CN114981425A

CN114981425A - 用于消化样品中核酸的方法

Info

Publication number: CN114981425A
Application number: CN202080081938.4A
Authority: CN
Inventors: 贾斯汀·约瑟夫·奥格雷迪; 杰玛·路易丝·凯; 塞穆拉·查拉姆普斯; 阿尔普·艾丁; 里卡多·斯科蒂
Original assignee: East Anglia University Enterprise Co ltd
Current assignee: East Anglia University Enterprise Co ltd
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2022-08-30
Also published as: WO2021105659A1; EP4065708A1; EP4065708B1; US20230203472A1; GB201917101D0; US11946037B2

Abstract

本发明提供了用于消耗生物样品中宿主核酸的方法、组合物和试剂盒，所述样品在先已经从动物宿主中获得。

Description

用于消化样品中核酸的方法

技术领域

本发明涉及消耗生物样品中宿主核酸的方法。

背景技术

快速且全面的传染性疾病诊断对于改善患者管理和对抗抗菌素耐药性是关键的。对败血症和肺炎等危及生命的传染性疾病进行快速诊断至关重要。这些临床综合征具有复杂的病因，需要在具有挑战性的样品基质(例如血液、痰涎等)中识别病原体。目前，用于临床诊断的“金标准”方法是微生物培养，该方法劳动强度大，周转时间长，临床敏感性差。目前可采用的快速分子方法(例如PCR)提高了得出结果的周转时间和灵敏度，但受限于范围，因此对于罕见的病原体和耐性标记物可能会出现问题。用于快速检测微生物病原体的最适用技术是核酸扩增测试(NAAT)。NAAT可用于脓毒症诊断(例如Septifast(RTM)、Roche)，但使用的复杂性和次优性能阻碍了它们的广泛采用。大多数用于呼吸道感染(RTI)的NAAT都集中在检测呼吸道病毒(例如，Biofire Filmarray Respiratory Panel、Seegene RV15)。例外情况包括设计用于社区获得性和医疗保健相关性肺炎的Curetis Unyvero(RTM)和Biofire(RTM)肺炎测试。然而，NAAT并不全面(例如，Curetis测试仅覆盖90％的顶级病原体)，仅寻找预设范围的靶标，这意味着将遗漏不太常见的病原体。因此，NAAT诊断是标准细菌学的辅助工具，而不是替代品，并且其采用受到限制。

诊断技术迫切需要典范转变(paradigm shift)，即可以检测任何病原体(例如病毒、细菌、真菌)和抗生素耐药性的通用诊断方法。不定型/鸟枪法宏基因组测序有可能成为推动这一转变的首选技术。鸟枪宏基因组测序可以检测并提供样品中病毒、细菌和真菌的相对比例，而无需事先了解存在的微生物群落，并且越来越多地用于研究临床样品中的复杂宏基因组。

那么为什么鸟枪法宏基因组学目前没有广泛应用于感染诊断呢？一个原因在于下一代测序(NGS)典型上是昂贵的、执行复杂且难以分析。MinION(RTM)纳米孔测序技术的发展通过廉价的便携式测序仪、快速简单的文库制备(15分钟)和自动实时分析工具改变了NGS的状况。另一主要障碍在于临床样品中存在大量人类DNA，其通常比存在的病原体DNA高出几个数量级。由于相对于病原体核酸(特别是DNA)存在极大量的人类核酸(比例通常为10⁸:1至10⁹:1，基于10⁶个白细胞/ml[其中～6.6pg DNA/细胞]，但少至1-10个菌落形成单位[CFU]的病原体/ml[其中，～5fg DNA/细胞])，血液对于基于NGS的病原体表征是尤其具有挑战性的基质。需要至少约10⁵的宿主DNA消耗，从而使可能带来人类DNA：病原体DNA比率为10³:1，以促进血液中基于NGS的病原体表征，而通过本领域公开的方法，例如商业上可获得的病原体DNA富集方法(QIAamp(RTM)DNA Microbiome Kit(Qiagen)；NEBNext(RTM)Microbiome DNA Enrichment kit(NEB)；MolYsis(RTM)Basic 5kit(Molzym))未能实现该消耗水平(引起病原体核酸富集)。此外，本领域公开的许多方法是相对较缓慢，部分原因在于它们采用单独的(连续的)宿主细胞裂解和宿主核酸降解步骤。

