BRPI0718231A2 - Métodos e estojos para isolar células - Google Patents

Description

“MÉTODOS E ESTOJOS PARA ISOLAR CÉLULAS” Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade para o pedido provisório U.S. No. 60/828.537, de- positado em 6 de outubro de 2006, e para o pedido provisório U.S. No. 60/894.818, deposi- tado em 14 de março de 2007.

Declaração Relacionada a Pesquisa Patrocinada pelo Governo Federal

Não aplicável.

Introdução

Extração diferencial é usada no isolamento de material de uma célula alvo de uma amostra que contém ou é composta predominantemente de outros tipos de células não al- vos. As células não alvos são preferencialmente lisadas, de maneira que as células alvos possam ser purificadas do material não alvo liberado das células não alvos lisadas. Isto é particularmente usado quando o material alvo é ácido nucléico de um tipo de célula particu- lar a ser usado ou detectado em amplificações de ácido nucléico a jusante em virtude de os ácidos nucléicos contaminantes das células não alvos poderem obscurecer o sinal alvo. Em virtude de a quantidade de gabarito de ácido nucléico usado na amplificação do ácido nu- cléico ter que ser limitada, é particularmente útil reduzir a contribuição de ácidos nucléicos não alvos no gabarito da amostra. Contaminação por material não alvo pode também inter- ferir em outros métodos de detecção, tais como detecção enzimática ou detecção a base de anticorpo de materiais alvos. Lisando células não alvos durante o processo de purificação, o fundo pode ser reduzido, desta maneira aumentando a sensibilidade e/ou confiabilidade de detecção do material alvo.

Exemplos de aplicações nas quais pode-se usar extração diferencial incluem o iso- lamento de células de esperma das amostras forenses, isolamento de organismos que po- dem ser usados como agentes de guerra biológica de diversos materiais tais como esgoto, amostras do solo, amostras do ar, ou fluidos corporais, e isolar organelas das amostras das células.

Material genético obtido de amostras forenses pode ser usado para identificar pes- soas que cometeram de agressões sexuais ou para isentar suspeitos inocentes. DNA purifi- 30 cado obtido das células de esperma isolado das amostras forenses pode ser usado em teste de identidade genética subsequente. O perfil genético do DNA de célula de esperma pode ser comparado ao de um suspeito conhecido ou aos dados de bases contendo informação genética a respeito de um grande número de criminosos condenados.

Em casos de agressão sexual, uma amostra forense tal como um esfregaço vaginal ou retal, ou roupa contendo um a mancha de sangue, é obtida da vítima ou da cena do cri- me para análise forense. Se células de esperma estiverem presentes na amostra, o DNA das células de esperma pode ser isolado e usado em teste de identidade genética. Entretan- to, um esfregaço vaginal obtido de uma vítima de agressão sexual tipicamente contém rela- tivamente poucas células de esperma e grandes números de células epiteliais da vítima. Como uma conseqüência, a menos que as células de esperma sejam primeiro separadas das outras células na amostra, o DNA purificado de uma amostra forense é suscetível à con- 5 taminação esmagadora com DNA de célula epitelial. Tal contaminação interfere na capaci- dade de estabelecer um casamento entre o perfil genético do DNA da amostra e aquele do suspeito ou um membro da base de dados. Deseja-se portanto isolar células de esperma das outras células em uma amostra forense antes do isolamento do DNA e análise.

Técnicas atualmente usadas para isolar células de esperma das outras células em 10 amostras forenses demandam muito tempo e mão-de-obra, e existe atualmente uma reserva de amostras não processadas. Em virtude desta reserva, algumas jurisdições têm uma polí- tica contra o processamento das amostras, a menos que um suspeito tenha sido identifica- do. Consequentemente, muitas amostras não processadas são finalmente descartadas, e a informação genética contida na amostra nunca é comparada ou registrada na base de da- 15 dos nacional, que reduz a capacidade de fazer cumprir a Iei para identificar e apreender in- fratores sexuais recorrentes.

Células de esperma são tipicamente isoladas das amostras forenses contendo célu- las epiteliais Iisando seletivamente as células epiteliais por tratamento com Proteinase K e um detergente em condições não redutoras (Gill et al. Nature 318:577-579, 1985). Após a 20 Iise da célula epitelial, células de esperma intactas são precipitadas por centrifugação e o sobrenadante, que contém DNA de Iise das células epiteliais lisadas, é removido. A fim de minimizar a contaminação por DNA de célula epitelial solúvel, o precipitado de esperma é submetido a lavagens repetidas com um tampão aquoso em uma tentativa de remover o DNA de célula epitelial solúvel. Este processo frequentemente resulta na perda de células 25 de esperma e demanda muita mão de obra.

Células de esperma foram isoladas das amostras contendo tanto esperma quanto células epiteliais ligando seletivamente as células de esperma à célula dos anticorpos poli- clonais ou monoclonais específicos do esperma anexados a um suporte sólido (por exemplo, partículas paramagnéticas). Após ligar as células aos anticorpos imobilizados, o suporte é 30 lavado para remover células não ligadas. Este método exige uma grande quantidade de an- ticorpos e é, portanto, relativamente caro. Além disso, o processo de ligação é ineficiente e as células de esperma tipicamente são perdidas durante as etapas de lavagem, resultando em menor rendimento e menor sensibilidade. Em virtude de as células de esperma passa- rem por mudanças estruturais no pH relativamente baixo da vagina, muitos anticorpos espe- 35 cíficos de célula de esperma não se ligam a células de esperma de todas as amostras con- tendo sêmen. Além do mais, anticorpos podem não se ligar eficientemente em virtude das variações ou mutações em antígenos superficiais da célula de esperma em certos indiví- duos, resultando em baixos rendimentos de célula de esperma. As células de esperma podem ser separadas das células epiteliais com base nas diferenças no tamanho da célula filtrando a amostra através das membranas seletivas do tamanho. Este método é problemático em virtude de as células de esperma tenderem a ficar aprisionadas entre as células epiteliais, muco e detrito celular, as células de esperma for- mam blocos que são muito grandes para passar através da membrana, e a membrana tende a entupir, que finalmente pode resultar em baixo rendimento de células de esperma. Além do mais, o DNA das células epiteliais lisadas passa através da membrana com o esperma e contamina o esperma.

Em um outro método, células de esperma são isoladas primeiro Iisando seletiva- mente células epiteliais e filtrando o Iisado para efetuar a separação do DNA de célula epite- lial solúvel e células de esperma intactas. Entretanto, o método apresenta desvantagens, incluindo o bloqueio da membrana, que resulta na contaminação das células de esperma com DNA de célula epitelial.

No campo da medicina reprodutiva, células de esperma foram isoladas do sêmen fresco usando um classificador celular que, embora efetivo, não é prático no contexto foren- se em virtude do alto custo e consumo de tempo, e não aborda efetivamente como recupe- rar células de esperma e células epiteliais de uma amostra forense (por exemplo, um esfre- gaço ou roupa).

Microdissecação de esperma de uma amostra em uma lâmina é uma outra aborda- gem que obtém esperma livre de contaminação do DNA de célula epitelial. Embora efetiva, esta abordagem não é condutiva a automação e é propensa a tendência seletiva em amos- tras contendo esperma de mais que um contribuinte, uma ocorrência comum em amostras de estupro.

Assim, existe uma necessidade na tecnologia de métodos simplificados para sepa- rar células de esperma das células epiteliais em amostras forenses que podem ser usados em processamento automatizado.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a invenção inclui um método de isolar primeiras células de uma amostra compreendendo primeiras células e segundas células, tratando a amostra para for- mar condições do Iisado aquoso que preferencialmente lisa as segundas células sem Iisar as primeiras células, aplicando uma força na amostra efetiva para formar um precipitado compreendendo as primeiras células, e formando uma proteção de imobilização de precipi- tado entre o precipitado e o Iisado aquoso.

Em um outro aspecto, os métodos permitem que organelas alvos sejam separadas de uma amostra de Iisado aquoso precipitado as organelas alvos intactas e formando uma proteção de imobilização de precipitado entre o precipitado e o Iisado aquoso. Descrição Detalhada da Invenção Métodos adequados são revelados para isolar células de esperma das amostras contendo células não esperma, por exemplo, células epiteliais, Iisando seletivamente as cé- lulas não esperma e em seguida separando as células de esperma intacta das células não esperma lisadas usando uma proteção de imobilização do precipitado. Além de permitir o isolamento de células de esperma, estes métodos foram considerados úteis no isolamento de outros tipos de células das amostras compreendendo mais que um tipo de célula.

Estes métodos são particularmente usados para purificar uma célula alvo de uma amostra incluindo ou composto predominantemente de células não alvos que podem ser preferencialmente lisadas selecionando as condições que Iisam as células não alvos en- quanto as células alvos não são lisadas, ou são lisadas a uma menor extensão do que as células não alvos. Isto facilita o isolamento das células alvos das células não alvos lisadas. As células alvos isoladas podem em seguida ser usadas para isolar, por exemplo, ácido nu- cléico da célula alvo que pode servir como um gabarito em amplificações subsequentes de ácido nucléico. A remoção de material de uma célula não alvo reduz o problema de conta- minação dos ácidos nucléicos das células não alvos, contribuir com o ácido nucléico de fun- do que pode encobrir ou obscurecer o sinal alvo.

Os métodos da invenção são aplicáveis a qualquer aplicação na qual se deseja iso- lar um material de uma célula em um material de partida contendo mais que um tipo de célu- la que são diferencialmente suscetíveis à Iise em certas condições. Os métodos podem ser usados, por exemplo, para purificar microorganismos de uma ampla faixa de materiais em potencial biologicamente complexos tais como esgoto, amostras do solo, amostras do ar, ou fluidos corporais. Microorganismos tais como bactérias, vírus, levedura, e fungo, incluindo, por exemplo, patógenos de ocorrência natural, agentes de guerra biológica, molde tóxico e similares podem ser purificados usando os métodos da invenção. Adicionalmente, os méto- dos podem ser usados para purificar organelas intactas tal como núcleo das amostras das células.

