JPH02501948A - 粒子含有試料中の分析物の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イムノアッセイは配位子結合アッセイの１つのタイプであり、そして分析物（検 出されている試料の物質または化学的構成体）の存在および量を決定するために 広く使用されている。凝集イムノアッセイは、免疫化学的反応が粒子、例えば、 赤血球またはポリマーのラテックス粒子の凝集を生ずる、１つのタイプのイムノ アッセイである。凝集を起こす１つの手段として免疫化学的反応を使用すること は、次の文献に記載されているように、多くの分析物の決定における用途を見い だしている：ニコルス（Ｎｉｃｈｏ　１　ｓ）、Ｗ、Ｓ、およびＲ，Ｍ、ナカム ラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）、「凝集および凝集阻害アッセイ（Ａｇｇｌｕｔｉｎａ ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎＡｓ　 ｓ　ａｙ　ｓ）　Ｊ　、臨床　疫学の実験室のマニュアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（Ｒｏ ｓｅ　ｅｔ　ａｌ、Ｂ）４９−５６　（１９８５）＊例えば、血液の型決定は凝 集アッセイにより実施し、ここで試薬の抗体を添加する；試料中の赤血球は添加 した試薬と細胞表面上の抗原との間の相互作用の結果凝固する。血球凝集試験は 、特別に処理した赤血球を使用するイムノアッセイである。このような試験は抗 体および抗原、例えば、風諭抗体、リウマチ因子、肝炎抗体、肝炎抗原および妊 娠ホルモンを検出するために使用されてきている。

血球凝集アッセイにおいて使用される試薬は、それらの表面に結合した抗原また は抗体を有する赤血球であることができる。赤血球は架橋によりあるいはタンニ ン剤（ｔａｎｎｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）で処理することにより安定化することがで きる。参照、例えば、米国特許第４．４０３．０３７号および米国特許第４，５ ８７．２２２号に教示されている方法。例えば、米国特許第４．４０３．０３７ 号は、被覆しｌ；赤血球を安定化しかつそれらの血球凝集活性を減少するという 二重の目的で、架橋剤を使用する抗原被覆しＩ；赤血球の調製を記載している。

血球凝集活性の減少は、赤血球結合した血球凝集抗原に対して特異的な抗体の不 存在における、抗原被覆赤血球の自発的凝集を防止するとして記載されている。

米国特許第４．５８７．２２２号は、赤血球および可溶性抗体を含有するする試 薬、ならびにその成分をアルデヒドまたはタンニン剋で処理することを包含する 、試薬を調製する方法を記載している。

これらのような方法は試薬赤血球の有効寿命を増加するが、このような化学的処 理は、また、柔軟な細胞膜を硬質の膜に転化し、そして細胞の表面の性質を変更 する。ある場合において、これらの変化はアッセイにおける試薬の特異性に悪影 響を及ぼす。

これらの理由で、ポリマーのラテックス粒子は、赤血球の代わりに、ある凝集ア ッセイ、例えば、米国特許第４，５４７．４６６号に記載されているりウマチ因 子についての凝集アッセイにおいて使用されてきており、前記米国特許はポリマ ーのラテックス粒子の表面に取り付けられた免疫複合体を存するポリマーのラテ ックス粒子を調製する方法、およびこのような粒子の使用を記載している。

しかしながら、試薬の赤血球および試薬のポリマー粒子の両者は、決定される分 析物の不存在下においてさえ、凝集する傾向があるという欠点を有する。試薬の 赤血球の場合において、非特異的凝集が普通であり、そして試料中の血液群の抗 体および異種親和性抗体の存在から生ずる。

ポリマー粒子の場合において、非特異的凝集は試料中のタンパク質および他の分 子の粒子への非特異的吸着から生ずる。

凝集に基づく現在利用可能な方法を実施することができる前に、赤血球を試料か ら除去することが一般に必要である。この１つの例外は、これを必要としない、 血液型決定分析において覚られる。赤血球の除去はこの手順において余分の工程 であるばかりでなく、かつまた決定される分析物の反応性を除去または変更する ことがある。米国特許第４，５９４．３２７号は、全血中の分析物を決定する免 疫クロマトグラフ法を記載しており、ここで２つの機能が１つの工程において組 み合わされる：結合剤への結合による妨害細胞（例えば、赤血球）の分離および 分析物の決定。

米国特許第４．５７８．３６０号および米国特許第４．５２９．７２１号は、抗 原または抗体のイムノアッセイにおいて使用するように設計された物質を記載し ている：それらを使用方法は凝集イムノアッセイではなく、分析物を検出する他 の技術に頼る。米国特許第４，５７８．３６０号において、スミス（Ｓｍｉｔｈ ）は抗原結合部位およびＷ４識結合部位を含有する混合結合試薬（ＭＢＲ）を記 載している：試薬は通常２つの抗体から成ると記載されている。記載している方 法において、分析物（例えば、抗原）の存在は、分析物含有試料をＭＢＲおよび 標識した物質と混合し、モしてＭＢＲの標識結合部位に結合した標識した物質の 量を決定することによって決定される。米国特許第４，５２９．７１２号におい て、ヘテロニ官能性試薬が記載されており、これは物質（例えば、抗原、抗体） を細胞またはリポソームの膜へ接合し、次いでこれを溶血または免疫細胞付着ア ッセイにおいて使用することができる。

凝集アッセイの結果は、一般に、ニコルスおよびナカムラが記載しているように 、視的に評価されてきている。非視的方法は、まｆ；、ある場合において凝集を 決定するために使用することができる。例えば、米国特許第４，３９８，８９４ 号、米国特許第４．４３６．８２７号および米国特許第４．５５４．２５７号は 非視的方法を記載している。これらの方法は、血球凝集アッセイを測定するため に使用することができる。

発明の開示 本発明は、配位子結合アッセイ、とくにイムノアッセイに有用な方法および試薬 に関する。本発明の方法は、粒子含有試料、例えば、全血についてこのような方 法の実施を可能とする。試料中に存在する粒子は、インジケーター粒子として使 用される。単一のタイプの粒子の懸濁液である試料、例えば、微生物の発酵また は組織培養形成得られた試料において、存在する単一のタイプの粒子は実施する アッセイにおいてインジケーター粒子として働く。２またはそれ以上のタイプの 粒子の懸濁液である試料（例えば、全血）において、１つのタイプの粒子（例え ば、全血において、赤血球）をインジケーター粒子として働くように選択する。

ここに記載する方法は、現在利用可能な方法よりすぐれたいくつかの利点を有す る。第１に、この方法において使用する試薬は従来の方法において使用するもの より大きい安定性を有する。この有効寿命の増加は、現在利用可能な凝集イムノ アッセイ技術において使用する試薬と異なり、本発明の方法において使用するも のは細胞まｔ；は他の粒子を含有するので、起こる。第２に、インジケーター粒 子（非凝集状態で天然に存在する）は試料と平衡し、そして非特異的抗体または 吸着仲介凝集にさらされないので、非特異的凝集は現在利用可能な方法むけるほ ど頻繁に起こらない。第３に、インジケーター粒子（例えば、赤血球）の化学的 処理（例えば、架橋、タンニン剤の処理）は存在しないので、それらの膜はそれ らの柔軟性を保持し、粒子間の表面接触を増大する。こうして、細胞表面の性質 は変更されない。第４に、本発明の方法は配位子結合アッセイを粒子含有試料（ 例えば、全血）について実施可能とするので、普通の方法を使用する分析前に実 施される凝固または細胞の除去により除去される分析物は、本発明の方法におい て除去されず、したがって決定することができる。第５に、本発明の方法は、現 在利用可能な方法を使用するとき分析前に必要とするような、試料の処理を要求 しない。予備処理は試料の組成を変化させ、そして、同時に、反応性を変化させ ることがある。

本発明の方法は、現在利用可能な手順よりも急速かつ簡単であり、そしてヒトの 健康の医ｇ（例えば、血液試料の試験）、動物の健康の医療、食品加工工業およ び製剤工業において価値をもつ。これらに関して、最初に粒子を除去することを 必要とせずに、全血および粒子を含有する他の試料（例えば、発酵懸濁液）のア ッセイにおいて使用することができるできるので、それは特に価値がある。

図面の簡単な説明 第１図は特異的結合対の概略的に表示である。対の一方の構成員は標的部位ｌを 有し、そして他方は特異的結合部位５を有する：このような対において標的部位 １８よび特異的結合部位はお互いに相補的である。

標的部位ｌは分子まＩ；は分子の部分であり、相補的結合部位５と配位子結合を 形成することができる化学的立体配置を有する。第１図に示すように、標的部位 ｌは追加の成分を有する物質２の部分または領域であることができる。

特異的結合部位５は標的部位ｌに対して相補的であり、そして分子または分子の 部分であり、その相補的標的部位と特異的に相互作用して、配位結合を形成する 。第１図にまた示すように、特異的結合部位５は追加の成分を有する物質６の部 分または領域であることができる。

