test, of een testkit voor de bepaling van humaan placentair lactogeen hormoon (HPL); bestaande uit een microtitratieplaat waarvan de wanden van de putjes zijn bedekt met monoclonaal antilichaam A tegen HPL; ampullen met een gevriesdroogd mengsel van antilichamen B en C tegen HPL, gemerkt met het enzym peroxidase; en voorts uit hulpstoffen als wasbuffer, enzymsubstraat, controles en standaarden.

In het algemeen heeft de uitvinding betrekking op een testkit bestaande uit: * 1. één monoclonaal antilichaam, of enkele verschillende soorten monoclonale antilichamen gericht tegen hetzelfde antigeen, dat gemerkt is, resp. zijn, met een bepaalde label.

2. één monoclonaal antilichaam verschillend van 1., of enkele verschillende soorten monoclonale antilichamen gericht tegen hetzelfde antigeen, dat ofwel onoplosbaar gemaakt is resp. zijn, ofwel gemerkt is resp. zijn, met een bepaalde label.

3. andere gebruikelijke reagentia.

De volgende voorbeelden zijn bedoeld ter illustratie, en geenszins ter beperking van de uitvinding;

Voorbeeld 1 Zwangerschapstest

1 a. Bereiding van monoclonale antilichamen tegen HCG

Muizen (stam Balb/C) werden geïmmuniseerd met humaan chorionsgonadotrofine (HCG) met een.zuiverheid van 10000 IU/mg. Na ca. 6 weken werd van de milt een 7 celsuspensie bereid, waarvan vervolgens 8 x 10 cellen 7 werden gefuseerd met 2 x 10 myeloomcellen (P^ x 63 Ag/8/653) onder in de literatuur beschreven omstandigheden (Kohier en Milstein, Nature 256 (1975) 495).

Hybridomas werden opgekweekt in Dulbecco modified Eagle's medium met 10% foetaal kalfsserum, en onderzocht op anti-HCG productie. Antilichaamproducerende hybridomas werden minstens tweemaal hercloond.

8004308

\ . * w C

,· ' - 8 -

Grote hoeveelheden monoclonale antilichamen werden verkregen door de hybridomas terug te spuiten in de buikholte van muizen (stam Balb/C) en na 2-3 weken de ascites vloeistof te winnen.

1 b. Bereiding van met monoclonaal anti-HCG bedekte schape-erythrocyten

Schhpe-erythrocyten werden gestabiliseerd door for-malinebehandeling (Wide: Acte endocrinol. Suppl. 70 (1962),20, zoals gemodificeerd door Schuurs etal:

Acta endocrinol.59 (1968)120) en bedekt met monoclonale antilichamen in een concentratie van 0,2 mg/ml.

1 c. Reaktie met monoclonaal anti-HCG bedekte schape-erythrocyten met HCG en LH

Aan 0,5 ml van een 0,4% erythrocyten suspensie werd 0,025 ml van een oplossing van HCG of luteiniserend hormoon (LH) toegevoegd in een glazen buis met ronde bodem. De buisinhoud werd geschud, waarna de buis gedurende 2 uur trillingsvrij werd weggezet. Indien geen agglutinatie optrad, werd een donkerbruine ring zichtbaar op de bodem van de buis(-); brij agglutinatie ontstond een effen lichtbruine laag op de bodem van de buis (+).

De resultaten van verschillende combinaties van antilichamen met HCG en het kruisreagerende hormoon LH zijn weergegeven in Tabel 1.

Terwijl geen enkele erythrocyt alleen tot agglutinatie leidde, leverden verscheidene combinaties gevoelige en specifieke zwangerschapstests op.

^SbOO 43 08 τ " « * · ' - 9 -

Tabel 1 antilichamen gevoeligheid voor gevoeligheid HCG (IU/1) voor LH (IU/1) •A;B;C;D;E; > 300000 niet getest afzonderlijk A+B 200 >2000 A+D 200 >2000 A+E 200 >2000 B+C 200 >2000 C+E 300 >2000

Voorbeeld 2 Enzym-immunoassay voor prolactine 2 a. Bereiding van monodlonale antilichamen tegen prolactine(PRL)

De gebruikte methode was identiek aan die beschreven in voorbeeld la, waarbij uiteraard met prolactine werd geïmmuniseerd.

2 b. Bereiding van koppelingsproducten van monoclonaal anti-PRL met peroxidase.

De Ig-fractie van monoclonaal anti-PRL gewonnen uit muize ascites vleoistof werd gekoppeld aan het enzym mierikswortel peroxidase (HRP) met behulp van natrium-perjodaat, zoals beschreven door Nakane en Wilson (in: Immunofluorescence and Related Staining Techniques; Knapp, Holubar, Wick (Editors); Elsevier, Amsterdam, 1978).

,80 0 4 3 08

.,1 -e V

- 10 - 2 c. Bereiding van met monoclonaal anti- PRL bedekte micro-put jes

De putjes van polystyreen microtitreerplaten werden gevuld met 0,1 ml van een oplossing van de Ig-fractie van muize ascitesvleoistof (zie 2a) met een concentratie van δμς/πιΐ en overnacht bij kamertemperatuur geincubeerd. Daarna werden de putjes gewassen met fosfaat-buffer, die eveneens 0,1 % Tween-20 bevatte, gedroogd aan.de lucht gedurende 24 uur, en nagedroogd boven fosforpentoxide.