Amostras forenses obtidas das vítimas de agressão sexual tipicamente contêm um grande número de células epiteliais e, se presentes, relativamente poucas células de es- perma. A fim de obter o DNA das células de esperma para uso subsequente em teste de identidade genética, é necessário isolar as células de esperma do material solúvel aquoso, especialmente o DNA, que pode interferir ou complicar a interpretação dos resultados. Por exemplo, o DNA das células epiteliais lisadas é solúvel em soluções aquosas.

Aqui a seguir são descritos métodos nos quais as células de esperma são separa- das do material aquoso solúvel em uma amostra aplicando-se uma força à amostra, tipica- mente por centrifugação, por um período de tempo suficiente para formar um precipitado de esperma, e distribuindo um material de proteção de imobilização de precipitado na amostra para formar uma barreira entre o precipitado de esperma e o material aquoso. O material aquoso solúvel (por exemplo, o DNA) permanece na fase aquosa e é fisicamente separado das células de esperma precipitado pela proteção de imobilização de precipitado. A proteção de imobilização de precipitado minimiza a separação do precipitado da célula de esperma que pode ocorrer, por exemplo, quando os líquidos são adicionados ou removidos do recipi- ente. O uso de uma proteção de imobilização de precipitado de acordo com a presente in- venção facilita a remoção de material contaminante (por exemplo, DNA de célula epitelial), minimizando ainda a perda do precipitado da célula de esperma. Precipitados da célula de esperma soltos formados por forças centrífugas relativamente baixas são particularmente suscetíveis a separação. Portanto, os métodos da invenção são particularmente adequados em sistemas de alta produção empregando placas multipoços, que são adaptadas para o uso em rotores de placa capaz de aplicar apenas forças centrífugas relativamente baixas. Os métodos são também usados na separação de precipitados da célula de esperma den- samente empacotados formados sob forças centrífugas relativamente altas do material con- taminante.

Da maneira aqui usada, “células de esperma” podem incluir uma célula de esperma intacta ou célula de esperma essencialmente intacta, e uma célula de esperma que perdeu seu flagelo ou “cauda”, e inclui precursores de célula de esperma imaturo tais como esper- matídeos. Embora uma célula de esperma possa ter sido exposta às condições ambientais, 20 desvio mecânico, ou tratamento químico (por exemplo, exposição a Proteinase K ou outros agentes) que alteraram a célula, tais células se enquadram no escopo da invenção, especi- almente as células que retêm seus núcleos.

Amostras forenses das vítimas de agressão sexual são tipicamente coletadas em um suporte sólido, tais como um esfregaço ou roupa (por exemplo, um pedaço da roupa contendo uma mancha de sangue). O esfregaço ou roupa pode ser transferido para um re- cipiente tal como um tubo de teste ou outro recipiente adequado e colocado em contato com uma solução aquosa tal como um tampão de lise, por exemplo, que preferencialmente lisa as células não esperma. Após a transferência do material do suporte sólido para a solução aquosa, o recipiente é centrifugado para efetuar a sedimentação ou precipitação das células de esperma no material aquoso. Opcionalmente, a recuperação do tampão aquoso e células de esperma pode ser facilitada transferindo o suporte sólido e tampão aquoso para um se- gundo recipiente equipado com uma barreira mecânica que efetivamente previne a passa- gem do suporte sólido permitindo ao mesmo tempo que a amostra líquida passe. A recupe- ração da amostra aquosa do suporte sólido e precipitação das células de esperma podem ser realizadas em uma única centrifugação.

O tampão de Iise usado para Iisar seletivamente as células epiteliais compreende adequadamente Proteinase K, e Sarkosyl ou SDS. Opcionalmente, o tampão de Iise pode compreender qualquer corante solúvel em água adequado (por exemplo, FD & C Amarelo) para melhorar a visualização da fase aquosa. O material é tratado com uma quantidade a- dequada de uma protease, tal como Proteinase K, em condições que permitem Iise das célu- las epiteliais, mas não promovem Iise das células de esperma. Células de esperma são rela- 5 tivamente resistentes a proteases em virtude de as proteínas expostas conterem um número relativamente grande de ligações de dissulfeto. Portanto, condições redutoras não são ade- quadas para Iise diferencial em virtude de a presença de agentes de redução interromper as ligações de dissulfeto e aumentar a Iise de células de esperma tratadas com proteases. Considera-se também que digitonina ou detergentes não iônicos tal como Tergitol possam 10 ser usados para impermeabilizar ou Iisar seletivamente diferentes tipos de células. Espera- se que em virtude de suas estruturas, células epiteliais sejam mais sensíveis a permeabili- zação ou Iise por digitonina do que as células de esperma. Similarmente, espera-se que células tendo diferente teor de colesterol apresentem suscetibilidade diferencial a permeabi- lização por digitonina.

Após o tratamento com a Proteinase K e detergente, o Iisado contendo as células

epiteliais lisadas e células de esperma intactas é centrifugado para precipitar as células de esperma. Um material de proteção de imobilização de precipitado é em seguida transferido para o recipiente para formar uma proteção de imobilização de precipitado entre as células de esperma precipitado e o material aquoso. Preferivelmente, a camada da proteção de i- 20 mobilização de precipitado é transferida para perto da porção inferior do material aquoso, logo acima do precipitado da célula de esperma. O material aquoso é em seguida removido, enquanto a proteção de imobilização de precipitado permanece no Iugardo precipitado.

Nos exemplos a seguir, partículas paramagnéticas MagneSil® (Promega Corp.) e resina de DNA IQ® (cat# A8252, Promega Corp., Madison, Wl) foram usadas como um ma- 25 terial de proteção de imobilização de precipitado para formar uma proteção de imobilização de precipitado entre o precipitado da célula e material não alvo (por exemplo, material aquo- so ou Iisado de célula não alvo). Uma proteção de imobilização de precipitado foi mantida no lugar entre o precipitado e material não alvo colocando um ímã no precipitado da célula du- rante a remoção do material aquoso para impedir mistura e separação do precipitado. Uma 30 vez que o material aquoso foi removido e o precipitado da célula lavado, as células no preci- pitado da célula foram lisadas em condições que permitem que o DNA das células se liguem às partículas.

Considera-se que outros materiais paramagnéticos adequados possam ser usados para formar uma proteção de imobilização de precipitado sobre o precipitado da célula para impedir separação do precipitado da célula de esperma durante a remoção do material a- quoso, incluindo, mas sem limitações aqueles descritos na Patente US 6.673.631, intitulada “Simultaneous Isolation and Quantitatíon of DNA”, de Tereba et al e patente US 6.027.945, intitulada “Methods of Isolating Biological Target Materials Using Siliea Magnetie Particles”, de Smith et al. Em uma modalidade preferida da presente invenção, o volume total de mate- rial magnético ou paramagnético da proteção de imobilização de precipitado será cerca de 40 uL ou menos. Em uma modalidade mais preferida da presente invenção, o volume total 5 de material magnético ou paramagnético da proteção de imobilização de precipitado por amostra será cerca de 10 uL ou menos. Em uma modalidade ainda mais preferida da pre- sente invenção, o volume total de material magnético ou paramagnético da proteção de i- mobilização de precipitado por amostra será cerca de 2 uL ou menos.

As partículas magnéticas compreendem material ferroso. Considera-se especifica- mente que outros materiais magnéticos ou paramagnéticos poderiam ser empregados, tais como materiais contendo níquel ou cobalto. As partículas magnéticas podem ser revestidas com material compreendendo compostos de sílica ou celulósicos (por exemplo, celulose, dextrano, ou agarose) tais como os descritos na Patente US 6.855.499.

Uma modalidade preferida da presente invenção utiliza partículas magnéticas ou 15 paramagnéticas agregadas em que cada partícula compreende dois ou mais núcleos mag- néticos ou paramagnéticos que são cobertos por um revestimento óxido silicioso. Um tama- nho preferido para tais partículas magnéticas agregadas é 1-15 microns na menor dimensão da partícula. Uma partícula preferida de área superficial BET para estas partículas magnéti- cas agregadas é de cerca de 1 m2/gm a cerca de 50 m2/gm da maneira determinada por 20 absorção de nitrogênio.

Um outro material adequado para o uso como uma proteção de imobilização de precipitado é pelo menos um material magnético compreendendo material magnético con- tendo fibra tecida ou não tecida, tal como um material magnético moldável comercialmente disponível pela 3M. Em operação, ele seria devidamente dimensionado para formar uma 25 camada entre o precipitado e a fase aquosa. O material poderia ser uma superfície sólida ou conter aberturas de tamanho suficiente para permitir a passagem de líquido, mas não do material precipitado. Por exemplo, o material magnético compreenderia rede com uma aber- tura menor que a menor dimensão do material alvo (por exemplo, esperma). O uso de múlti- plos materiais pode fornecer segurança adicional de que o precipitado é coberto durante as 30 etapas de processamento. Materiais magnéticos podem ser ímãs moldáveis plásticos. Os ímãs plásticos são ímãs de baixo custo que podem ser moldados, estampados ou usinados em uma forma particular, são leves e têm alta intensidade magnética. Um exemplo de tais ímãs plásticos é o material de ímã B-1060 fabricado pela 3M Electronics Products Division de St. Paul, MN. ímãs permanentes na forma de chapas finas ou trias de ferrita flexível dis- 35 poníveis pela Dexter Magnetic Technologies (Elk Grove Village, IL) poderiam também ser usados para formar um material tecido ou não tecido.