第２図は、第１図の特異的結合対の２つの成分の間で形成した配位結合１〜５を 示す。配位結合１〜５は、標的部位ｌとその相補的特異的結合部位５の間で形成 する。

第３図は、２つの部分から構成された、本発明の構成体の概略的表示である＝１ ）分析すべき試料中に存在する粒子（インジケーター粒子）上の適当な部位と配 位結合を形成する、特異的結合部位まＩ；は標的部位を有する部分９、および２ ）試料中に存在する問題の分析物上の適当な部位と配位結合を形成する、特異的 結合部位または標的部位を有する、部分１００部分９および部分ＩＯは、−緒に なって、リンク１１により本発明の構成体になる。

第４図は、本発明の構成体の４つの立体的配置を示す。第４ａ図は、部分９ａが 標的部位であり、そして部分１０ａが非相補的特異的結合部位を有する、本発明 の構成体を示す。

第４ｂ図は、部分の各々が標的部位を有する、本発明の構成体を示す：部分９ｂ の標的部位は部分１０ｂの標的部位と異なる。

第４ｃ図は、部分の各々が特異的結合部位を有する、本発明の構成体を示す：部 分９ｃの結合部位は部分１０ｃの結合部位と異なる。

第４ｄ図は、部分９ｄが特異的結合部位を有し、そして部分１０ｄが非相補的標 的部位を有する、本発明の構成体を示す。

第５図は、−次の凝集形成生ずる組成物の概略的表示である。２つのインジケー ター粒子１２は次の方法で接合している：インジケーター粒子１２は構成体１３ に、インジケーター粒子１２と構成体１３との間に形成した配位結合（図示せず ）により接合されている。構成体１３は次いで問題の分析物１４に配位結合（図 示せず）により接合する。分析物１４は配位結合（図示せず）により第２構成体 １３に結合し、この第２構成体１３は配位結合（図示せず）により第２インジケ ーター粒子１２に結合している。各場合において、配位結合は１〜５として第２ 図に示すものと同一である。これは複合体を生じ、その存在は既知の方法を使用 して検出することができる。

発明の詳細な説明 本発明は、配位子結合部位アッセイ、とくにイムノアッセイを実施する方法、お よびこのようなアッセイにおいて有用な組成物（すなわち、構成体および試薬） に関する。それは、分析すべき試料中に存在する粒子をアッセイにおいてインジ ケーター粒子として使用して、試料中の結合可能な物質の存在および量を決定す ることができるという事実を使用する０本発明の方法は、試料を予備処理するか 、あるいは粒子を除去するだめの処理を行わないで、粒子含有試料について実施 することができる。

本発明を定義および説明する目的で、次の定義を提供する：（１）９ｆｒ惣（ａ ｎａｌｙｔｅ）（ここで「Ａ」と記号化する）二粒子含有試料中で検出される物 質。

配置と特異的に相互作用する、１分子または多分子の組み合わせの部分。

こうして、適当な条件下に、相互作用は結合部位と標的部位との間の配位結合を 形成する。この結合はここで「〜」として記号化する。結合部位５は第１図に示 されている。

（３）標的部位：結合部位と配位結合「〜」を形成するために必要な、化学的ま たは物理的性質または特性を有する、１分子または多分子の組み合わせの部分。

標的部位ｌは第１図に描かれている。

（４）インジケーター粒子：（ここで「Ｐ」と記号化する）：水性環境中に懸濁 されることのできる広範な種類の粒子。それらは一般に０゜０１〜５０ミクロン の直径を有し、そして化合物の不均質混合物からなり、各々が境界の膜まＩ；は フィルムを有することによって特徴づけられる。この定義には、天然に存在する 細胞および細胞より小さい構成体、例えば、核、ミトコンドリアなどが包含され る。インジケーター粒子は、それぞれ、それらの標的部位または結合部位と１ま たは２以上の配位結合を形成するｔ；めに、利用可能な、ｌまたは２以上の結合 部位および／または標的部位を有する。

（５）構成体（ここでｒｐ−ａＪおよびｒａ−１と記号化する、これらは同等で あり、そして第３図および第４図に示されている）：２つの部分を１つの分子中 に化学的の結合または他の方法で接合するような方法で、設計または合成された 化合物：１つの部分インジケーター粒子に結合し、そして第２部分は問題の分析 物と結合する。第３図に表される構成体において、部分９はインジケーター粒子 に結合し、そして部分１０は問題の分析物に結合する。部分の各々は結合部位ま たは標的部位のいずれかを有し、そして構成体中に存在する他方の部分と特異的 に区別され（すなわち、異なり）かつそれにに対して相補的でない。本発明の構 成体の例は、第４図に表されている。

本発明の方法および組成物を使用すると、粒子含有試料中に分析物およびインジ ケーター粒子と結合または接合することができる構成体を混入することによって 、試料中の分析物の存在を検出することができる。

試料中の粒子はインジケーター粒子として使用され、そしてその方法で呼ぶ。１ つのみのタイプの粒子が存在する粒子含有試料において、粒子はインジケーター 粒子として働く。しかしながら、ｌより多いタイプの粒子が存在する粒子含有試 料において、特定の１または２以上のタイプの粒子はインジケーター粒子として 働くように選択される。例えば、全血において、いくつかのタイプの粒子が存在 し、赤血球をインジケーター粒子として使用することができる。

本発明の方法において使用する構成体は、２つの部分が、第３図に示されている ように、１つの分子中に化学的に結合するか、あるいは他の方法接合するような 方法で、設計および合成される。構成体中の部分の一方は試料中の粒子に結合す る；他方は問題の分析物に結合する。部分の各々は標的部位または結合部位を有 し、そして他方の部分と特異的に区別され（すなわち、異なり）そしてそれと相 補的でない。

直接分析法と呼ぶ、本発明の１つの実施態様において、構成体を分析すべき粒子 含有試料と組み合わせる。この方法は少なくとも２つの構成体分子と結合するこ とができる分析物の分析に適当である。問題の分析物を２つの構成体分子に結合 することは、第５図に示されている。問題の分析物が試料中に存在するとき、分 析物、構成体およびインジケーター粒子から構成されＩ；網状構造体へのインジ ケーター粒子の凝集または凝固が起こる。第２図に示すように、特異的結合部位 および相補的標的部位との間の反応の結果、配位結合は形成する。例えば、化学 結合、例えば、共有結合、水素結合、イオン結合または塩の架橋、疎水性相互作 用などは、特異的結合部位との標的部位との間に形成する。第２図は、２および ６が接合された結果として、ｌおよび５の間の配位結合を表す。

分析物の存在および濃度は、粒子の凝集の廃生を検出し、そしてそれが起こる程 度を測定することによって決定される。こうして、粒子はインジケーター粒子と して働く。

間接分析法と呼ぶ、本発明の第２寅施態様において、前述の構成体を試薬と呼ぶ 第２化合物と組み合わせて使用する。この実施態様において、構成体（分析物と 結合するか、あるいは分析物を含有し、そしてインジケーター粒子と結合する） 、および試薬はポリマーの形態の分析物実在物またはポリマーの形態の分析物に 対して特異的な結合相手であり、分析すべき試料と組み合わせる。最初の場合に おいて、ポリ分析物試薬を使用し、試薬は２まＩ；はそれ以上の構成体分子と結 合することができる。

第２において、ポリ特異的結合相手まｊ；は因子を使用し、試薬は２またはそれ 以上の分析物分子に結合することができる。この方法は分析物、例えば、直接法 において検出できない、１つのみの構成体分子に結合することができるものを検 出するために適する。試料中の分析物の存在は、粒子の凝集の欠如または減少に より実証される。試料中の問題の分析物が構成体と試薬との間の配位結合の形成 を阻害するので、凝集は欠如または減少する。

直接分析法 直接法と呼ぶ、本発明の１つの実施態様において、問題の分析物の存在および量 は、粒子含有試料中で、問題の分析物および粒子の両者と結合することができる 構成体を試料（例えば、全血）と混合することによって決定される。構成体を試 料と混合すると、次の一次相互作用が一次の（最初の）反応成分の間で起こる： 分析物（Ａ）、粒子ＣＰ）および構成体ここでｐ−ａと表示する、これはａ−ｐ と同等である）ニー次反応成分　相互作用の結果 （ａ）　Ｐ　十Ａ　反応なし くｂ）ｐ−ａ＋ｐａ　反応なし くｃ）　Ｐ　十ｐ−ａ　Ｐ−ｐ−ａ （ｄ）　Ａ　＋ａ−ｐ　ｐ−ａ　−Ａ 明らかなように、−次相工作用のあるものは一次反応成分の結合を生ずる（反応 （３）および（４）。これらは−次結合事象と呼ぶ。