2d. Bepaling van PRL

: In de putjes van een met monoclonaal anti-PRL behandelde microtitreerplaat (zie 2c) werd 0,1 ml van oplossingen met verschillende gehalte aan PRL gebracht, waarna de putjes werden afgedekt en de plaat geincubeerd gedurende 2 uur bij 37°C. Hierna werden de putjes leeggezogen en 4 x gewassen met fosfaatbuffer met Tween-20.

Vervolgens werden de putjes gevuld met 0,1 ml van een oplossing van een monoclonaal anti-PRL-HRP koppelings-product (zie 2b), afgedekt en geincubeerd gedurende 2 uur bij 37°C. Na opnieuw leegzuigen en wassen werden de putjes gevuld met een oplossing van o-phenyleendiamine, 2 HC1 en ureumperoxide (substraat voor het enzym HRP).

Na 30 minuten incubatie werd de enzymreaktie gestopt door toevoegen van 0,1 ml 2 mol/1 zwavelzuur, en de extinctie werd gemeten bij 492 nm. Tenslotte werden dosis-responsiekrommen geconstrueerd door de gemeten extincties uit te zetten tegen de logaritme van de PRL-concentratie in de als eerste in de putjes gebrachte oplossingen, Een aantal van deze krommen, verkregen met verschillende monoclonale anti-PRL preparaten, zijm weergegeven in figuur 1.

\ \ \ 800 4 3 08 ' -if. 5»

V

- 11 -

Fl^u.ua. 1 3 - «g Π PRL-Eit) / 7 %ó m" / / (,0 ~ = — . ' * o--AA/Ui-1_: I_l-—I-!--- /0 2,0 *fo 3#t>

PRL- ίί^ΟΛύβι^αΛ^ίΑ, {/70.^ !syvtJl J

curve anti-PRL in anti-PRL in koppelingsproduct putje

1 A A

2 A B

3 B A

4 B B

Voorbeeld 3 Solpartiele immunoassay voor PAG

3 a. Bereiding van monoclonale antilichamen tegen PAG

De gebruikte methode was identiek aan die beschreven in voorbeeld la, waarbij uiteraard met pregnancy-associated glycoprotein (PAG) werd geïmmuniseerd.

3 b. Bereiding van een goudsol bedekt met monoclonaal anti-PAG

Goudsolen met een gemiddelde deeltjesgrootte van 60 nm werden bereid volgens de methode beschreven \ \ door Frens (Nature Phys. Sci. 241 (1973), 20) en j vervolgens bedekt met de Ig-fractie van muizeascites- 800 4 3 08 vloeistof (zie 3a) zoals beschreven door Leuvering, V .j'· w - 12 -

Thai, van der Waart en Schuurs (J. Immunoassay 1 (1980) 77). 3 c. Bepaling van PAG

Van de onder 3b bereide, met anti-PAG bedekte goudsol werd 0,9 ml gemengd met 0,1 ml van oplossingen met een verschillend gehalte aan PAG. De mengsels werden ge-incubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, waarna de extinctie werd gemeten bij S40 nm.

Dosis-responsiecurven werden verkregen door de gemeten extincties uit te zetten tegen de logaritme van de PAG-concentratie. Een aantal van deze krommen zijn weergegeven in figuur 2.

ÖPL ötUtA· %o" Ρββ-sp/fi o--VV>-*-1-1-h-I-- OA 0,3 t,d T>A 6>\ O C /'VK-Z) curve "

1 goudsol bedekt met anti-PAG A

2 goudsol bedekt met anti-PAG B

3 goudsol bedekt met mengsel van anti-PAG a en

anti-PAG B

% 4 mengsel van goudsol bedekt met anti-PAG A en goud- \ sol bedekt met anti-PAG B.

8004308 £· Γ - 13 -

Voorbeeld 4 latex aqqlutinatletest voor PAP 4 4 a. Bereiding van monoclonale antilichamen tegen humaan plasmine-antiplasminecomplex (PAP) werden bereid volgens de methode beschreven in voorbeeld la.

Alleen die monoclonale antilichamen werden gebruikt in de hierna beschreven experimenten die wel met het PAP-complex, maar niet met de afzonderlijke samenstellende delen(piasmine; antiplasmine) kunnen reageren.

4 b. Bereiding van latex bedekt met monoclonaal anti-PAP

Polystyreenlatex met een deeltjes diameter van 0,8μ werd bedekt met de Ig-fractie van muizeascitesvloeistof-fen die monoclonaal anti-PAP bevatten (zie voorbeeld 4a) volgens de methode van Singer en Plotz (Amer J. Med. 21 (1956) 888).