Materiais adequados para o uso como uma proteção de imobilização de precipitado incluem materiais com uma densidade maior que a do material aquoso, isto é, maior que cerca de 1,0 g/cm3. Preferivelmente, o material de proteção de imobilização de precipitado é um que não se liga ao material aquoso solúvel nas condições usadas para efetuar separa- ção entre o precipitado da célula de esperma e o material aquoso. Adicionalmente, o materi- al é preferivelmente capaz de deslocar o material aquoso para formar uma proteção de imo- bilização de precipitado sobre o precipitado da célula de esperma, ao mesmo tempo exclu- indo substancialmente o material aquoso. Convenientemente, o material de proteção de i- mobilização de precipitado é configurado para resistir a mistura como, por exemplo, em res- posta a adição ou a remoção de líquidos do sistema. Em um método preferido de usar a presente invenção, a proteção de imobilização de precipitado é capaz de ser mantida no lugar pela aplicação de um campo magnético externo, ou fisicamente por uma mudança no estado da proteção de imobilização do precipitado, tal como uma mudança na temperatura ou pressão. Embora o tamanho de partícula não seja crítico, espera-se que partículas relati- vamente pequenas aprisionem menos solução aquosa e que portanto exijam menos Iava- gens.

Exemplos de materiais de proteção de imobilização de precipitado adequados in- cluem um material sensível a temperatura. O material sensível a temperatura encontra-se em um estado sólido ou estado semi-sólido a temperaturas acima de cerca de 32 0C e lí- quido abaixo de cerca de 32 °C. Dessa maneira, o material sensível a temperatura se en- 20 contra no estado líquido à temperatura ambiente. O material sensível a temperatura é rever- sivelmente conversível de líquido a sólido (ou estado semi-sólido) e vice-versa, de maneira que seja criada uma proteção de imobilização de precipitado aquecendo-se suficientemente a amostra para converter o material sensível a temperatura em uma fase sólida.

Um material sensível a temperatura exemplar é N-isopropilacrilamida (NIPA) (tam- bém conhecido como N-(n-Propil) acrilamida; Registro No. 2210-25-5). Outros materiais sensíveis a temperatura adequados incluem poli(N,N- dimetilacrilamida), poli(etilacrilamida), poli(N-etilmetacrilamida), poli[N-(3 etoxipropíl)acrílamida]; poli[N-(2- hidroxipro- pil)metacrilamida]; poli(N-vinilisobutiramida), poli(N-vinilacetamida), um copolímero de meto- xi poli(etileno glicol) e poli(propileno fumarato), um éter vinílico de etileno glicol, hidroxipro- pilcelulose, etil hidroxietil celulose, metil celulose, poli(éter vinil metílico), éter butil vinílico, poliglicidol, éster acriloil-L-prolina metílico, um vinil pirrolidona e copolímero de acetato de vinila, um copolímero de N-acriloil-N'-alquil piperazina e metacrilato de metila, poli(metil 2- propionamidoacrilato), poli(ácido acrílico), poli(metacrilato de acrilamida-co-butila), po- li(organofosfazenos), poli(2-etil-2-oxazolina), gelatina, poli(N-vinilcaprolactam), elastina, poli- peptídeo mimético de elastina, 2,4,6 trimetilpiridina e poli(N-vinilpirrolidona).

Um líquido não aquoso com uma densidade maior que a do material aquoso pode opcionalmente ser adicionado após a formação da proteção de imobilização de precipitado sobre o precipitado da célula de esperma e antes da remoção do material aquoso para facili- tar a remoção do material aquoso. Líquidos não aquosos adequados para o uso em combi- nação com os métodos da invenção incluem aqueles descritos no pedido U.S. No. de série 10/939.105, que está aqui incorporado pela referência. A densidade do líquido não aquoso é 5 preferivelmente intermediária à do material aquoso e a do material de proteção de imobiliza- ção de precipitado. Entretanto, se o material de proteção de imobilização de precipitado for mantido no lugar por um outro material de força, por exemplo, uma força magnética aplicada a uma proteção de imobilização do precipitado paramagnética, um líquido não aquoso com uma densidade maior que a do material de proteção de imobilização de precipitado pode 10 convenientemente ser usado. Depois da adição do líquido não aquoso, as fases aquosa e não aquosa são separadas, opcionalmente facilitado por centrifugação, e a fase aquosa é removida.

Está bem de acordo com a capacidade dos versados na técnica avaliar a adequabi- Iidade de líquidos não aquosos para facilitar a remoção do material aquoso de acordo com o 15 método da invenção. O líquido não aquoso é convenientemente não caotrópico de maneira a impedir Iise indesejável das células precipitadas. O líquido não aquoso é preferivelmente um que tem uma solubilidade relativamente baixa em água. O uso de um líquido não aquoso com baixa solubilidade em água tipicamente proporcionará melhor separação de fases e menor contaminação do precipitado da célula de esperma com materiais solúveis em água, 20 tal como DNA de célula epitelial.

Como descrito com detalhes no pedido U.S. No. de série 10/939.105, líquidos não aquosos adequados incluem, mas sem limitações, glutarato de dietila (“DEG”), glutarato de dimetila (“DMG”), e 1-cloro-2-metil-2-propanol. A densidade do líquido não aquoso pode ser ajustada usando dois ou mais líquidos não aquosos com diferentes densidades em combi- 25 nação a razões efetivas para obter a densidade desejada. Quando dois ou mais líquidos não aquosos são usados, os líquidos são convenientemente substancialmente miscíveis uns com os outros de maneira a formar uma mistura líquida de densidade substancialmente uni- forme. Alternativamente, a extração de DNA do precipitado pode ser realizada usando mé- todos de purificação padrões.

Além do mais, considera-se especificamente que clorofórmio poderia ser usado em

combinação com DMG, DEG ou 1-cloro-2-metil-2-propanol para isolar células de esperma selecionando razões apropriadas para fornecer um líquido não aquoso misturado com uma densidade adequada.

DNA de célula epitelial de células epiteliais lisadas, que é solúvel em água, é en- contrado na camada aquosa, e é separado removendo-se o material aquoso por qualquer meio adequado, incluindo, por exemplo, por pipetação. O DNA de célula epitelial presente na fase aquosa pode opcionalmente ser usado como um controle em teste de identidade genética para confirmar a fonte da amostra. Após a recuperação da fase aquosa, uma pe- quena quantidade de solução aquosa pode permanecer na superfície da barreira e na pare- de do recipiente, ou próxima a estes. Opcionalmente, para melhorar a remoção da solução aquosa e DNA de célula epitelial sem romper o precipitado da célula de esperma, a solução 5 aquosa residual pode ser removida por lavagem com água ou uma solução aquosa adequa- da. Opcionalmente, o material de proteção de imobilização de precipitado e células de es- perma podem ser precipitados, e a lavagem aquosa removida. Opcionalmente, material de proteção de imobilização de precipitado adicional pode ser adicionado para formar uma pro- teção de imobilização de precipitado adicional sobre as células de esperma previamente 10 precipitada e capeada antes da remoção do material da lavagem aquosa. O material de pro- teção de imobilização de precipitado adicional pode ser igual ou diferente do material de proteção de imobilização de precipitado adicionado durante a purificação inicial.

Como descrito nos exemplos, o material aquoso pode ser removido para deixar um precipitado da célula de esperma, e as células de esperma podem ser lisadas colocando as células em contato com uma solução aquosa compreendendo um detergente e/ou caotropo e pode também conter DTT, seguido por extração de DNA. Alternativamente, a extração de DNA do precipitado pode ser realizada usando métodos de purificação padrões.

Por exemplo, após a remoção da fase aquosa, um tampão de Iise contendo um a- gente caotrópico e um agente redutor pode ser adicionado ao líquido não aquoso e vortexa- 20 do para formar uma mistura substancialmente homogênea. Como mostrado nos exemplos, um tampão de Iise contendo tiocianato de guanidina (GTC) e ditiotreitol (DTT) foi combinado com resina de sílica magnética de fase não aquosa, e precipitado da célula de esperma para efetuar Iise das células de esperma e ligação do DNA liberado das células mediante Iise na resina de sílica magnética.

Alternativamente, tanto a camada aquosa quanto não aquosa podem ser removidas

para deixar um precipitado da célula de esperma, e as células de esperma presentes podem ser lisadas colocando as células em contato com uma solução aquosa compreendendo um detergente, tal como dodecil sulfato de sódio (SDS), e um agente redutor, tal como DTT. Lise pode ser seguida pelo isolamento do DNA por extração com fenokclorofórmio ou usan- 30 do qualquer método de purificação de DNA adequado, por exemplo, métodos de purificação de DNA padrões conhecidos na tecnologia.

Como descrito nos exemplos, o método da invenção foi considerado efetivo no iso- lamento de células de esperma de células epiteliais contidas em amostras forenses tais co- mo esfregaços vaginais ou cervicais. Considera-se que o método será usado no isolamento 35 células de esperma de outras fontes, incluindo outros suportes sólidos contendo sêmen, tal como roupa. Espera-se razoavelmente que o método da invenção seja adequado para uso com amostras contendo células de esperma e células do sangue vermelho ou azul contami- nantes ou DNA derivado de outras células não esperma nucleadas.

Além de sua adequabilidade para o uso no isolamento de células de esperma, es- pera-se que o método da invenção tenha aplicabilidade geral na separação de células com base nas sensitividades diferenciais a várias condições de lise. Por exemplo, o método da 5 invenção pode ser adaptado para separar certas células bacterianas gram positivas de célu- las gram negativas após a Iise diferencial das células gram negativas pelo tratamento com lisozima, ao qual as células gram negativas são particularmente suscetíveis.

