CN109072231A - 非细胞生物流体中宿主核酸对核酸消化酶的可及性的调节 - Google Patents

非细胞生物流体中宿主核酸对核酸消化酶的可及性的调节 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用去污剂和核酸消化酶从生物流体的非细胞部分分离感染原的核酸并对其进行扩增和测序的方法。本发明还涉及包含去污剂和核酸消化酶的用于实施根据本发明的方法的试剂盒套装。

Description

非细胞生物流体中宿主核酸对核酸消化酶的可及性的调节
技术领域
本发明涉及用于调节生物流体的非细胞部分中宿主核酸(HNA)的可及性的方法。本发明还涉及用于检测生物流体的非细胞部分中感染原的方法。
背景技术
生物流体中病原性感染原的检测应尽可能在最短的时间内进行，特别是在败血症的情况下，尽管医生可以使用的抗生素种类繁多，但死亡率依旧很高。
与来自对象的宿主组分相比，患者体液中的感染原水平通常非常低。通过离心去除活细胞或死细胞的典型生物样品如血浆、血清、脑脊液仍含有大量的非细胞HNA。在特定的情况下，循环游离细胞(与其他细胞不相关)，如宿主细胞或妊娠情况下的胎儿细胞，可以释放HNA。
WO2010/062354和WO2014/114896中描述了减少宿主核酸的量的方法，并且该方法在于用去污剂处理含有细胞的生物流体以破坏细胞膜，然后用核酸酶(具有DNA酶和/或RNA酶活性的酶)处理所得样品。然而，这些方法只具有部分效力，因为其使被处理样品中对核酸酶具有抗性的HNA残留。
本申请人在本文中出人意料地证明，将生物流体的非细胞部分与去污剂和核酸酶一起孵育改善了对样品中感染原的检测。因此，本申请人提供了一种显著降低生物样品的非细胞部分中HNA浓度的新方法，这使得所述样品中感染原更好地被检测。
发明内容
本发明涉及用于从生物流体的非细胞部分分离感染原的核酸并对其进行扩增和测序的体外方法。
在一个实施方案中，该方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在一个实施方案中，该方法还包括感染原核酸的提取和测序。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括以下步骤：
a)使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，
b)提取感染原的核酸，
c)任选地，逆转录感染原的基因组RNA，
d)扩增感染原的基因组DNA和/或感染原的cDNA，以及
e)对扩增的感染原基因组DNA和/或感染原cDNA进行测序。
在一个实施方案中，感染原核酸的测序通过下一代测序(NGS)来进行。
在一个实施方案中，感染原选自病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫。
在一个实施方案中，至少一种去污剂选自非离子型去污剂、两性离子去污剂和阴离子去污剂。
在一个实施方案中，至少一种去污剂为非离子型去污剂。
在一个实施方案中，至少一种去污剂选自皂苷、Triton、NP-40、吐温及其衍生的去污剂。
在一个实施方案中，至少一种去污剂为皂苷。
在一个实施方案中，至少一种去污剂是具有约5％至约50％的皂苷元含量的皂苷。
在一个实施方案中，至少一种核酸消化酶是具有DNA酶和/或RNA酶活性的核酸酶。
在一个实施方案中，至少一种核酸消化酶选自baseline-zero DNA酶、全能核酸酶(benzonase)、DNA酶I、DNA酶II、内切核酸酶III、内切核酸酶IV、内切核酸酶V、内切核酸酶VIII、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶V，外切核酸酶VII、外切核酸酶VIII、外切核酸酶T、λ外切核酸酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶BAL-31、核酸酶P1、核酸酶S1、T4内切核酸酶V、T5外切核酸酶、T7内切核酸酶I和T7外切核酸酶。
在一个实施方案中，所述部分内残留细胞的存在不影响所述部分中的所述感染原的可及性或富集。
本发明还涉及一种试剂盒套装。
在一个实施方案中，该试剂盒套装用于进行根据本发明的方法。
在一个实施方案中，该试剂盒套装包含：
a)至少一种去污剂，
b)至少一种核酸消化酶。
在一个实施方案中，该试剂盒套装包含：
a)至少一种去污剂，其选自皂苷、Triton、NP-40、吐温或其衍生物，
b)至少一种核酸消化酶，其选自baseline-zero DNA酶、全能核酸酶、DNA酶I、DNA酶II、内切核酸酶III、内切核酸酶IV、内切核酸酶V、内切核酸酶VIII、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶V，外切核酸酶VII、外切核酸酶VIII、外切核酸酶T、λ外切核酸酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶BAL-31、核酸酶P1、核酸酶S1、T4内切核酸酶V、T5外切核酸酶、T7内切核酸酶I和T7外切核酸酶。
在一个实施方案中，该试剂盒套装可以包含试剂。在一个实施方案中，该试剂盒套装可以包含用于根据本发明的方法的说明书。
因此，在一个实施方案中，该试剂盒套装包含：
a)至少一种去污剂，其选自皂苷、Triton、NP-40、吐温或其衍生物，
b)至少一种核酸消化酶，其选自baseline-zero DNA酶、全能核酸酶、DNA酶I、DNA酶II、内切核酸酶III、内切核酸酶IV、内切核酸酶V、内切核酸酶VIII、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶V，外切核酸酶VII、外切核酸酶VIII、外切核酸酶T、λ外切核酸酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶BAL-31、核酸酶P1、核酸酶S1、T4内切核酸酶V、T5外切核酸酶、T7内切核酸酶I和T7外切核酸酶，
c)任选地，试剂，以及
d)任选地，用于根据本发明的方法中的说明书。
在一个实施方案中，该试剂选自核酸提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、核酸清洗试剂、核酸大小选择试剂、核酸定量试剂、核酸文库制备试剂、核酸文库测序试剂和内部对照物。
在一个实施方案中，该试剂包括核酸提取试剂、逆转录酶、vent exo-DNA聚合酶、dNTP、具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：13中任一个所示的序列的寡核苷酸引物、具有如SEQ ID NO：2所示的序列的寡核苷酸引物、外切核酸酶I和/或SPRI珠。
定义
在本发明中，以下术语具有下列含义：
-“非细胞部分”是指去除了其约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％，优选99％，更优选100％的细胞内容物的生物流体。生物流体的非细胞部分可以通过本领域任何公知的技术获得。例如，在生物流体为血液的一个实施方案中，所述非细胞部分可以经约100g至约500g离心约5分钟至约20分钟，优选经300g离心约10分钟的离心步骤获得。
-“宿主核酸”或“HNA”是指由对象产生的核酸。
-“调节”是指HNA可及性的改善或提高。
-“引物”是指能够与核酸杂交或退火并在适当条件下用作核苷酸聚合起始位点的寡核苷酸，该适当条件例如为在核苷三磷酸和用于聚合的酶如DNA聚合酶或RNA聚合酶或逆转录酶的存在下，并在适当的缓冲液中以及在合适的温度下。
-“扩增”是指产生期望的模板序列的多个拷贝，即至少2个拷贝的过程。扩增核酸的技术是本领域技术人员熟知的，并且包括特异性扩增方法以及随机扩增方法。
-“逆转录”是指使用RNA导向的DNA聚合酶(逆转录酶，RT)复制RNA以产生互补的DNA链(cDNA)。可以使用逆转录酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)即脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)和(脱氧)胸苷三磷酸(dTTP)的混合物，通过本领域技术人员熟知的技术进行RNA的逆转录。
-“对象”是指任何物种，例如家养动物(即，农场鱼、宠物、反刍动物、猪、马)、野生动物和人。在一个实施方案中，对象可以是“患者”，即等待接受或正在接受医疗护理或者过去/现在/将会是医疗程序的对象或者被监测疾病进展的哺乳动物或更优选人。
-“内部对照物”是指在测定中用作参照点和/或对比点以对所分析的一种或多于一种因子的存在、不存在或水平作出判断的一种或多于一种材料。一些内部对照物可以包括阴性或阳性对照样品。阴性对照物是已知为缺少一种或多于一种被分析因子的样品。阳性对照物是已知为包含一种或多于一种被分析因子的样品。在一个实施方案中，内部对照物可以是在给定时间点以已知浓度被添加到样品中的内部对照核酸序列。在一个实施方案中，内部对照物可以是在给定时间点以已知浓度被添加到样品中的病毒，如噬菌体。
-数字前面的“约”是指加上或减去所述数字数值的10％。
详细描述
本发明的一个目的是一种用于富集生物流体的非细胞部分中的感染原的体外方法，该方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
本发明的另一个目的是一种用于调节生物流体的非细胞部分中宿主核酸(HNA)对核酸消化酶的可及性的方法，该方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
本发明的另一个目的是一种用于增加生物流体的非细胞部分中感染原的核酸与总核酸的比例的体外方法，该方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
本发明的另一个目的是一种用于从生物流体的非细胞部分分离病毒核酸并对其进行扩增和测序的体外方法，该方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
本发明的另一个目的是一种用于从生物流体的非细胞部分分离细菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法，该方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在本发明的一个实施方案中，感染原的结构或整体性不受本发明方法的影响。
在一个实施方案中，用于富集生物流体的非细胞部分中的感染原的体外方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在一个实施方案中，用于富集生物流体的非细胞部分中的感染原的体外方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，提取感染原的核酸并对所述提取的感染原的核酸进行测序。
在一个实施方案中，用于调节生物流体的非细胞部分中宿主核酸(HNA)对核酸消化酶的可及性的方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在一个实施方案中，用于调节生物流体的非细胞部分中宿主核酸(HNA)对核酸消化酶的可及性的方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，提取感染原的核酸并对所述提取的感染原核酸进行测序。
在一个实施方案中，用于增加生物流体的非细胞部分中感染原的核酸与总核酸的比例的体外方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在一个实施方案中，用于增加生物流体的非细胞部分中感染原的核酸与总核酸的比例的体外方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，提取感染原的核酸并对所述提取的感染原核酸进行测序。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离感染原的核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离感染原的核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，提取感染原的核酸并对所述提取的感染原的核酸进行测序。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离感染原的核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括：
a)使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，
b)提取感染原的核酸，
c)任选地，逆转录感染原的基因组RNA，
d)扩增感染原的基因组DNA和/或感染原的cDNA，
e)对扩增的感染原的基因组DNA和/或感染原的cDNA进行测序。
在一个实施方案中，通过采用高通量测序(HTS)或下一代测序(NGS)的随机测序对扩增的感染原的基因组DNA和/或感染原的cDNA进行测序。因此，在一个实施方案中，该方法还包括感染原的基因组DNA和/或感染原cDNA文库构建的步骤，包括但不限于DNA清洗、DNA大小选择和/或DNA文库制备。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离病毒核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，提取病毒核酸并对所述提取的病毒核酸进行测序。
在一个实施方案中，该方法还包括病毒RNA逆转录的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括病毒DNA和/或病毒cDNA扩增的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸清洗的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸大小选择的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸定量的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸文库制备的步骤。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离病毒核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括：