4 c. Bepaling van PAP

Op een glazen testplaatje van 4x4 cm werden 1 druppel anti-PAP latexsuspensie (zie voorbeeld 4b) en 1 druppel normaal humaan plasma(NHP) of met urokinase behandeld normaal humaan plasma(UNHP) gemengd en verspreid over een zo groot mogelijk oppervlak, waarna de vloeistof gedurende 3 minuten in rustige, gelijkmatige beweging werd gehouden. Zichtbare korreling van de latexsuspensie werd aangemerkt als een positief resultaat, het glad blijven van de suspensie als negatief. Een PAP-titer in een plasmamonster kon worden bepaald door een verdunningsreeks te testen, waarbij de hoogste verdunning die nog een positief resultaat gaf als de titer geldt.

. Voor het goede begrip diene dat NHP weinig of geen PAP bevat, en dat UNHP een maximale hoeveelheid PAP bevat. Een groot verschil tussen NHP-titer en UNHP-\ -titer is dus het gewenste resultaat.

8004308 - 14 - V ^

De resultaten met een aantal monoclonale antilichamen zijn weergegeven in Tabel 2. Hierin zijn weergegeven de resultaten van de mengsels van latex·»suspensies die elk zijn gecoat met slechts één monoclonaal anti-PAP, maar ook die van latex-suspensies die zijn gecoat met mengsels van 2 of 3 monoclonale anti-PAP's.

Tabel 2 PAP-latex agglutinatie A. Mengsel van latex suspensies die met één mnoclonaal anti-PAP zijn bedekt.

latex A latex B latex C

latex A NHPC16 NHP<16 NHP<16 U-NHPC16 U-NHP 128 U-NHP 128 latex B NHP<^16 nhp<16 U-NHP<1/16 U-NHP 256 latex C NHP<16 U—NHP<16

Een mengsel van gelijke delen latex A,B en C gaf een NHP toter van <16, terwijl de UNHP titer 512 bedroeg: B. Latex bedekt met mengsels van monoclonaal anti-PAP.

anti-PAP A B C

anti-PAP A NHP<16 NHP<16 NHP<16 UNHP<16 UNHP 256 UNHP 256 B NHP<16 NHP<16 UNHP<16 UNHP 256 \ c NHP<16 • UNHP<16 8004308 - 15 - . —^ λ"

Latex bedekt met een mengsel van anti-PAP's A,B en C ΐ leverden een UNHP titer van 512-1024 op, terwijl de , NHP titer < lé bleef.

j i 800 4 3 08

Claims (7)

1. Methode voor het bepalen van antigenen met behulp van een immunochemische reactie, waarbij het antigeen een binding moet aangaan met tenminste twee anti-lichaam-moleculen, daardoor gekenmerkt, dat hierbij twee of meer verschillende soorten monoclonale antilichamen, gericht tegen hetzelfde antigeen, worden gebruikt.

2. Methode volgens conclusie 1, met als ke$erk dat gebruik wordt gemaakt van een reagens bestaande uit een mengsel van twee of meer partijen deeltjes, die elk zijn bedekt met een ander monoclonaal antilichaam tegen het te bepalen antigeen, en dat agglutineert in aanwezigheid van het antigeen.

3. Methode volgens conclusie 1, met als kenmerk dat gebruik -wordt gemaakt van een reagens bestaande uit deeltjes die zijn bedekt met een mengsel van twee of meer monoclonale antilichamen tegen het te bepalen antigeen en dat agglutineert in aanwezi gheid van het antigeen.

4. Methode volgens conclusie 1, met als kenmerk dat als reagentia zowel een onoplosbaar gemaakt monoclonaal antilichaam als een gemerkt monoclonaal antilichaam worden gebruikt, waarbij deze monoclonale antilichamen niet van dezelfde oorsprong zijn, en waarbij het te bepalen antigeen een binding teweegbrengt tussen de beide reagentia.

5. Methode volgens conclusie 1, met als kenmerk dat als h reagentia zowel een onoplosbaar gemaakt mengsel van 2 \ of meer verschillende monoclonale antilichamen, als een gemerkt mengsel van 2 of meer verschillende 8004308 ,*v ^ ---£ - 16 - monoclonale antilichamen worden gebruikt, waarbij het te bepalen antigeen een binding teweeg brengt tudsen de t beide reagentia.

6. Testkit, bestaande uit: a. één monoclonaal antilichaam, of enkele verschillende soorten monoclonale antilichamen, gericht tegen hetzelfde antigeen, dat gemerkt is resp. zijn met een bepaalde label. b. één monoclonaal antilichaam verschillend van a., of enkele verschillende soorten monoclonale antilichamen gericht tegen hetzelfde antigeen, dat ofwel onoplosbaar gemaakt is resp.zijn, ofwel gemerkt is resp. zijn met een bepaalde label. c. andere gebruikelijke reagentia.

7. Testkit, bestaande uit: a. een partij deeltjes, elk bedekt met verschillende monoclonale antilichamen, gericht tegen de verschillende, in het monster te bepalen antigenen, b. een partij deeltjes, elk bedekt met monoclonale antilichamen, gericht tegen dezelfde antigenen, waarbij deze antilichamen van een andere soort zijn dan die, genoemd onder a., c. andere gebruikelijke reagentia. f- . 800 4 3 08