BR102022019150A2 - Kit e método para extração e purificação de ácidos nucleicos - Google Patents
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Abstract
A presente invenção pertence ao campo da biologia, mais especificamente ao campo da biologia molecular. O presente invento apresenta um kit e método para extrair e purificar ácidos nucleicos. O invento possibilita a extração de ácidos nucleicos (DNA e RNA) de vírus, bactérias, fungos, organismos unicelulares e pluricelulares, tecidos vegetais e animais, sangue total e amostras de tecidos fixadas em bloco de parafina, dentre outros. O presente invento permite a simplificação do processo de extração de ácidos nucleicos pela eliminação da necessidade do uso de ambiente e equipamento laboratorial e de pessoal com alto nível de treinamento. Além disto, é rápido, consumindo apenas dois minutos do início ao fim, não depende de produtos adicionais e tem custo muito menor do que os atualmente ofertados no mercado.
Description
[001] A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular. O presente invento apresenta um kit e um método para extrair e purificar ácidos nucleicos. O invento possibilita a extração de ácidos nucleicos (DNA e RNA) de vírus, bactérias, fungos, organismos unicelulares e pluricelulares, tecidos vegetais e animais, sangue total e amostras de tecidos fixadas em bloco de parafina, dentre outros.
[002] O processo de extração de ácidos nucleicos é a primeira etapa para a realização de variadas metodologias de biologia molecular. É fundamental que, para quaisquer ensaios de determinação qualitativa ou quantitativa da presença de RNA ou DNA, tais ácidos nucleicos estejam presentes com concentração e pureza compatíveis com as técnicas utilizadas. Assim sendo, é importante que o processo de extração consiga liberar a máxima quantidade possível de DNA ou RNA a partir do material biológico inicial. Da mesma forma, é importante que estes ácidos nucleicos estejam na forma mais pura possível, ou seja, livres de outras moléculas como proteínas resultantes do processo de extração.
[003] Existem diversos kits e métodos para a extração de ácidos nucleicos. Seu objetivo comum é causar a ruptura do envelope proteico onde estão contidos, como por exemplo as células de um dado organismo. Tais métodos baseiam-se principalmente em processos mecânicos, enzimáticos e químicos. A escolha da metodologia implica, por sua vez, no eventual aumento da complexidade do processo como um todo, assim como na necessidade de utilização de reagentes de alto custo e, em alguns casos, alta toxicidade.
[004] De forma semelhante, há vários processos de purificação de ácidos nucleicos. Em sua maioria utilizam separação física ou afinidade química, o que exige o uso de equipamentos tais como centrífugas. Os produtos disponíveis atualmente no mercado são em geral baseados no princípio de extração em coluna de sílica, extração com utilização de compostos tóxicos a exemplo do fenol, extração envolvendo beads magnéticos. Tais métodos e kits possuem especificação para cada tipo de amostra, requerem o uso de equipamentos de laboratório, reagentes químicos de elevado grau de periculosidade e também a manutenção do material extraído em temperaturas controladas. Consequentemente, os métodos atuais de extração necessitam de profissionais com alto nível de treinamento e possuem elevados custos associados.
[005] Diante do cenário atual, o presente invento permite a simplificação do processo de extração de ácidos nucleicos pela eliminação da necessidade do uso de ambiente e equipamento laboratorial e de pessoal com alto nível de treinamento. Além disto, é rápido, consumindo apenas dois minutos do início ao fim, não depende de produtos adicionais, a exemplo de álcool padrão biologia molecular ou fenol, e tem custo muito menor do que os atualmente ofertados no mercado. O invento destaca-se pela simplicidade de execução, pois o processo dá-se sem o uso de quaisquer equipamentos de laboratório, rapidez (tempo igual ou inferior a dois minutos), compatibilidade com processos convencionais de biologia molecular como a amplificação por PCR outras metodologias, baixo custo e alto desempenho (pureza e qualidade dos ácidos nucleicos igual ou superior a outros processos comerciais). Por sua simplicidade e portabilidade, permite a extração e purificação no próprio local de coleta do material biológico, permitindo assim o transporte de material não contaminante. Os ácidos nucleicos assim obtidos permanecem estáveis e viáveis durante dias, sem necessidade de armazenamento em baixas temperaturas.
