CN101548005A

CN101548005A - 分离细胞的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN101548005A
Application number: CNA200780044716XA
Authority: CN
Inventors: R·J·奥尔森; R·M·比特纳; A·M·特雷巴; L·L·博热克
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 2006-10-06
Filing date: 2007-10-08
Publication date: 2009-09-30

Abstract

本发明公开了差异提取主要由其他类型非靶细胞组成的样品中靶组分的方法。通过使用不裂解靶细胞的方法可将这些非靶细胞裂解，这样便可从裂解的非靶物质中纯化靶物质。一个例示性方法涉及分离含水样品中的精细胞和进行该分离的试剂盒。

Description

分离细胞的方法和试剂盒

相关申请的交叉引用

本申请主张2006年10月6日提交的美国临时申请60/828,537和2007年3月14日提交的美国临时申请60/894,818的优先权。

关于联邦政府资助研究的声明

不适用

引言

差异提取法(differential extraction)可用于从含有其他类型非靶细胞或主要由其他类型非靶细胞组成的样品中分离靶细胞物质。优先裂解非靶细胞，这样可纯化靶细胞，使其与裂解的非靶细胞所释放的非靶物质分离。若靶物质为下游核酸扩增中待使用或检测的特定细胞类型的核酸，这一方法特别有用，因为来自非靶细胞的污染核酸会使靶信号模糊不清。由于必须限制用于核酸扩增的核酸模板的量，该方法特别有助于降低样品模板中非靶核酸的干扰作用。非靶物质的污染也会干扰其他检测方法，例如酶检测或基于抗体的靶物质检测。通过在纯化过程中裂解非靶细胞，可降低背景，从而增加靶物质检测的灵敏性和/或可靠性。

可使用差异提取法的应用实例包括分离法医样品中的精细胞、分离各种不同材料例如污水、土壤样品、空气样品或体液中可用作生物战剂的生物以及分离细胞样品中的细胞器。

取自法医样品的遗传物质可用于鉴定性攻击的犯罪者或洗脱无罪疑犯的罪名。从法医样品中分离的精细胞获得的纯DNA可用于随后的基因相同性检测。精细胞DNA的基因谱可与已知疑犯的基因谱或与含有大量定罪重犯遗传信息的数据库进行比较。

在性攻击案件中，从受害者或犯罪现场获得法医样品例如阴道拭子或直肠拭子或含有精斑的衣物以用于法医分析。如果样品中出现精细胞，可分离来自精细胞的DNA，用于基因相同性检测。但是，取自性攻击受害者的阴道拭子一般含有较少的精细胞和来自受害者的大量上皮细胞。因此，除非首先将精细胞与样品中的其他细胞分离开，从法医样品中纯化的DNA易受上皮细胞DNA的极大污染。这种污染会干扰样品的DNA的基因谱与疑犯或数据库成员的基因谱之间建立匹配的能力。因此在分离和分析DNA前，将精细胞与法医样品中的其他细胞分离开来是理想的。

目前用于将精细胞与法医样品中其他细胞分离的技术耗时费力，因此目前积压了许多未处理样品。由于未处理样品积压过多，一些司法部门采取了除非已确认疑犯否则不予处理样品的政策。结果，许多未处理样品最终被丢弃，而样品所含的遗传信息却从未与国家数据库比较过或被录入到国家数据库，因而降低了鉴定和震慑性犯罪惯犯的执法能力。

一般通过蛋白酶K和去污剂在非还原性条件下处理含有上皮细胞的法医样品，选择性裂解上皮细胞，从而分离出法医样品中的精细胞。上皮细胞裂解后，离心沉淀下完整的精细胞，并除去含有裂解上皮细胞DNA的上清。为了最大程度降低可溶的上皮细胞DNA的污染，使用含水缓冲液反复洗涤精细胞沉淀，以除去可溶的上皮细胞DNA。该过程通常导致精细胞损失，且极为费力。

通过将精细胞选择性结合到固相载体(例如顺磁颗粒)上的精细胞特异性多克隆抗体或单克隆抗体，已从同时含有精细胞和上皮细胞的样品中分离出精细胞。细胞结合到固定化抗体上后，洗涤载体以除去未结合的细胞。该方法需要大量抗体，因此相对较贵。而且结合过程效率低，一般在洗涤步骤中会损失精细胞，从而导致收率和敏感性降低。由于精细胞在阴道较低的pH下发生了结构变化，许多精细胞特异性的抗体并不结合来自所有含有精液的样品的精细胞。此外，由于某些个体精细胞表面抗原发生变异或突变，抗体可能无法有效地结合，因而导致精细胞的低收率。

根据细胞尺寸的差异，通过在尺寸选择性滤膜上过滤样品，可分离出上皮细胞中的精细胞。由于精细胞容易被困在上皮细胞、粘液和细胞碎片之间，使得精细胞形成过大的团块难以通过滤膜，而且滤膜容易发生堵塞，最终可导致精细胞的低收率，因此该方法存在问题。此外，来自裂解的上皮细胞的DNA与精子一同通过滤膜，因而会污染精子。

在另一种方法中，通过首先选择性裂解上皮细胞，随后过滤裂解液，以将可溶的上皮细胞DNA和完整精细胞分离开，从而分离精细胞。但是，该方法也有缺点，其中包括滤膜堵塞，它会导致精细胞被上皮细胞的DNA污染。

在生殖医学领域，使用细胞分选仪业已从新鲜精液中分离出精细胞。该方法虽有效，但对于法医鉴定却不实用，这是因为该方法费用高，耗时长，也没有解决如何从法医样品(例如拭子或衣物)中有效回收精细胞和上皮细胞的问题。

另一种方法是在玻片上显微解剖样品中的精子，它能得到不含上皮细胞DNA污染的精子。该方法虽有效，但无法自动化，而且对含有一个以上供体的精子的样品容易发生选择性偏差，而这在强奸样品中很常见。

因此，本领域需要简化将精细胞同法医样品中的上皮细胞分离开的方法，以用于自动化处理。

发明内容

一方面，本发明包括从包含第一种细胞和第二种细胞的样品中分离第一种细胞的方法：在优先裂解第二种细胞而不裂解第一种细胞的条件下处理样品，以形成含水裂解物(aqueous lysate)；向样品施加有效形成包含所述第一种细胞的沉淀的力；以及在所述沉淀和含水裂解物之间形成沉淀固定化封盖(pellet immobilizing cap)。

另一方面，通过沉淀下完整的靶细胞器和在沉淀和含水裂解物之间形成沉淀固定化封盖，所述方法可分离含水裂解物样品中的靶细胞器。

具体实施方式

本发明公开了适合于从含有非精细胞如上皮细胞的样品中分离精细胞的方法，其中所述方法首先选择性裂解非精细胞，随后使用沉淀固定化封盖从裂解的非精细胞中分离完整的精细胞。除了允许分离精细胞外，这些方法可用于从包含一种以上细胞类型的样品中分离其他细胞类型。