Adicionalmente, o método é usado no isolamento material de organela subcelular solúvel em um solvente aquoso após Iise seletiva, por exemplo, Iise seletiva da membrana 10 celular ou parede celular. Como descrito nos exemplos a seguir, o método foi considerado útil para ser usado no isolamento de núcleo de outros substituintes celulares após Iise celu- lar de sangue total. O método é usado na separação de material precipitado alvo de substi- tuintes celulares em solução, e é também usado na separação de substituintes celulares alvos de material precipitado não alvo.

Opcionalmente, núcleo celular pode ser isolado usando os métodos da invenção Ii-

sando seletivamente a membrana celular de uma célula usando condições nas quais a Iise da membrana nuclear é minimizada. O exemplo 6 descreve, prognosticamente, o uso dos métodos da invenção para isolar RNA de células HEK tratando as células com um tampão de Iise que inclui digitonina e RNasin. Nessas condições, espera-se que a membrana celular 20 seja pelo menos parcialmente lisadas para permitir a liberação de RNA citoplásmico da célu- la, e que o núcleo celular permaneça suficientemente intacto para permitir que ele seja pre- cipitado por centrifugação, enquanto o RNA permanece no lisado. Lise ou permeabilização seletiva usando digitonina é descrito com mais detalhes no pedido provisório U.S. No. de série 60/894.810, depositado em 14 de março de 2007, que está aqui incorporado na sua 25 íntegra pela referência. Uma proteção de imobilização de precipitado é em seguida formada entre o precipitado e o lisado compreendendo o RNA.

O exemplo 6 descreve, prognosticamente, o uso de um tampão de Iise compreen- dendo 40 mg/mL digitonina. Entretanto, considera-se que digitonina possa ser usada em qualquer concentração adequada, desde que a concentração seja efetiva para Iisar a mem- 30 brana celular, sem causar Iise ou permeabilização substancial do núcleo. Lise substancial do núcleo é aquela que interferiria na capacidade de precipitar o núcleo. Preferivelmente, pelo menos 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 99% do núcleo podem ser removidos por centrifuga- ção. Por exemplo, considera-se que digitonina em concentrações de 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 mg/mL seja adequada. O exemplo 6 também descreve, prognosti- 35 camente, incluir no tampão de Iise RNasin Plus a uma concentração de 400 U/mL. Conside- ra-se que RNasin possa ser incluído em uma quantidade efetiva para inibir qualquer RNase que pode estar presente até um ponto suficiente para permitir o isolamento de pelo menos parte do RNA. Preferivelmente, RNasin está presente em uma concentração de pelo menos 0,1 unidade/uL de lisado, 0,2 unidade/uL de lisado, 0,4 unidade/uL de lisado, 1,0 unidade/uL de lisado, 2 unidade/uL de lisado, 4 unidade/uL de lisado, 6 unidade/uL de lisado, 8 unida- de/uL de lisado, ou 12 unidade/uL de lisado. Conforme versados na tecnologia percebem, qualquer RNasin adequado pode ser usado.

O exemplo 7 descreve, prognosticamente, Iise seletiva de células epiteliais em uma amostra compreendendo tanto células epiteliais quanto células de esperma. Espera-se que o uso de um tampão de Iise compreendendo digitonina ou um detergente não iônico tal co- mo Tergitol, ou uma mistura destes, reduza a quantidade de Proteinase K necessária para 10 Iisar as células epiteliais, ou eliminar completamente a necessidade de Proteinase K. A re- dução de Pproteinase K pode resultar em menor degradação ou Iise de células de esperma e melhor rendimento de células de esperma e do ácidos nucléicos de células de esperma.

O exemplo 7 descreve, prognosticamente, o uso de um tampão de Iise compreen- dendo 40 mg/mL digitonina. Entretanto, considera-se que digitonina possa ser usada em 15 qualquer concentração adequada, desde que a concentração seja efetiva para Iisar as célu- las epiteliais, sem causar Iise substancial das células de esperma. Por exemplo, considera- se que digitonina em concentrações de 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 mg/mL seja adequada. Lise substancial das células de esperma é aquela que interferiria na capacidade de precipitar células de esperma. Preferivelmente, pelo menos 5%, 10%, 25%, 20 50%, 75% ou 99% das células de esperma podem ser removidos por centrifugação.

Convenientemente, materiais usados nos métodos da invenção podem ser providos como um estojo. Um estojo compreende adequadamente um material de proteção de imobi- lização de precipitado, por exemplo, partículas paramagnéticas, partículas magnéticas ou paramagnéticas de sílica agregada ou partículas magnéticas de sílica, tais como partículas 25 MagneSil®. Um estojo da presente invenção pode também compreender um ou mais outros componentes usados no isolamento de células particulares, organelas subcelulares, ou componentes celulares de células particulares. Por exemplo, os estojos podem conter um tampão ou reagente usado na Iise diferencial de células contaminantes, por exemplo, Pro- teinase K, lisozima, ou um detergente. Opcionalmente, o estojo pode compreender compo- 30 nentes usados no isolamento de DNA de célula de interesse, incluindo, por exemplo, um agente caotrópico. O estojo pode opcionalmente conter um líquido não aquoso de uma den- sidade adequada para facilitar a remoção de materiais aquosos.

Os exemplos não Iimitantes seguintes devem ser puramente ilustrativos.

Exemplo 1.Método de Proteção de imobilização de Precipitado vs. Método Padrão de Centrifugações e Lavagens sucessivas

Amostras usadas neste exemplo foram esfregaços de amostras secos preparados a partir de esfregaços vaginais aos quais foi adicionado sêmen diluído com água nanopura para render o equivalente de 0,2 pL sêmen (-32.000 esperma) por esfregaço. O substrato de tecido de algodão de cada esfregaço foi dividido ao meio para formar duas amostras. 400 pL de Tampão de Digestão (Promega) com 108 pg de Proteinase K (número V3022 do ca- tálogo Promega) foram adicionados a cada amostra em um tubo de microcentrífuga de 1,5 5 mL. As amostras foram vortexadas por 30 segundos e incubadas a 56 0C por 1 hora. Após incubação, as porções do substrato de tecido de algodão dos esfregaços foram removidas da solução com pinças e transferidas para cestos rotativos assentados em tubos de micro- centrífuga de 1,5 mL frescos. As digestões do líquido remanescente foram transferidas por pipeta para os cestos rotativos contendo o substrato de tecido de algodão correspondente. 10 Amostras foram centrifugadas em um rotor de caçamba oscilante (Todas da Beckman: Cen- trífuga Allegra 6R; Rotor GH-3.8; Microplus Carrier; Estante de tubos de 24 posições Bio- mek2000 com adaptadores de tubo de microcentrífuga de 1,5 mL) a 1.400 x g (3.000 rpm) por 10 minutos. Os cestos rotativos, que continham os substratos de tecido de algodão, fo- ram removidos dos tubos de amostra e descartados. As amostras foram divididas em dois 15 grupos de tratamento: Grupo 1 (proteção de imobilização do precipitado) e Grupo 2 (Centri- fugação/lavagem) para obter frações de esperma.

Grupo 1: 7 pL de resina de DNA IQ™ (cat# A8252, Promega Corp.) foram adiciona- dos a cada tubo de amostra centrifugado. O tubo foi colocado sobre um ímã chato de manei- ra tal que a Resina de DNA IQ™ magnetizada localizasse na porção inferior do tubo onde um precipitado da célula foi visto ou que se esperou ser visto. 100 pL de Solução de Sepa- ração Differex™ (cat# A8512) foram em seguida adicionados a cada tubo de amostra próxi- mo da base da digestão aquosa, mas acima da resina magnetizada. A fração da digestão aquosa e a Solução de Separação se separaram em uma camada aquosa superior e uma camada não aquosa inferior. A camada aquosa superior foi removida. As paredes do tubo e a superfície superior da camada não aquosa foram lavadas com duas lavagens seriais com água nanopura de 500 //L. Após remoção da lavagem final, 200 pL de Tampão de Iise de DNA IQTM (cat# A8262) com 60 mM DTT foram adicionados a cada amostra, e as amostras foram vortexadas rapidamente. O isolamento do DNA foi feito usando o Sistema de isola- mento de ácido nucléico de DNA IQTM (cat# DC6700). O DNA foi eluído em um volume de 40 pL.

Grupo 2: Após a centrifugação, a maior parte do sobrenadante da digestão foi re- movida, restando 15 a 20 pL de sobrenadante sobre o precipitado celular. Uma alíquota de 500 pL de água nanopura foi adicionada a cada amostra, e as amostras foram centrifugadas em uma centrífuga por mais 10 minutos. O sobrenadante foi removido para deixar 15 a 20 35 pL. O processo de lavagem foi repetido duas vezes por um total de três lavagens com água. Após a remoção da lavagem final, 100 pL Tampão de Iise IQ de DNA com 60 mM DTT fo- ram adicionados a cada amostra. 7 pL IQ de DNA de resina foram adicionados a cada a- mostra. As amostras foram vortexadas rapidamente e usadas como material de partida para isolamento de ácido nucléico IQ de DNA. Os isolamentos do DNA foram eluídos em volume de 40 pL.

Amostras de fração de esperma dos Grupos 1 e 2 foram quantificadas usando sis-

tema de ensaio Quantifiler Y (Applied Biosistemas, San Carlos CA, número de catálogo 4343906). Uma amplificação STR de TH01 único local (Promega Corp, cat#DC6561) foi feita para cada amostra de fração esperma, usando gabarito de 0,5 a 1,25 ng. Eletroforese capilar foi feita (3100 Genetic Analyzer; Applied Biosistemas) para amostra da fração macho combinando 1 pL do produto de amplificação TH01 com 9 pL Hi-Corante Formamida e 1 pL 10 ILS600. Parâmetros de injeção para dados resultantes do eletroforese capilar foram analisa- dos usando Genescan software (Applied Biosistemas).