[006] O documento BR 102017017150-7 revela um método de extração de material genético que consiste em desnaturar e precipitar as proteínas da amostra com isotiocinato de guanidina, utilizar um agente caotrópico para quebrar ligações hidrofóbicas, utilizar um agente redutor para desfazer ligações dissulfeto, usar fenol livre nucleases, hidratado ou saturado com água e, posteriormente, recuperação do RNA da fase aquosa por precipitação com etanol. O presente documento refere-se a uma metodologia substancialmente diferente da metodologia do presente invento. Além disso, o presente invento resolve o problema técnico em não utilizar substâncias com alto grau de periculosidade como o fenol.
[007] A publicação https://interprise.com.br/easyextract/ refere-se a um produto disponível no mercado atual que permite a extração, sem centrifugação, químicos perigosos ou colunas, para a extração de ácidos nucleicos para PCR. Conforme os detalhes na ilustração do site, o processo de extração requer equipamentos para vácuo e incubação, que não são necessários no presente invento.
[008] O documento BR 112021015952-5 é relacionado a um método para isolar ácido nucleico, que compreende um filtro com pelo menos uma região porosa e uma segunda região porosa, de modo que a amostra entre em contato com a primeira região com tamanho nominal de poro, que é maior que a da segunda região. O processo envolve uma série de etapas com aplicações de filtro, eluição e incubação. Tais processos não se assemelham com o método do presente invento.
[009] O documento BR 102020001929-5 revela um processo para extração de DNA de plantas com altos teores de metabólitos secundados, que consiste na inserção de tecido foliar liofilizado em um tubo de propileno e com adição de tampão, que é aquecido e encubado. O tubo é direcionado para um agitador vórtex e, posteriormente, é obtido um pellet de DNA. Apesar de ser um método de extração de ácidos nucleicos, o presente documento não apresenta configuração semelhante com o invento ora apresentado.
[010] O documento BR 112014028123-8 revela um método e dispositivo para extrair ácidos nucleicos de amostra biológica. O método compreende um material celular com uma membrana ou parede celular ou envelope viral ou capsídeo viral. O método compreende colocar uma amostra em contato com um substrato, que é funcionalizado com um agente biocida capaz de enfraquecer a membrana celular e promover a lise celular e, posteriormente, a amostra é submetida ao aquecimento. O presente documento apresenta metodologia e processos (como por exemplo, o aquecimento) diferentes do invento proposto.
[011] O documento WO2016117999A1 revela um método para rastrear DNA suíno em uma sutura de categute. O método envolve o corte de sutura de categute em pedaços pequenos, congelamento e moagem corte de sutura de categute e adição de tampão de lise, mistura de mistura e adição de proteinase, incubação de mistura homogeneizada, centrifugação de mistura homogeneizada, transferência de sobrenadante compreendendo DNA, adição de tampão de ligação genômica ao sobrenadante e mistura até formar uma homogeneidade solução homogênea, incubando a solução homogênea e misturando com etanol absoluto, separando o DNA da solução homogênea, eluindo o DNA e analisando o DNA extraído por PCR. Conforme observado, as etapas envolvidas do presente documento em relação ao presente invento são substancialmente diferentes e voltadas para a extração de DNA suíno.
[012] O documento US20140147855A1 revela um método de extração de RNA da amostra de tecido embebido fixo em formalina que envolve (a) remover o material embebido, (b) Incubar o tecido com protease para dissolver ligações cruzadas proteicas e inativar ribonuclease (RNase) (se houver), (c) remover proteína de ácidos nucleicos, (d) precipitar ácidos nucleicos, (e) remover DNA dos ácidos nucleicos e (e) purificar o RNA mediante ligação e eluição da membrana gel de sílica. O presente documento apresenta a extração de RNA com etapas substancialmente diferentes do presente invento, e também que utilizam equipamentos de laboratório, problema técnico que o presente invento visa solucionar.