a)使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，
b)提取病毒核酸，
c)任选地，逆转录病毒基因组RNA，
d)扩增病毒基因组DNA和/或病毒cDNA，
e)对扩增的病毒基因组DNA和/或病毒cDNA进行测序
在一个实施方案中，通过采用高通量测序(HTS)或下一代测序(NGS)的随机测序对扩增的病毒基因组DNA和/或cDNA进行测序。因此，在一个实施方案中，该方法还包括病毒基因组DNA和/或cDNA文库构建的步骤，包括但不限于DNA清洗、DNA大小选择和/或DNA文库制备。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离细菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离细菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括选择性裂解生物流体的细胞部分中的非细菌细胞以回收所述生物流体的非细胞部分，使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在一个实施方案中，该方法还包括细菌DNA扩增的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸清洗的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸大小选择的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸定量的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸文库制备的步骤。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离细菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括从所述生物流体的非细胞部分沉淀(pelleting)细菌，使所述沉淀与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，提取细菌核酸并对所述提取的细菌核酸进行测序。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离细菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括选择性裂解生物流体的细胞部分中的非细菌细胞以回收所述生物流体的非细胞部分，使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，提取细菌核酸并对所述提取的细菌核酸进行测序。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离细菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括：
a)从生物流体的非细胞部分沉淀细菌，
b)使来自生物流体的非细胞部分的沉淀与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，
c)提取细菌基因组DNA，
d)扩增细菌基因组DNA，
e)对扩增的细菌基因组DNA进行测序。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离细菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括：
a)选择性裂解生物流体的细胞部分中的非细菌细胞以回收所述生物流体的非细胞部分，
b)使生物流体的所述非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，
c)提取细菌基因组DNA，
d)扩增细菌基因组DNA，
e)对扩增的细菌基因组DNA进行测序。
在一个实施方案中，通过采用高通量测序(HTS)或下一代测序(NGS)的随机测序对扩增的细菌基因组DNA进行测序。因此，在一个实施方案中，该方法还包括细菌基因组DNA文库构建的步骤，包括但不限于DNA清洗、DNA大小选择和/或DNA文库制备。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离真菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离真菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括选择性裂解生物流体的细胞部分中的非真菌细胞以回收所述生物流体的非细胞部分，使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
在一个实施方案中，该方法还包括真菌DNA扩增的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸清洗的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸大小选择的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸定量的步骤。在一个实施方案中，该方法还包括核酸文库制备的步骤。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离真菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括从所述生物流体的非细胞部分沉淀真菌，使所述沉淀与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，提取真菌核酸并对所述提取的真菌核酸进行测序。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离真菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括选择性裂解生物流体的细胞部分中的非真菌细胞以回收所述生物流体的非细胞部分，使生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，提取真菌核酸并对所述提取的真菌核酸进行测序。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离真菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括：
a)从生物流体的非细胞部分沉淀真菌，
b)使来自生物流体的非细胞部分的沉淀与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，
c)提取真菌基因组DNA，
d)扩增真菌基因组DNA，
e)对扩增的真菌基因组DNA进行测序。
在一个实施方案中，用于从生物流体的非细胞部分分离真菌核酸并对其进行扩增和测序的体外方法包括：
a)选择性裂解生物流体的细胞部分中的非真菌细胞以回收所述生物流体的非细胞部分，
b)使生物流体的所述非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，
c)提取真菌基因组DNA，
d)扩增真菌基因组DNA，
e)对扩增的真菌基因组DNA进行测序。
在一个实施方案中，通过采用高通量测序(HTS)或下一代测序(NGS)的随机测序对扩增的真菌基因组DNA进行测序。因此，在一个实施方案中，该方法还包括真菌基因组DNA文库构建的步骤，包括但不限于DNA清洗、DNA大小选择和/或DNA文库制备。
在本发明的含义内，生物流体的非细胞部分是指包含小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％原始存在于生物流体中的细胞物质的生物流体部分。
在一个实施方案中，所述非细胞部分可以从已经经历了从生物流体中弃去细胞的步骤的生物流体中获得。
在一个实施方案中，所述非细胞部分可以从已经经历了从生物流体中裂解细胞的步骤的生物流体中获得。
在另一个实施方案中，所述非细胞部分包含不影响感染原的富集或可及性的残留细胞。
根据本发明，生物流体的实例包括但不限于血液、羊水、房水、胆汁、膀胱灌洗液、乳房渗出物、细支气管肺泡灌洗液、乳糜、食糜、胞质溶胶、粪便(半流体或流体形式)、间质液、淋巴、月经、黏液、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、痰、汗液、滑液、眼泪、尿和玻璃体液。
在一个实施方案中，生物流体为血液。在另一个实施方案中，血液的非细胞部分为血浆。
如本文所用的术语“感染原”是指通常为单细胞的微生物，其可以繁殖并且包括：细菌、真菌(酵母或霉菌)、病毒和原生动物。术语“感染原”也指多细胞微生物，其可以繁殖并且包括：蠕虫(worm)和寄生虫。
细菌的非限制性实例包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、分枝杆菌(mycobacteria)或柔膜细菌(mollicute)。
本发明的革兰氏阴性细菌属的非限制性实例包括以下属的细菌：醋杆菌属(Acetobacter)、摩根氏菌属(Morganella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、无色杆菌属(Achromobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普氏菌属(Prevotella)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、伯克氏菌属(Burkholderia)、柠檬杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属(Aeromonas)、莫拉氏菌属(Moraxella)、布鲁氏菌属(Brucella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、普罗威登斯菌属(Providencia)和军团菌属(Legionella)。
本发明的革兰氏阳性细菌属的非限制性实例包括以下属的细菌：肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、加德纳菌属(Gardnerella)、考克菌属(Kocuria)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)，微球菌属(Micrococcus)和棒状杆菌属(Corynebacteria)。
分枝杆菌的非限制性实例包括但不限于分枝杆菌属(Mycobacterium)。
柔膜细菌的非限制性实例包括但不限于支原体(Mycoplasma)和尿素原体(Ureaplasma)。
可以在LPSN网站(具有固定术语的原核生物名称清单：http：//www.bacterio.net/index.html)上找到包含在感染原列表中的细菌清单。
病毒的非限制性实例包括但不限于以下科的成员：疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如，水痘带状疱疹病毒、爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein-Barr virus)、单纯疱疹病毒)，腺病毒科(Adenoviridae)，痘病毒科(Poxviridae)，星状病毒科(Astroviridae)，布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，冠状病毒科(Coronaviridae)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)，呼肠弧病毒科(Reoviridae)(例如，轮状病毒)，细小病毒科(Parvoviridae)(例如，细小病毒B19)，小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(鼻病毒、柯萨奇病毒、肠病毒、甲型肝炎病毒)，玻那病毒科(Bornaviridae)，丝状病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒)，嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(例如，乙型肝炎病毒)，肝炎病毒科(Hepeviridae)(戊型肝炎病毒)，逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，HIV、人类T淋巴细胞病毒)，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒)，披膜病毒科(Togaviridae)(例如，风疹病毒)，副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，呼吸道合胞体病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒)，弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，狂犬病病毒、牛流行热病毒、感染性造血坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、印第安纳型水泡性口炎病毒)，黄病毒属(Flavivirus)(例如，西尼罗病毒、登革热病毒)，乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、噬菌体(例如，肌尾噬菌体科(Myoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae))，痘病毒科(Poxviridae)(例如，天花病毒、牛痘病毒)。
可以在国际病毒分类委员会(ICTV，http：//www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp)上找到可以被视为本申请含义内的感染原的病毒的列表。