本申请的目的之一是解决前述问题。

发明内容

因此，提供了一种用于消耗生物样品中宿主核酸的方法，所述样品在先已经从动物宿主中获得，所述方法包括：

a)将皂苷、DNase，以及NaCl和/或KCl加入到所述样品中，以形成反应混合物，其中，加入的所述NaCl和/或KCl足以确保所述反应混合物中NaCl和/或KCl的终浓度为至少0.2M；以及

b)在10℃和50℃之间孵育所述反应混合物。

优选地，所述DNase是盐活性(salt-active)的DNase，诸如具有SEQ ID NO:1或SEQID NO:2序列的DNase或它们的活性变体；和/或，所述方法进一步包括：将Mg盐和/或Mn盐加入至所述样品中，其中，加入的所述Mg盐和/或Mn盐足以确保所述反应混合物中Mg盐和/或Mn盐的终浓度为至少1.0mM。

优选地，所述皂苷包括单糖链皂苷；和/或，所述皂苷包括皂苷配基，并且优选包括三萜类化合物。

优选地，所述方法进一步包括从所述反应混合物提取剩余核酸的后续步骤。优选地，所述方法进一步包括：使提取出的核酸经受纯化处理的步骤；和/或对提取出的核酸进行扩增的步骤。进一步优选地，所述方法进一步包括：对提取出的核酸进行核酸扩增测试的步骤，或者优选地，对提取出的核酸进行测序处理。

优选地，所述生物样品是痰涎(sputum)样品或血液样品；和/或，所述方法使得所述样品中初始含有的宿主DNA消耗至少10倍，优选至少10²倍，优选至少5×10²倍，优选至少10³倍，优选至少5×10³倍，优选至少10⁴倍，优选至少5×10⁴倍，最优选至少10⁵倍。

还提供了一种含浓度为至少0.2M的NaCl和/或KCl，以及皂苷的组合物。优选地，所述组合物进一步包括浓度为至少1.0mM的Mg盐和/或Mn盐，和/或DNase；优选其中所述DNase是盐活性的DNase，诸如具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的DNase或它们的活性变体。进一步优选地，所述组合物进一步包括生物样品，所述样品在先已经从动物宿主中获得，优选其中，所述生物样品是痰涎样品或血液样品。

还提供了一种试剂盒，包括：i)含浓度为至少0.2M的NaCl和/或KCl的组合物；ii)含皂苷的组合物。优选地，所述试剂盒进一步包括：iii)含DNase(优选盐活性的DNase，诸如具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的DNase或它们的活性变体)的组合物。

还提供了一种试剂盒，包括：i)含皂苷和浓度为至少0.2M的NaCl和/或KCl的组合物；ii)含DNase(优选盐活性的DNase，诸如具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的DNase或它们的活性变体)的组合物。

具体实施方式

一般性描述

本文提供了一种用于消耗生物样品中宿主核酸(尤其是RNA，和/或最优选DNA)的方法，所述样品在先已经从动物宿主中获得，所述方法包括：a)将皂苷、DNase(具有DNase活性的任何酶)，以及NaCl和/或KCl加入到所述样品，以形成(液体)反应混合物，其中，加入的所述NaCl和/或KCl足以确保反应混合物中NaCl和/或KCl的终浓度为至少0.2M；以及b)在10℃和50℃之间孵育反应混合物。

动物宿主可以是脊椎动物，例如鸟、鱼，或优选哺乳动物，最优选人类。在收集样品时，宿主可能是活着的，也可能是死亡的。

生物样品可以是包含动物细胞(以组织形式或其他形式)的任何样品。感兴趣的具体(例如临床)样品包括胆汁、指甲、鼻/支气管灌洗液、骨髓、源自身体的干细胞、骨骼、非胎儿妊娠产物(non-fetal products of conception)、脑、母乳、器官、心包液、血沉棕黄层(buffy coat layer)、血小板、脑脊液、胸膜液、囊液、原代细胞培养物、脓液、唾液、皮肤、胎儿组织、囊性病变液、胃内容物、毛发、牙齿、肿瘤组织、脐带血、粘液和干细胞。但是，尤其优选的样品包括关节抽吸物、粪便、脑脊液、尿液，并且尤其是痰涎和血液(包括血浆)。样品可以直接带入本申请方法中，或者可以在本申请方法之前对其进行处理、操作或改动。

优选地，样品为液体形式。在进行本方法之前，可能需要将初始样品转化为液体形式。液体样品的体积可在10μl和100ml之间，优选在10μl和50ml之间，例如在10μl或100μl和20ml之间(例如0.2ml或1ml)。可替代地，可以将固体样品悬浮在(液体)组合物中，该组合物包含一种或多种关键的外源性反应混合物组分，皂苷，DNase和NaCl/KCl(以及其他可选的外源性组分)。