[013] O documento WO 02/055737 revela composições e métodos para purificação de DNA em sangue. O método é compreendido por adicionar uma solução aquosa (AS) ao fluido biológico (BF) com um glóbulo vermelho (RBC) e um glóbulo branco (WBC), para lisar o RBC; remover o WBC da mistura de lise ;lavar o WBC com um segundo AS; lisar o WBC pela adição de um terceiro AS para formar uma mistura de extração (EM); precipitar a proteína do EM pela adição de um quarto AS; e remoção da proteína. O documento é direcionado especificamente para a extração de DNA em sangue humano, enquanto o presente invento pode ser aplicado a vírus, bactérias, fungos, organismos unicelulares e pluricelulares, tecidos vegetais e animais, sangue total e amostras de tecidos fixadas em bloco de parafina, dentre outros. Além disso, o presente invento apresenta etapas mais práticas e simples para o processo de purificação com menos soluções e etapas.
[014] O documento EP1632578A1 revela um método de descontaminação de DNA, método compreendendo as etapas de (a) converter uma base de citosina não metilada no ácido nucleico alvo metilado na amostra em uma base de uracila enquanto não converte a base metilcitosina; (b) adicionar uma enzima de restrição à amostra que digere o ácido nucleico alvo não metilado pelo qual o ácido nucleico alvo metilado não é digerido pela enzima de restrição; (c) inativação da enzima de restrição; e (d) amplificação do ácido nucleico alvo metilado. O presente documento possui um método substancialmente diferente do presente invento e também é especificamente relacionado para amplificar um ácido nucleico alvo metilado em uma amostra para evitar a amplificação de um ácido nucleico de alvo não metilado.
[015] O documento US20030215818A1 revela um método de isolamento e/ou purificação de ácidos nucleicos de uma amostra, compreendendo o contato da amostra com um material de suporte (I) na presença de um sal de um cátion multivalente, para adsorção de ácidos nucleicos, lavagem (I) pelo menos uma vez e isolamento de ácidos nucleicos ácidos por adição de solução aquosa de agente quelante adequado para cátion para dessorção de ácidos nucleicos de (I), e separação de solução aquosa contendo ácido nucleico de (I). O presente documento utiliza cátions multivalentes e agentes quelantes para a purificação de ácidos nucleicos compreendidos no suporte de sílica, preferencialmente um mineral de argila, configuração que não é observada no presente invento (que utiliza agentes quelantes dentro de tubos para reagentes que interage com uma haste com celulose). Com isso, torna-se evidente que o presente invento possui configuração diferente do presente documento.
[016] O Requerente concebeu, testou e incorporou a presente invenção de forma a superar as deficiências do estado da técnica e obter os propósitos e vantagens acima mencionados e abaixo explicitados.
[017] O kit para extração e purificação de ácidos nucleicos compreende: - pelo menos uma solução de extração; - pelo menos uma solução tampão; e - pelo menos um material para suporte.
[018] A solução de extração contém agentes quelantes, agentes caotrópicos e compostos iônicos.
[019] Os componentes da solução de extração compreendem dentre ácido acético na faixa de 0 a 10 mM, ácido bórico na faixa de 0 a 5 mM, ácido clorídrico 37% na faixa de 0 a 10 mM, bicarbonato de sódio na faixa de 0 a 20 mM, cloreto de sódio na faixa de 0 a 250 mM, cloreto de potássio na faixa de 0 a 80 mM, DMSO na faixa de 0 a 150 mM, EDTA na faixa de 0 a 25 mM, hidrocloreto de guanidina na faixa de 0 a 5 mM, hidróxido de sódio na faixa de 0 a 1 M, polissorbato 20 na faixa de 0 a 1 M, polivinilpirrolidona na faixa de 0 a 500 mM, dodecil sulfato de sódio 95% na faixa de 0 a 1 e tris base na faixa de 0 a 200 mM.