酵母或霉菌的非限制性实例包括但不限于假丝酵母属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、青霉菌属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、红酵母属(Rhodotorula)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、酵母属(Saccharomyces)、毛孢子菌属(Trichosporon)、肺囊虫属(Pneumocystis)。
原生动物的非限制性实例包括但不限于锥虫属物种(Trypanosoma sp)、巴倍虫属物种(Babesia sp)、利什曼原虫属物种(Leishmania sp)、疟原虫属物种(Plasmodium sp)、吴策线虫属物种(Wucheria sp)、弓形虫属物种(Toxoplasma sp)、隐孢子虫属物种(Cryptosporidium sp)。
原生动物的非限制性实例包括但不限于鞭毛虫(例如，贾第鞭毛虫属(Giardia)、Trochomonas、唇鞭毛虫属(Chilomastix)、肠滴虫属(Enteromonas)、曲滴虫属(Retortamoinas)、双核内变形虫属(Dientamoeba)、利什曼原虫属(Leishmania)、锥虫属(Trypanosoma))，变形虫(例如，内阿米巴属(Entamoeba)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、Massisteria、纳氏虫属(Naegleria)、表壳虫属(Arcella)、变形虫属(Amoeba)、Chaos、多核变形虫属(Peloxyma)、Syringammina)，孢子虫(例如，疟原虫属(Plasmodium)、巴倍虫属(Babesia)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、环孢子虫属(Cyclospora)、等孢球虫属(Isospora)、弓形虫属(Toxoplasma))和纤毛虫(例如，肠袋虫属(Balantidium)、栉毛虫属(Didinium)、肾形虫属(Colpoda)、喇叭纤虫属(Stentor)、板壳虫属(Coleps)、草履虫属(Paramecium)、钟虫属(Vorticella)、四膜虫属(Tetrahymena)、Cariocothrix))。
在一个实施方案中，肠虫(helminth)被排除在本发明的方法之外。
在一个实施方案中，朊病毒因子被排除在本发明的方法之外。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种去污剂包含：非离子去污剂和/或两性离子去污剂和/或阴离子去污剂。
所述去污剂在不破坏感染原的结构或整体性的情况下发挥作用，以保留感染原的核酸。术语“感染原的结构”是指完整的病毒颗粒、细菌胞外部分或细菌胞内部分等。
在一个实施方案中，去污剂可以是非离子去污剂，包括但不限于皂苷、毛地黄皂苷、Triton X-100、Triton X-100-R、Triton X-114、NP-40、吐温-20、吐温-40、吐温-80、Brij 98、Brij 58、Brij 35、Genapol C-100、Genapol X-100、Igepal、Brij 96/97、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷和单十二烷基九乙二醇醚(C12E9)或其衍生物。在优选实施方案中，非离子型去污剂为皂苷、Triton、NP-40、吐温或其衍生物。
如本文所用的术语“皂苷”是在天然来源中，特别是在各种植物中和海洋物种中发现的化合物，通常是次级代谢物。具体而言，皂苷是两亲糖苷，通过在水溶液中振荡产生的皂样泡沫在现象学上进行分类，并且通过其一个或多于一个亲水性糖苷部分与亲脂性三萜衍生物组合的组成在结构上进行分类。皂苷的糖苷配基(不含糖苷部分)被称为皂苷元。与皂苷元/糖苷配基核心连接的糖链的数目可以变化，每条链的长度也可以变化。典型的链长为1至11，其中数目2至5是最常见的，并且呈现线性和支化糖链。
单糖如D-葡萄糖和D-半乳糖是连接链中最常见的组分。亲脂性糖苷配基可以是多种多环有机结构中的任何一种，这些多环有机结构来源于连续增加十碳(C10)萜烯单元以构成C30三萜骨架，通常伴随后续的改变以产生C27甾体骨架。
皂苷的衍生物可以包括但不限于三萜皂苷，来自肥皂草属(Saponaria)(皂树(Quillaja saponaria))的皂苷，来自石竹科(Caryophyllaceae)的皂苷，来自无患子科(Sapindaceae)的皂苷，来自槭树科(Aceraceae)(槭树)和七叶树科(Hippocastanaceae)的皂苷，来自绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)(葫芦科绞股蓝属)的绞股蓝皂苷，人参皂苷(在高丽参或红参(五加科人参属)中)，甾体皂苷也称为saraponin，如薯蓣皂苷元、剑麻皂苷元、sarsapogenin、胆甾烷醇、呋喃甾醇和螺旋甾烷醇皂苷。已知的呋喃甾醇甾体皂苷是包含在新鲜大蒜中的皂苷，如proto-isoeruboside-B和isoeruboside-B，而陈年大蒜提取物也含有螺旋甾烷醇甾体皂苷。螺旋甾烷醇甾体皂苷的其他实例是来自假叶树(Ruscusaculeatus)地下部分的皂苷、来自箭根薯(Tacca chantrieri)根状茎的皂苷、来自Solanumhispidum的皂苷、来自Dioscorea polygonoides块茎的皂苷、来自收获的刺蒺藜(Tribulusterrestris)的皂苷、来自白花百合(Lilium candidum)的皂苷。
甾体皂苷还是包含在肥皂草(Saponaria officinalis)根中的皂苷，其在商业化生产的肥皂出现之前被用作肥皂；丝兰(Yucca schidigera)的皂苷，其被美洲土著用来制作肥皂，丝兰生长在干旱的墨西哥沙漠地区下加利福尼亚；包含在肥皂百合Chlorogalumpomeridianum中的皂苷，其被美洲土著用作肥皂；来自无患子树(soapberry tree)的皂苷。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种去污剂是来自肥皂草属(皂树，也被称为Quillaja树皮(Quillaja bark)、皂皮树(soap bark tree)或北美榆树(soapbark))的皂苷。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种去污剂是皂苷元含量为约5％至约50％，优选约10％至约40％，更优选约20％至约35％的皂苷。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种去污剂是皂苷元含量为约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％的皂苷。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种去污剂是皂苷元含量为约20％至35％的来自肥皂草属(皂树)的皂苷。
在另一个实施方案中，去污剂可以是两性离子去污剂，其包括但不限于3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)、酰胺磺基甜菜碱-14(amidosulfobetaine-14，ASB-14)、酰胺磺基甜菜碱-16(ASB-16)、磺基甜菜碱3-10(SB3-10)、磺基甜菜碱3-12(SB3-12)和磺基甜菜碱3-14(SB3-14)。
在另一个实施方案中，去污剂可以是阴离子去污剂，其包括但不限于十二烷基硫酸钠、N-(C10-C16烷基)-N，N-二甲基甘氨酸甜菜碱(EMPIGEN BB)、月桂基硫酸锂(LLS)、脱氧胆酸钠、月桂基硫酸钠、胆固醇琥珀酸单酯、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种去污剂的终浓度为约0.01％w/v至约10％w/v、约0.1％w/v至约5％w/v、约0.1％w/v至约1.5％w/v、约0.1％w/v至约1％w/v、约0.1％w/v至约0.5％w/v。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种去污剂的终浓度为约0.1％w/v至约4％w/v、约1％w/v至约4％w/v。
在一个实施方案中，去污剂优选为非离子型洗涤剂，优选皂苷或其衍生物。在另一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种去污剂不影响感染原的结构。
在另一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种核酸消化酶是指表现出DNA酶和/或RNA酶活性的酶。
核酸消化酶包括但不限于核酸酶，例如脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、外切核酸酶、外切脱氧核糖核酸酶、外切核糖核酸酶、内切核酸酶、内切脱氧核糖核酸酶、内切核糖核酸酶。
核酸酶的实例包括但不限于baseline-zero DNA酶、全能核酸酶、DNA酶I、DNA酶II、内切核酸酶III、内切核酸酶IV、内切核酸酶V、内切核酸酶VIII、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶V，外切核酸酶VII、外切核酸酶VIII、外切核酸酶T、λ外切核酸酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶BAL-31、核酸酶P1、核酸酶S1、T4内切核酸酶V、T5外切核酸酶、T7内切核酸酶I、T7外切核酸酶。
在一个实施方案中，本发明方法中使用的至少一种核酸消化酶选自但不限于baseline-zero DNA酶和全能核酸酶。在一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸消化酶包含baseline-zero DNA酶和全能核酸酶或由baseline-zero DNA酶和全能核酸酶组成。
在一个实施方案中，至少一种核酸消化酶的浓度为约0.1单位/μg至约10单位/μg，优选约0.5单位/μg至约5单位/μg，更优选约1单位/μg的蛋白质。
在一个实施方案中，生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触约5分钟至约5小时，优选约30分钟至约2小时，更优选约1小时的时段。
在另一个实施方案中，生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时的时段。
在另一个实施方案中，孵育温度为约30℃至约40℃，优选37℃。在另一个实施方案中，孵育温度为约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃。
在另一个实施方案中，生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂接触少于30分钟、少于20分钟、少于10分钟，然后与至少一种核酸消化酶接触约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时的时段。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括抑制核酸消化酶活性的步骤。
抑制核酸消化酶是本领域技术人员熟知的并且可以使用螯合剂来进行或通过在约60℃至约80℃，更优选约65℃至约80℃的温度下加热样品来进行。在一个实施方案中，核酸消化酶的抑制可以通过在约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃、约80℃下加热样品来进行。
核酸消化酶的抑制剂在本领域中是熟知的，包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)和胍。
在一个实施方案中，抑制步骤进行至少约5分钟至约20分钟。在一个实施方案中，抑制步骤进行至少约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟。
在一个实施方案中，核酸消化酶的抑制剂如EDTA的浓度为约1mM至约10mM。在一个实施方案中，核酸消化酶的抑制剂如EDTA的浓度为约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM。
在一个实施方案中，本发明的方法还可以包括浓缩感染原的富集步骤，例如离心、超离心、盐析或过滤步骤。本领域技术人员会意识到哪种技术对于这种富集是最有效的。
在一个实施方案中，本发明的方法不包括使用沉淀剂如聚乙二醇(PEG)、糖原或核酸来沉淀感染原的步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法还可以包括制备感染原匀浆的步骤。制备匀浆的技术在现有技术中是为人熟知的，包括但不限于机械均化(例如匀浆器、超声处理)、化学均化(例如蛋白酶消化)。
在一个实施方案中，感染原在室温(15-25℃)、高度变性条件下裂解。在一个实施方案中，感染原在蛋白酶K的存在下裂解。在一个实施方案中，感染原在盐酸胍(guanidinium chloride)的存在下裂解。
对于许多革兰氏阴性细菌，用化学品和蛋白酶K处理足以完全裂解，但革兰氏阳性细菌和一些革兰氏阴性细菌的细胞壁必须通过其他方法来破坏。为了在处理难以裂解的细菌时获得最大的裂解效率，可以另外或替代地进行机械和/或酶促均化。
在一个实施方案中，本发明的方法还可以包括用于感染原的核酸提取和所述感染原的检测的步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法检测低于约10000个基因组拷贝/mL，优选低于约1000个基因组拷贝/mL，最优选低于约100个基因组拷贝/mL的感染原的量。
核酸的提取/纯化通过本领域技术人员熟知的技术进行。这些技术包括但不限于苯酚-氯仿萃取，碱抽提，硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取，结合在阴离子交换树脂、二氧化硅基质、玻璃颗粒、硅藻土、由不同合成聚合物制成的磁性颗粒、生物聚合物、多孔玻璃上或基于无机磁性来进行。