这些方法特别适合于纯化包含非靶细胞或主要由非靶细胞组成的样品中的靶细胞，其中通过选择裂解非靶细胞而不裂解靶细胞或靶细胞裂解程度比非靶细胞低的条件，可优先裂解非靶细胞。这有助从裂解的非靶细胞中分离靶细胞。分离的靶细胞随后可用于分离例如靶细胞核酸，它可用作后续核酸扩增的模板。除去非靶细胞物质减少了来自非靶细胞的污染核酸的问题。非靶细胞会增加背景核酸，从而掩盖或模糊靶信号。

本发明所述方法适用于期望从含有一种以上细胞的起始材料中的细胞中分离物质的任何场合，其中一种以上的细胞在一定条件下具有不同的裂解敏感性。这些方法可用于例如纯化各种各样的潜在生物复合物质如污水、土壤样品、空气样品或体液中的微生物。可使用本发明所述方法纯化微生物，例如细菌、病毒、酵母和真菌，其中包括例如天然存在的病原体、生物战剂和毒霉等。而且，这些方法可用于纯化细胞样品中完整的细胞器，例如细胞核。

取自性攻击受害者的法医样品一般含有大量的上皮细胞和相对少量的精细胞(若有)。为了获得精细胞的DNA以用于随后的基因相同性检测，有必要将精细胞与可能干扰结果解读或使结果解读变得复杂的水溶性物质尤其是DNA分离开。例如，来自裂解的上皮细胞的DNA溶于水溶液。

在下文描述的方法中，通过向样品施加力(一般为离心)经过一段足以形成精子沉淀的时间，随后向样品加入沉淀固定化封盖材料以在精细胞沉淀和水溶性物质之间形成阻挡层，从而将精细胞与样品中的水溶性物质分离开来。水溶性物质(例如DNA)留在水相，沉淀固定化封盖将其与沉淀下来的精细胞进行物理分离。沉淀固定化封盖最大程度降低了例如向容器内加入液体或除去容器中液体时分散精细胞沉淀现象的发生。根据本发明使用沉淀固定化封盖有助于除去污染物质(例如上皮细胞的DNA)，同时最大程度减少精细胞沉淀的损失。较低离心力形成的松散精细胞沉淀特别容易分散。因此，本发明所述方法特别适合于采用多孔平板的高通量体系，这些多孔平板被改造用于仅可施加较低离心力的平板转子。这些方法还可用于将较高离心力所形成的致密堆积的精细胞沉淀与污染物质分离开。

本文中所用的“精细胞”可包括完整的精细胞或基本完整的精细胞，以及已失去其鞭毛或“尾”的精细胞，还包括未成熟的精细胞前体细胞如精子细胞。虽然精细胞可被暴露于改变细胞的环境条件、机械剪切或化学处理(例如暴露于蛋白酶K或其他药剂)下，但这些细胞、尤其是保留其细胞核的这些细胞仍位于本发明的范围内。

来自性攻击的法医样品一般收集自固相载体，例如拭子或布(例如从含有精斑的衣物剪下来的部分)。拭子或布可转移至容器如试管或其他适宜的容器中，并与水溶液例如优先裂解非精细胞的裂解缓冲液接触。将材料从固相载体转移至水溶液后，离心容器，使含水材料中的精细胞发生沉降或沉淀。任选情况下，可将固相载体和含水缓冲液转移到配有机械阻挡层的第二容器中，促进含水缓冲液和精细胞的回收，其中机械阻挡层可有效阻止固相载体通过，同时却允许液体样品通过。回收固相载体上的含水样品和沉淀精细胞可在一次离心中完成。

用于选择性裂解上皮细胞的裂解缓冲液适宜地包括蛋白酶K、肌氨酰或SDS。任选情况下，该裂解缓冲液可包括任何适宜的水溶性染料(例如FD& C Yellow)，以增加水相的显色。以适宜量的蛋白酶例如蛋白酶K在允许上皮细胞裂解而不促进精细胞裂解的条件下处理材料。由于暴露的蛋白质含有相对大量的二硫键，精细胞较为耐受蛋白酶。因此，还原条件不适合于差异裂解，因为还原剂的存在会破坏二硫键，增加蛋白酶处理的精细胞的裂解。本发明还预想到毛地黄皂苷或非离子型去污剂例如Tergitol可用于选择性透化或裂解不同类型的细胞。本发明预计，上皮细胞因其结构对毛地黄皂苷引起的透化或裂解比精细胞更为敏感。同样，本发明还预计，具有不同胆固醇含量的细胞会表现出对毛地黄皂苷引起的透化的不同敏感性。

蛋白酶K和去污剂处理后，离心含有裂解的上皮细胞和完整精细胞的裂解物，以沉淀精细胞。随后将沉淀固定化封盖材料转移到该容器中，以在沉淀的精细胞和含水材料之间形成沉淀固定化封盖。优选情况下，沉淀固定化封盖层被转移到靠近含水材料的下部，恰好位于精细胞沉淀之上。随后除去含水材料，同时沉淀固定化封盖仍保留在沉淀上方适当的位置。

在下文的实施例中，顺磁颗粒(Promega Corp.)和DNA 树脂(目录号A8252，Promega Corp.，Madison，WI)被用作沉淀固定化封盖材料，以在细胞沉淀和非靶物质(例如含水材料或非靶细胞裂解物)之间形成沉淀固定化封盖。除去含水材料的过程中，在细胞沉淀的下方放置一块磁体，以将沉淀固定化封盖保持在沉淀和非靶物质之间适当的位置，防止沉淀的混合和分散。除去含水材料和洗涤细胞沉淀后，在允许来自细胞的DNA结合到颗粒的条件下裂解细胞沉淀中的细胞。

预见到，可使用其他适宜的顺磁性材料在细胞沉淀上方形成沉淀固定化封盖以便在除去含水材料的过程中防止精细胞沉淀的分散，其中包括但不限于名为＂Simultaneous Isolation and Quantitation of DNA＂的美国专利6,673,631(Tereba等人)和名为＂Methods of Isolating Biological TargetMaterials Using Silica Magnetic Particles＂的美国专利6,027,945(Smith等人)描述的顺磁性材料。在本发明的一个优选实施方式中，磁性或顺磁性沉淀固定化封盖材料的总体积约为40μl或更少。在本发明的一个更加优选的实施方式中，每份样品磁性或顺磁性沉淀固定化封盖材料的总体积约为10μl或更少。在本发明的一个最优选实施方式中，每份样品磁性或顺磁性沉淀固定化封盖材料的总体积约为2μl或更少。

磁性颗粒包括含铁物质。本发明特别预期到，可使用其他的磁性或顺磁性材料，例如含镍或含钴的物质。磁性颗粒可覆以包含二氧化硅或纤维素性化合物(例如纤维素、葡聚糖或琼脂糖)的物质，例如美国专利6,855,499描述的物质。