[020] A solução tampão é compreendida dentre ácido cítrico mono-hidratado na faixa de 0 a 5 mM, ácido clorídrico 37% na faixa de 0 a 10 mM, cloreto de sódio na faixa de 0 a 250 mM, cloreto de potássio de 0 a 80 mM, clorofórmio 99% na faixa de 0 a 30 mM, fenol na faixa de 0 a 15 mM, hidróxido de sódio na faixa de 0 a 1 M, polissorbato 20 na faixa de 0 a 1 M e tris base na faixa de 0 a 200 mM.
[021] O material para suporte é uma haste contendo material à base de celulose.
[022] O método de extração de ácidos nucleicos conforme kit da reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: - Transferir a amostra do analito para a solução de extração; - Imergir o material para suporte na solução de extração; - Imergir o material para suporte na solução tampão; e - Obtenção do ácido nucleico purificado.
[023] Os processos de imersão do material para suporte ocorrerem em um período de tipicamente 30 segundos a 2 minutos.
[024] A amostra do analito é amostra de vírus, bactérias, fungos, organismos unicelulares e pluricelulares, tecidos vegetais e animais, sangue e amostras de tecido fixadas em bloco de parafina.
[025] O ácido nucleico purificado é aplicado para amplificação por PCR.
[026] O presente invento tem por objetivo a simplificação do processo de extração de ácidos nucleicos pela eliminação da necessidade do uso de ambiente e equipamento laboratorial e de pessoal com alto nível de treinamento. Consequentemente, o invento também possui por finalidade um processo de extração ácidos nucleicos com custo muito menor do que os atualmente ofertados no mercado.
[027] Figura 1 - A figura 1 representa um fluxograma de uma modalidade do método para a extração e purificação de ácidos nucleicos do kit referido.
[028] A invenção aqui descrita baseia-se na extração química de ácidos nucleicos através de detergentes, agentes tensoativos e/ou agentes caotrópicos. A purificação é baseada na afinidade entre os ácidos nucleicos e a celulose. Isto é possível porque a celulose possui uma elevada densidade dos grupos funcionais hidroxila e carboxila, tornando-a fortemente polar e, portanto, favorável à ligação com ácidos nucleicos.
[029] O processo de extração e purificação é simples e dispensa a utilização de quaisquer equipamentos de laboratório. Seu custo é relativamente baixo e sua execução dá-se em um minuto.
[030] O presente invento revela um Kit de formulações para extração e purificação de ácidos nucleicos e o método de extração conforme o kit apresentado.
[031] O kit para extração e purificação de ácidos nucleicos compreende: - um tubo contendo pelo menos uma solução de extração; - um tubo contendo pelo menos uma solução tampão; e - pelo menos um material para suporte.
[032] O material para suporte referenciado é preferencialmente uma haste com material à base de celulose
[033] A solução de extração contém agentes quelantes, agentes caotrópicos e compostos iônicos. Os agentes quelantes e caotrópicos possuem como função a ruptura e quebra de parede celular ou de cápsula proteica e os compostos iônicos promovem a adsorção do ácido nucleico ao material para suporte com base de celulose.
[034] A solução tampão é utilizada para a lavagem e eliminação de fragmentos proteicos, permitindo a purificação dos ácidos nucleicos.
[035] O método de extração e purificação conforme utilização do kit acima mencionado compreende as seguintes etapas: - Transferir a amostra do analito (por exemplo fragmento de tecido, swab ou papel absorvente contendo líquido como sangue, urina ou líquor) para a solução de extração; - Imergir o material para suporte na solução de extração; - Imergir o material para suporte na solução tampão; e - Obtenção do ácido nucleico purificado.