核酸的提取/纯化可以使用市售的试剂盒进行，例如QIAamp cador PathogenMini Kit(QIAGEN)、QIAamp DNA Microbiome Kit(QIAGEN)、DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN)、QIAamp DSP DNA Mini Kit(QIAGEN)、QIAampDNA Blood Mini Kit(QIAGEN)、QIAamp MinElute Virus Spin Kit Print(QIAGEN)、PureLink Microbiome DNA Purification Kit(ThermoFisher Scientific)、PureLinkViral RNA/DNA Mini Kit(ThermoFisher Scientific)、MagMAX Pathogen RNA/DNA Kit(ThermoFisher Scientific)、GeneJET Viral DNA/RNA Purification Kit(ThermoFisherScientific)、GenElute Bacterial Genomic DNA Kit(Sigma Aldrich)、QuickExtractBacterial DNA Extraction Kit(Illumina)、ZR Fungal/Bacterial DNA MicroPrep Kit(Zymo Research)、ZR Viral DNA Kit(Zymo Research)。
在一个实施方案中，本发明的方法还可以包括逆转录所提取的RNA的步骤。
在一些实施方案中，感染原可以包括RNA病毒。这些病毒以RNA为遗传物质。该核酸通常是单链RNA(ssRNA)，但也可能是双链RNA(dsRNA)。由RNA病毒引起的显著人类疾病包括埃博拉出血热、SARS、普通感冒、流感、丙型肝炎、西尼罗热、小儿麻痹症和麻疹。
在一个实施方案中，为了获得衍生自提取的病毒RNA的接近全长的基因组序列，首先需要逆转录所提取的RNA以产生cDNA拷贝。
使用逆转录酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)即脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)和(脱氧)胸苷三磷酸(dTTP)的混合物，通过本领域技术人员熟知的技术进行RNA的逆转录。
在一个实施方案中，基因组RNA的逆转录包括第一链cDNA合成的第一步骤。第一链cDNA合成的方法是本领域技术人员熟知的。
第一链cDNA合成反应可以使用序列特异性引物、寡聚(dT)或随机引物的组合。在一个实施方案中，第一链cDNA合成反应使用序列特异性引物。在一个实施方案中，第一链cDNA合成反应使用随机引物。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物包含固定的5′端序列和简并的3′端序列。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物包含固定的3′端序列和简并的5′端序列。
在一个实施方案中，固定序列包含20至40个核苷酸。在一个实施方案中，固定序列包含20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸或由20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40个核苷酸组成。
在一个实施方案中，简并序列包含5至10个核苷酸。在一个实施方案中，简并序列包含5、6、7、8、9、10个核苷酸或由5、6、7、8、9、10个核苷酸组成。
如本文所用的术语“简并序列”是指具有核苷酸混合物即A、T、C和/或G的混合物的序列。在一个实施方案中，简并序列具有G和T的混合物(本文称为K)。在一个实施方案中，简并序列具有C和T的混合物(本文称为Y)。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-K8：
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGKKKKKKKK(SEQ ID NO：1)，
其中K＝T或G。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-K9：
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGKKKKKKKKK(SEQ ID NO：3)，
其中K＝T或G。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-K10：
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGKKKKKKKKKK(SEQ ID NO：4)，
其中K＝T或G。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-K7：
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGKKKKKKK(SEQ ID NO：5)，
其中K＝T或G。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-K6：
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGKKKKKK(SEQ ID NO：6)，
其中K＝T或G。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-K5：
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGKKKKK(SEQ ID NO：7)，
其中K＝T或G。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-Y8：
CTCACTCATCCTTCACCTACTCTCCACYYYYYYYY(SEQ ID NO：8)，
其中Y＝T或C。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-Y9：
CTCACTCATCCTTCACCTACTCTCCACYYYYYYYYYY(SEQ ID NO：9)，
其中Y＝T或C。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-Y10：
CTCACTCATCCTTCACCTACTCTCCACYYYYYYYYYY(SEQ ID NO：10)，
其中Y＝T或C。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-Y7：
CTCACTCATCCTTCACCTACTCTCCACYYYYYYY(SEQ ID NO：11)，
其中Y＝T或C。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-Y6：
CTCACTCATCCTTCACCTACTCTCCACYYYYYY(SEQ ID NO：12)，
其中Y＝T或C。
在一个实施方案中，用于第一链cDNA合成的随机引物为引物-Y5：
CTCACTCATCCTTCACCTACTCTCCACYYYYY(SEQ ID NO：13)，
其中Y＝T或C。
在一个实施方案中，基因组RNA的逆转录包括第二链cDNA合成的第二步骤。第二链cDNA合成的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于发夹引发的合成、Okayama-Berg法、Gubler-Hoffman法。
在一个实施方案中，基因组RNA的逆转录包括扩增第一链cDNA的步骤。在一个实施方案中，基因组RNA的逆转录包括扩增第二链cDNA的步骤。
基因组RNA的逆转录可以使用市售的试剂盒进行，例如SuperScript III First-Strand Synthesis System(ThermoFisher Scientific)、SuperScript IV First-StrandSynthesis System(ThermoFisher Scientific)、Transcriptor First Strand cDNASynthesis Kit(Roche)、First-Strand cDNA Synthesis Kit(GE Healthcare)、ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit(New England Biolabs)。
感染原的检测可以通过用于扩增感染原核酸并对其进行测序的技术和用于确定感染原细胞活性、生理活性、表型活性的技术来进行。优选地，使用的检测方法是用于扩增核酸并对其进行测序的方法。
核酸扩增和测序技术是本领域技术人员熟知的。核酸扩增技术可以包括特异性扩增方法以及随机扩增方法。特异性扩增技术包括但不限于需要温度循环的方法(如PCR、连接酶链反应、基于转录的扩增)和/或等温扩增系统(如自持续序列复制、复制酶系统、解旋酶系统、链置换扩增、基于滚环的扩增和NASBA)。在一个实施方案中，感染原核酸的扩增可以通过聚合酶链反应和/或其任何变化方式进行，该变化方式包括但不限于等位基因特异性PCR、不对称PCR、热启动PCR、序列间特异性PCR、甲基化特异性PCR、微引物PCR(miniprimer PCR)、多重连接依赖性探针扩增、多重PCR、巢式PCR、定量PCR、逆转录PCR和/或降落PCR。扩增可以使用引物和/或引物集合来进行，该引物和/或引物集合可以选自能够与至少一种感染原的核酸特异性结合的那些。
随机扩增技术包括但不限于多重置换扩增(MDA)、随机PCR、多态DNA的随机扩增(RAPD)或基于多重退火和成环的循环扩增(MALBAC)。
适用于扩增核酸的DNA聚合酶包括但不限于Taq聚合酶Stoffel片段、Taq聚合酶、Advantage DNA聚合酶、AmpliTaq、AmpliTaq Gold、Titanium Taq聚合酶、KlenTaq DNA聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Accuprime Taq聚合酶、Pfu聚合酶、Pfu聚合酶turbo、Vent聚合酶、Vent exo-聚合酶、Pwo聚合酶、9 Nm DNA聚合酶、Therminator、Pfx DNA聚合酶、ExpandDNA聚合酶、rTth DNA聚合酶、DyNAzyme-EXT聚合酶、Klenow片段、DNA聚合酶I、T7聚合酶、测序酶、Tfi聚合酶、T4 DNA聚合酶、Bst聚合酶、Bca聚合酶、phi-29 DNA聚合酶和DNA聚合酶β或其修饰形式。
在一个实施方案中，感染原核酸的扩增包括成环的第一步骤。使用如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：13所示的引物能够使扩增子成环，从而阻止扩增子在随后的循环中进一步扩增，从而线性扩增核酸。这些引物的简并序列随机与基因组DNA分子和/或cDNA分子退火。在一次延伸后，得到半扩增子，即仅在5′端含有固定序列的扩增子。在第二轮延伸期间，半扩增子用作模板，并产生全扩增子，即3′端与5′端的序列互补的扩增子。
在一个实施方案中，成环步骤包括4至10个延伸循环。在一个实施方案中，成环步骤包括4、5、6、7、8、9、10个延伸循环或由4、5、6、7、8、9、10个延伸循环组成。在优选的实施方案中，成环步骤包括6个延伸循环或由6个延伸循环组成。
在一个实施方案中，成环步骤使用DNA聚合酶进行。在一个实施方案中，成环步骤使用Vent exo-DNA聚合酶进行。
在一个实施方案中，在每个延伸循环之前，样品在约80℃至约100℃的温度下孵育约5秒至5分钟的时段，优选在约94℃下孵育约10秒至约4分钟的时段。
在一个实施方案中，每个延伸循环包括数个逐渐加热步骤。在一个实施方案中，每个延伸循环包括约4℃至约100℃，优选约10℃至约65℃的数个逐渐加热步骤。在一个实施方案中，每个延伸循环包括保持约15秒至约180秒，优选约30秒至约120秒，更优选约45秒至约120秒的时段的逐步加热步骤。
在一个实施方案中，感染原核酸的扩增包括常规扩增的步骤。在一个实施方案中，感染原核酸的扩增包括通过PCR进行常规扩增的步骤。使用仅含有固定序列(SEQ ID NO：2)的引物能够仅进一步扩增完整的成环扩增子并以指数方式扩增核酸。
GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAG(SEQ ID NO：2)。
在一个实施方案中，常规扩增步骤包括15至30个延伸循环，优选18至25个延伸循环，更优选21个延伸循环。
在一个实施方案中，常规扩增步骤使用DNA聚合酶进行。在一个实施方案中，常规扩增步骤使用Vent exo-DNA聚合酶进行。
在一个实施方案中，可以通过与能够特异性结合于至少一种感染原的扩增核酸的探针和/或探针集合杂交来检测扩增的感染原的核酸。
在一个实施方案中，本发明的方法还可以包括清洗核酸的步骤。
在制备用于测序的核酸文库之前，可能需要除去单链引物和反应产物如酶。
核酸清洗技术是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，清洗核酸的步骤使用单链特异性核酸酶。单链特异性核酸酶包括但不限于外切核酸酶I、绿豆核酸酶、核酸酶Bh1、核酸酶P1、核酸酶S1、BAL 31核酸酶。在一个实施方案中，清洗核酸的步骤使用外切核酸酶I。在一个实施方案中，清洗核酸的步骤包括在约30℃至约45℃，优选约37℃的温度下进行孵育约10分钟至约30分钟的时段，优选约15分钟的时段的步骤。
在一个实施方案中，清洗核酸的步骤包括核酸的磷酸化末端的去磷酸化。在一个实施方案中，核酸的去磷酸化使用碱性磷酸酶，优选虾碱性磷酸酶。在一个实施方案中，可以通过在约60℃至约80℃，优选约65℃的温度下加热约10分钟至约30分钟，优选约15分钟的时段使虾碱性磷酸酶完全且不可逆地失活。
清洗核酸的步骤可以使用市售的试剂盒进行，例如illustra ExoProStar(GEHealthcare)、GenUP Exo SAP Kit(BiotechRabbit)。
在一个实施方案中，本发明的方法还可以包括核酸大小选择的步骤。
根据制造商的建议，短读序列分析仪如Illumina或Ion Torrent在供应含有相似大小片段的DNA文库时效果最佳。当文库的大小选择不当时，这些序列分析仪可能变得较为低效。