本发明的一个优选实施方式使用了集聚的磁性或顺磁性颗粒，其中每个颗粒包含两个或更多的覆以含硅氧化物(silaceous oxide)涂层的磁性或顺磁性核心。该集聚磁性颗粒的优选大小是颗粒最小尺寸为1-15微米。这些集聚磁性颗粒的优选颗粒BET表面积为约1m²/gm到约50m²/gm，其由氮吸收法测定。

另一种适合用于沉淀固定化封盖的材料是包含编织纤维或未编织纤维的至少一层磁垫(magnetic mat)，其中编织纤维或未编织纤维含磁性材料，例如可从3M购得的可塑磁性材料。实际操作中，可确定沉淀固定化封盖的适宜大小，使其在沉淀和水相之间形成一层。该垫可为固相表面或含有足够大小的开口以允许液体通过而不允许沉淀材料通过。例如，该磁垫可包含其开口小于靶物质(如精子)最小尺寸的网。使用多个垫可提供更多保障，确保沉淀在处理步骤中被覆盖。磁垫可为可塑性塑料磁体。该塑料磁体是可塑造、冲压或机器制造成特定形状的低成本磁体，其重量轻，磁场强度高。这类塑料磁体的实例是位于St.Paul，MN的3　M Electronics ProductsDivision生产的Magnet Material B-1060。可从Dexter Magnetic Technologies(Elk Grove Village，IL)获得的挠性铁氧薄片或条带形式的永久磁体也可用于形成编织垫或未编织垫。

适合用作沉淀固定化封盖的材料包括密度大于含水材料即密度大于约1.0g/cm³的材料。优选情况下，沉淀固定化封盖材料是在用于分离精细胞沉淀和含水材料的条件下不结合到可溶性含水材料上的材料。此外，该材料优选能够使含水材料发生位移，以在精细胞沉淀上方形成沉淀固定化封盖，同时基本排除含水材料。适宜情况下，该沉淀固定化封盖材料经配置，可防止混合，例如在向体系加入液体或除去体系中液体时可防止混合。在使用本发明的一个优选方法中，通过应用外部磁场或改变沉淀固定化封盖的物理状态如温度或压力变化，可将沉淀固定化封盖保持在适当的位置。虽然颗粒尺寸不是关键因素，但仍期望其为俘获更少水溶液的较小颗粒，因此需要较少的洗涤。

适宜的沉淀固定化封盖材料的实例包括温度响应性材料。温度响应性材料在约32℃以上的温度时为固态或半固态，而在约32℃以下为液态形式。因此，温度响应性材料在室温下应为液态。温度响应性材料能够可逆地从液态转化为固态(或半固态)，反之亦然。因此当把样品加热到足够程度以使温度响应性材料转化为固态时，即生成了沉淀固定化封盖。

一种例示性的温度响应性材料是N-异丙基丙烯酰胺(NIPA)(也被称为N-(n-丙基)丙烯酰胺；登录号2210-25-5)。其他适宜的温度响应性材料包括聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)、聚(乙基丙烯酰胺)、聚(N-乙基甲基丙烯酰胺)、聚[N-(3-乙氧基丙基)丙烯酰胺]；聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]、聚(N-乙烯基异丁酰胺)、聚(N-乙烯基乙酰胺)、甲氧基聚乙二醇和聚延胡索酸亚丙酯的共聚物、乙二醇的乙烯醚、羟丙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯基甲醚、丁基乙烯醚、聚缩水甘油、丙烯酰-L-脯氨酸甲酯、乙烯基吡咯烷酮和乙酸乙烯酯的共聚物、N-丙烯酰-N′-烷基哌嗪和甲基丙烯酸甲酯的共聚物、聚(甲基2-丙酰胺基丙烯酸酯)、聚丙烯酸、聚(丙烯酰胺-co-甲基丙烯酸丁酯)、聚(有机膦腈)(poly(organophosphazene))、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、明胶、聚(N-乙烯基己内酰胺)、弹性蛋白、弹性蛋白模拟多肽、2，4，6-三甲基吡啶和聚(N-乙烯基吡咯烷酮)。

在精细胞沉淀上方形成沉淀固定化封盖后和在除去含水材料之前，可任选加入密度大于含水材料的非水液体以促进含水材料的除去。适合与本发明方法联用的非水液体包括美国申请10/939,105所描述的非水液体，该申请已通过引用的方式纳入本文。非水液体的密度优选位于含水材料和沉淀固定化封盖材料的密度之间。但是，如果沉淀固定化封盖材料被另一种力例如施加到顺磁性沉淀固定化封盖上的磁场力保持在适当的位置，则可适宜地使用大于沉淀固定化封盖材料密度的非水液体。加入非水液体后，任选地通过离心辅助分离水相和非水相，并除去水相。

本领域技术人员完全有能力评估非水液体是否适合于依据本发明所述方法除去水溶性物质。适宜的非水液体为非离液序列高的，以防止沉淀细胞不期望发生的裂解。非水液体优选为具有较低水溶性的液体。采用低水溶性的非水液体，一般可实现更好的相分离，减少水溶性物质如上皮细胞的DNA对精细胞沉淀的污染。

正如美国申请10/939,105所详述，适宜的非水液体包括但不限于戊二酸二乙酯(DEG)、戊二酸二甲酯(DMG)和1-氯-2-甲基-2-丙醇。使用具有不同密度的两种或更多种非水液体可调节非水液体的密度，其中两种或更多种非水液体以有效得到所需密度的比例进行组合。若使用两种或更多种的非水液体，这些液体可适宜地基本相互混溶，以形成密度基本均一的液体混合物。或者，可采用标准纯化方法从沉淀提取DNA。

此外，本发明还特别预想到，通过选择合适的比例以提供具有适宜密度的混合非水液体，氯仿可与DMG、DEG或1-氯-2-甲基-2-丙醇联合使用以分离精细胞。

来自裂解的上皮细胞的上皮细胞DNA溶于水，其出现在水相层，经采用任何适宜的方式例如移液除去含水材料可将其分离。出现在水相的上皮细胞DNA可在基因相同性检测中任选用作对照，以确认样品的来源。回收水相后，少量的水溶液可能仍残留在阻挡层表面上或附近以及容器壁上。任选情况下，为了促进除去水溶液和上皮细胞DNA而不分散精细胞沉淀，可以水或适宜的水溶液洗涤，除去残留的水溶液。任选情况下，沉淀固定化封盖材料和精细胞可沉淀下来，并除去水洗液。任选情况下，除去水洗物质之前，可加入另外的沉淀固定化封盖材料，以在之前被沉淀和封盖的精细胞的上方形成另外的沉淀固定化封盖。另加的沉淀固定化封盖材料与最初纯化过程中加入的沉淀固定化封盖材料可相同或不同。

正如实施例所描述，可除去含水材料留下精细胞沉淀，通过使细胞接触包含去污剂和/或离液剂以及还可能含有DTT的水溶液，可裂解精细胞，随后提取DNA。或者，可采用标准纯化方法从沉淀提取DNA。