[036] De forma simplificada, a amostra do analito é transferida para a primeira solução (solução de extração) através de swab ou elemento semelhante. Em seguida o material para suporte (haste com celulose) é imerso na primeira solução, tipicamente durante 30 segundos a 2 minutos. A haste é depois transferida para a segunda solução também tipicamente por 30 segundos a 2 minutos. A celulose contém, então, o ácido nucleico extraído e purificado, pronto para etapas posteriores como a amplificação por PCR ou processos semelhantes. A figura 1 apresenta um fluxograma com as etapas do processo descrito, como forma de exemplo do processo.
[037] A presente metodologia pode ser utilizada em amostras de vírus, bactérias, fungos, organismos unicelulares e pluricelulares, tecidos vegetais e animais, sangue e amostras de tecido fixadas em bloco de parafina.
[038] São apresentadas abaixo as composições preferenciais das soluções utilizadas: TABELA 1 — SOLUÇÕES DE EXTRAÇÃO TABELA 2 — SOLUÇÕES TAMPÃO
[039] Diante disso, o invento apresentado revela uma alternativa eficaz, de baixo custo e simplificada para extração de ácidos nucleicos.
Claims (9)
1. Kit para extração e purificação de ácidos nucleicos caracterizado por compreender: - pelo menos uma solução de extração; - pelo menos uma solução tampão; e - pelo menos um material para suporte.
2. Kit para extração e purificação de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de extração contém agentes quelantes, agentes caotrópicos e compostos iônicos.
3. Kit para extração e purificação de ácidos nucleicos de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que os componentes da solução de extração compreendem dentre ácido acético na faixa de 0 a 10 mM, ácido bórico na faixa de 0 a 5 mM, ácido clorídrico 37% na faixa de 0 a 10 mM, bicarbonato de sódio na faixa de 0 a 20 mM, cloreto de sódio na faixa de 0 a 250 mM, cloreto de potássio na faixa de 0 a 80 mM, DMSO na faixa de 0 a 150 mM, EDTA na faixa de 0 a 25 mM, hidrocloreto de guanidina na faixa de 0 a 5 mM, hidróxido de sódio na faixa de 0 a 1 M, polissorbato 20 na faixa de 0 a 1 M, polivinilpirrolidona na faixa de 0 a 500 mM, dodecil sulfato de sódio 95% na faixa de 0 a 1 e tris base na faixa de 0 a 200 mM.
4. Kit para extração e purificação de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução tampão é compreendida dentre ácido cítrico mono- hidratado na faixa de 0 a 5 mM, ácido clorídrico 37% na faixa de 0 a 10 mM, cloreto de sódio na faixa de 0 a 250 mM, cloreto de potássio de 0 a 80 mM, clorofórmio 99% na faixa de 0 a 30 mM, fenol na faixa de 0 a 15 mM, hidróxido de sódio na faixa de 0 a 1 M, polissorbato 20 na faixa de 0 a 1 M e tris base na faixa de 0 a 200 mM .
5. Kit para extração e purificação de ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material para suporte é uma haste contendo material à base de celulose.
6. Método de extração de ácidos nucleicos conforme kit da reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: i) Transferir a amostra do analito para a solução de extração; ii) Imergir o material para suporte na solução de extração; iii) Imergir o material para suporte na solução tampão; e iv) Obtenção do ácido nucleico purificado.
7. Método de extração de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por os processos de imersão do material para suporte ocorrerem em um período de 30 segundos a 2 minutos.
8. Método de extração de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a amostra do analito ser amostra de vírus, bactérias, fungos, organismos unicelulares e pluricelulares, tecidos vegetais e animais, sangue e amostras de tecido fixadas em bloco de parafina.
9. Método de extração de ácidos nucleicos, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o ácido nucleico purificado ser aplicado para amplificação por PCR.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR102022019150A2 true BR102022019150A2 (pt) | 2024-04-02 |
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