さらに、二次相互作用が引き続いて起こる（いったんｐ　−ｐ　−ａおよびｐ− ａ−Ａが形成すると）。二次結合反応は起こるが、上の反応（３）および（４） は続く。次の相互作用が可能であるニー次反応成分　二次生成物　二次の結果（ ５）Ｐ　＋Ｐ”ｐ−ａ　反応なし く６）Ｐ　＋ｐ−ａ−Ａ　Ｐ−ｐ−ａ　−Ａ（７）　Ａ　＋Ｐ−ｐ−ａ　Ｐ−ｐ −ａ　−Ａ（８）Ａ　十ｐ−ａ　−Ａ　反応なし く９）　ｐ　ａ　＋ｐ−ｐ−ａ　ａ−ｐ−Ｐ−ｐ−ａ（ｌ　Ｏ）　ｐ−ａ　＋ｐ −ａ　−Ａ　ｐ−ａ−Ａ−ａ−ｐここで明らかなように、また、二次相互作用の あるものは相互作用物質を生ずるが、他のものは生じない。結合において生ずる ものは二次結合事象または反応と呼ぶ。

反応（６）および（７）の生成物は同一化合物である：Ｐ−ｐ−ａ〜Ａ。

より高次の結合反応は一次反応成分および反応（３）−（１０）の種々の生成物 の間で起こる。第５図参照。これらのより高次の反応の結果、多くの複合体積が 異なる可能な反応の道筋を経て形成する。

反応（３）−（Ｉ　Ｏ）およびより高次の反応が起こるためには、−次反応成分 は次の性質を有する： （ｉ）分析物（Ａ）は少なくとも２つの構成体分子と結合することができる、反 応（ｌＯ）におけるように：（ｉ　ｉ）粒子（Ｐ）は１または２以上の構成体分 子と結合することができる、反応（３）および（９）におけるように：（ｉ　ｉ 　ｉ）構成体ｐ−ａは少なくとも１つの分析物Ａおよび少なくとも１つ粒子Ｐに 結合することができる、（５）および（８）に示すように。

直接法のために使用する構成体（ｐ　−ａ）は、試料の粒子および問題の分析物 と結合することができる。粒子および分析物の両者の結合は、相補的結合部位と 標的部位との間に配位結合が形成する結果、起こる。

したがって、有用な構成体は、分析物する試料中の粒子および分析物の性質に適 するように設計することができる。例えば、次の可能性が存在する： （ｉ）分析物は少なくとも２つの同一の結合部位を有することができる；これら の部位は分析物の一体の部分として、他の結合性質の不存在下にあるいはそれに 加えて起こることができる。この場合において、構成体は、第４ａ図および第４ ｂ図に示すようにこの反復部位の標的部位を有するように設計される。

（ｉ　ｉ）分析物は少なくとも２つの同一の標的部位を有することができ、これ らは他の結合性質の不存在下にあるいはそれに加えて存在することができる。こ の場合において、構成体は相補的結合部位を有するように設計される（第４Ｃ図 および第４ｄ図）。

（ｉ　ｉ　ｉ）分析物は２まｌ；はそれ以上の結合部位の各々の１または２以上 を有することができる；これらは他の結合性質の不存在下にあるいはそれに加え て存在することができる。この場合において、構成体は異なる分子からなり、そ れらの各々は結合部位の１つにに対して１つの標的部位を有する。

（ｉｖ）この場合は（ｉｉｉ）におけるとおりであるが、標的部位は分析物と関 連し、そして結合部位は構成体混合物を形成する！こめに使用される。

（Ｖ）この場合において、分析物は１または２以上の結合部位８よびｌまたは２ 以上の標的部位の両者を有することができる。適当な構成体は相補的標的部位お よび結合部位の混合物である。

前述のもの（ｉ−ｖ）と同一の場合は、粒子の性質および有用な構成体の設計お よび合成のために存在する。すべてにおいて、構成体の設計の大きい柔軟性が提 供される。

次の拘束は構成体の設計および合成において存在する二分析物の不存在下に、粒 子の検出可能な凝集が起こらないような方法で、試料中の粒子とのみ反応する構 成体を生成する。

構成体は２つの部分を一緒に接合することによって調製され、１つは粒子と結合 し、そして１つは問題の分析物と結合することができる。本発明は２つの部分を 接合する結合の性質により制限されないが、このような結合は、構成体が配位結 合を経てインジケーター粒子を分析物に結合させる働きをするとき、構成体の一 体性を維持するために十分な強さもｔ；なくてはならない。

本発明において、分析物の存在および量は、第５図におけるように少なくとも２ つのインジケーター粒子を接合するような方法で、粒子および分析物の両者に結 合する構成体の発生を検出することによって決定することができる。この結合を 検出する任意の方法は本発明の実施において有用であろう。例えば、粒子計数法 、例えば、インピーダンス粒子の計数を使用して、分析物の存在下に２またはそ れ以上のインジケーター粒子の配位を検出することができる。

抗体のイムノアッセイのための直接法の使用本発明に従い分析物を検出および定 量する直接法は、例えば、粒子および抗体（分析物）を含有する水溶液の分析に おいて使用することができる。それは抗体産生細胞の細胞培養物を分析するため に使用することができ、モして全血の試料中の抗体の検出および定量のｔ；めに とくに有用である。本発明の直接法の使用は、全血中の抗体の検出の説明により 下に例示する。これはいかなる方法においても限定を意味しないことを理解すべ きである。

このようなアッセイのための構成体は、次のものと配位結合を形成するように設 計された連結された部分から成る：（１）全血試料中に存在することが知られて いる粒子から選択されるインジケーター粒子（好ましくは細胞実在物、例えば、 赤血球、白血球、血小板）および（２）問題の分析物（すなわち、決定すべき抗 体）。検出すべき分析物は、例えば、免疫グロブリン（すなわち、タンパク質） 、例えば、ＩｇＧ％　ＩｇＭ、ＩｇＥ％　ＩｇＡ、ＩｇＤなどである。

粒子（例えば、赤血球）と結合すべき構成体の成分は、ここで粒子結合部分と呼 ぶ。それは（１）細胞の表面に自然に存在する標的部位、例えば、抗原、膜構成 成分などに対する結合部位、例えば、抗体、レクチンなどの中に存在するもの； または（２）細胞表面上に自然に存在する結合部位に対して相補的な標的部位。

問題の分析物（ここで、抗体）と結合すべき構成体の部分は、ここで分析物結合 部分は好ましくは抗原または決定すべき抗体に対して特異的な抗原である。また 、分析物の抗体との配位結合を形成する他の物質、例えば、ハプテン、抗原類似 体、同族体または拮抗因子、抗イデイオタイプ抗体、抗免疫グロブリン抗体など を使用することができる。

粒子結合部分および分析物結合部分として働くために選択し！：構成体の２つの 部分は、連結を生ずる、この分野において知られている、共有結合または他の化 学的手段により接合される。例えば、二官能性反応性化合物を部分の連結に使用 することができる。このような二官能性化合物は、部分上に存在する化学的基と 共有結合または他の安定な結合を形成する反応性基を含有する。反応性基、例え ば、アルデヒド、マレイミド、イミダゾリド、ラクトン、ラクタム、活性エステ ル、アジド、アシル活性水素、不飽和アシルなど働くために二官能化合物におい て有用であることが分かった。さらに、成分の物質上に存在する官能基（例えば 、カルボキシル）を活性化する化合物、例えば、カーポジイミドを、構成体の合 成するＩ；めに選択することができる。

試料（例えば、全血）中の抗体の存在および量を決定するとき有用な方法は、好 ましくは、次の工程からなる：（１）血液の凝固が起こらないような方法で全血 の試料を獲得する（例えば、ヘパリンまたは他の抗凝固剤中に試料を集めること によって）：（２）ある体積の血液試料を構成体と混合する。構成体は溶液（す なわち、水または他の適当な溶媒中の）または乾燥調製物であろう；（３）構成 体と細胞成分との間および構成体と、存在する場合、抗体との間の結合度応を起 こさせる。これは（２）において形成した組み合わせを適当な条件（例えば、温 度、イオン強度、ｐＨ）下に反応が起こるために十分冬時間維持することによっ て達成される：（４）適当な手段、例えば、光の散乱または吸収、粒子の計数お よび大きさ決定などにより、血球の凝集の程度を測定するか、あるいは他の方法 で決定する； （５）細胞の凝集の発生および程度を存在する分析物の存在および量に関係付け る。これは、例えば、削具て確立した標準曲線を参照することによって実施する ことができる。

本発明の利点は、既知の先行技術の材料および技術を使用して構成体を設計およ び合成し、そして試薬を調製することができるということである。よく知られた 技術を、また、使用して分析を実施し、そして結果を読むことができる。これら の材料および技術は、例えば、イムノアッセイ試験試薬および凝集に基づくイム ノアッセイ、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光イムノア ッセイにおいて使用されてきている。試料中の抗体を検出するために現在使用さ れているイムノアッセイ技術において、試験試薬は抗原または分析物の抗体に対 して特異的な抗原を包含する。これらの抗原は、また、本発明の構成体の分析物 結合部分として使用することができる。

例えば、ヒト血液中の風疹ウィルスに対する抗体の検出および定量において有用 な構成体は、−緒に接合された粒子結合部分および風疹抗体結合部分からなるこ とができる。風疹に対する抗体の検出において有用な分析物結合部分は、風疹ウ ィルスからの１または２以上の抗原である。