例如，除去水相后，可向非水液体加入含有离液剂和还原剂的裂解缓冲液，经漩涡离心，形成基本均一的混合物。正如实施例所示，合并含有硫氰酸胍(GTC)和二硫苏糖醇(DTT)的裂解缓冲液、非水相、磁性二氧化硅树脂和精细胞沉淀，以裂解精细胞，并使裂解后细胞释放出的DNA结合到磁性二氧化硅树脂上。

或者，可同时除去水层和非水层，留下精细胞沉淀；再通过使细胞接触包含去污剂如十二烷基磺酸钠(SDS)和还原剂如DTT的水溶液，裂解精细胞。裂解后，采用苯酚/氯仿萃取或使用适宜的DNA纯化方法例如本领域知晓的标准DNA纯化方法分离DNA。

正如实施例所描述，本发明所述方法可有效地将精细胞同法医样品例如阴道拭子或子宫颈拭子中所含的上皮细胞分离开。预见到，该方法可用于分离其他来源的精细胞，其中包括含精液的其他固相载体，例如布。本发明还合理地预计，本发明所述方法适合用于含有精细胞并有红细胞或白细胞或源自其他有核非精细胞的DNA污染的样品。

本发明所述方法不仅适合用于分离精细胞，预计它还可普遍适用于基于对各种裂解条件的不同敏感性的细胞分离。例如，以革兰氏阴性细胞对其特别敏感的溶菌酶处理来差异裂解革兰氏阴性细胞后，本发明所述方法经修改可将某些革兰氏阳性菌细胞同革兰氏阴性细胞分离开。

此外，选择裂解例如选择裂解细胞膜或细胞壁之后，本方法可用于分离溶于水溶剂的亚细胞器物质。正如下文的实施例所描述，已发现该方法可用于全血细胞裂解后从其他细胞取代物(substituent)中分离出细胞核。该方法可用于从溶液中的细胞取代物分离出沉淀的靶物质，还可用于从沉淀的非靶物质分离出靶细胞取代物。

任选情况下，使用本发明所述方法采用尽量避免核膜裂解的条件，经选择性裂解细胞的细胞膜，可分离细胞核。实施例6预测性地描述了使用本发明所述方法分离HEC细胞RNA的过程，其中以含有毛地黄皂苷和RNA酶抑制剂的裂解缓冲液处理细胞。在这些条件下，预计细胞膜至少会被部分裂解，以释放细胞内的细胞质DNA，预计细胞核将保持足够程度的完整，以被离心沉淀下来，而RNA仍保留在裂解物中。2007年3月14日提交的美国临时申请60/894,810更详细描述了使用毛地黄皂苷进行的选择性裂解或透化，该临时申请以引用的方式被整体纳入本文。随后在沉淀和包含RNA的裂解物之间形成沉淀固定化封盖。

实施例6预测性地描述了使用包含40mg/ml毛地黄皂苷的裂解缓冲液。但是，预见到，可使用任何适宜浓度的毛地黄皂苷，只要其浓度可有效裂解细胞膜，而不引起细胞核发生实质裂解或透化。细胞核的实质裂解是指干扰沉淀细胞核能力的裂解。优选情况下，通过离心可除去至少5％、10％、25％、50％、75％或99％的细胞核。例如，预见到，浓度为0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml的毛地黄皂苷是适宜的。实施例6还预测性地描述了在裂解缓冲液中包含浓度为400U/ml的RNasinPlus。预见到，可加入RNA酶抑制剂，其量可有效抑制可能存在的任何RNA酶，这种抑制程度足以允许分离出至少一部分RNA。优选情况下，RNA酶抑制剂的浓度为至少0.1单位/μl裂解物、0.2单位/μl裂解物、0.4单位/μl裂解物、1.0单位/μl裂解物、2单位/μl裂解物、4单位/μl裂解物、6单位/μl裂解物、8单位/μl裂解物或12单位/μl裂解物。正如本领域技术人员会理解，可使用任何适宜的RNA酶抑制剂。

实施例7预测性地描述了同时包含上皮细胞和精细胞的样品中上皮细胞的选择性裂解。使用包含毛地黄皂苷或非离子型去污剂例如Tergitol或它们的混合物的裂解缓冲液，预计可减少裂解上皮细胞所需的蛋白酶K的量，或者甚至无需蛋白酶K。减少蛋白酶K可导致精细胞降解或裂解的减少，并提高精细胞和精细胞核酸的收率。

实施例7预测性地描述了使用包含40mg/ml毛地黄皂苷的裂解缓冲液。但是，预见到，可使用任何适宜浓度的毛地黄皂苷，只要其浓度可有效裂解上皮细胞，而不引起精细胞发生实质裂解。例如，预见到，浓度为0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml的毛地黄皂苷是适宜的。精细胞的实质裂解是指干扰沉淀精细胞能力的裂解。优选情况下，通过离心可除去至少5％、10％、25％、50％、75％或99％的精细胞。

适宜情况下，用于本发明所述方法的物质可提供为试剂盒。试剂盒适宜地包括沉淀固定化封盖材料，例如顺磁性颗粒、集聚二氧化硅磁性颗粒或集聚二氧化硅顺磁性颗粒或二氧化硅磁性颗粒，例如

颗粒。本发明的试剂盒还可包含一种或多种可用于将特定细胞、亚细胞器或细胞组分从特定细胞分离开来的其他组分。例如，试剂盒可包含用于差异裂解污染细胞的缓冲液或试剂，例如蛋白酶K、溶菌酶或去污剂。任选情况下，试剂盒可包含用于从目的细胞分离DNA的组分，其中包括例如离液剂。该试剂盒可任选含有非水液体，其具有适宜密度以便除去含水材料。

下列非限制性实施例仅用于说明。

实施例1.沉淀固定化封盖方法与连续旋转和洗涤的标准方法比较

用于该实施例的样品为由阴道拭子制备的干燥样品拭子，其中该阴道拭子上加入超纯水稀释的精液，使得每个拭子含0.2μl的精液(～32,000精子)。来自每个拭子的棉花基底被分成两半，得到两个样品。向1.5ml微量离心管内的每份样品加入含有108μg蛋白酶K(Promega目录号V3022)的400μl消化缓冲液(Promega)。样品漩涡振荡30秒，56℃下温育1小时。温育后，用镊子夹出溶液中拭子的棉花基底部分，将其转移至位于新的1.5ml微量离心管中的spin basket。剩余液体消化液用移液管转移到含有相应棉花基底的spin basket。样品在吊桶式转头上(全部来自Beckman：Allegra 6R离心机；GH-3.8转子；Microplus Carrier；Biomek2000 24-位试管架，配1.5ml微量离心管适配器)以1,400×g(3,000rpm)旋转10分钟。从样品管取出含有棉花基底的spin basket，弃去。将样品分成两个处理组：组1(沉淀固定化封盖)和组2(旋转/洗涤)，以获得精子部分。