No local TH01, tanto de contribuintes fêmeas quanto de machos foram heterozigo- tos. O contribuinte fêmea apresentou um genótipo de (9.3, 9) e o contribuinte macho apre- sentou um genótipo de (9. 6). Ambos contribuintes compartilharam do alelo da repetição 9 15 no local TH01. Os alelos TH01 não compartilhados entre os dois contribuintes foram repeti- ções 9.3 (específicas de fêmea) e repetições 6 (específicas de macho). Os picos de eletrofe- rograma para os produtos de amplificação par base-repetição 9,3 e 6 apresentados no canal de fluoresceína em aproximadamente 175 e 161 pares base, respectivamente.

Exame das intensidades fluorescentes desses picos, manifestadas como alturas de pico dos eletroferogramas, foi usado para determinar representação relativa dos dois contri- buintes nas amostras de fração de macho. Os resultados obtidos para os dois picos alelos não compartilhados (específico de fêmea e macho) são apresentados em Tabela 1 a seguir.

Tabela 1.

Amostra altura do pico 175bp (específi¬ altura do pico 161 bp (especí¬ co de fêmea) em unidades de fico de macho) em unidades fluorescência relativa de fluorescência relativa Grupo de tratamento 1 329 739 Réplica 1 Grupo de tratamento 1 0 370 Réplica 2 Grupo de tratamento 1 0 1.069 Réplica 3 Grupo de tratamento 2 0 184 Réplica 1 Grupo de tratamento 2 0 1205 Réplica 2 Grupo de tratamento 2 0 262 Réplica 3 Estes dados mostram que a proteção de imobilização de precipitado (Grupo 1) de- sempenha comparavelmente to o método diferencial de extração tradicional de diluições, centrifugações e remoções de fração epitelial em série (Grupo 2) na separação do esperma da maioria das células epiteliais de fêmea em uma fração de macho que é predominante- mente livre de transporte do DNA epitelial de fêmea.

Exemplo 2. Imobilização Magnética de um Precipitado de Esperma Usando Resina de DNA IQ™, com e sem um Líquido Não Aquoso, como uma Proteção de Imobilização do Precipitado.

Amostras usadas neste exemplo, foram esfregaços de amostras secos preparados a partir de esfregaços vaginais aos quais foram diluídos sêmen com água nanopura para render o equivalente de 2 μΙ_ de sêmen (-200.000 esperma) por esfregaço. O substrato de tecido de algodão de cada esfregaço foi dividido ao meio para formar duas amostras. 400 pL de tampão de digestão com 310 pg de Proteinase K foram adicionados a cada amostra em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. As amostras foram vortexadas por 30 segundos e incu- badas a 56 0C por 90 minutos. Após a incubação, os substratos de tecido de algodão foram removidos da solução com pinças e transferidos para cestos rotativos assentados em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL frescos. As digestões do líquido remanescente foram transfe- ridas por pipeta para os cestos rotativos contendo o substrato de tecido de algodão corres- pondente. As amostras foram capeadas e centrifugadas em um rotor de caçamba oscilante a 1.400 x g (3.000 rpm) por 10 minutos. Os cestos rotativos, que continham os substratos de tecido de algodão, foram removidos dos tubos de amostra e descartados. Amostras foram colocadas em um MagneSphere Technology Magnetic Separação Stand (Promega catalog# Z5332) modificado de maneira que o campo magnético fosse concentrado no precipitado da célula na base do tubo. 7 pL de resina de DNA IQ™ foram em seguida adicionados a cada tubo de amostra. As amostras foram divididas em dois grupos de tratamento: Grupo 1 (imo- bilização do precipitado de esperma da resina de DNA IQ™ seguido pela adição de barreira do líquido não aquoso) e Grupo 2 (Imobilização do precipitado com resina de DNA IQ™ so- zinha).

Grupo 1: 100 pL de Differex™ de Solução de Separação (glutarato de dimetila) 30 (cat# A8512) foram em seguida adicionados a cada tubo de amostra próximo da base da digestão aquosa, mas acima da resina magnetizada para cobrir a resina e precipitado da célula. A fração da digestão aquosa e a Solução de Separação são separadas em uma ca- mada aquosa superior e uma camada não aquosa inferior. A camada aquosa superior foi removida. 500 pL de água livre de Nuclease (Promega Corp., Cat# P1193) foram adiciona- dos suavemente a cada tubo para lavar as paredes do tubo e superfície superior de Solução de Separação. Os tubos da amostra retornaram ao rotor de caçamba oscilante para centri- fugação por mais 10 minutos a 1.400 x g. Após a centrifugação, a lavagem com água foi removida e descartada. A etapa de lavagem foi repetida duas vezes mais para um total de 5 três lavagens com água. 250 μΙ_ de tampão de Iise DNA IQ™ com DTT a 60 mM foram em seguida adicionados às amostras e as amostras foram vortexadas rapidamente. As amos- tras resultantes foram usadas como material de partida para isolamento de ácido nucléico de DNA IQ™.

Grupo 2: A maior parte da digestão epitelial aquosa foi removida, deixando cerca de 10 20 pL do volume residual em tubo de amostra acima do precipitado da célula imobilizado por resina. 500 pL de água livre de Nuclease foram suavemente adicionados aos tubos de a- mostra para diluir o DNA de célula epitelial presente no sobrenadante. O volume da lavagem foi removido, deixando 20 pL de volume residual. O processo de lavagem foi repetido duas vezes, para um total de três lavagens. 250 pL de tampão de Iise DNA IQ™, com DTT adi- 15 cionados ta 60 mM, foram adicionados às amostras e as amostras foram vortexadas rapi- damente. As amostras resultantes foram usadas como material de partida para isolamento de ácido nucléico de DNA IQ™.

Frações de esperma de ambos grupos de tratamento foram transferidas para poços de uma placa de 96 poços com 2,2 mL de capacidade por poço (ABgene catalog #AB-0932, Rochester, NY). O DNA foi isolado das amostras na placa usando isolamento de ácido nu- cléico de DNA IQ™ automatizado no Biomek® 2000 Workstation (Beckman Coulter). O DNA Isolado foi eluído de cada amostra em um volume de 100 pL.

Cada preparação de DNA foi quantificada por teor de DNA específico de macho u- sando um ensaio de PCR quantitativo Plexor™ (Promega catalog # A4011) alvejado para o 25 cromossomo Y. 0,25 ng DNA específico de macho de cada preparação da fração de esper- ma foi usado como gabarito para amplificação STR em único local TH01. No local TH01, tanto contribuinte fêmea quanto machos eram heterozigoto. O contribuinte fêmea apresen- tou um genótipo de (9.3, 9) e o contribuinte macho apresentou um genótipo de (9, 6). Ambos contribuintes compartilharam o alelo de repetição 9 no local TH01. Os alelos THOI não 30 compartilhados entre os dois contribuintes foram repetições 9.3 (específicas de fêmea) e repetições 6 (específicas de macho). Picos de eletroferograma para os produtos de amplifi- cação par base-repetição 9.3 e 6 apresentaram no canal de fluoresceína em aproximada- mente 175 e 161 pares base, respectivamente.

Exame das intensidades fluorescentes desses picos, manifestadas como alturas do pico dos eletroferogramas, foi usado para determinar representação relativa dos dois contri- buintes nas amostras de fração de macho. O resultado obtido para os dois picos alelos não compartilhados (específico de fêmea e de macho) são apresentados na Tabela 2 a seguir. Tabela 2.

Amostra altura do pico 161 bp (espe¬ altura do pico 175bp (espe¬ cífico de macho) em unida¬ cífico de fêmea) em unida¬ des de fluorescência relati¬ des de fluorescência relati¬ va va Frações de esperma Grupo de tratamento 1 1565 0 Amostra 1 Grupo de tratamento 1 2061 133 Amostra 2 Grupo de tratamento 1 1793 0 Amostra 3 Grupo de tratamento 2 1057 0 Amostra 1 Grupo de tratamento 2 1447 118 Amostra 2 Grupo de tratamento 2 2101 0 Amostra 2 Estes dados mostram que, em certas condições, a imobilização de um precipitado de esperma usando uma resina paramagnética como uma barreira comporta igualmente na separação do esperma de um componente minoritário em um mistura com células epiteliais de fêmea tanto com (Grupo 1) quanto sem (Grupo 2) adição de um líquido não aquoso para aumentar a barreira.

Exemplo 3. Imobilização de Precipitado da Células do Lisado Após Lise Diferencial de Gênero Diferente de Células.

Células Staphylococcus aureus Gram positivas de uma amostra de urina (de um in- 10 divíduo saudável, com bactéria adicionada) foram separadas da cepa bacteriana E coli gram negativa JM109 (pMGFP), com base em digestão inicial da mistura com lisozima, que Iisou o E coli mas não o Staphylococcus aureus. Amostras de controle de cada cepa bacte- riana sozinhas correram em octuplicata em paralelo com as amostras a seguir. Adicional- mente, controles que não usam nenhuma enzima (2 X 8 = 16) e outros que usam tanto Iiso- 15 zima quanto Iisostafina na etapa de Iise inicial (2X8 = 16) foram também incluídos. Nenhu- ma dessas amostras de controle foi disposta com partículas.