このような抗原はよく知られており、そして入手可能である：例えば、それらは 現在風疹に対する抗体のための商業的試験キットで使用されており、これはアボ ット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ベクトン ーディキンソン・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏｍｐａ ｎｙ）およびベージング・ダイアグノスチクス（Ｂｅｒｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎ ｓｔｉｃｓ）から商業的に入手可能である。現在使用されるアッセイのために風 疹ウィルスから抗原を調製するとき使用する技術は、本発明の分析物結合部分の 調製に使用することができる。

分析物結合部分に加えて、本発明の構成体は粒子結合部分を含む。ヒト血液中の 抗体の検出に有用な構成体を設計および合成するとき、粒子結合部分は好ましく は赤血球に結合するであろう。粒子結合部分は、この分野において知られている 多くの物質（例えば、抗体およびレクチン）から選択することができる。例えば 、ヒツジ赤血球に対するウサギ抗体は、カバッ）（Ｋａｂａｔ）、免疫学および 免疫化学における構造的機４８　（１９６８）に記載されているように、補体固 定試験のために日常的に使用されている。赤血球と配位結合を形成するレクチン は、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ−） から商業的に入手可能である：参照、例えば、１９８６年のシグマ・ケミカルの カタログ、ここでレクチンの性質は記載されており、そして参照されている。

本発明の方法を使用してヒト血液中の風疹抗体を検出するとき、構成体の粒子結 合部分はヒト赤血球と配位結合を形成することができる物質から選択される：と くに有用な選択はヒト赤血球と結合するｌまたは２以上の抗体である。風疹に対 する抗体についての試験において選択しかつ使用する構成体の粒子結合部分は、 もちろん、また、インジケーター粒子としてヒト赤血球を使用する本発明に基づ く多くの他の試験において使用することができる（例えば、肝炎抗体抗原：バク テリアの抗体など）。

本発明の構成体は、粒子結合部分を分析物結合部分に接合することによって合成 される。２つの分子−緒に接合する（が部分の各々の活性を保持して）とき有用 である、この分野においてよく知られている多数の化合物および方法が存在する 。例えば、抗体を酵素に接合すると同時に物質の各々の活性を保持することによ って、酵素イムノアッセイを実施することができる。このような技術は、例えば 、シバ・カンパニー（Ｓｙｖａ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、アボット・ラボラトリーズ （ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびコープイス・ラボラトリーズ （Ｃｏｒｄｉｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手可能なキットに含められ る試薬の調製において使用されてきている。前述のように、構成体を使用する間 、構成体の一体性を維持するために十分な強度をもつ接続または連結を生ずる、 ２つの材料を連結または接合する任意の方法（すなわち、インジケーター粒子を 分析物に連結する働きをする）。必要な化合物および方法はこの分野においてよ く知られている。

風疹抗体試験の試料において有用な構成体は、粒子結合部分を分析物結合部分に 接合することによって調製される。この場合において、両者部分はタンパク質で あり、したがって、アミノ酸残基を含有する。二官能性の連結化合物［例えば、 ピアース・ケミカルス（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）などから方法の文 献を使用して商業的に入手可能である］は、タンパク質の官能基、例えば、ヒド ロキシル、アミ八チオール、およびカルボキシル基と反応する；これは接合され る２つの部分を生ずる。非対称の二官能性結合化合物の入手可能性は、２つの部 分を構成体分子に選択的に接合するために本発明において有利に使用することが できる。本発明の構成体分子は、２つの部分中連結化合物の合計に等しい分子大 きさおよび分子量をもつであろう：したがって、必要に応じて、それらは分子の 大きさおよび分子量を基準にして連結しない部分から分離することができる。こ れは、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー［例えば、７アーマシア・ファイン ・ケミカルス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手 可能である］電気泳動および調節した孔大きさの膜濾過のような方法を使用して 実施することかできる。

風疹に対する抗体の検出に使用な試薬は、ヒト赤血球および風疹ウィルス抗原に 対する抗体と反応するように、調製した構成体を使用して調製することができる 。試薬中の構成体の濃度は、次のように選択する＝１）分析物抗体の不存在下に （例えば、既知の陰性の試料において場合のように）、試料の赤血球の検出可能 な凝集が起こらず、モして２）分析物抗体の存在下に、検出可能な凝集が起こる 。使用すべき構成体の適当な濃度は選択し、そして塩類（例えば、ＮａＣ１，Ｋ ＣＩなど）およびｐＨ緩衝剤（例えば、リン酸塩、トリス、ＨＥＰＥＳなと）お よび商業的に入手可能な試験試薬において普通に使用されている化学物質の溶液 中で混合する。このような混合物は、こうして、活性成分として、構成体ばかり でなく、かつまＩ；貯蔵の間の構成体の活性を保存しかつ反応混合物のｐＨ，イ オン強度などの最適な反応条件を制御する他の成分を含有する。

風疹ウィルス抗原に対する抗体を検出する方法の１つの例は、次の工程を含むこ とができる： （１）細胞学および血液学のｔ；めの現在の実施であるように、ヒト全血試料を 抗凝固剤、例えば、ヘパリンまたはＥＤＴＡ中に抜き出す；（２）小さい体積の 血液（例えば、ｌμＱ程度に少ないが、一般に約２０μｇ以上）を規定する体積 の試薬（例えば、１００μＱ）と混合する； （３）反応混合物を室温において凝集が起こるために十分な時間の間維持する（ 例えば、数分間）：そして （４）風疹に対する抗体の存在または不存在を赤血球の凝集の存在まｌ；は不存 在を視的に検出することによって決定する。

細胞計数装置、例えば、コールアター・エレクトロニクス（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅ ｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）から入手可能なもの、を装備する実験室において風疹に 対する抗体を検出する試薬および方法は、これらの計器による凝集の測定より分 析物抗体の検出を可能とするように選択されＩ；、構成体の濃度において、前述 のものと異なる。

本発明は、風疹について前述したヒト血液試料中の他の抗体のＩ；めに使用する ことができる：各場合において、問題の分析物に対して特異的な１種まｔ；は２ 種以上の抗原を使用すべき構成体に含められる。例えば、エイズ（ＡＩＤＳ）試 験は、分析物結合部分としてＨＴＬＶ−１１１ウイルスから得られるかまＩ；は 遺伝子操作したＨＴＬＶ−１１Ｉ　（ＨＩ　Ｖ）抗原［例えば、アボット・ラボ ラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ’Ｌエレクトロヌクレオ ニクス・インコーホレーテッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｔｉｃｓ、Ｉｎｃ 、）から入手可能な試験において現在使用されている］を使用し、そしてＡＩＤ Ｓ試験の要件を満足するように構成体濃度を選択することによって準備すること ができる。

本発明の１つの特徴は、赤血球を含有する種の血液を試験することができるとい うことである。構成体の粒子結合部分は、問題の種の細胞と配位結合を形成する 物質から選択する。動物血液中の抗体、例えば、ブタ血液中のセンモウチュウ抗 体のために試験を提供することができる。

さらに、全血以外の粒子含有試料を使用することができる。−例として、抗体は モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ細胞の生体外培養物において検出するこ とができる。これらの場合において、構成体は、例えば、マウス−マウスハイブ リドーマ細胞に結合する粒子結合部分から合成し、そしてその抗体に対して特異 的な分析物結合部分を生成することができる。

上の説明は抗体を検出する本発明の使用を例示するために提供された。

記載する構成体は、必要に応じて変更して、問題の他の抗体を検出することがで き、そして上に記載する構成体およびそれらの使用はいがなる方法おいても限定 を意図しない。

抗原についてのイムノアッセイのための直接法の使用直接法を、また、使用して 試料、例えば、全血中の抗原を検出および定量することができる。下において使 用する方法は、抗体の検出および定量について前述したもの類似する。

この実施態様は、しかしながら、構成体の１つの部分である分析物結合部分にお いて、抗体のための前述の方法と異なる。使用する構成体は、例えば、試料中に 存在する細胞に結合する抗体または抗体断片（例えば、Ｆａｂ’）から、および 決定すべき抗原と反応性である抗体または抗体断片から調製することができる。

決定すべき抗原は、構成体中に準備された結合部位と反応する、２またはそれ以 上の標的部位から構成されなくてはならない。

抗原を決定する方法は、前述の抗体についてのアッセイと同一であろう。

例えば、ヒト血液中のＢ型肝炎の表面抗原（ＨＢｓＡｇ）についての試験は、（ １）風疹抗体を参照して前述したような、粒子結合部分および（２）ＨＢｓＡｇ に結合することが知られている物質、例えば、抗体から選択される分析物結合部 分からなる構成体を使用して実施することができる。使用できるＨＢｓＡｇに対 する抗体は、例えば、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ）およびコープイス・ラボラトリーズ（Ｃｏｒｄｉｓ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）などから商業的に入手可能な試験において現在使用されている ものである。抗体はヒトまたはヒト以外の由来のものであることができる。各々 がアミノ酸残基の官能基を含有する、これらの２つの部分を接合して、風疹抗体 に関して前述したように、構成体を形成する。