组1：每个旋转样品管加入7μl DNA IQ^TM树脂(目录号A8252，PromegaCorp.)。样品管置于水平磁体上，使得磁化的DNA IQ^TM树脂位于可见到或预计可见到细胞沉淀的样品管底部。随后在每个样品管靠近水消化液底部但高于磁化树脂处加入100μl Differex^TM分离液(目录号A8512)。水消化液部分和分离液分开到上面的水层和下面的非水层。除去上面的水层。采用500μl超纯水，连续两次洗涤管壁和非水层的顶部表面。除去最后一次洗涤液后，向每份样品加入含60mM DTT的200μl DNA IQTM裂解缓冲液(目录号A8262)，短暂漩涡振荡样品。采用DNA IQ^TM核酸分离体系(目录号DC6700)进行DNA分离。DNA洗脱在40μl体积中。

组2：离心后，除去大部分消化上清，留下细胞沉淀上方15到20μl的上清。每份样品加入500μl的超纯水，随后样品又旋转离心10分钟。除去上清，只留下15到20μl。洗涤过程重复两次，一共进行三次水洗涤。除去最后一次洗涤液后，每份样品加入含有60mM DTT的100μl DNA IQ裂解缓冲液。每份样品加入7μl DNA IQ树脂。样品短暂漩涡振荡后，用作DNA IQ核酸分离的起始材料。DNA分离物洗脱在40μl体积中。

采用Quantifier Y测定体系(Applied Biosystems，San Carlos CA，目录号4343906)定量测定来自组1和组2的精细胞部分的样品。采用0.5到1.25ng的模板，对每份样品进行THO1单基因座STR扩增(Promega Corp，目录号DC6561)。合并1μl的THO1扩增产物和9μl Hi-Dye甲酰胺以及1μl ILS600，对男性部分的样品进行毛细管电泳(3100 Genetic Analyzer；AppliedBiosystems)。采用Genescan软件(Applied Biosystems)分析来自毛细管电泳的数据的注射参数。

女性和男性供体的THO1基因座均为杂合型。女性供体表现出(9.3，9)的基因型，而男性供体表现出(9，6)的基因型。两位供体在THO1基因座具有相同的9个重复的等位基因。两位供体之间非共有的THO1等位基因为9.3个重复(女性特有)和6个重复(男性特有)。9.3和6碱基对重复的扩增产物的电泳图谱峰在荧光素通道分别显示为大约175和161个碱基对。

这些峰的荧光强度(表示为电泳图谱上的峰高)的检测结果被用于测定男性部分的样品中两位供体的相对表示值(relative representation)。下文的表1给出了两个非共有的等位基因峰(女性特有和男性特有)所得到的结果。

表1.

样品	175bp(女性特有)峰高的相对荧光单位	161bp(男性特有)峰高的相对荧光单位
样品	175bp(女性特有)峰高的相对荧光单位	161bp(男性特有)峰高的相对荧光单位	处理组1平行1	329	739
处理组1平行2	0	370	处理组1平行1	329	739
处理组1平行2	0	370	处理组1平行3	0	1069
			处理组1平行3	0	1069
			处理组2平行1	0	184
处理组2平行2	0	1205	处理组2平行1	0	184
处理组2平行2	0	1205	处理组2平行3	0	262

这些数据表示，在将精细胞同大部分女性上皮细胞分离开，使其成为基本不含女性上皮细胞DNA残留的男性部分方面，沉淀固定化封盖(组1)的表现可以与传统的上皮细胞连续差异提取方法即稀释、旋转和除去(组2)相比。

实施例2.采用DNA IQ^TM树脂作为沉淀固定化封盖(加入或不加入非水液体)进行精细胞沉淀的磁性固定化

用于该实施例的样品为由阴道拭子制备的干燥样品拭子，其中该阴道拭子上加入超纯水稀释的精液，使得每个拭子含2μl的精液(约200,000个精子)。来自每个拭子的棉花基底被分成两半，得到两个样品。向1.5ml微量离心管内的每份样品加入含310μg蛋白酶K的400μl毛地黄皂苷缓冲液。样品漩涡振荡30秒，56℃下温育90分钟。温育后，用镊子从溶液中夹出棉花基底，将其转移至位于新的1.5ml微量离心管中的spin basket。剩余液体消化液用移液管转移到含有相应棉花基底的spin basket。封盖样品，随后其在吊桶式转头上以1,400×g(3,000rpm)旋转离心10分钟。从样品管取出含有棉花基底的spin basket，弃去。样品被放置到MagneSphere TechnologyMagnetic Separation Stand(Promega目录号Z5332)中，其经改造，可使磁场集中到管底部的细胞沉淀上。随后每份样品加入7μl DNA IQ^TM树脂。样品被分成两个处理组：组1(以DNA IQ^TM树脂进行精细胞沉淀固定化，随后加入非水液体阻挡层)和组2(只使用DNA IQ^TM树脂进行沉淀固定化)。

组1：随后向每个样品管靠近水消化液底部但高于磁化树脂处加入100μl Differex^TM分离液(戊二酸二甲酯)(目录号A8512)，以覆盖树脂和细胞沉淀。水消化液组分和分离液分开到上面的水层和下面的非水层。除去上面的水层。轻轻向每管加入500μl不含核酸酶的水(Promega Corp.，目录号P1193)，洗涤管壁和分离液的上表面。样品管放回到吊桶式转头内，1,400×g下又旋转离心10分钟。旋转离心后，取出水洗涤液并弃去。又重复两次洗涤步骤，一共进行三次水洗涤。随后向样品加入含60mM DTT的250μlDNA IQ^TM裂解缓冲液，短暂漩涡振荡样品。形成的样品被用作DNA IQ^TM核酸分离的起始材料。

组2：除去大部分上皮细胞水消化液，样品管内的RNA酶抑制剂固定化的细胞沉淀上方留下大约20μl的残余物。向样品管轻轻加入500μl不含核酸酶的水，稀释上清中的上皮细胞DNA。除去洗涤液，留下20μl的残余物。洗涤过程重复两次，一共进行三次洗涤。随后向样品加入含60mM　DTT的250μlDNA IQ^TM裂解缓冲液，短暂漩涡振荡样品。形成的样品被用作DNA IQTM核酸分离的起始材料。

来自两个处理组的精细胞组分被转移到每孔容量为2.2ml的96孔板(ABgene目录号AB-0932，Rochester，NY)的孔中。采用在　2000Workstation(Beckman Coulter)上自动化的DNA IQ^TM核酸分离来分离平板上样品中的DNA。洗脱每份样品分离出的DNA，得到100μl的体积。

采用靶向Y染色体的Plexor^TM(Promega目录号A4011)定量PCR检测方法定量测定每份DNA样品中男性特有DNA的含量。使用来自每份精子部分的制品的0.25ng男性特有DNA作为THO1单基因座STR扩增的模板。女性和男性供体的THO1基因座均为杂合型。女性供体表现出(9.3，9)的基因型，而男性供体表现出(9，6)的基因型。两位供体在THO1基因座具有相同的9个重复的等位基因。两位供体之间非共有的THO1等位基因为9.3个重复(女性特有)和6个重复(男性特有)。9.3和6个碱基对重复的扩增产物的电泳图谱峰在荧光素通道分别显示为大约175和161个碱基对。

这些峰的荧光强度(表示为电泳图谱上的峰高)的检测结果被用于测定男性部分的样品中两位供体的相对表示值。下文的表2给出了两个非共有的等位基因峰(女性特有和男性特有)所得到的结果。

表2.