Em placas de 96 poços de base redonda de Corning, 5 uL de lisozima 10 mg/mL (Sigma Aldrich, St. Louis, MO cat # L-6876) foram adicionados por poço a 180 uL de urina contendo EDTA 50 mM e cerca de 3 X 107 S. aureus e cerca de 1 X IO8E coli JM109 (pMGFP), e incubados por 30 minutos a 37 0C. Após a Iise diferencial do E. coli por digestão de lisozima, as células S. aureus foram precipitadas por centrifugação em placas de 96 po- ços de base redonda de Corning a 800 X g por 20 minutos usando uma centrífuga Sorvall RT6000B (Thermo Electron, Waltham MA) com um rotor de caçamba articulada. Os precipi- 5 tados resultantes foram em seguida sobrepostos tanto com 2 uL de resina Promega’s DNA- IQ (4 X 8 = 32) (100 mg por mL, catalogo # DC6701), quanto (para as amostras remanes- centes) “nas partículas adicionadas” (amostras 4X8 =32), 2 uL de água foram adicionados em vez de resina de DNA IQ®. As amostras foram mantidas por 60 segundos de forma que as partículas adicionadas assentassem na base, cobrindo os precipitados. Em seguida as 10 aplicações de força magnética de um ímã chato colocado abaixo da placa imobilizaram as partículas da resina de DNA IQ® nos precipitados S. aureus enquanto o fluido de sobreposi- ção (contendo o E. coli lisado) foi removido. Usando Sistema de Purificação de DNA Genô- mico Promega’s Wizard, o seguinte protocolo foi seguido para todas as amostras:

a) 8 uL de Iisostafina (2 mg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO cat # L0761) foram adicionados por poço, e o precipitado ré-suspenso por pipetação (para cima e para baixo) 6

vezes, e incubados a 37 0C por 30 minutos. Em seguida 90 uL de Solução de Lise de Núcleo (cat # A7943) foram adicionados por poço e misturados por pipetação 6 vezes. A placa foi incubada a 21 0C por 10 minutos.

b) 35 uL de Solução de precipitação de proteína (cat# A7953) foram adicionados, e as amostras misturadas 10 vezes por pipeta, a placa foi incubada a 21 0C por 5 minutos.

c) A placa foi centrifugada a 800 X g por 20 minutos.

d) Cada sobrenadante foi transferido para uma placa de 96 poços de base redonda de Corning limpa, contendo 140 uL de isopropanol por poço. As amostras foram misturadas por 10 pípetações e deixadas a 21 0C por 15 minutos. A placa foi centrifugada a 800 X g por

20 minutos. Os sobrenadantes foram removidos por pipeta.

e) 200 uL de etanol 75 % foram adicionados por poço.

f) A placa foi centrifugada a 800 X g por 20 minutos.

g) O sobrenadante foi separado por pipetação e a placa foi seca no ar por 20 minu- tos.

h) 50 uL de tampão de eluição, sangue (cat# MD1421) foram adicionados por poço.

i) A placa foi deixada a 4 0C por 12 horas. 12 uL de cada amostra foram agrupados em uma amostra em média 96 uL por coluna, que (após 12.000 X g por 30 segundos) foi quantificada por absorbância a 260 nm. Amostras individuais foram quantificadas por Pico- grama®(lnvitrogen, Carlsbad, CA).

O resultado, mostrado na Tabela 3, indica que a método de proteção de imobiliza-

ção do precipitado dá maior rendimento de DNA médio. Tabela 3.

Amostras da Placa A nq/uL coluna 1 nenhuma partí- cula A 1,25 coluna 1 nenhuma partí- culas B 1,75 coluna 1 nenhuma partí- cula C 1,59 coluna 1 nenhuma partí- cula D 1,83 coluna 1 nenhuma partí- cula E 1,86 coluna nenhuma partícula F 2,04 coluna 1 nenhuma partí- cula G 1,79 coluna 1 nenhuma partí- cula H 2,57 coluna 2 nenhuma partí- cula A 1,97 coluna 2 nenhuma partí- culas B 1,85 coluna 2 nenhuma partí- cula C 1,26 coluna 2 nenhuma partí- cula D 1,53 coluna 2 nenhuma partí- cula E 2,20 coluna 2 nenhuma partí- cula F 1,78 coluna 2 nenhuma partí- cula G 1,36 coluna 2 nenhuma partí- cula H 1,99 coluna 3+ 2 uL resina de DNA IQ 2,15

Placa A Amostras da Placa B nq/uL

Coluna 1 +2 uL resina de DNAIQA 1,76

Coluna 1 +2 uL resina de DNAIQB 1,92

Coluna 1 +2 uL resina de DNAIQC 1,65

Coluna 1 +2 uL resina de DNAIQ D 2,31

Coluna 1 +2 uL resina de DNAIQE 2,18

Coluna 1 +2 uL resina de DNAIQF 1,94

Coluna 1 +2 uL resina de Média DNAIQ G 2,56

Coluna 1 +2 uL resina de 1,83 DNAIQH 2,48

Coluna 2 +2 uL resina de DNAIQ A 2,02

Coluna 2 +2 uL resina de DNAIQB 1,88

Coluna 2 +2 uL resina de DNAIQC 1,34

Coluna 2 +2 uL resina de DNAIQD 1,82

Coluna 2 +2 uL resina de DNAIQE 1,73

Coluna 2 +2 uL resina de DNAIQF 1,78

Coluna 2 +2 uL resina de Média DNAIQG 1,61

Coluna 2 +2 uL resina de 1,74 DNAIQH 1,86

coluna 3 nenhuma partícula adicionada A 1,36

Placa B

Média

2,10

Média

1,75 coluna 3+ 2 uL resina de DNAJQ 1,91

coluna 3+ 2 uL resina de DNAJQ 1,65

coluna 3+ 2 uL resina de DNAJQ 2,30

coluna 3+ 2 uL resina de DNAJQ 2,15

coluna 3+ 2 uL resina de DNAJQ 2,26

coluna 3+ 2 uL resina de DNAJQ 2,81

coluna 3+ 2 uL resina de DNAJQ 2,83

coluna 4+ 2 uL resina de DNAJQ 2,32

coluna 4+ 2 uL resina de DNAJQ 1,84

coluna 4+ 2 uL resina de DNAJQ 1,59

coluna 4+ 2 uL resina de DNAJQ 2,11

coluna 4+ 2 uL resina de DNAJQ 2,19

coluna 4+ 2 uL resina de DNAJQ 1,73

coluna 4+ 2 uL resina de DNAJQ 2,01

coluna 4+ 2 uL resina de DNAJQ 3,38

coluna 5 nenhum controle de enzima 1,55

coluna 5 nenhum controle de enzima 1,08

coluna 5 nenhum controle de enzima 1,09

coluna 3 nenhuma partícula adicionada B 1,14

coluna 3 nenhuma partícula adicionada C 1,42

coluna 3 nenhuma partícula adicionada D 1,20

coluna 3 nenhuma partícula adicionada E 1,14

coluna 3 nenhuma partícula adicionada F 1,31

coluna 3 nenhuma partícula Média adicionada G 1,93

coluna 3 nenhuma partícula 2,26 adicionada H 2,23

coluna 4 nenhuma partícula adicionada A 1,24

coluna 4 nenhuma partícula adicionada B 1,34

coluna 4 nenhuma partícula adicionada C 0,96

coluna 4 nenhuma partícula adicionada D 1,13

coluna 4 nenhuma partícula adicionada E 0,99

coluna 4 nenhuma partícula adicionada F 0,96

coluna 4 nenhuma partícula Média adicionada G 1,39

coluna 4 nenhuma partícula 2,15 adicionada H 1,21

coluna 5 ambas enzimas adi- cionadas A 0,68 coluna 5 ambas enzimas adi- cionadas B 0,60 coluna 5 ambas enzimas adi- cionadas C 0,62

Média

1,47

Média

1,15 coluna 5 nenhum controle de enzima coluna 5 nenhum controle de enzima coluna 5 nenhum controle de enzima coluna 5 nenhum controle de enzima coluna 5 nenhum controle de enzima coluna 6 nenhum controle de enzima coluna 6 nenhum controle de enzima coluna 6 nenhum controle de enzima coluna 6 nenhum controle de enzima coluna 6 nenhum controle de enzima coluna 6 nenhum controle de enzima coluna 6 nenhum controle de enzima coluna 6 nenhum controle de enzima

0,94

0,91

0,68

1,04 Média

1,12 1,05

0,71

0,62

0,76

0,77

1,40

0,87

1,55 Média

1,90 1,07

coluna 7 JM109 (pMGFP) 0,80

coluna 7 JM109 (pMGFP) 0,83

coluna 7 JM109 (pMGFP) 0,80

coluna 7 JM109 (pMGFP) 0,95 coluna 7 JM109 (pMGFP) 0,28 coluna 7 JM109 (pMGFP) 0,34 coluna 7 JM109 (pMGFP) 0,54

Média

coluna 5 ambas enzimas adi- cionadas D 0,63 coluna 5 ambas enzimas adi- cionadas E 0,76 coluna 5 ambas enzimas adi- cionadas F 0,58 coluna 5 ambas enzimas adi- cionadas G 0,73 coluna 5 ambas enzimas adi- cionadas H 0,75 coluna 6 ambas enzimas adi- cionadas A 0,91 coluna 6 ambas enzimas adi- cionadas B 0,65 coluna 6 ambas enzimas adi- cionadas C 0,68 coluna 6 ambas enzimas adi- cionadas D 0,80 coluna 6 ambas enzimas adi- cionadas E 0,57 coluna 6 ambas enzimas adi- cionadas F 0,45 coluna 6 ambas enzimas adi- cionadas G 0,33 coluna 6 ambas enzimas adi- cionadas H 0,28 col 7 S, aureus nenhum Iisos- tafina A 0,16 col 7 S, aureus nenhum Iisos- tafina B 0,18 col 7 S, aureus nenhum Iisos- tafina C 0,16 col 7 S, aureus nenhum Iisos- tafina D 0,16 col 7 S, aureus + Iisostafina A 0,39 col 7 S, aureus + Iisostafina B 0,32 col 7 S, aureus + Iisostafina C 0,21

Média

0,67

Média

0,58

Média coluna 7 JM109 (pMGFP) 0,80 0,67 col 7 S, aureus + Iisostafina D 0,33 0,24

Exemplo 4. Isolamento do DNA do Núcleo Precipitado Imobilizado.