用于DNA大小选择的技术是本领域技术人员熟知的，包括但不限于核酸凝胶电泳、基于珠子的方案、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、自动化尺寸选择。
用于选择核酸大小的步骤可以使用市售的试剂盒进行，例如SPRIselect(BeckmanCoulter)、MagJET NGS Cleanup and Size Selection Kit(ThermoFisher Scientific)、Select-a-Size DNA Clean&Concentrator(Zymo Research)、NucleoMag NGS Clean-upand Size Select(Macherey-Nagel)。
在一个实施方案中，本发明的方法还可以包括对所扩增的核酸进行定量的步骤。
用于定量扩增的核酸的技术是本领域技术人员熟知的，包括但不限于UV吸收、嵌入染料、与实时定量PCR(qPCR)偶联的5′水解探针、液滴数字乳液PCR。
核酸大小选择的步骤可以使用市售的试剂盒进行，例如Quant-iT dsDNA HSAssay Kit(ThermoFisher Scientific)、Quant-iT dsDNA BR Assay Kit(ThermoFisherScientific)、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit(ThermoFisher Scientific)、SpectraMax Quant dsDNA Assay Kit(Molecular Devices)、DNA Quantitation Kit(Sigma Aldrich)、AccuClear Ultra High Sensitivity(Biotium)、AccuBlue(Biotium)、AccuGreen(Biotium)。
制备核酸测序文库的技术是本领域技术人员熟知的。
制备核酸测序文库的步骤可以使用市售的试剂盒进行，例如Nextera XT DNALibrary Prep Kit(Illumina)、NEBNext DNA Library Prep Master Mix(New EnglandBiolabs)、NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit(New England Biolabs)、TruSeq NanoDNA Library Prep Kit(Illumina)、JetSeq DNA Library Preparation Kit(Bioline)。
在一个实施方案中，核酸的检测可以通过采用高通量测序(HTS)或下一代测序(NGS)的随机测序进行。
用于核酸文库NGS的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于配对末端测序、合成测序、单读测序。
NGS平台是可获得的，包括但不限于Illumina MiSeq(Illumina)、Ion TorrentPGM(ThermoFisher Scientific)、PacBio RS(PacBio)、Illumina GAIIx(Illumina)、Illumina HiSeq 2000(Illumina)。
对核酸文库进行测序的步骤可以使用市售的试剂盒如MiSeq Reagent Kit v2(Illumina)进行。
在一个实施方案中，贯穿本发明的方法使用内部对照物以评估所述方法的可靠性。
在一个实施方案中，将内部对照物添加到生物流体的细胞部分中。在一个实施方案中，将内部对照物添加到生物流体的非细胞部分中。在一个实施方案中，内部对照物在至少一种去污剂之前、之后或与至少一种去污剂同时添加。在一个实施方案中，内部对照物在至少一种核酸消化酶之前、之后或与至少一种核酸消化酶同时添加。在一个实施方案中，内部对照物在抑制核酸消化酶活性的步骤之前、之后或期间添加。在一个实施方案中，内部对照物在浓缩感染原的富集步骤之前、之后或期间添加。在一个实施方案中，内部对照物在制备感染原匀浆的步骤之前、之后或期间添加。在一个实施方案中，内部对照物在DNA或RNA提取步骤之前、之后或期间添加。在一个实施方案中，内部对照物在感染原核酸的扩增和测序步骤之前、之后或期间添加。
在一个实施方案中，内部对照物为核酸序列。在一个实施方案中，内部对照物为DNA序列。在一个实施方案中，内部对照物为RNA序列。
适合作为本发明方法中的内部对照物的DNA序列包括但不限于噬菌体的基因组DNA和/或噬菌体的基因组DNA片段，噬菌体例如为来自短尾噬菌体科、肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科、脂毛噬菌体科、古噬菌体科、瓶状噬菌体科(Ampullaviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、Clavaviridae、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、微小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、Globuloviridae、滴状病毒科(Guttaviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、原质噬菌体科(Plasmaviridae)或复层噬菌体科(Tectiviridae)的噬菌体。
适合作为本发明方法中的内部对照物的DNA序列包括但不限于噬菌体的基因组DNA和/或噬菌体的基因组DNA片段，噬菌体例如为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、M11、λ、Ф、Ф29、P22、P37、μ、PBSX、P1Puna样、P2、I3、Bcep1、Bcep43、Bcep78、C2、L5、HK97、N15、嗜酸两面菌属(Acidianus)丝状病毒1、冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)杆状病毒1。
适合作为本发明方法中内部对照物的RNA序列包括但不限于噬菌体的基因组RNA和/或噬菌体的基因组RNA片段，噬菌体例如为来自囊状噬菌体科(Cystoviridae)或光滑病毒科(Leviviridae)的噬菌体。
适合作为本发明方法中内部对照物的RNA序列包括但不限于噬菌体的基因组RNA和/或噬菌体的基因组RNA片段，噬菌体例如为MS2、Qβ。
在一个实施例中，内部对照物为病毒原种(stock)。在一个实施方案中，内部对照物为噬菌体原种。在一个实施方案中，内部对照物为病毒纳米颗粒衣壳化核酸序列。
适合作为本发明方法中的内部对照物的噬菌体包括但不限于来自短尾噬菌体科、肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科、脂毛噬菌体科、古噬菌体科、瓶状噬菌体科、双尾病毒科、Clavaviridae、覆盖噬菌体科、微小纺锤形噬菌体科、Globuloviridae、滴状病毒科、丝状噬菌体科、微小噬菌体科、原质噬菌体科或复层噬菌体科的噬菌体。
适合作为本发明方法中内部对照物的噬菌体包括但不限于噬菌体T3、T1、T2、T4。
在一个实施方案中，内部对照物是噬菌体T3原液。在一个实施方案中，内部对照物是衍生自噬菌体T3原液的基因组DNA的提取物。
在一个实施方案中，内部对照物是噬菌体MS2原液。在一个实施方案中，内部对照物是衍生自噬菌体MS2原液的基因组RNA的提取物。
本发明的另一目的是一种包含至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶的试剂盒套装。
在一个实施方案中，所述试剂盒包含：
a)至少一种去污剂，
b)至少一种核酸消化酶，
c)任选地，试剂，以及
d)任选地，用于根据本发明的方法的说明书。
“试剂盒”是指包括至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶(例如，皂苷和核酸酶)或包括至少一种去污剂的容器和至少一种核酸消化酶的容器的任何制品(例如，包装或至少一个容器)。该试剂盒可以作为用于实施本发明方法的单元进行推广、分销或销售。此外，任何或全部试剂盒试剂可以提供于保护它们免受外部环境影响的容器内，例如在密封和无菌的容器中。该试剂盒还可以包括描述试剂盒及其使用方法的包装说明书。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含：
a)至少一种去污剂，其选自但不限于皂苷、毛地黄皂苷、Triton X-100、Triton X-100-R、Triton X-114、NP-40、吐温-20、吐温-40、吐温-80、Brij 98、Brij 58、Brij 35、Genapol C-100、Genapol X-100、Igepal、Brij 96/97、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷和单十二烷基九乙二醇醚(C12E9)或其衍生物；
b)至少一种核酸消化酶，其选自但不限于baseline-zero DNA酶、全能核酸酶、DNA酶I、DNA酶II、内切核酸酶III、内切核酸酶IV、内切核酸酶V、内切核酸酶VIII、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶V，外切核酸酶VII、外切核酸酶VIII、外切核酸酶T、λ外切核酸酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶BAL-31、核酸酶P1、核酸酶S1、T4内切核酸酶V、T5外切核酸酶、T7内切核酸酶I、T7外切核酸酶，
c)任选地，试剂，其选自但不限于核酸提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、核酸清洗试剂、核酸大小选择试剂、核酸定量试剂、核酸文库制备试剂、核酸文库测序试剂、内部对照物，以及
d)任选地，用于根据本发明的方法的说明书。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含：
a)至少一种去污剂，其选自但不限于皂苷、Triton、NP-40、吐温或其衍生物，
b)至少一种核酸消化酶，其选自但不限于baseline-zero DNA酶、全能核酸酶，
c)任选地，试剂，其选自但不限于核酸提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、核酸清洗试剂、核酸大小选择试剂、核酸定量试剂、核酸文库制备试剂、核酸文库测序试剂、内部对照物，以及
d)任选地，用于根据本发明的方法的说明书。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含：
a)皂苷，优选含有20-35％的皂苷元的皂苷，
b)baseline-zero DNA酶和/或全能核酸酶核酸酶，
c)任选地，试剂，其选自但不限于核酸提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、核酸清洗试剂、核酸大小选择试剂、核酸定量试剂、核酸文库制备试剂、核酸文库测序试剂、内部对照物，以及
d)任选地，用于根据本发明的方法的说明书。
在一个实施方案中，核酸提取试剂选自但不限于QIAamp Microbiome Kit、QIAampCador Pathogen Kit、线性聚丙烯酰胺。
在一个实施方案中，逆转录试剂选自但不限于Superscript III第一链合成系统、引物寡核苷酸、dNTP。在一个实施方案中，用于逆转录的引物寡核苷酸选自但不限于具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：13所示的核酸序列的引物。
在一个实施方案中，核酸扩增试剂选自但不限于Vent exo-DNA聚合酶、引物寡核苷酸、Thermopol缓冲液、dNTP。在一个实施方案中，用于核酸扩增的引物寡核苷酸选自但不限于具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：13所示的核酸序列的引物。
在一个实施方案中，核酸清洗试剂选自但不限于外切核酸酶I、外切核酸酶I缓冲液。
在一个实施方案中，核酸大小选择试剂选自但不限于SPRIselect试剂盒。
在一个实施方案中，核酸定量试剂选自但不限于Quant-iT dsDNA HS Assay Kit、Quant-iT dsDNA BR Assay Kit。
在一个实施方案中，核酸文库制备试剂选自但不限于Nextera XT DNA LibraryPrep Kit。
在一个实施方案中，核酸文库测序试剂选自但不限于MiSeq Reagent Kit v2。
在一个实施方案中，内部对照物选自但不限于噬菌体T3原液、衍生自噬菌体T3原液的基因组DNA提取物、噬菌体MS2原液、衍生自噬菌体MS2原液的基因组RNA提取物。在一个实施方案中，内部对照物选自但不限于噬菌体T3原液和/或衍生自噬菌体MS2原液的基因组RNA提取物。
实施例
以下实施例进一步说明本发明，但本发明并不限于此。下面参照用于说明的实例应用来描述若干方面。应该理解的是，列出了许多具体的细节、关系和方法，以提供对本文所述特征的完整理解。然而，相关领域的普通技术人员将易于认识到本文所描述的特征可以在没有一个或多于一个具体细节的情况下或者利用其他方法来实施。本文所描述的特征不受限于所示的行为或事件的顺序，因为一些行为可以以不同的顺序发生和/或与其他行为或事件同时发生。此外，并非所有示出的行为或事件都需要根据本文描述的特征来实施方法。
实施例1：降低来自血浆样品的非细胞部分中的HNA浓度
由血液经1600rpm(300g)离心10分钟，然后再经13000rpm(15000g)离心10分钟(以确保充分去除囊泡或聚集体)形成的上清液获得非细胞部分，该非细胞部分在不存在或存在0.01％至1％w/v皂苷的条件下用核酸酶处理(条件：37℃下1小时)(表1)。
通过高灵敏度Alu重复序列qPCR测定所得HNA浓度。在0.01％至1％的皂苷存在下孵育非细胞部分是有效的。在该实验中，最佳浓度0.3％至1％的皂苷加核酸酶分裂HNA的量是仅存在核酸酶(即抗核酸酶部分)的至少18倍。事实上，对于HNA较丰富的非细胞部分而言，还可以证实更高的HNA负荷减少(最多25ct，即超过106)，因为皂苷加核酸酶的处理通常将HNA浓度降低至由qPCR的混合物所表示的背景水平。
表1
*所有的计算都假设PCR效率为2.