这些数据表明，在某些条件下不管加入非水液体(组1)还是不加入非水液体(组2)以增强阻挡层，使用顺磁性树脂作为障碍固定化精细胞沉淀，其将精细胞同带有女性上皮细胞的混合物中的主要组分分离开来的效果是可比的。

实施例3.差异裂解不同属的细胞后，固定化裂解物中的细胞沉淀。

最初以裂解大肠杆菌而不裂解金黄色葡萄球菌的溶菌酶消化混合物，将来自新鲜尿样(来自健康个体，加入细菌)的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌同革兰氏阴性菌大肠杆菌E.coli JM 109(pMGFP)分离开来。与以下样品平行，还进行了八份只含每种菌株的对照样品。此外，还包括不使用任何酶的对照(2×8＝16)和在最初裂解步骤中同时使用溶菌酶和溶葡萄球菌素的其他样品(2×8＝16)。这些对照样品的上方均未放置颗粒。

在Corning圆底96孔板上，向含有50mM EDTA和约3×10⁷个金黄色葡萄球菌以及约1×10⁸个E.coli JM109(pMGFP)的180μl尿样每孔加入5μl的10mg/ml溶菌酶(Sigma Aldrich，St.Louis，MO目录号L-6876)，37℃下温育30分钟。经溶菌酶消化差异裂解大肠杆菌后，使用带吊桶式转头的Sorvall RT6000B离心机(Thermo Electron，Waltham MA)离心沉淀(800×g，20分钟)Corning圆底96孔板上的金黄色葡萄球菌细胞。随后或以2μl的Promega DNA-IQ树脂(4×8＝32)(100mg/ml，目录号DC6701)覆盖形成的沉淀，或对于其余不加入颗粒的样品(4×8＝32样品)加入2μl的水而非DNA

树脂，覆盖形成的沉淀。样品放置60秒，使得加入的颗粒沉降到底部，覆盖沉淀。随后在平板下放置水平磁体，施加磁场力以固定化金黄色葡萄球菌沉淀上的DNA

树脂颗粒，同时除去覆盖在上面的液体(含有裂解的大肠杆菌)。采用Promega的Wizard基因组纯化体系，所有样品均遵循以下方案：

a)每孔加入8μl的溶葡萄球菌素(2mg/ml)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO目录号L0761)，反复抽吸6次(上下抽吸)重新悬浮沉淀，37℃下温育30分钟。随后每孔加入90μl的细胞核裂解液(Nuclei Lysis Solution，目录号A7943)，反复抽吸6次进行混合。平板在21℃下温育10分钟。

b)加入35μl的蛋白沉淀液(Protein Precipitation Solution，目录号A7953)，样品以吸管混合10次。平板在21℃下温育5分钟.

c)平板以800×g离心20分钟。

d)每份上清被转移到每孔含140μl异丙醇的洁净Corning圆底96孔板上。样品经抽吸10次，混匀，21℃下放置15分钟。平板以800×g离心20分钟。用吸管除去上清。

e)每孔加入200μl的75％乙醇。

平板以800×g离心20分钟。

g)吸取除去上清，平板风干20分钟。

h)每孔加入50μl的Elution Buffer，Blood(目录号MD1 421)。

i)平板4℃下放置12小时。对于每列，每份样品取12μl汇集成一份96μl的平均样品，12,000×g离心30秒后定量测定其在260nm处的吸光度。以(Invitrogen，Carlsbad，CA)定量测定单个样品。

表3所示的结果表明沉淀固定化封盖方法得到了更高的平均DNA收率。

表3.