Uma alíquota de 50 uL de sangue humano total foi diluída em 150 uL de tampão de Iise de célula vermelha, usando o Sistema de Purificação do DNA genômico Wizard® (Pro- mega número de catálogo A1120). Células sanguíneas vermelhas e células sanguíneas 5 brancas foram lisadas, enquanto o núcleo de células sanguíneas brancas permaneceu intac- to. Os núcleos foram precipitados por centrifugação a 1.400 X g em uma placa de 96 poços de base redonda de Corning por 10 minutos usando um rotor de caçamba articulada. Na metade das amostras, os precipitados resultantes foram sobrepostos com 20 uL de partícu- las paramagnéticas Promega’s MagneSil® (catalog # A2201) para cobrir os núcleos precipi- 10 tados com uma camada de partículas magnéticas. A outra metade das amostras foi coloca- da em contato com 20 uL de água foi adicionada em vez de partículas MagneSil®. Uma força magnética foi aplicada colocando um ímã abaixo da placa para imobilizar os núcleos precipi- tados enquanto o sobrenadante de reposição foi removido.

co Wizard após o protocolo padrão. Resumidamente, 100 uL de Solução de Lise dos Nú- cleos (Promega cat # A7943) foram adicionados por poço e misturados por pipetação 6 ve- zes. A placa foi incubada a 21 0C por 10 minutos. 35 uL de solução de precipitação de prote- ína (cat# A7953) foram adicionados, e as amostras misturadas 6 vezes por pipeta. A placa 20 foi incubada a 21 0C por 5 minutos. A placa foi centrifugada a 800 X g por 20 minutos. Cada sobrenadante foi transferido para uma placa de 96 poços de base redonda de Corning lim- pa, contendo 140 uL de isopropanol por poço. A placa foi centrifugada a 800 X g por 20 mi- nutos. Os sobrenadantes foram removidos por pipeta. 200 uL de 75 % de etanol foram adi- cionados por poço. A placa foi centrifugada a 800 X g por 20 minutos. O sobrenadante foi 25 pipetado e a placa foi seca no ar por 30 minutos. 50 uL de tampão de eluição, sangue (cat# MD1421) foram adicionados por poço. A placa foi incubada a 4 0C por 12 horas. 12 uL de cada amostra foram agrupados em uma amostra em média de 96 uL por coluna, que (após

12,000 X g por 30 segundos) foi quantificada por absorbância a 260 nm (minus A320). A- mostras individuais foram quantificadas por Picograma® (Invitrogen, Carlsbad, CA). O s re- sultados são mostrados nas Tabelas 4 e 5.

15

Exemplo 5. Isolamento do DNA dos Núcleos Precipitados Imobilizados.

O DNA foi isolado da cada amostra usando o Sistema de Purificação DNA genômi-

Tabela 4.

Amostras da Pla- nq/uL ca 1

Coluna 1 "0 uL" 6,6 Coluna 1 "0 uL" 3,8

Amostras da nq/uL Placa 2

Coluna 1 "2 uL" 8,4 Coluna 1 "2 uL" 12,2 Coluna 1 0 uL" 2,5 Coluna 1 2 uL" 6,5 Coluna 1 0 uL" 0,0 Coluna 1 2 uL" 3,6 Coluna 1 0 uL" 0,0 Coluna 1 2 uL" 13,0 Coluna 1 0 uL" 0,0 Coluna 1 2 uL" 13,1 Coluna 1 0 uL" 0,4 Média Coluna 1 2 uL" 17,6 Média Coluna 1 0 uL" 3,7 2,1 Coluna 1 2 uL" 19,3 11,7 Coluna 2 0 uL" 10,4 Coluna 2 2 uL" 0,0 Coluna 2 0 uL" 4,2 Coluna 2 2 uL" 0,6 Coluna 2 0 uL" 1,1 Coluna 2 2 uL" 8,2 Coluna 2 0 uL" 10,9 Coluna 2 2 uL" 7,6 Coluna 2 0 uL" 0,8 Coluna 2 2 uL" 11,4 Coluna 2 0 uL" 0,9 Coluna 2 2 uL" 19,5 Coluna 2 0 uL" 1,5 Média Coluna 2 2 uL" 16,1 Média Coluna 2 0 uL" 3,3 4,1 Coluna 2 2 uL" 11,7 9,4 Coluna 3 4ul" 1,6 Coluna 3 1 uL" 12,7 Coluna 3 4ul" 4,1 Coluna 3 1 uL" 16,4 Coluna 3 4ul" 3,2 Coluna 3 1 uL" 12,1 Coluna 3 4ul" 9,0 Coluna 3 1 uL" 4,5 Coluna 3 4ul" 7,3 Coluna 3 1 uL" 0,0 Coluna 3 4ul" 11,2 Coluna 3 1 uL" 8,6 Coluna 3 4ul" 13,9 Média Coluna 3 1 uL" 4,5 Média Coluna 3 4ul" 10,2 7,6 Coluna 3 1 uL" 0,6 7,4 Coluna 4 4ul" 0,0 Coluna 4 1ul" 7,9 Coluna 4 4ul" 0,8 Coluna 4 1ul" 10,7 Coluna 4 4ul" 7,2 Coluna 4 1 uP 9,2 Coluna 4 4ul" 9,1 Coluna 4 1ul" 6,7 Coluna 4 4ul" 3,4 Coluna 4 1uP 6,9 Coluna 4 4ul" 8,8 Coluna 4 1uP 16,0 Coluna 4 4ul" 11,8 Média Coluna 4 1uP 14,6 Média Coluna 4 4ul" 15,4 7,1 Coluna 4 1uP 13,2 10,7 Coluna 5 0 uL" 6,2 Coluna 5 1 uL" 25,6 Coluna 5 0 uL" 6,0 Coluna 5 1 uL" 13,8 Coluna 5 0 uL" 8,5 Coluna 5 uL" 11,6 Coluna 5 0 uL" 8,2 Coluna 5 uL" 7,0 Coluna 5 0 uL" 9,3 Coluna 5 uL" 9,5 Coluna 5 uL" 3,3 Coluna 5 uL" 17,8 Coluna 5 uL" 6,3 Média Coluna 5 uL" 10,6 Média Coluna 5 "0 uL" 9,1 7,1 Coluna 5 "1 uL" 7,8 13,0 Coluna 6 "0 uL” 2,1 Coluna 6 "2 uL" 3,3 Coluna 6 "0 uL" 1,0 Coluna 6 "2 uL" 3,5 Coluna 6 "0 uL" 2,4 Coluna 6 "2 uL" 3,7 Coluna 6 "0 uL" 2,3 Coluna 6 "2 uL" 3,0 Coluna 6 "0 uL" 3,7 Coluna 6 "2 uL" 5,3 Coluna 6 "0 uL" 3,1 Coluna 6 "2 uL" 7,3 Coluna 6 ”0 uL" 3,3 Média Coluna 6 "2 uL" 12,7 Média Coluna 6 "0 uL" 2,0 2,5 Coluna 6 "2 uL" 15,5pan> 6,8 Tabela 5.

amostra A260 A280 A320 A260 50 uL ren- picograma picograma ng/uL pg

ng/uL dimento ug médio por ug rendi- classe coluna mento média

nenhum 0,0316 0,0133 0 1,58 0,079 2,1 0,105 3,95 A nenhum 0,1373 0,067 0 6,865 0,34325 4,1 0,205 B nenhum 0,1426 0,0705 0 7,13 0,3565 7,1 0,355 C nenhum 0,0613 0,0295 0 3,065 0,15325 2,5 0,125 D 1ul A 0,1577 0,0778 0 7,885 0,39425 7,2 0,36 10,1 1 ul B 0,2102 0,1052 0 10,51 0,5255 10,4 0,52 1 ul C 0,2934 0,1471 0 14,67 0,7335 12,7 0,635 2 uL A 0,2484 0,1256 0 12,42 0,621 11,5 0,575 9,1 2 uL B 0,2003 0,0995 0 10,015 0,50075 9,2 0,46 2 uL C 0,1357 0,0663 0 6,785 0,33925 6,6 0,33 4ul A 0,1493 0,0737 0 7,465 0,37325 7,6 0,38 7,35 4ul B 0,1373 0,067 0 6,865 0,34325 7,1 0,355 Como pode ser visto na Tabela 4 (valores médios para cada coluna (grupo de oito amostras) por categoria de amostra) e Tabela 5 (valores picograma par amostras individu- 5 ais, e suas médias), o uso de 1 uL, 2 uL ou 4 uL de partículas magnéticas MagneSil (1 ug, 2 ug ou 4 ug de partículas por poço) forneceu maiores rendimentos médios do que as amos- tras sem partícula sobreposta MagneSil®. Adicionalmente, o resultado do Picograma indica que existe uma menor frequência de abandonos de amostra (isto é, amostras na qual no DNA foi detectado) quando os núcleos precipitados foram imobilizados usando partículas MagneSil®. O uso de partículas magnéticas para imobilizar os núcleos precipitados fornece resultado mais uniformemente seguro e maior rendimento de DNA. Presumivelmente, pou- cos núcleos celulares no precipitado foram perdidos por amostra, e poucos núcleos precipi- 5 tados em agregado foram perdidos quando os sobrenadantes foram removidos das amos- tras nas quais partículas magnéticas foram usadas para imobilizar os precipitados.