同様に、ヒトおよびヒト以外の血液中の他の抗原についての試験は、構成体の分 析物結合部分として特異的抗体または抗体官能基使用することによって提供する ことができる。試薬の調製および試験の方法は、抗体の試験について前述したと おりである。

物質についての非イムノアッセイのための直接法の使用抗体または抗原の決定に おける使用について前述した、本発明の直接法は、まＩ；、試料中の他の物質（ 分析物）の存在を検出するために実施することができる。直接法は、構成体と結 合することができる粒子を含有する試料において、少なくとも２つの結合部位ま たは標的部位を有する分析物の検出に応用することができる。

例えば、この方法を使用して、次の物質の存在を検出し、そして定量することが できる：受容体、結合性タンパク質、担体分子、封鎖性（Ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉ ｎｇ）化合物、およびホルモン、アクチベーター、作用因子、拮抗因子、阻害因 子、基質、コファクター、および２まｔ；はそれ以上の標的部位を含有する分子 と配位結合形成する他の分子または分子の凝集体。これは決定すべき分析物のＩ ；めに適当な設計した構成体を使用することによって実施することができる；こ の場合において、構成体は分析物のそれにに対して相補的な結合活性を有するよ うに設計する。

本発明の方法は、また、ヒトまたは動物の血液試料以外の試料について実施する ことができる。例えば、それは、インジケーター粒子として試料中に存在する細 胞を利用することによって、細胞を含有する試料（例えば、微生物の発酵、組織 培養などから得られる試料）分析するために使用することができる。

一例として、ニワトリ血液中の活性アビジンの検出において有用な構成体は、ニ ワトリの赤血球と結合する粒子結合部分を有し、その部分にビオチンの分析物結 合部分を接合する。商業的に入手可能なビオチン誘導体、例えば、ｄ−ビオチン −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル［シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から入手可能である〕を使用して構成体 を形成することができる。

試薬中でこの構成体を使用すると、赤血球の凝集は、４つのビオチン結合部位を 有するアビジンが、構成体中に存在する２またはそれ以上のビオチン分子と結合 することができる活性な形態で存在するときにのみ、起こるであろう。対照的に 、アビジンについてのイムノアッセイは、抗原的に活性なアビジンを検出し、し たがって、血液中のビオチン結合活性についての情報を提供しないであろう。

粒子に関連する物質を決定するための直接法の使用本発明の方法および構成体は 、また、２またはそれ以上のタイプの粒子を含有する試料（例えば、全血）中の 、細胞表面上の結合部位または標的部位の存在または量を検出するために使用す ることができる。例えば、この方法は全血中で特定のタイプの細胞（例えば、白 血球、リンパ球、好塩基球、Ｂ細胞、感染した細胞、微生物細胞、活性化細胞、 未熟細胞など）の存在の決定および定量を他のタイプの細胞（例えば、赤血球） の存在下に実施するｔ；めに有用である。使用する構成体は、分析物（これはこ の場合において粒子である）およびインジケーター細胞のタイプ（これは第２の 異なる粒子である）の両者と配位結合を形成するように設計される。

本発明を使用して全血中の物質について試験する能力は、細胞または細胞関連分 析物の検出において価値がある。例えば、ヒト白血球のＴ細胞およびＢ細胞の分 類を実施するＩ；めの試薬はオルト・ダイアグノスチクス（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ）から入手可能である。これらの試験は、Ｍｉ胞のタイプに特 異的な抗体に加えて、高度に訓練した人員により操作される高価な計器を必要と する。本発明の目的は、白血球を分類するために現在使用されている抗体に接合 したヒト赤血球に結合するであろう、部分からなる構成体を提供することである 。ヒト血液中の赤血球と白血球との間の相対的濃度が異なる（４〜１ＯｘｌＯ３ ／μＱの白血球に比較して５ＸｌＯ’／μＱの赤血球）ため、構成体の分析物結 合部分により選択されるタイプの白血球は、結合した赤血球の存在のために、例 えば、顕微鏡検査により、容易に検出可能であろう。

さらに、血液中のバクテリア細胞の存在は、直接にあるいは培養後において、問 題のバクテリアに結合する構成体の分析物結合部分を使用することによって検出 することができる。例えば（バクテリア種に対する抗体を使用することができる 。あるいは、ペニシリン誘導体は、細胞壁の成分としてペニシリン結合性タンパ ク質を有するバクテリアの存在を検出するために、分析物結合部分として働（こ とができる。

分析の間接法 本発明の第２実施態様は、間接法と呼び、分析物が１つの構成体分子のみに結合 できる場合におけるような、直接法により検出できない分析物の検出において有 用である。このような分析物は、２つの組成物を使用することによって検出する ことができる：ｌ）構成体および２）試薬。

この方法において、構成体の粒子結合部分は直接法について記載したものと同一 である。

間接法の１つの用途において、分析物結合部分は構成体の１成分であり（直接法 について前述した場合のように）そして試薬は一緒に接合されかつ２またはそれ 以上の構成体分子と結合することができる２またはそれ以上の分析物実在物であ る。

間接法の第２の用途において、−緒に接合された２またはそれ以上の分析物結合 部分（例えば、問題の分析物に対して特異的な抗体）は試薬を構成する。この場 合において構成体は、粒子結合部分に結合した、分析物である。この用途は実施 例ＩＩに例示されている。

間接法の２つの用途のいずれの使用も、分析物が存在する場合、凝集を阻害する 。いずれの場合においても、阻害は、存在する分析物および試薬の相対量に依存 して、部分的または完全であることができる。

本発明のこの実施態様を使用して、単一の非反復標的部位を有するか、あるいは 標的部位を含有する１つの構成体のみに結合できる、物質の存在および量を検出 することができる。これは、例えば、ハプテン、ステロイドホルモン、低分子量 の薬物（典型的には１．０００より少ない分子量を有する）、抗生物質、および 結合性タンパク質のような物質にっいて試料を分析するときに有用である。この 方法を使用して一価の結合性質をもつ物質を検出および定量する場合、次のこと を行う：試料中の分析物に結合しかつインジケーター粒子に結合する構成体を試 料に添加する：ポリマーの形態の分析物実在物（試薬と呼ぶ）をまＩ；添加する 。

分析物が試料中に存在する場合、試薬は構成体への結合について分析物と競合す るので、インジケーター粒子の凝集または凝固が阻害される。

その結果、凝集の程度が減少し、それは凝集の部分的または完全な阻止であるこ とができる。凝集の阻止は分析物の存在の指示である：阻止の程度は試料の分析 物の量を指示する。

間接法は、直接法について説明したように、種々の結合反応のいずれに頼ること もできる。それは、また、凝集の阻害に加えて、凝集の逆を可能とするような形 式をとることができる。

間接法を使用して実施できる試験の例は、ハプテンのアッセイにおいて知られて いるものを包含する。このクラスに次のものが包含される：治療学的薬物監視試 験、例えば、ゲンタマイシン、ジゴキシン、フェノバルビトール、７エ二トイン 、およびホルモンの試験、例えば、チロキシン、エストロゲン、コルチゾル。例 えば、ヒト血液中の分析物としてジゴキシンについての試験において有用な構成 体は、前述の方法によりジゴキシンに対する抗体に接合した粒子結合部分（例え ば、風疹抗体についての試験に関して前述したもの）からなるであろう。この場 合においてジゴキシンおよび一般のクラスとしてハプテンの性質のＩ；めに、分 析物は１つのみの構成体分子と配位結合を形成することができる。

本発明の利点は、構成体に加えて試薬を提供することにより、ハプテンを検出す るために有用な試験を実施することができるということである。この実施例にお ける試薬は、例えば、次の工程により調製することができる、ジゴキシンのオリ ゴマーまたはポリマーからなることができる：（１）過ヨウ素酸を使用してジゴ キシン中に存在する隣位のグリコールをアルデヒドに特別に酸化する：（２）酸 化されたジゴキシンを複数のアミン基を含有する適当なポリマー、例えば、ヒト 血清アルブミンまたはポリ−リジンと混合して、アルデヒドとアミノ基との間に イン結合を形成させる：および（３）そのように形成したイミンをシアノホウ水 素化ナトリウムで還元してジゴキシンをポリアミンに結合する第二アミンにする 。これらのおよび同様な反応はハプテンを変性して抗原性を付与するために普通 に実施されている。これらの技術は、ジゴキシン以外のハプテンのオリゴマーま たはポリマーの形態の調製において使用することができる。

ハプテン、例えば、ジゴキシンについて試験するための本発明の間接法の使用は 、２つの組成物を使用する：構成体および試薬。前述のように、分析物結合部分 がジゴキシンに特異的に結合する、構成体を調製する。しかしながら、この場合 において、試料中に存在する赤血球の凝集は、重合した分析物（ここでジゴキシ ン）である試薬が存在するときにのみ起こる。この場合において、構成体および 重合したジゴキシンの濃度は、試料を構成体および試薬と混合したとき、赤血球 の凝集が分析物ジゴキシンの不存在下において起こるように、選択する：臨床的 に有意の濃度でジゴキシンが存在するとき、凝集の検出可能な阻害が起こる。