平板A样品 ng/ul 平板A 平板B样品 ng/ul 平板B

列1无颗粒A 1.25 列1+2ul DNAIQ树脂A 1.76

列1无颗粒B 1.75 列1+2ul DNAIQ树脂B 1.92

列1无颗粒C 1.59 列1+2ul DNAIQ树脂C 1.65

列1无颗粒D 1.83 列1+2ul DNAIQ树脂D 2.31

列1无颗粒E 1.86 列1+2ul DNAIQ树脂E 2.18

列1无颗粒F 2.04 列1+2ul DNAIQ树脂F 1.94

列1无颗粒G 1.79 平均值列1+2ul DNAIQ树脂G 2.56 平均值

列1无颗粒H 2.57 1.83 列1+2ul DNAIQ树脂H 2.48 2.10

列2无颗粒A 1.97 列2+2ul DNAIQ树脂A 2.02

列2无颗粒B 1.85 列2+2ul DNAIQ树脂B 1.88

列2无颗粒C 1.26 列2+2ul DNAIQ树脂C 1.34

列2无颗粒D 1.53 列2+2ul DNAIQ树脂D 1.82

列2无颗粒E 2.20 列2+2ul DNAIQ树脂E 1.73

列2无颗粒F 1.78 列2+2ul DNAIQ树脂F 1.78

列2无颗粒G 1.36 平均值列2+2ul DNAIQ树脂G 1.61 平均值

列2无颗粒H 1.99 1.74 列2+2ul DNAIQ树脂H 1.86 1.75

列3+2ulDNA_IQ树脂 2.15 列3未加入颗粒A 1.36

列3+2ulDNA_IQ树脂 1.91 列3未加入颗粒B 1.14

列3+2ulDNA_IQ树脂 1.65 列3未加入颗粒C 1.42

列3+2ulDNA_IQ树脂 2.30 列3未加入颗粒D 1.20

列3+2ulDNA_IQ树脂 2.15 列3未加入颗粒E 1.14

列3+2ulDNA_IQ树脂 2.26 列3未加入颗粒F 1.31

列3+2ulDNA_IQ树脂 2.81 平均值列3未加入颗粒G 1.93 平均值

列3+2ulDNA_IQ树脂 2.83 2.26 列3未加入颗粒H 2.23 1.47

列4+2ulDNA_IQ树脂 2.32 列4未加入颗粒A 1.24

列4+2ulDNA_IQ树脂 1.84 列4未加入颗粒B 1.34

列4+2ulDNA_IQ树脂 1.59 列4未加入颗粒C 0.96

列4+2ulDNA_IQ树脂 2.11 列4未加入颗粒D 1.13

列4+2ulDNA_IQ树脂 2.19 列4未加入颗粒E 0.99

列4+2ulDNA_IQ树脂 1.73 列4未加入颗粒F 0.96

列4+2ulDNA_IQ树脂 2.01 平均值列4未加入颗粒G 1.39 平均值

列4+2ulDNA_IQ树脂 3.38 2.15 列4未加入颗粒H 1.21 1.15

列5无酶对照 1.55 列5加入两种酶A 0.68

列5无酶对照 1.08 列5加入两种酶B 0.60

列5无酶对照 1.09 列5加入两种酶C 0.62

列5无酶对照 0.94 列5加入两种酶D 0.63

列5无酶对照 0.91 列5加入两种酶E 0.76

列5无酶对照 0.68 列5加入两种酶F 0.58

列5无酶对照 1.04 平均值列5加入两种酶G 0.73 平均值

列5无酶对照 1.12 1.05 列5加入两种酶H 0.75 0.67

列6无酶对照 0.71 列6加入两种酶A 0.91

列6无酶对照 0.62 列6加入两种酶B 0.65

列6无酶对照 0.76 列6加入两种酶C 0.68

列6无酶对照 0.77 列6加入两种酶D 0.80

列6无酶对照 1.40 列6加入两种酶E 0.57

列6无酶对照 0.87 列6加入两种酶F 0.45

列6无酶对照 1.55 平均值列6加入两种酶G 0.33 平均值

列6无酶对照 1.90 1.07 列6加入两种酶H 0.28 0.58

列7JM109(pMGFP) 0.80 列7金黄色葡萄球菌无溶葡萄球菌酶A 0.16

列7JM109(pMGFP) 0.83 列7金黄色葡萄球菌无溶葡萄球菌酶B 0.18

列7JM109(pMGFP) 0.80 列7金黄色葡萄球菌无溶葡萄球菌酶C 0.16

列7JM109(pMGFP) 0.95 列7金黄色葡萄球菌无溶葡萄球菌酶D 0.16

列7JM109(pMGFP) 0.28 列7金黄色葡萄球菌+溶葡萄球菌酶A 0.39

列7JM109(pMGFP) 0.34 列7金黄色葡萄球菌+溶葡萄球菌酶B 0.32

列7JM109(pMGFP) 0.54 平均值列7金黄色葡萄球菌+溶葡萄球菌酶C 0.21 平均值

列7JM109(pMGFP) 0.80 0.67 列7金黄色葡萄球菌+溶葡萄球菌酶D 0.33 0.24

实施例4.从固定化的沉淀细胞核分离DNA

采用

基因组DNA纯化体系(Promega目录号A1120)以150μl的红细胞裂解缓冲液稀释50μl等份的人全血。裂解红细胞和白细胞，同时保持白细胞细胞核的完整。采用吊桶式转头在Corning圆底96孔板上离心沉淀细胞核(1400×g，10分钟)。在一半的样品中，以20μl的Promega

顺磁性颗粒(目录号A2201)覆盖形成的沉淀上，以一层磁性颗粒覆盖沉淀下的细胞核。另一半样品与20μl水而非

颗粒接触。在平板下放置一磁体，施加磁场力以固定化沉淀下的细胞核，同时除去上面覆盖的上清。

实施例5.从固定化的沉淀细胞核分离DNA

采用Wizard基因组DNA纯化体系按照标准方案分离每个样品的DNA。简而言之，每孔加入100μl的细胞核裂解液(Promega目录号A7943)，反复抽吸6次进行混合。平板在21℃下温育10分钟。加入35μl的蛋白沉淀液(目录号A7953)，样品以吸管混合6次。平板在21℃下温育5分钟。平板以800×g离心20分钟。每份上清被转移到每孔含140μl异丙醇的洁净Corning圆底96孔板上。平板以800×g离心20分钟。用移液管除去上清。每孔加入200μl的75％乙醇。平板以800×g离心20分钟。吸取除去上清，平板风干30分钟。每孔加入50μl的Elution Buffer，Blood(目录号MD 1421)。平板在4℃下温育12小时。对于每列，每份样品取12μl汇集成一份96μl的平均样品，12,000×g离心30秒后定量测定其在260nm处的吸光度(minus A320)。以(Invitrogen，Carlsbad，CA)定量测定单个样品。结果显示在表4和表5中。

表4.

表5

正如表4(每样品种类每列的平均值(一组八个样品))和表5(单个样品的picogreen值以及它们的平均值)所示，与未使用

颗粒覆盖的样品相比，使用1μl、2μl或4μl的MagneSil磁性颗粒(平均每孔1μg、2μg或4μg颗粒)得到了更高的平均收率。此外，Picogreen结果表明，当使用

颗粒固定化细胞核沉淀时，样品信息丢失(dropout，即未检测出DNA的样品)的频率更低。使用磁性颗粒固定化沉淀下的细胞核提供了更均一可靠的结果和更高的DNA收率。当使用磁性颗粒来固定化沉淀时，有可能每样品沉淀的细胞核损失得更少，除去样品的上清时聚集物中的细胞核沉淀损失得更少。

实施例6.纯化细胞质RNA，使其与细胞核分离开。

96孔板上每孔使用200μl的裂解液分离每个样品的细胞质RNA，其中裂解液包含100mMHEPES pH7.6/100mM EDTA/40mg/ml毛地黄皂苷/0.4％DMSO(体积/体积)/400单位RNasin Plus(Promega目录号N2611)。简而言之，每孔加入含1×10⁶HEK 293细胞的200μl裂解液，反复抽吸6次进行混合。平板在4℃下温育10分钟。平板以800×g离心20分钟。其他每个样品沉淀(例如96孔板中的A1、A3、A5、A7、B2、B4、B6等)以1μl的MagneSil Blue颗粒覆盖，其余样品沉淀没有用MagneSil Blue颗粒覆盖。平板随后在水平磁体上放置60秒。随后通过使用多通道移液器将上清转移到洁净的Corning圆底96孔板的相应孔内。采用Promega的DNA定量体系(目录号K4000)得到每个样品的DNA定量结果；采用Quant-iTRiboGreen(Invitrogen目录R11490，Carlsbad，CA)得到RNA的定量结果。采用Promega的Plexor两步qRT-PCR体系(目录号A4051)进行RNA的定量RT-PCR。

实施例7.纯化人精细胞，使其与上皮细胞碎片分离开。

96孔板上每孔使用200μl的裂解液分离每个样品的人精子，其中裂解液包含100mMHEPES pH7.6/100mM EDTA/40mg/ml毛地黄皂苷/0.4％DMSO(体积/体积)。简而言之，每孔加入含1×10³人精细胞和1×10⁶人上皮细胞的200μl裂解液，反复抽吸6次进行混合。平板在40C下温育10分钟。平板以800×g离心20分钟。其他每个样品沉淀(例如96孔板中的A1、A3、A5、A7、B2、B4、B6等)以1μl的MagneSil Blue颗粒覆盖，其余样品沉淀没有用MagneSil Blue颗粒覆盖。平板随后在水平磁体上放置60秒。随后通过使用多通道移液器将上清转移到洁净Corning圆底96孔板的相应孔内。采用Promega的Differex System(目录号DC6800)纯化精细胞沉淀；采用Promega的AluQuant人DNA定量体系(Aluquant Human DNAQuantitation System，目录号DC1010)定量测定得到的DNA，并采用Promega的PowerPlex 16 System(目录号DC6530)了解得到的DNA概况。