Exemplo 6. Purificação de RNA Citoplásmico dos Núcleos.

RNA citoplásmico é isolado da cada amostra usando 200 uL por poço em um placa de 96 poços de uma solução de Iise compreendendo HEPES 100 mM pH 7,6 / EDTA 100 10 mM / digitonina 40 mg/mL / DMSO 0,4% (volume/volume) / 400 unidades de RNasin Plus (Promega catalog N2611). Resumidamente, 200 uL de Solução de Lise contendo 1 X 106 células HEK 293 são adicionados por poço e misturados por pipetação 6 vezes. A placa é incubada a 4 0C por 10 minutos. A placa é centrifugada a 800 X g por 20 minutos. Cada ou- tro precipitado da amostra (por exemplo, em uma placa de 96 poços, poços A1, A3, A5, A7, 15 B2, B4, B6, etc.) é sobreposta com 1 uL de partículas MagneSil Blue, e os precipitados de amostra remanescentes não são sobrepostos com partículas MagneSil Blue. A placa é em seguida colocada em um ímã chato por 60 segundos. Os sobrenadantes são em seguida transferidos para seus poços correspondentes pelo uso de um pipetador multicanal em uma placa de 96 poços de base redonda de Corning limpa. A quantificação do DNA por poço de 20 amostra é obtida usando Promega’s sistema de Quantificação de DNA (número de catálogo K4000), e quantificação de RNA é obtida usando Quant-iT RiboGreen (Invitrogen catalog R11490, Carlsbad, CA). O RNA é corrido em RT-PCR quantitativa usando Sistema qRT- PCR da etapa 2 Promega’s Plexor (número de catálogo A4051).

Exemplo 7. Purificação de Esperma Humano dos Detritos da Célula Epitelial.

O esperma humano é isolado da cada amostra usando 200 uL por poço em uma

placa de 96 poços de uma solução de Iise compreendendo HEPES 100 mM pH 7,6 / EDTA 100 mM / digitonina 40 mg/mL / DMSO 0,4 % (volume/volume). Resumidamente, 200 uL de Solução de Lise contendo células de esperma humano 1 X 103 e células epiteliais humanas

1 X 106 é adicionados por poço e misturado por pipetação 6 vezes. A placa é incubada a 4 30 0C por 10 minutos. A placa é centrifugada a 800 X g por 20 minutos. Cada outro precipitado da amostra (por exemplo, em uma placa de 96 poços, poços A1, A3, A5, A7, B2, B4, B6, etc.) é sobreposta com 1 uL de partículas MagneSil Blue, e os precipitados da amostra re- manescente não são sobrepostos com partículas MagneSil Blue. A placa é em seguida co- locada em um ímã chato por 60 segundos. Os sobrenadantes são em seguida transferidos 35 para seus poços correspondentes pelo uso de um pipetador multicanal em uma placa de 96 poços de base redonda de Corning limpa. O precipitado de esperma é purificado usando Sistema Promega’s Differex (número de catálogo DC6800), e o DNA obtido é quantificado usando Sistema de Quantificação de DNA Humano Promega’s AIuQuant (número de catálo- go DC1010), e perfilado usando Sistema Promega’s PowerPIex 16 (número de catálogo DC6530).

Claims (44)

1. Método de isolar primeiras células de uma amostra compreendendo primeiras cé- lulas e segundas células, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) tratar a amostra para formar um Iisado aquoso em condições que Iisam as se- gundas células sem Iisar as primeiras células; (b) aplicar uma força à amostra por um período de tempo suficiente para formar um precipitado compreendendo as primeiras células; e (c) formar uma proteção de imobilização de precipitado entre o precipitado e o Iisa- do aquoso.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as primeiras células são células de esperma.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente remover o Iisado aquoso da etapa (c).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o precipitado.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente lavar o precipitado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente, antes de remover o Iisado aquoso, colocar o Iisado aquoso da etapa (c) em contato com um líquido não aquoso com uma densidade maior que cerca de 1,00 g/cm3 para formar uma camada não aquosa entre a proteção de imobilização do preci- pitado e o Iisado aquoso.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a força é aplicada por centrifugação.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteção de imobilização do precipitado compreende material magnético ou paramagnético.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente aplicar um campo magnético no material magnético ou para- magnético para manter a proteção entre o precipitado de esperma e o material aquoso.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o material paramagnético compreende sílica.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o material paramagnético compreende partículas magnéticas de sílica.

12. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o material paramagnético compreende partículas magnéticas revestidas com óxido silicioso.

13. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o material paramagnético compreende uma partícula magnética agregada em que cada par- tícula compreende dois ou mais núcleos magnéticos ou paramagnéticos que são cobertos por um óxido silicioso.

14. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o material paramagnético compreende um material magnético.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de proteção de imobilização do precipitado compreende partículas magnéticas celulósicas.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de proteção de imobilização do precipitado compreende um material sensível a temperatura.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado em um processo de alta produ- ção.

18. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a força é cerca de 3.000 x g ou menos.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que as segundas células são células epiteliais.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o material aquoso compreende DNA de célula não es- perma.

21. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o líquido não aquoso compreende pelo menos um de glutarato de dietíla, glutarato de dimeti- la, e 1-cloro-2-metil-2-propanol.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o líquido não aquoso compreende adicionalmente clorofórmio.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o líquido não aquoso compreende clorofórmio e glutarato de dimetila em uma razão de cer- ca de glutarato de dimetila:clorofórmio de 0,1:99,9 a cerca de 50:50.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente Iisar as primeiras células em condições que permitem ligação do DNA da primeira célula à sílica.

25. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente Iisar as primeiras células em condições que permitem ligação do DNA das primeiras células ao material celulósico.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o Iisado aquoso compreende digitonina em uma con- centração efetiva para Iisar as segundas células sem Iisar as primeiras células.

27. Método de isolar DNA de célula de esperma de uma amostra aquosa compre- endendo células epiteliais, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) tratar a amostra em condições que permitem a Iise seletiva das células epiteli- ais; (b) aplicar uma força à amostra tratada por um período de tempo suficiente para formar um precipitado de esperma; (c) formar uma proteção de imobilização do precipitado entre o precipitado de es- perma e o material aquoso contendo células epiteliais lisadas; (d) remover o material aquoso; e (e) Iisar as células no precipitado de esperma em condições que permitem a purifi- cação do DNA de célula de esperma.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente, antes da etapa (d), adicionar um líquido não aquoso com uma densidade maior que cerca de 1,00 g/cm3 para formar uma camada não aquosa entre a pro- teção de imobilização do precipitado e as células epiteliais lisadas.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente: (f) após a etapa (d) e antes da etapa (e), lavar o líquido não aquoso, a proteção de imobilização do precipitado e as células de esperma; (g) aplicar uma força para formar uma camada de lavagem, uma camada não a- quosa, e um precipitado compreendendo o material de proteção de imobilização do precipi- tado e células de esperma; (h) após a etapa (g), adicionar um material paramagnético compreendendo sílica para formar uma proteção de imobilização do precipitado paramagnética entre o precipitado da etapa (g) e a camada não aquosa; e (i) remover o camada de lavagem e a camada não aquosa.

30. Método de separar células intactas ou organelas alvos de uma amostra de Iisa- do de célula aquosa, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) aplicar uma força à amostra por um período de tempo suficiente para formar um precipitado compreendendo pelo menos algumas das células intactas ou organelas alvos; e (b) formar uma proteção de imobilização do precipitado entre o precipitado e o Iisa- do de célula aquoso.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente remover o material aquoso.

32. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente recuperar o precipitado.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a força é aplicada por centrifugação.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteção de imobilização do precipitado compreende material magnético ou paramagnético.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente aplicar um campo magnético no material paramagnético para manter a proteção de imobilização do precipitado entre o precipitado e material aquoso.

36. Método de isolar organelas alvos de uma amostra compreendendo células que compreendem uma organela alvo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) tratar a amostra para formar um Iisado aquoso em condições que Iisam seleti- vamente as células sem Iisar as organelas; (b) aplicar uma força à amostra por um período de tempo suficiente para formar um precipitado compreendendo as organelas alvos; e (c) formar uma proteção de imobilização do precipitado entre o precipitado e o Iisa- do.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que tratar a amostra da etapa (a) compreende fazer contato com a amostra com um tampão de Iise compreendendo digitonina em uma concentração efetiva para causar a Iise seletiva da etapa (a).

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o tampão de Iise compreende adicionalmente RNasin.

39. Método de isolar um substituinte de célula alvo de uma amostra compreenden- do células alvos, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) tratar a amostra para formar um Iisado aquoso em condições que Iisam seleti- vamente as células alvos e nas quais pelo menos uma organela não é lisada; (b) aplicar uma força à amostra por um período de tempo suficiente para formar um precipitado compreendendo as organelas não lisadas; e (c) formar uma proteção de imobilização do precipitado entre o precipitado e o Iisa- do.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o precipitado compreende núcleo.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, CARACTERIZADO pelo fato de que tratar a amostra da etapa (a) compreende colocar a amostra em contato com um tampão de Iise compreendendo digitonina em uma concentração efetiva para causar o Iise seletivo da etapa (a).

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o tampão de Iise compreende adicionalmente RNasin.

43. Estojo para isolar uma célula alvo ou organela de uma célula não alvo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um agente de Iise para Iisar preferencial- mente a célula não alvos e um material de imobilização de precipitado.

44. Estojo, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de imobilização de precipitado compreende pelo menos um de uma partícula magnética de sílica, um material magnético celulósico, um material sensível a temperatura, e um material magnético.