本発明の特定の利点は、直接法の実施態様について記載した種々の試料中の種々 の分析物への適用の広さが、２つの方法における構成体により実施される同様な 機能のために、間接法を使用して比較的広がるということである。

本発明を次の実施例により例示する。これらの実施例はい゛かなる方法おいても 限定を意味しない。

ヒト赤血球（ＲＢＣ）を、ヒト血液から、血液をヘパリン抗凝固剤中に抜き出し 、そしてこの血液を遠心して液状血漿除去することによって調製した。バフィー コート中に含有される白血球を除去した後、ＲＢＣ血小板をリン酸塩緩衝液（Ｐ 　Ｂ　Ｓ）中に最懸濁させ、そして細胞を洗浄し、そして遠心した。洗浄工程は ２回反復した。血漿および白血球の汚染物質を含有しないＲＢＣを、標準の方法 に従い、ウサギに注射して、ヒトＲＢＣに対するウサギ抗体を作り出した。注射 しｔ；ウサギの抗体力価は、ウサギ血液試料を集め、試料を凝固させ、そしてヒ ト全血でヒトＲＢＣ凝集活性について抗血清を試験することによって決定しＩ； 。動物は抗体力価およびＲＢＣに対する抗体の産生における使用のための特異性 を基準にして選択した。

Ｂ１免疫グロブリン断片の調製 免疫グロブリンＩｇＧは、ウサギ第２部分から、塩析、モレキュラシーブおよび イオン交換クロマトグラフィーにより、この分野においてよく知られかつ次の文 献に記載されている方法を使用して精製しｔ；：カバン１９６１）第４９章。Ｆ （ａｂ″）、断片を精製したＩｇＧのペプシン消化により調製した。ＩｇＧ断片 を消化されないＩｇＧおよび汚染物質からゲル濾過クロマトグラフィーにより分 離した。Ｆａｂ’断片は、ニソノフ（Ｎｉｓｏｎｏｆ　ｆ）、Ａ、およびマデイ （Ｍｎａｄｙ）、Ｗ。

Ｈ２、ネイチャー　（Ｎａ　ｔｕ　ｒｅ）（Ｌｏｎｏｎ）　、ｌ　９４　：　３ ５５　（１９６２）により最初に記載された方法を使用して、Ｆ（ａｂ″）、か ら２−メルカプトエタノール−アミンでｐＨ５，５−６，０において還元するこ とによって調製した。

Ｃ５構成体−ＴＮＰ−Ｆａｂ’の調製 上のｂ（：８いて調製しＩ：Ｆａｂ’断片を２．４．６−トリニトロベンゼンス ルホン酸と反応させた。生ずるＴＮＰ−Ｆａｂ″を汚染物質から透析により精製 した。ＴＮＰ−Ｆａｂ″試薬は、構成体をＰＢＳ中にほぼ２μｇ／μｇに希釈す ることによりて調製した。

Ｄ、ヒト血液を抗凝固剤、例えば、ヘパリン中に集めた。血液のアリコートを４ つの部分のＰＢＳで希釈した。５０μＱの希釈した血液をマイクロタイタープレ ート中に分配した。第１ウエル中に、ＭＯＰＣ３１５細胞系（ＡＴＣＣＴＩＢ　 ２３）の生体外培養から誘導したＴＮＰに対するモノクローナル抗体の１００μ ｇを添加した。このモノクローナル抗体は、また、ＤＮＰと反応する。抗体の系 統的ｌ：２希釈を、合計２４ウエルに、実施した。ＴＮＰ−Ｆａｂ’の５０μＱ を２４ウエルの各々に、およびＴＮＰに対する抗体を含まない希釈した血液およ びＰＢＳを含有するする３ウエル中に、添加した。さらに、希釈した血液および 希釈したＴＮＰに対する抗体を含有するが、ＴＮＰ−Ｆａｂ’　を含有しないウ ェルを構成した。ウェルの内容物を混合し、そして１５分間静置した。次いで、 結果をニフルおよびナカムラにより記載されているように視的に読んで、沈降し た赤血球によりつくられたパターンを決定した。結果を標準の血球凝集アッセイ において得られたパターンと比較した。

結果が示すように、ＴＮＰに対する抗体の不存在下、ＴＮＰ−Ｆａｂ″の不存在 下またはＴＮＰに対する抗体の高い希釈（１：４０００より大きい希釈）におい て、細胞は陰性の血球凝集試験に典型的なパターンで沈降した。陰性の血球凝集 試験におけるパターンは、平板を傾斜しそして沈降した細胞を流れさせたとき、 「トレイリング（ｔｒａｉｌｉｎ　ｎ　ｇ）　Ｊをもつ「ボタンパターン（ｂｕ ｔｔｏｎ　ｐａｒｒｅｒｎ）Ｊであった。ＴＮＰに対する抗体の低い希釈（１： １０２４より小さい）を含有するウェルにおいて、細胞は陽性の血球凝集試験に 典型的なパターンに沈降しＩ；；すなわち、それらは、全血試料から誘導した細 胞、ＴＮＰ−Ｆａｂ’　とＴＮＰに対する抗体との間で起こる結合反応のＩ；め 、細胞の架橋の複雑な網状構造を示す「ローンパターン（ｌａｗｎ　ｐａｒｒｅ ｒｎ）Ｊを形成した。中程度の希釈のＴＮＰに対する抗体を含有するウェルにお いて、沈降の過渡的なパターンが観察され、血球凝集試験に典型的な反応の発生 を示した。

得られた読み取りは血球凝集試験において熟練した人が予測した結果と一致した 。しかしながら、使用した方法は、従来全血を試料として使用した方法とかなり 異なっていた。

この試薬は実施例Ｉにおけるようにして調製した。

この化合物はシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、）から購入した。

Ｃ，ＤＮＰ−リジンについてのイムノアッセイＴＮＰ−Ｆａｂ’による試料ＲＢ Ｃの陽性の凝集を生じたアッセイの条件を、実施例Ｉにおけるアッセイから選択 した。それらの条件下に、ＴＮＰについてのアッセイは希釈した血液をマイクロ タイタープレートのウェル中に分配し；適当な濃度のＴＮＰに対する抗体をウェ ルに添加し、ＤＮＰ−リジンを最初のウェルに添加し、モして２３の追加のウェ ルについて系統的ｌ：２希釈を実施することによって構成した。最後の工程にお いて、ＴＮＰ−Ｆａｂ’構成体を添加した。追加の陰性の対照を実施例Ｉにおけ るように構成しｔ；。ウェルの内容物を混合し、そして反応を１５分分間性させ た。実施例１におけるように、結果を視的に読み、そして血球凝集試験のパター ンと比較した。

このアッセイの結果が実証するように、十分に高い濃度、少なくともｌＯμｇ／ ｍＱのＤＮＰ−リジンの存在下に、赤血球の凝集はＤＮＰ−リジンによる競合的 阻害により防止されｔ；。凝集阻害は投与量応答曲線に従い、そしてｌμｇ／ｍ Ｑ以下である、高い希釈のＤＮＰ−リジンにおいて起こらなかった。ＤＮＰ−リ ジンはハプテンのよく知られたモデルであるので、この実施例の研究において使 用した。

実施例ＩＩＩ　細胞へ結合する構成体の評価実験は凝集の不存在下に、細胞と構 成体のＦａｂ’部分との間の反応が起こることを実証するために実施しｔ；。ウ サギＦａｂ’　と反応させた抗体は、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍ ａ　ＣｈｅｍｉｃａＩ　Ｃｏ、）から購入した；その反応性は免疫沈澱反応によ り確証した。

必要な他の材料は実施例■に記載するようにして調製した。

希釈したヒト血液を、２つの反復実験のプレートにおいてマイクロタイタープレ ートのウェル中に分配した。Ｆａｂ’　またはＴＮＰ−Ｆａｂ＃をプレート中の 複数のウェルに添加した。ＴＮＰに対する抗体を、実施例Ｉにおいて得られｔ； 結果に基づいて選択した２つの濃度でＦａｂ′まｌ；はＴＮＰ−Ｆａｂ″を含有 するウェルに添加した：ＴＮＰに対するＭＯＰＣ３１５抗体をＩ：５００に希釈 して得られた高い濃度、およびＴＮＰに対する抗体を１：５０００に希釈して得 られた低い濃度。

Ｆａｂ’　に対する抗体を一方のプレートのウェルに添加し、モしてＦａｂ′に 対する抗体を含まない等しい体積のＰＢＳを他方のプレートに添加した。反応を 進行させ、そして結果を実施例Ｉに記載するように読んだ。

次の結果が得られた：ＴＮＰに対する抗体の不存在下に、Ｆａｂ’に対する抗体 の希釈において、およびＦａｂ’に対する抗体の不存在下に、凝集は起こらなか った：高い濃度のＴＮＰ−Ｆａｂ″およびＴＮＰに対する抗体の存在下に、期待 した凝集が生じた。Ｆａｂ″またはＴＮＰ−Ｆａｂ’の存在下におよびＦａｂ’ に対する抗体インジケーター粒子、凝集は起こった。これらの結果は、Ｆａｂ″ に対する抗体がＦａｂ’の不存在下に凝集を起こさないという発見という組み合 わせて、Ｆａ、ｂ’およびＴＮＰ−Ｆａｂ’　は凝集の不存在下においてさえ細 胞と反応すること、および凝集は決定される分析物の存在または不存在に特別に 関係があることを示す。