Claims

1.一种从包含第一种细胞和第二种细胞的样品分离第一种细胞的方法，其包括：

(a)在裂解所述第二种细胞而不裂解所述第一种细胞的条件下处理所述样品，以形成含水裂解物；

(b)向样品施加力一段时间，所述时间足以形成包含所述第一种细胞的沉淀；以及

(c)在所述沉淀和含水裂解物之间形成沉淀固定化封盖。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一种细胞是精细胞。

3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括除去步骤(c)的所述含水裂解物。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其还包括回收所述沉淀。

5.如权利要求4所述的方法，其还包括洗涤所述沉淀。

6.如权利要求3所述的方法，其还包括在除去所述含水裂解物之前，以密度大于约1.00g/cm³的非水液体接触步骤(c)的所述含水裂解物，以在所述沉淀固定化封盖和所述含水裂解物之间形成非水层。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中通过离心施加所述力。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述沉淀固定化封盖包含磁性或顺磁性材料。

9.如权利要求8所述的方法，其还包括向所述磁性或顺磁性材料施加磁场，以维持所述封盖位于所述精子沉淀和含水材料之间。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述顺磁性材料包含二氧化硅。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述顺磁性材料包含二氧化硅磁性颗粒。

12.如权利要求8所述的方法，其中所述顺磁性材料包含覆有含硅氧化物的磁性颗粒。

13.如权利要求8所述的方法，其中所述顺磁性材料包含集聚的磁性颗粒，其中每个颗粒包含覆有含硅氧化物的两个或更多的磁性或顺磁性核心。

14.如权利要求8所述的方法，其中所述顺磁性材料包含磁垫。

15.如权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述沉淀固定化封盖材料包含纤维素性磁性颗粒。

16.如权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述沉淀固定化封盖材料包含温度响应性材料。

17.如权利要求1-16任一项所述的方法，其中所述方法以高通量过程进行。

18.如权利要求7所述的方法，其中所述力大约为3000×g或更小。

19.如权利要求1-18任一项所述的方法，其中所述第二种细胞是上皮细胞。

20.如权利要求1-19任一项所述的方法，其中所述含水材料包括非精细胞DNA。

21.如权利要求6所述的方法，其中所述非水液体包括戊二酸二乙酯、戊二酸二甲酯和1-氯-2-甲基-2-丙醇中的至少一种。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述非水液体还包括氯仿。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述非水液体包括氯仿和戊二酸二甲酯，其中戊二酸二甲酯：氯仿二者比例从约0.1:99.9到约50:50。

24.如权利要求10-12任一项所述的方法，其还包括在允许第一种细胞DNA结合到二氧化硅的条件下裂解所述第一种细胞。

25.如权利要求15所述的方法，其还包括在允许来自所述第一种细胞的DNA结合到纤维素性物质的条件下裂解所述第一种细胞。

26.如权利要求1-25任一项所述的方法，其中所述含水裂解物包含毛地黄皂苷，其浓度可有效裂解所述第二种细胞而不裂解所述第一种细胞。

27.一种从包含上皮细胞的含水样品分离精细胞DNA的方法，其包括：

(a)在允许选择性裂解所述上皮细胞的条件下处理所述样品；

(b)向处理过的所述样品施加力一段时间，所述时间足以形成精子沉淀；

(c)在所述精细胞沉淀和含裂解的上皮细胞的含水材料之间形成沉淀固定化封盖。

(d)除去所述含水材料；以及

(e)在允许纯化精细胞DNA的条件下裂解所述精细胞沉淀中的细胞。

28.如权利要求27所述的方法，其还包括在步骤(d)之前，加入密度大于约1.00g/cm³的非水液体，以在所述沉淀固定化封盖和所述裂解的上皮细胞之间形成非水层。

29.如权利要求28所述的方法，其还包括：

(f)在步骤(d)之后和步骤(e)之前，洗涤所述非水液体、沉淀固定化封盖和精细胞；

(g)施加力，以形成洗涤层、非水层和包含所述沉淀固定化封盖材料和精细胞的沉淀；

(h)在步骤(g)后，加入含二氧化硅的顺磁性材料，以在步骤(g)的所述沉淀和所述非水层之间形成顺磁性沉淀固定化封盖；以及

(i)除去所述洗涤层和非水层。

30.一种从含水细胞裂解物样品中分离完整细胞或靶细胞器的方法，其包括：

(a)向样品施加力一段时间，所述时间足以形成包含至少部分完整细胞或靶细胞器的沉淀；以及

(b)在所述沉淀和含水细胞裂解物之间形成沉淀固定化封盖。

31.如权利要求30所述的方法，其还包括除去所述含水材料。

32.如权利要求30或31所述的方法，其还包括回收所述沉淀。

33.如权利要求30-32任一项所述的方法，其中通过离心施加所述力。

34.如权利要求30-33任一项所述的方法，其中所述沉淀固定化封盖包含磁性或顺磁性材料。

35.如权利要求34所述的方法，其还包括向所述顺磁性材料施加磁场，以维持所述沉淀固定化封盖在所述沉淀和所述水溶性物质之间。

36.一种从包含含靶细胞器的细胞的样品分离靶细胞器的方法，其包括：

(a)在选择性裂解所述细胞而不裂解所述细胞器的条件下处理所述样品，以形成含水裂解物；

(b)向样品施加力一段时间，所述时间足以形成包含所述靶细胞器的沉淀；以及

(c)在所述沉淀和裂解物之间形成沉淀固定化封盖。

37.如权利要求36所述的方法，其中步骤(a)中处理所述样品包括使所述样品接触包含毛地黄皂苷的裂解缓冲液，其中毛地黄皂苷的浓度可有效地引起步骤(a)的选择性裂解。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述裂解缓冲液还包含RNA酶抑制剂。

39.一种从包含靶细胞的样品中分离靶细胞取代物的方法，其包括：

(a)在选择性裂解所述靶细胞而不裂解至少一种细胞器的条件下处理所述样品，以形成含水裂解物；

(b)向样品施加力一段时间，所述时间足以形成包含所述未裂解细胞器的沉淀；以及

(c)在所述沉淀和裂解物之间形成沉淀固定化封盖。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述沉淀包含细胞核。

41.如权利要求39或40所述的方法，其中步骤(a)中处理所述样品包括使所述样品接触包含毛地黄皂苷的裂解缓冲液，其中毛地黄皂苷的浓度可有效地引起步骤(a)的选择性裂解。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述裂解缓冲液还包含RNA酶抑制剂。

43.一种将靶细胞或靶细胞器与非靶细胞分离开的试剂盒，其包含优先裂解所述非靶细胞的裂解剂和沉淀固定化物质。

44.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述沉淀固定化物质包含二氧化硅磁性颗粒、纤维素性磁性材料、温度响应性材料和磁垫中的至少一种。