总之，我们证明了皂苷增加非细胞部分如血浆样品中游离(非细胞相关的)HNA对核酸消化酶如核酸酶的可及性。
实施例2：生物样品中感染原的全基因下一代测序(NGS)(本例中HNA＝微生物核酸 (MNA))
从生物样品直接检测感染原(细菌、病毒、真菌、原生动物)的新工具正在出现：它们包括通过高通量测序(HTS)对生物样品进行随机测序。在生物样品中鉴定感染原的主要障碍在于MNA存在的量极小，同时伴随HNA的水平相对较高。在技术的最初发展中，提取来自样品的全部核酸并通过随机聚合酶链反应(PCR)、RCA(滚环扩增)、MDA(多重置换扩增)进行随机扩增。该方法的缺点在于同时扩增MNA和HNA。这限制了下游MNA检测的灵敏度：例如，微阵列检测的灵敏度损失，而HTS需要更深入的测序来达到足够的灵敏度水平。即使要使用单分子测序，增加MNA与HNA的比值对于增加给定读数的灵敏度也是至关重要的。为了克服这一缺陷，已经提出了通过核酸酶来水解宿主DNA。
我们在此示出了来自加入血浆中的感染原(病毒和细菌)的感染原读数的相对增加。该示值是感染原读数与HNA读数值的比例。在0.1％至1％的皂苷的存在下，核酸酶处理得到极大改善。这些浓度的皂苷保留了病毒和/或细菌结构内的MNA，同时提供了对核酸酶先前不可及的HNA的可及性。
通过NGS进行血浆样品中病毒检测的有效性：实验1
本实验中，向血液样品中加入三种病毒：两种DNA病毒(VZV和B19)和一种RNA病毒(轮状病毒)。然后按照生物医学实验室中的常规程序，经1600rpm(300g)离心10分钟以沉淀血细胞来获得血浆样品。将称为“非细胞部分”的上清液在13000rpm(15000g)下进一步离心，以确保完全使所得上清液中不含血细胞，该所得上清液称为“病毒部分”。用0.3％w/v皂苷加核酸酶处理该病毒部分，随机扩增并在质子测序仪(Life Technology)上测序。
结果显示了病毒靶标读数值的较大(4.1至6.4)提高。同时，人类读数的比例减少(×0.68)(表2)。这导致在皂苷存在的情况下病毒/人类读数的比率增加7.1倍，这意味着将需要更低的测序深度来获得针对病毒靶标的相同读数值。
表2
通过NGS进行血浆样品中病毒检测的有效性：实验2
在该实验中，向经生物医学实验室常规程序获得的来自供体(id：076)的血浆样品加入三种DNA病毒(VZV、猫疱疹病毒、犬细小病毒)和两种RNA病毒(轮状病毒、猫杯状病毒)。以13000rpm(15000g)进一步离心血浆并用1％w/v皂苷加核酸酶处理上清液(或“病毒组分”)，随机扩增并在质子测序仪(Life Technology)上测序。
结果显示了病毒靶标的读数值的较大(1.3至19.2)提高。同时，人类读数的比例减少(×0.50)(表3)。这导致在皂苷存在的情况下病毒/人类读数的比率增加13.6倍，这意味着将需要更低的测序深度来获得针对病毒靶标的相同读数值。
表3
血浆样品中细菌检测的有效性
在该实验中，血液样品中加入了革兰氏阴性细菌(鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、摩氏摩根菌(Morganella morganii))和革兰氏阳性细菌(粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae))。然后按照生物医学实验室中使用的常规程序，经1600rpm(300g)离心以沉淀血细胞，获得血浆样品。将上清液(或“非细胞部分”)以13000rpm(15000g)进一步离心10分钟以沉淀血浆中的细菌。该沉淀在本文中也被称为“细菌部分”，在有或没有1％w/v皂苷加核酸酶的情况下处理该沉淀，随机扩增并在质子测序仪(Life Technology)上测序。
结果显示了来自细菌靶标的读数值的较大(21.5至43.5)提高。同时，人类读数的比例显著减少(×0.80)(表4)。这导致在皂苷存在的情况下细菌/人类读数的比率增加112倍。基因组覆盖率(即被测序的细菌基因组部分)在没有皂苷的情况下为1.3-7.8％，在皂苷存在的情况下为32.2-82.3％。
表4
因此，步骤的特别顺序是：
1)用皂苷和核酸酶处理非细胞部分以消化HNA，
2)使核酸酶失活，
3)提取非细胞部分的核酸，
4)读取可能是PCR、随机扩增后的NGS或单分子的NGS、DNA阵列上的杂交的度数。
实施例3：病毒核酸的分离、扩增、文库构建和测序
基于上文所述的实验，制定了一套用于检测血浆样品中病毒的完整标准化方案。
提取
将1μL的噬菌体T3原种即时稀释于PBS中，至终浓度为105个噬菌体基因组拷贝/mL。同时，将1mL新鲜混合的血液样品转移至1.5mL微型管中，并在室温下以300g离心10分钟。
将297μL血浆(即，上清液相)转移至1.5mL微型管中，并补充3μL以105个基因组拷贝/mL稀释的T3噬菌体。将样品在室温下以12000g进一步离心10分钟，并将150μL上清液转移至新的1.5mL微型管中。弃去剩余的上清液。
通过将0.1g皂苷(含20-35％皂苷元的皂苷，来自Sigma-Aldrich，参考货号：S4521)溶解在1mL无DNA酶和RNA酶的超纯蒸馏水(ThermoFisher Scientific，参考货号：10977035)中来制备10％w/v的皂苷溶液。加入4μL的全能核酸酶核酸酶(VWR，参考货号：70664-3)、4μL的Baseline-ZERO DNA酶(Tebu-Bio，参考货号：DB0711K)、18μL的Baseline-ZERO DNA酶缓冲液和1.8μL的10％w/v皂苷(不预先混合这些酶)。在摇动和脉冲旋转后，将样品放置在37℃下孵育1小时。
然后将样品脉冲旋转，并加入pH 8.0的20μL 30mM EDTA(Sigma Aldrich，参考货号：03690)。之后将管在加热器或水浴中于65℃放置10分钟以使核酸酶失活。
按照制造商的说明书，使用QIAamp Cador Pathogen Mini Kit(QIAGEN，参考货号：54104)进行核酸提取本身。
简言之，加入20μL蛋白酶K，然后加入100μL含有10μg线性聚丙烯酰胺的“VXL”缓冲液(25-50％盐酸胍，2.5-10％Triton-X)(98μL的“VXL”缓冲液+2μL 5mg/mL的线性聚丙烯酰胺(Life Technologies，参考货号：AM9520))。通过脉冲旋涡振荡混合样品，并在室温(20-25℃)下孵育15分钟。
然后加入350μL“ACB”缓冲液(30-50％硫氰酸胍，异丙醇)，并通过脉冲旋涡振荡混合样品。
将裂解物上样至置于收集管的QIAamp Mini柱上，6000g离心1分钟，弃去流出液。将柱置于新的收集管上，加入600μL“AW1”缓冲液(50-70％盐酸胍，乙醇)洗涤，并以6000g离心1分钟。弃去流出液，将柱置于新的收集管上，加入600μL“AW2”缓冲液(70％乙醇)洗涤，并以6000g离心1分钟。弃去流出液，将柱置于新的收集管上，并以12000g离心2分钟以干燥膜。弃去流出液并将柱置于新的1.5mL无RNA酶和DNA酶的管中。向该膜中心加入50μL“AVE”缓冲液(不含RNA酶的水，0.04％叠氮化钠)，在工作台上孵育1至2分钟，然后以12000g离心1分钟。最后弃去该柱。
向回收的洗脱物中加入1μL MS2噬菌体RNA溶液。将样品置于冰上或置于+4℃下以供即时使用。另外，应该将样品储存在-20℃(最长一个月)或-80℃(最长五年)。
用于文库扩增的连续标记(STLA)
在提取的核酸群中，可能存在一些病毒RNA。因此，有必要首先进行逆转录以将这些RNA转化成cDNA。可以用SuperScript III First-Strand Synthesis System(LifeTechnologies，参考货号：18080-051)以及含有固定的5′端序列(25bp至35bp)和3′端8个连续G/T核苷酸的单引物进行第一链cDNA合成。本实验中，使用“引物-K8”(其中K＝G或T)(SEQID NO：1)。
将先前回收的4μL核酸样品转移到0.2mL不含RNA酶和DNA酶的微型管中，并补充1μL以下混合物，其含有0.5μL 10mM各dNTP(New England Biolabs，参考货号：N0447S)以及0.5μL的20μM引物-K8寡核苷酸(SEQ ID NO：1)。混合后，将样品在75℃下加热5分钟，然后在25℃下冷却2分钟。
向样品中加入5μL混合物，该混合物含有：
-1μL的10X SuperScript III RTion缓冲液，
-2μL的25mM MgCl2，
-1μL的100mM DTT，
-0.5μL的40 U/μL RNAseOUT，
-0.5μL的200 U/μL SuperScript III RTAse。
将0.2mL微型管置于热循环仪中，并在25℃下孵育10分钟以使引物退火和延伸，然后在45℃下孵育60分钟，以进行第一链cDNA合成。立即使用所回收的核酸，或将其储存在-20℃备用。
用于文库扩增的连续标记(STLA)法使用Vent exo-DNA聚合酶。使用单引物(引物-K8，已用于逆转录(SEQ ID NO：1))进行6个随机扩增循环。从第二轮循环开始，已标记片段的每次引发将产生在两端具有衔接序列(即引物-K8序列，如SEQ ID NO：1所示)的锅柄样结构。Vent exo-DNA聚合酶用于该程序。在开始之前，将所有缓冲液在使用前小心旋涡振荡。
向先前获得的10μL样品(4μL核酸+1μL dNTP/引物混合物+5μL SuperScript IIIRTion混合物)中加入19.5μL混合物，该混合物含有：
-3μL的10X Thermopol缓冲液，
-3μL的10mM MgSO4，
-1.2μL的5mM各dNTP，
-12.3μL的不含DNA酶/RNA酶的超纯蒸馏水。
混合后，将样品在95℃下孵育3分钟，然后快速置于冰上2分钟。之后对样品进行脉冲旋转并补充0.5μL(2U/μL)Vent exo-DNA聚合酶(New England Biolabs，参考货号：M0257S)。然后将样品混合并在热循环仪中孵育：
-10℃下45秒，
-20℃下45秒，
-30℃下45秒，
-40℃下45秒，
-50℃下45秒，
-65℃下2分钟，
-94℃下20秒。
该程序重复5次(共6个循环)，最后保持在+4℃。然后立即使用核酸或将其储存在-20℃备用。
使用对应于在第一链cDNA合成期间使用引物的固定部分的引物(SEQ ID NO：2)进行该扩增步骤，其修饰由3′端随机序列的缺失组成。这一步以指数方式扩增了锅柄样结构。Vent exo-DNA聚合酶用于该程序。在开始之前，将所有缓冲液在使用前小心地旋涡振荡。
向先前获得的30μL样品中加入30μL混合物，该混合物含有：
-3μL的10X Thermopol缓冲液，
-3μL的10mM MgSO4，
-3μL的10μM引物(SEQ ID NO：2)，
-1.2μL的5mM各dNTP，
-1μL的2U/μL Vent exo-DNA聚合酶，
-18.8μL不含DNA酶/RNA酶的超纯蒸馏水。
然后将样品混合并在热循环仪中孵育：
-循环1 95℃下3分钟，65℃下30秒，72℃下1分钟，
-循环2-21 95℃下20秒，65℃下30秒，72℃下1分钟。
如果在一周内使用，则之后将核酸保存在+4℃，或保存在-20℃以供长期使用。
测序文库构建前的样品清洗
在构建测序文库之前，应清洗样品以去除单链引物和反应产物。
可使用外切核酸酶I去除单链引物，以降解来自前述反应混合物的单链引物寡核苷酸。
PCR完成后，脉冲旋转样品，补充6.7μL的10X外切核酸酶I缓冲液和1μL外切核酸酶I(New England Biolabs，参考货号：M0293S)，并在37℃下孵育15分钟。