実施例１ｖ　希釈しない血液を使用するアッセイ実施例ＩおよびＩＩに記載され ているアッセイを、ここで調製した材料を使用して実施した。しかしながら、ア ッセイは、分析物前の血液の希釈が不必要であるように選択した、実施例！およ びＩＩにおいて使用した濃度および量の構成体を使用して実施した。このアッセ イの７オーマツトを使用して得られた結果は、希釈した全血を使用した実施例１ およびＩＩに記載する結果と完全に一致した。

実施例Ｖ　モノクローナル抗体を使用するアッセイマウスモノクローナルＲＢＣ −凝集抗体の調製実施例Ｉ、Ａにおけるようにブタまたはウシから調製したＲＢ Ｃ接種。

物を、標準の手順に従ってＢａ１ｂ−Ｃマウスに注射した。マウスの各々の抗体 力価を、全血に対してマイクロタイタープレートの凝集において決定した。膵臓 細胞をＮ５−１骨髄腫細胞との融合のため調製しあ；ハイブリドーマを形成し、 そして組織培養ウェル中に分散させた。ＲＢＣを凝集させる抗体を分泌する生存 可能な細胞を含有するウェルを、全血に対して上澄み液を試験することによって 決定した。使用可能な抗体を産生ずる細胞のコロニーをサブクローニングし、そ して生体内および生体外培養法により維持してＲＢＣに対するモノクローナル抗 体を生成しに。

こうして生成したモノクローナル抗体を使用して、構成体の赤血球結合部分を調 製した。この構成体は、ウサギポリクローナル抗体から調製した断片と同様に、 凝集アッセイにおいて挙動した。

モノクローナルマウス免疫グロブリンＭの調製およびヒト全血を使用するアッセ イ ヒト赤血球と反応する、モノクローナル多発性硬化症免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ ）を調製しｊ；。ハイプリドーマ細胞を腹水としであるいは培養において増殖さ せることによって産生じ、モしてＦＥＩと呼ぶ。腹水をトリス−塩化ナトリウム （生理的塩類溶液）緩衝液（ｐＨ７，４）で希釈し、そしてマイクロタイタープ レートにおいて１：３に希釈したヒト赤血球（０型）に対して滴定した。結果は 視的に得られた。１：４０゜０００より低い希釈においてＦＢＩは凝集を発生さ ゼた。これより高い希釈において、凝集は起こらかなかっ！；。

４００μＱのｌ：１０の抗体およびｌＯＯμＱのメルカプトエタノールアミンを 、還元性条件下に、トリス−生理的塩類溶液緩衝液（ｐＨ７゜４）中で１０時間 室温において一緒にした。還元したＦＥＩ　（ＦＥＩＲ）の滴定は、ｌ　：　５ ０００より低い力価で凝集が起こることを示した。

トリス−生理的塩類溶液緩衝液（ｐＨ７゜４）およびウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ）において１：２５のＦＥＩＲの希釈を行った。これを還元した抗体の原溶液 として使用した。

抗マウスＩｇＭをヒト全血（Ｏ型）と混合した。上に記載した原溶液中の還元し た抗体（ＦＥＩＲ）を、この混合物に種々の濃度で添加した。

細胞の凝集はＦＥＩＲの１　：　１０．００００の希釈で起こり、ＦＥＩＲは赤 血球に結合することが示された。抗ＩｇＭ−ＦＥＩＲサブユニトーヒト赤血球複 合体の形成は、観測された凝集を生ずる（肉眼による）。

抗１ｇＭを含まない対照混合物において、ＦＥＩＲ単独はａ測可能な凝集を起こ さなかった。

同等の態様 当業者は日常の実験を越えないものを使用して、ここに記載する発明を逸脱しな いで特定の実施態様に対する多くの同等の態様を、認識するか、あるいは確証す ることができるであろう。このような同等の態様は次の請求の範囲日常包含され ることを意図する。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成１年７月２８日 Ｉ４ 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１００２３３ ２、発明の名称 粒子含有試料中の分析物の検出 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国マサチュセツツ州０１８４５ノースアンドバー・ピーオ ーボックス２１９名　称　サイトジグネット・インコーホレーテッド４、代理人 　〒１０７ 住　所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号５、補正書の提出年月日 １９８９年２月２日 ６、添付書類の目録 （１）　補正書の写しく翻訳文）　１通　４４請求の範囲 １１工程： ａ１粒子含有試料を、試料中に存在する粒子と結合する第１部分および前記第１ 部分と化学的にに接合され、問題の分析物と結合する第２部分から構成された構 成体と、前記粒子を前記構成体の第１部分に結合させかつ分析物を前記構成体の 第２部分に結合させるために適当な条件下に、接触させ、これによって分析物、 構成体および粒子から構成された複合体を形成し、そして ｂ５分析物、構成体および粒子から構成された複合体の存在を検出する、 からなる、粒子含有試料中の問題の分析物を決定する方法。

２、粒子含有試料は全血である、請求の範囲第１項記載の方法。

３、試料中に存在する分析物の量を複合体が形成する程度を決定することによっ て決定する、請求の範囲第２項記載の方法。

４、ａ１問題の分析物は抗体であり、 ｂ１構成体は、 １１試料中の粒子の表面上に存在する結合部位に対する標的部位を含有する物質 および試料中の粒子の表面上に存在する標的部位に対して相補的な結合部位を含 有する物質から成る群より選択される第１部分、および ２、前記第」部分と化学的に接合され、問題の分析物である抗体に対して特異的 な抗原および問題の分析物である抗体と結合を形成する他の物質から成る群より 選択される第２部分、から構成されている、 請求の範囲第２項記載の方法。

５、工程： ａ１全血の試料を、赤血球に結合する第１部分および前記第１部分と化学的に接 合され、抗原であるか、あるいは問題の分析物と結合を形成する物質である第２ 部分から構成された構成体と、赤血球を前記構成体の第１部分に結合させかつ抗 体を前記構成体の第２部分に結合させる条件下に、接触させ、結合は試料中に存 在する赤血球を凝集させ、モしてｂ１赤血球の凝集を検出する、 からなる、全血中の問題の抗体を決定する方法。

６、全血の試料中に存在する問題の抗体を、赤血球の凝集が起こる程度を決定す ることによって定量する、請求の範囲第５項記載の方法。

７、ａ５問題の分析物は抗原であり、 ｂ１構成体は、 ！、試料中の粒子の表面上に存在する結合部位に対する標的部位を含有する物質 および試料中の粒子の表面上に存在する標的部位に対して相補的な結合部位を含 有する物質から成る群より選択される第り部分、および ２、前記第り部分と化学的に接合され、問題の分析物である抗原に対して特異的 な抗体および問題の分析物である抗原と結合を形成する他の物質から成る群より 選択される第２部分、から構成されている、 請求の範囲第２項記載の方法。

８、全血の試料中に存在する問題の抗原を、試料中で赤血球の凝集が起こる程度 を決定することによって定量する、請求の範囲第７項記載の方法。

Ｉ３、問題の分析物は受容体、酵素、結合性タンパク員、担体分子、ホルモンと の結合を形成する封鎖性化合物および分子、アクチベーター、作用因子、拮抗因 子、阻害因子、基質、コファクターおよび少なくとも２つの結合部位を有する分 子から成る群より選択される、請求の範囲第９項記載の方法。

１４、問題の分析物は細胞に結合されている、請求の範囲第９項記載の方法。

】５、問題の分析物は抗原、抗体、受容体、作用因子および拮抗因子から選択さ れる、請求の範囲第１４）ｌｊｊ記載の方法。

１６、工程： ａ１粒子含有試料を構成体および試薬と接触させ、前記構成体は試料中に存在す る粒子と結合する粒子結合部分および前記粒子結合部分と化学的に接合され、問 題の分析物と結合する分析物結合部分からなり、そして前記試薬は少なくとも２ つの分析物実在物からなり、前記分析物および前記試薬は前記構成体と競合的に 結合し、前記接触は粒子を粒子結合部分に結合させかつ分析物を分析物結合部分 に結合させるために適当な条件下に実施し、そして ｂ１試料中の抗原の阻害の程度を決定する、からなる、１つの結合部位まｌ；は １つの標的部位を有する問題の分析物を粒子含有試料中で定量する方法。

２５、さらに試薬を含み、前記試薬は問題の分析物と結合する少なくとも２つの 分析物結合部分からなる、請求の範囲第２４項記載の組成物。

２６、全血中に存在する細胞と結合する第１部分および前記第１部分と化学的に 接合され、問題の分析物と結合する第２部分からなり、前記２つの部分への結合 は全血の試料中に存在する細胞を凝集させる、少なくとも２つの結合部位または 少なくとも２つの標的部位を有する問題の分析物を、全血の試料中で、検出する 構成体。