为了进一步纯化扩增的核酸，可以使用SPRI珠(SPRIselect试剂盒，BeckmanCoulter，参考货号：B23317)进行两个连续的大小选择步骤。依次使用的两个比率为0.8X和0.6X。
首先，将SPRI珠悬浮液旋涡振荡直至颜色均匀。将65μL先前获得的核酸转移到具有52μL SPRI珠悬浮液的1.5mL LoBind管(Dominique Dutscher，参考货号：033871)中。吹吸10次以混合总反应体积，并在室温下孵育1分钟。将管置于磁架中3分钟，或直至溶液澄清。然后移出上清液并丢弃。
将管留在磁体上，向样品中加入180μL新制备的85％乙醇并孵育30秒。然后在不扰动沉淀的情况下移出乙醇上清液并丢弃。为了去除残留的乙醇，将管脉冲旋转，并放回磁架中，在不扰动沉淀的情况下用20μL移液器小心地去除上清液。
将管保持在磁体上，将珠子在室温下风干不超过1分钟。然后将管从磁架上取下，并向样品中加入50μL不含核酸酶的水。将混合物吹吸5次，并旋涡振荡10秒以充分混合。
将管进一步脉冲旋转并放回磁架中放置至少1分钟。清洗溶液后，在不扰动沉淀的情况下将含有洗脱DNA的上清液转移到新的1.5mL LoBind管中。
接着，向先前回收的50μL样品中加入30μL SPRI珠悬浮液。吹吸10次以混合总反应体积，并在室温下孵育1分钟。将管置于磁架中3分钟，或直至溶液澄清。然后移出上清液并丢弃。
将管留在磁体上，向样品中加入180μL新制备的85％乙醇并孵育30秒。然后在不扰动沉淀的情况下移出乙醇上清液并丢弃。为了去除残留的乙醇，将管脉冲旋转，并放回磁力架中，在不扰动沉淀的情况下用20μL移液器小心地去除上清液。
将管保持在磁体上，将珠子在室温下风干不超过1分钟。然后将管从磁架上取下，并向样品中加入20μL无核酸酶的水。将混合物吹吸5次，并旋涡振荡10秒以充分混合。
将管进一步脉冲旋转并放回磁架中放置至少1分钟。清洗溶液后，在不扰动沉淀的情况下将含有洗脱DNA的上清液转移到新的1.5mL LoBind管中。
扩增DNA的定量
混合1μL Quant-iT dsDNA HS/BR试剂和199μL Quant-iT dsDNA HS/BR缓冲液以制备200μL Quant-iT dsDNA HS/BR工作液(1∶200稀释)(Quant-iT dsDNA HS/BR检测试剂盒，ThermoFisher Scientific，参考货号：Q32851/Q32853)。
向10μL试剂盒提供的两种噬菌体λDNA标准物中分别加入190μL Quant-iT dsDNAHS/BR工作液，并将管在室温下孵育2分钟。
向5μL先前回收并稀释过两次的扩增DNA样品中加入195μL Quant-iT dsDNA HS/BR工作液，并将管在室温下孵育2分钟。
使用Qubit 2.0荧光计(ThermoFisher Scientific，参考货号：Q32866)，选择“DNA”，然后选择“dsDNA HS/BR”，运行两种标准物的校准程序。
最后，读取核酸样品。Qubit 2.0荧光计给出的值对应于测定管中稀释样品的浓度。应通过稀释因子校正该值，以获得清洗步骤后扩增DNA的浓度。
扩增核酸现在可以用于测序文库的构建，以供NGS测序。
测序文库的构建和运行
该步骤需要1ng的输入DNA并可以按照制造商的说明书(文档号15031942 v01，2016年1月)使用Nextera XT DNA Library Prep Kit(Illumina，参考货号：FC-131-1096)进行。
文库定量在2100 BioAnalyzer仪器(Agilent technologies，参考货号：G2939AA)上进行，无需进行基线减除。获得的文库与MiSeq测序系统(Illumina)兼容。
然后按照制造商的说明书，使用Illumina MiSeq系统和MiSeq Reagent Kit v2(Illumina，参考货号：MS-102-2002)运行150碱基单端测序来处理该文库。
最后，可以将获得的序列或“测序读数”与数据库进行比对，该数据库优选包含临床上重要的感染原基因组的多病原体数据库。
实施例4：细菌核酸的分离、扩增、文库构建和测序
基于上文所述的实验，制定了一套用于检测血浆样品中的细菌的完整标准化方案。
提取
按照制造商的说明书，使用QIAamp DNA Microbiome Kit(QIAGEN，参考货号：51704)进行核酸提取本身。
简言之，将300μL新鲜混合的血液样品转移到2mL微型管中，补充700μL的PBS以将体积调整至1mL，并补充500μL“AHL”缓冲剂(3-10％皂苷，10-20％蔗糖)，然后在室温下以端到端翻转旋转(end-over-end rotation)孵育30分钟，或替代地，以600rpm在恒温混匀仪中孵育。然后将样品在室温下以10000g离心10分钟，并弃去上清液。
通过将0.1g皂苷(含20-35％皂苷元的皂苷，来自Sigma-Aldrich，参考货号：S4521)溶解在1mL不含DNA酶和RNA酶的超纯蒸馏水(ThermoFisher Scientific，参考货号：10977035)中来制备10％w/v的皂苷溶液。将回收的沉淀用184.2μL“RDD”缓冲液(QIAGEN专有组合物)重悬，并补充2.5μL全能核酸酶核酸酶(VWR，参考货号：70664-3)和5.8μL 10％w/v皂苷(不预先混合酶)。在摇动和脉冲旋转后，将样品于37℃下在恒温混匀仪中以600rpm孵育30分钟。
进一步加入20μL蛋白酶K，并将样品于56℃下在恒温混匀仪上以600rpm孵育30分钟。
管经短暂旋转以除去凝结物后，加入含有试剂DX(消泡剂)的200μL“ATL”缓冲液(1-3％十二烷基硫酸钠，SDS)(1490μL“ATL”缓冲液+10μL试剂DX)。
然后将所有体积的样品转移到含有玻璃珠的Pathogen Lysis Tube L(随试剂盒提供)中。将管放在用于微型管的旋涡振荡器接头上并全速旋涡振荡10分钟以裂解细菌。将管进一步以10000g离心1分钟以减少裂解后的泡沫量。
将198μL上清液转移到1.5mL微型管中。同时，将1μL的噬菌体T3原种即时稀释于PBS中，至终浓度为106个噬菌体基因组拷贝/mL。向样品中加入2μL该工作液。
进一步加入40μL蛋白酶K，旋涡振荡样品，并于56℃下在恒温混匀仪上以600rpm孵育30分钟。然后加入200μL“APL2”缓冲液(30-50％硫氰酸胍)。通过脉冲旋涡振荡30秒来混合样品并在70℃下孵育10分钟。
然后加入200μL的乙醇并通过脉冲旋涡振荡15-30秒来混合样品，接着将裂解物上样到放置在收集管上的QIAamp UCP Mini柱(随试剂盒提供)上。将柱子以6000g离心1分钟，并弃去流出液。将柱置于新的收集管上，加入500μL“AW1”缓冲液(50-70％盐酸胍，乙醇)洗涤，并以6000g离心1分钟。弃去流出液，将柱置于新的收集管上，加入500μL“AW2”缓冲液(70％乙醇)洗涤，并以12000g离心3分钟。弃去流出液，将柱置于新的收集管上，并以12000g再离心1分钟以干燥膜。弃去流出液并将柱置于新的不含RNA酶和DNA酶的1.5mL管中。向该膜中心加入50μL“AVE”缓冲液(不含RNA酶的水，0.04％叠氮化钠)，在工作台上孵育5分钟，然后以6000g离心1分钟。最后弃去该柱。
将样品置于冰上或于+4℃以供即时使用。另外，应该将样品储存在-20℃(最长一个月)或-80℃(最长五年)。
用于文库扩增的连续标记(STLA)
用于文库扩增的连续标记(STLA)法使用Vent exo-DNA聚合酶。使用单引物(引物-K8，已用于逆转录(SEQ ID NO：1))进行6个随机扩增循环。从第二轮循环开始，已标记片段的每次引发将产生在两端具有衔接序列的锅柄样结构。Vent exo-DNA聚合酶用于该程序。在开始之前，将所有缓冲液在使用前小心地旋涡振荡。
将4μL先前获得的样品转移到0.2mL不含RNA酶和DNA酶的管中，并补充25.5μL混合物，该混合物含有：
-3μL的10X Thermopol缓冲液，
-3μL的10mM MgSO4，
-1.2μL的5mM各dNTP，
-0.5μL的20μM引物-K8寡核苷酸(SEQ ID NO：1)，
-17.8μL的不含DNA酶/RNA酶的超纯蒸馏水。
混合后，将样品在95℃下孵育3分钟，然后快速置于冰上2分钟。之后对样品进行脉冲旋转并补充0.5μL(2U/μL)Vent exo-DNA聚合酶(New England Biolabs，参考货号：M0257S)。然后将样品混合并在热循环仪中孵育：
-10℃下45秒，
-20℃下45秒，
-30℃下45秒，
-40℃下45秒，
-50℃下45秒，
-65℃下2分钟，
-94℃下20秒。
该程序重复5次(共6个循环)，最后保持在+4℃。然后立即使用核酸或将其储存在-20℃备用。
使用对应于在第一链cDNA合成期间使用引物的固定部分的引物(SEQ ID NO：2)进行该扩增步骤，其修饰由3′端随机序列的缺失组成。这一步以指数方式扩增了锅柄样结构。Vent exo-DNA聚合酶用于该程序。在开始之前，将所有缓冲液在使用前小心地旋涡振荡。
向先前获得的30μL样品中加入30μL混合物，该混合物含有：
-3μL的10X Thermopol缓冲液，
-3μL的10mM MgSO4，
-3μL的10μM引物(SEQ ID NO：2)，
-1.2μL的5mM各dNTP，
-1μL的2U/μL Vent exo-DNA聚合酶，
-18.8μL不含DNA酶/RNA酶的超纯蒸馏水。
然后将样品混合并在热循环仪中孵育：
-循环1 95℃下3分钟，65℃下30秒，72℃下1分钟，
-循环2-21 95℃下20秒，65℃下30秒，72℃下1分钟。
如果在一周内使用，则之后将核酸保存在+4℃，或保存在-20℃以供长期使用。
测序文库构建前的样品清洗
在构建测序文库之前，应清洗样品以去除单链引物和反应产物。
可使用外切核酸酶I进行单链引物的去除，以降解来自前述反应混合物的单链引物寡核苷酸。
PCR完成后，脉冲旋转样品，补充6.7μL的10X外切核酸酶I缓冲液和1μL外切核酸酶I(New England Biolabs，参考货号：M0293S)，并在37℃下孵育15分钟。
为了进一步纯化扩增的核酸，可以使用SPRI珠(SPRIselect试剂盒，BeckmanCoulter，参考货号：B23317)进行两个连续的大小选择步骤。依次使用的两个比率为0.8X和0.6X。
首先，将SPRI珠悬浮液旋涡振荡直至颜色均匀。将65μL先前获得的核酸转移到具有52μL SPRI珠悬浮液的1.5mL LoBmd管(Dominique Dutscher，参考货号：033871)中。吹吸10次以混合总反应体积，并在室温下孵育1分钟。将管置于磁架中3分钟，或直至溶液澄清。然后移出上清液并丢弃。
将管留在磁体上，向样品中加入180μL新制备的85％乙醇并孵育30秒。然后在不扰动沉淀的情况下移出乙醇上清液并丢弃。为了去除残留的乙醇，将管脉冲旋转，并放回磁架中，在不扰动沉淀的情况下用20μL移液器小心地去除上清液。
将管保持在磁体上，将珠子在室温下风干不超过1分钟。然后将管从磁性架上取下，并向样品中加入50μL不含核酸酶的水。将混合物吹吸5次，并旋涡振荡10秒以充分混合。
将管进一步脉冲旋转并放回磁架中放置至少1分钟。清洗溶液后，在不扰动沉淀的情况下将含有洗脱DNA的上清液转移到新的1.5mL LoBind管中。
接着，向先前回收的50μL样品中加入30μL SPRI珠悬浮液。吹吸10次以混合总反应体积，并在室温下孵育1分钟。将管置于磁架中3分钟，或直至溶液澄清。然后移出上清液并丢弃。
将管留在磁体上，向样品中加入180μL新制备的85％乙醇并孵育30秒。然后在不扰动沉淀的情况下移出乙醇上清液并丢弃。为了去除残留的乙醇，将管脉冲旋转，并放回磁架中，在不扰动沉淀的情况下用20μL移液器小心地去除上清液。
将管保持在磁体上，将珠子在室温下风干不超过1分钟。然后将管从磁架上取下，并向样品中加入20μL不含核酸酶的水。将混合物吹吸5次，并旋涡振荡10秒以充分混合。
将管进一步脉冲旋转并放回磁架中放置至少1分钟。清洗溶液后，在不扰动沉淀的情况下将含有洗脱DNA的上清液转移到新的1.5mL LoBind管中。
扩增DNA的定量
混合1μL Quant-iT dsDNA HS/BR试剂和199μL Quant-iT dsDNA HS/BR缓冲液以制备200μL Quant-iT dsDNA HS/BR工作液(1∶200稀释)(Quant-iT dsDNA HS/BR检测试剂盒，ThermoFisher Scientific，参考货号：Q32851/Q32853)。
向10μL试剂盒提供的两种噬菌体λDNA标准物中分别加入190μL Quant-iT dsDNAHS/BR工作液，并将管在室温下孵育2分钟。
向5μL先前回收并稀释过两次的扩增DNA样品中加入195μL Quant-iT dsDNA HS/BR工作液，并将管在室温下孵育2分钟。
使用Qubit 2.0荧光计(ThermoFisher Scientific，参考货号：Q32866)，选择“DNA”，然后选择“dsDNA HS/BR”，运行两种标准物的校准程序。
最后，读取核酸样品。Qubit 2.0荧光计给出的值对应于测定管中稀释样品的浓度。应通过稀释因子校正该值，以获得清洗步骤后扩增DNA的浓度。
扩增核酸现在可以用于测序文库的构建，以供NGS测序。
测序文库的构建和运行
该步骤需要1ng的输入DNA并可以按照制造商的说明书(文档号15031942 v01，2016年1月)使用Nextera XT DNA Library Prep Kit(Illumina，参考货号：FC-131-1096)进行。
文库定量在2100 BioAnalyzer仪器(Agilent technologies，参考货号：G2939AA)上进行，无需进行基线减除。获得的文库与MiSeq测序系统(Illumina)兼容。
然后按照制造商的说明书，使用Illumina MiSeq系统和MiSeq Reagent Kit v2(Illumina，参考货号：MS-102-2002)运行150碱基单端测序来处理该文库。
最后，可以将获得的序列或“测序读数”与数据库进行比对，该数据库优选包含临床上重要的感染原基因组的多病原体数据库。
实施例5：分析的性能特征
本实验中，血液样品中加入了九种感染原(表5)。
表5
gc/mL：个基因组拷贝/mL
检测限
从8个独立的血液样品确定了9种感染原的检测限(LoD)，这些血液样品中5个样品是重复(从核酸提取物开始)的，也就是共13个样品。
在上述5种病毒中，有三种病毒在所有情况(13/13)下被检测到：VZV、细小病毒B19和轮状病毒A。除了5个重复样品中的一个被处理两次外，都检测到了BK多瘤病毒(12/13阳性)。
加入浓度为104gc/mL的副流感病毒3型，在几个样品中仅检测到数十至数百的测序读数，而在其他样品中未检测到。该数据意味着副流感病毒3型的加入浓度对应于LoD的极限值。
因此，计算出的病毒LoD为：
在3种革兰氏阳性细菌中，在所有情况(13/13)下检出了粪肠球菌，13个样品中有12个检出了屎肠球菌和金黄色葡萄球菌。后两种细菌在第13个样品中以中等置信度被检测到，这表明以104gc/mL被加入的所有上述革兰氏阳性细菌可以容易地在该浓度下被检测到。
在所有13个样品中检测到以104gc/mL加入的革兰氏阴性细菌肺炎克雷伯氏菌，其中9例具有高置信度，其余4例为低置信度。没有样品中检测不到肺炎克雷伯菌。
因此，计算出的细菌LoD为：
可重复性
在两个不同的水平下评估可重复性：通过测试加载到不同Illumina MiSeq流动池(flowcell)上的相同NGS文库，并独立分析。该方法允许评估数据输出中由NGS测序随机步骤引入的变化性。
两个不同的NGS文库被加载到两个NGS中运行。在18种条件(9种感染原且为2套不同的文库)下，只有1种条件给出了不同的结果。对于相同文库的两个重复样品，轮状病毒A未被检测到或以中等置信度被检测到。更重要的是，当在样品的给定点检测到感染原时，在重复样品中也检测到该感染原，这表明检测到的因子具有一致的可重复性。
然后，进行从相同的病毒和细菌提取物开始但经独立处理直至NGS测序的实验。该实验用于监测由核酸扩增、NGS文库构建和测序步骤引入的变化性。
对5种不同的血液样品进行这类实验，每种样品含有病毒和细菌提取物。对每种病毒和细菌提取物，将核酸扩增、NGS文库构建和测序的重复样品加载到两种不同的MiSeq流动池上。对5种血液样品产生的10个NGS文库进行分析。
在45个重复样品中(9种感染原加入到5种不同的血液样品中)，只有7个不一致。关于检测，这7例可以如下分类：
-从阳性到中等置信水平：
4例(2×副流感病毒3型；屎肠球菌；金黄色葡萄球菌)，
-从阳性到阴性检测结果：
1例(BK多瘤病毒)，
-从阳性到低置信水平：
1例(肺炎克雷伯氏菌)，
-从低置信水平到阴性水平：
1例(肺炎克雷伯氏菌)。
在7个不一致的案例中，副流感病毒3型和肺炎克雷伯氏菌占据4例显示了可重复性较差的数据。更重要的是，在单一重复样品内由阳性检测和非检测所代表的极端变化只在所研究的45例的一例中被发现。
总之，该数据表明从单一核酸提取物开始的感染原检测具有非常好的可重复性。
实施例6：内部对照物
内部对照物1
在病毒部分和细菌部分的制备期间，使用在此称为“内部对照物1”的第一内部对照物来评估本发明方法的可靠性。内部对照物1是噬菌体T3的超纯原液。
在病毒部分中，在皂苷和核酸酶处理之前，将内部对照物1加入血浆中，并用于监测该程序的所有后续步骤。
在细菌部分中，在皂苷和核酸酶处理后但在细菌DNA提取前添加内部对照物1。其用于监测细菌DNA纯化及该程序的后续步骤。
病毒部分和细菌部分制备之间的差异对通过添加内部对照1而监测这些程序具有意义。事实上，从病毒颗粒中提取病毒核酸是通过“软”处理(通常使用离液盐)实现的，相较而言，破坏细菌细胞壁所需要的是强力的机械裂解，尤其是对于革兰氏阳性细菌。这种硬处理将不可避免地降解内部对照物1的核酸并阻止对该程序的进一步监测。因此，细菌部分中内部对照物1的添加正好在机械裂解之后且在细菌核酸纯化之前进行。
内部对照物2
在病毒部分的制备期间，可使用称为“内部对照物2”的第二内部对照物来评估本发明方法的可靠性。内部对照物2是衍生自噬菌体MS2超纯原液的基因组RNA的提取物。
在病毒部分中，内部对照物2可在病毒核酸纯化之后立即加入到病毒核酸提取物中。在这种情况下，其用于监测RNA病毒检测和测序所需的逆转录步骤，以及同内部对照物1一起监测该程序的后续步骤。
如果对于内部对照物1和2重新获得足够的测序读数，即超过所覆盖基因组的约10％，则本发明的方法被认为是可靠的。

Claims (14)

1.一种用于从生物流体的非细胞部分分离感染原的核酸并对其进行扩增和测序的体外方法，其包括使所述生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触。
2.根据权利要求1所述的体外方法，其还包括所述感染原的核酸的提取和测序。
3.根据权利要求1或2所述的体外方法，其包括以下步骤：
a)使所述生物流体的非细胞部分与至少一种去污剂和至少一种核酸消化酶接触，
b)提取感染原的核酸，
c)任选地，逆转录感染原的基因组RNA，
d)扩增感染原的基因组DNA和/或感染原的cDNA，
e)对扩增的感染原的基因组DNA和/或感染原的cDNA进行测序。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的体外方法，其中所述感染原的核酸的测序通过下一代测序来进行。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的体外方法，其中所述感染原选自病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的体外方法，其中所述至少一种去污剂选自非离子去污剂、两性离子去污剂和阴离子去污剂，优选地，所述至少一种去污剂为非离子去污剂。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的体外方法，其中所述至少一种去污剂选自皂苷、Triton、NP-40、吐温及其衍生的去污剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的体外方法，其中所述至少一种去污剂是具有约5％至约50％的皂苷元含量的皂苷。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的体外方法，其中所述至少一种核酸消化酶是具有DNA酶和/或RNA酶活性的核酸酶。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的体外方法，其中所述至少一种核酸消化酶选自baseline-zero DNA酶、全能核酸酶、DNA酶I、DNA酶II、内切核酸酶III、内切核酸酶IV、内切核酸酶V、内切核酸酶VIII、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶V，外切核酸酶VII、外切核酸酶VIII、外切核酸酶T、λ外切核酸酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶BAL-31、核酸酶P1、核酸酶S1、T4内切核酸酶V、T5外切核酸酶、T7内切核酸酶I和T7外切核酸酶。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的体外方法，其中所述部分内残留细胞的存在不影响所述部分中的所述感染原的可及性或富集。
12.一种试剂盒套装，其包括：
a.至少一种去污剂，其选自皂苷、Triton、NP-40、吐温或其衍生物，
b.至少一种核酸消化酶，其选自baseline-zero DNA酶、全能核酸酶、DNA酶I、DNA酶II、内切核酸酶III、内切核酸酶IV、内切核酸酶V、内切核酸酶VIII、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶V，外切核酸酶VII、外切核酸酶VIII、外切核酸酶T、λ外切核酸酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶BAL-31、核酸酶P1、核酸酶S1、T4内切核酸酶V、T5外切核酸酶、T7内切核酸酶I和T7外切核酸酶，
c.任选地，试剂，以及
d.任选地，用于根据本发明方法中的说明书。
13.根据权利要求12所述的试剂盒套装，其中试剂选自核酸提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、核酸清洗试剂、核酸大小选择试剂、核酸定量试剂、核酸文库制备试剂、核酸文库测序试剂和内部对照物。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒套装，其中试剂包括核酸提取试剂、逆转录酶、vent exo-DNA聚合酶、dNTP、具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：13中任一个所示的序列的寡核苷酸引物、具有SEQ ID NO：2所示的序列的寡核苷酸引物、外切核酸酶I和/或SPRI珠。
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