２７、赤血球と結合する第１部分および前記第１部分と化学的に接合され、問題 の分析物と結合する第２部分からなる、請求の範囲第２６項記載の構成体。

２８、問題の分析物は抗体であり、そして第２部分は問題の分析物である抗体に 対して特異的な抗原および問題の分析物である抗体と結合を形成する他の物質か ら成る群より選択される、請求の範囲第２６項記載の構成体。

国際調査報告 イー一一＾−−−１轍　ＰＣＴ／ｌｊｓ　８８１００２３３−２−国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： ａ、粒子含有試料を、試料中に存在する粒子と結合する第１部分および問題の分 析物と結合する第２部分から構成された構成体と、前記粒子を前記構成体の第１ 部分に結合させかつ分析物を前記構成体の第２部分に結合させるために適当な条 件下に、接触させ、これによって分析物、構成体および粒子から構成された複合 体を形成し、そしてｂ、分析物、構成体および粒子から構成された複合体の存在 を検出する、 からなる、粒子含有試料中の問題の分析物を決定する方法。 ２、粒子含有試料は全血である、請求の範囲第１項記載の方法。 ３、試料中に存在する分析物の量を複合体が形成する程度を決定することによっ て決定する、請求の範囲第２項記載の方法。 ４、ａ、問題の分析物は抗体であり、 ｂ、構成体は、 １、試料中の粒子の表面上に存在する結合部位に対する標的部位を含有する物質 および試料中の粒子の表面上に存在する標的部位に対して相補的な結合部位を含 有する物質から成る群より選択される第１部分、および ２、問題の分析物である抗体に対して特異的な抗原および問題の分析物である抗 体と結合を形成する他の物質から成る群より選択される第２部分、 から構成されている、 請求の範囲第２項記載の方法。 ５、工程： ａ、全血の試料を、赤血球に結合する第１部分および抗原であるか、あるいは問 題の抗体と結合を形成する物質である第２部分から構成された構成体と、赤血球 を前記構成体の第１部分に結合させかつ抗体を前記構成体の第２部分に結合させ る条件下に、接触させ、待合は試料中に存在する赤血球を凝集させ、そして ｂ、赤血球の凝集を検出する、 からなる、全血中の問題の抗体を決定する方法。 ６、全血の試料中に存在する問題の抗体を、赤血球の凝集が起こる程度を決定す ることによって定量する、請求の範囲第５項記載の方法。 ７、工程： ａ、全血の試料を、赤血球に綜合する第１部分および問題の抗原に対して特異的 な抗体である第２部分から構成された構成体と、赤血球を第１部分に結合させか つ問題の抗原を第２部分に結合させるために適当な条件下に、接触させ、結合は 試料中に存在する赤血球を凝集させ、そして ｂ、試料中の凝集を検出する、 からなる、全血中の問題の抗原を決定する方法。 ８、全血の試料中に存在する問題の抗原を、試料中で赤血球の凝集が起こる程度 を決定することによって定量する、請求の範囲第７項記載の方法。 ９、工程： ａ、凝固が起こらないような方法で全血の試料を獲得し、ｂ、前記試料を、前記 試料中に存在する粒子と結合する粒子結合部分および問題の分析物と結合する分 析物結合部分から構成された構成体と、粒子を粒子結合部分へ結合させかつ分析 物を分析物結合部分へ結合させるために適当な条件下に、接触させ、結合は赤血 球を凝集させ、そしてＣ、試料中の凝集を検出する、 からなる、少なくとも２つの結合部位または少なくとも２つの標的部位を有する 問題の分析物を全血中において決定する方法。 １０、問題の分析物を凝集が起こる程度を決定することによって定量する、請求 の範囲第９項記載の方法。 １１、問題の分析物は抗原であり、そして構成体の分析物結合部分は抗原に対し て特異的な抗体である、請求の範囲第９項記載の方法。 １２、問題の分析物は抗体であり、そして構成体の分析物結合部分け問題の抗体 に対して特異的な抗原である、請求の範囲第９項記載の方法。 １３、問題の分析物は受容体、酵素、結合性タンパク質、担体分子、ホルモンと の結合を形成する封鎖性化合物および分子、アクチベーター、作用因子、拮抗因 子、阻害因子、基質、コファクターおよび少なくとも２つの結合部位を有する分 子から成る群より選択される、請求の範囲第９項記載の方法。 １４、問題の分析物は細胞に結合されている、請求の範囲第９項記載の方法。 １５、問題の分析物は抗原、抗体、受容体、作用因子および拮抗因子から選択さ れる、請求の範囲第１４項記載の方法。 １６、工程： ａ、粒子含有試料を構成体および試薬と接触させ、前記構成体は試料中に存在す る粒子と結合する粒子結合部分３よび問題の分析物と結合する分析物結合部分か らなり、そして前記試薬は少なくとも２つの分析物実在物からなり、前記分析物 および前記試薬は前記構成体と競合的に結合し、前記接触は粒子を粒子結合部分 に結合させかつ分析物を分析物結合部分に結合させるために適当な条件下に実施 し、そしてｂ、試料中の抗原の阻害の程度を決定する、からなる、１つの結合部 位または１つの標的部位を有する問題の分析物を粒子含有試料中で定量する方法 。 １７、粒子含有試料は全血である、請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、問題の分析物はハプテン、ステロイドホルモン、低分子量の柔物、抗生物 質および結合性タンパク質から成る群より選択される、請求の範囲第１７項記載 の方法。 １９、工程： ａ、粒子含有試料を構成体および試薬と接触させ、前記構成体は試料中に存在す る粒子と結合する第１部分および問題の分析物である第２部分からなり、そして 前記試薬は問題の分析物と結合する少なくとも２つの分析物待合部分からなり、 前記接触は粒子を粒子結合部分に結合させかつ問題の分析物を分析物結合部分に 結合させるために適当な条件下に実施し、そして ｂ、試料中の凝集の阻害の程度を決定する、からなる、１つの結合部位または１ つの標的部位を有する問題の分析物を粒子含有試料中で定量する方法。 ２０、粒子含有試料中に存在する粒子と結合する第１部分および問題の分析物と 結合する第２部分から構成された構成体からなる、粒子含有試料中の問題の分析 物を検出する組成物。 ２１、問題の分析物は抗体であり、そして第２部分は問題の分析物である抗体に 対して特異的な抗原および問題の分析物である抗体と結合を形成する他の物質か ら成る群より選択される、請求の範囲第２０項記載の組成物。 ２２、全血の試料中の問題の分析物を検出するための請求の範囲第２０項記載の 組成物。 ２３、さらに試薬を含み、前記試薬は問題の分析物でありかつ前記分析物と競合 的に前記構成体と結合する少なくとも２つの同一成分を有する、請求の範囲第２ ０項記載の組成物。 ２４、粒子含有試料中に存在する粒子と結合する第１部分および問題の分析物で ある第２部分から構成された構成体からなる、粒子含有試料中の問題の分析物を 検出する組成物。 ２５、さらに試薬を含み、前記試薬は問題の分析物と結合する少なくとも２つの 分析物結合部分からなる、請求の範囲第２４項記載の組成物。 ２６、赤血球と結合する第１部分および問題の分析物と結合する第２部分からな る、全血中の問題の分析物を検出する構成体。 ２７、問題の分析物は抗体であり、そして第２部分は問題の分析物である抗体に 対して特異的な抗原および問題の分析物である抗体と結合を形成する他の物質か ら成る群より選択される、請求の範囲第２６項記載の構成体。 ２８、全血中に存在する細胞と結合する第１部分および問題の分析物と待合する 第２部分からなり、前記２つの部分への結合は全血の試料中に存在する細胞を凝 集させる、少なくとも２つの結合部位または少なくとも２つの標的部位を有する 問題の分析物を、全血の試料中で、検出する構成体。 ２９、第１部分は抗体または抗体の断片であり、試料中に存在する赤血球の表面 の抗原と結合する、請求の範囲第２８項記数の構成体。 ３０、ａ）全血中に存在する細胞と結合する第１部分および問題の分析物と結合 する第２部分から構成された構成体、およびｂ）少なくとも２つの分析物から構 成された試薬からなり、問題の分析物と第２部分との結合および試薬と第２部分 との結合は競合的である、１つの結合部位または１つの標的部位を有する問題の 分析物を全血の試料中で検出するための組成物。 ３１、ａ、粒子含有試料中に存在する粒子と結合する第１部分および問題の分析 物と結合する第２部分からなる構成体、ｂ、前記構成体を粒子含有試料と接触さ せる含有手段、からなる、粒子含有試料中の問題の分析物を検出するキット。 ３２、ａ、粒子含有試料中に存在する粒子と結合する第１部分および問題の分析 物および分析物結合部分から成る群より選択される第２部分からなる構成体、 ｂ、少なくとも２つの分析物結合部分または少なくとも２つの分析物実在物から なる試薬、および Ｃ、前記構成体および前記試薬を粒子含有試料と接触させる含有手段、からなる 、１つの結合部位または１つの標的部位を有する問題の分析物を粒子含有試料中 で検出するキット。