反应混合物组分，皂苷和DNase将在后文中讨论。

加入的KCl和/或(优选)NaCl的量足以确保反应混合物中NaCl和/或KCl的终浓度为至少0.2M，即，不考虑样品中可能含有的任何NaCl和/或KCl。例如，对于200μl样品，可加入200μl含皂苷、DNase以及NaCl和/或KCl的组合物，其中组合物中NaCl和/或KCl的浓度为0.4M或更高(例如2.0M或更高以确保至少1.0M的终浓度)。换言之，反应混合物包括至少0.2M的外源加入的NaCl和/或KCl。优选的浓度(对于单独的NaCl，对于单独的KCl，或者对于NaCl和KCl的混合物)包括至少0.3M、至少0.4M、至少0.5M、至少0.75M、至少1.0M、至少1.25M、至少1.5M、至少1.75M、至少2.0M、至少2.25M、至少2.3M、至少2.4M以及至少2.5M，直至例如3.0M、3.5M、4.0M、4.5M、5.0M或5.5M。优选的NaCl/KCl浓度范围包括0.2M和0.3M和5.0M之间，0.4M或0.5M和4.5M之间，1.0M或1.5M和4.5M之间，2.0M和4.0M之间，以及2.25M和3.0M或4.0M之间。

优选地，尤其当DNase为“HL-SAN DNase”或者为“M-SAN DNase”(参见下文)时，该方法进一步包括：将Mn盐和/或(优选)Mg盐(优选MgCl₂)加入至样品，其中，加入的所述Mg盐和/或Mn盐足以确保反应混合物中Mg盐和/或Mn盐的终浓度为至少1.0mM(如上文关于NaCl/KCl所进行的描述)。优选的浓度包括至少2mM、至少3mM、至少4mM、至少5mM、至少10mM、至少15mM、至少20mM、至少25mM、至少30mM、至少35mM或至少40mM，直至例如60mM、100mM、200mM、500mM或1.0M。优选Mg盐/Mn盐浓度范围包括1.0mM或10mM和1.0M之间，20mM和500mM之间，以及30mM和200mM之间。

额外任选的外源反应混合物组分是分离的RNase(具有RNase活性的酶)，以(部分或完全)消化宿主RNA，尤其是在DNase不额外地具有RNase活性时。

该方法涵盖在不同时间点加入关键的外源反应混合物组分的情况，例如有时将皂苷加入至样品之后，将DNase加入至样品中，前提是所有的这些组分(以及任何任选的其他组分)已经加入并在孵育步骤之前与样品一起存在于反应混合物中。然而，优选的是，NaCl/KCl(以及任何的Mg/Mn盐)的加入不晚于DNase的加入。此外，尤其优选的是，外源反应混合物组分基本上同时加入至样品，例如，加入第一外源反应物组分和最后一个(例如关键)外源反应物组分之间不超过5分钟，诸如不超过2分钟，不超过60秒，或不超过30秒，或者诸如通过向样品中加入包含外源反应混合物组分的组合物，来将同时加入至样品。

优选地，反应混合物是在孵育步骤之前和/或期间混合的(例如，经由吸取)。

反应混合物在10℃和50℃之间孵育优选至少30秒，诸如至少60秒，至少2分钟，或至少5分钟。优选地，该孵育持续长达10分钟，诸如长达15分钟，长达20分钟，长达30分钟，或长达1小时。优选地，孵育时间范围包括60秒至30分钟，以及60秒至20分钟，例如10分钟。优选地，孵育温度范围包括15℃或20℃和45℃之间，以及25℃或30℃和40℃之间，例如37℃。对于部分或全部孵育，使反应混合物例如以1rpm和2000rpm之间，优选100rpm和1500rpm之间(例如，以500rpm或1000rpm)经受混合/摇动。

皂苷引起宿主细胞(及其内膜)的(选择性)裂解，释放宿主核酸，从而使得其能够被DNase(其任选地具有RNase活性以及DNase活性)(部分或完全)消化。非宿主细胞或颗粒(例如病原体)中的核酸基本上保持完整(即没有从样品中显著去除或者被消化)并且是可识别的，因此其可以随后被收集和分析，特别是被识别(通过例如测序或靶向PCR)。核酸是可识别的，例如如果其序列和/或生物来源是可确定的。

任选地，例如在反应混合物未处于例如7.0至9.5(诸如7.5至9.5)的pH的情况下，可向反应混合物中加入缓冲剂。可使用缓冲剂以将反应混合物的pH保持在例如7.0至9.5，诸如(尤其对于HL-SAN DNase)7.5至9.5(例如8.0或8.5至9.0或9.5，优选9.0)或(尤其对于M-SAN DNase)7.0至9.0(尤其是8.0)。

皂苷

皂苷被发现于例如各种植物物种中，并且可以通过在摇动其水性溶液时产生肥皂状泡沫来在现象学上进行分组。它们用作非离子表面活性剂。

皂苷是两亲性分子，含有通过糖苷键与亲脂性糖苷配基基团连接的亲水性糖苷。通过一个、两个或更多这样的键的连接将皂苷分类为单糖链、双糖链或多糖链。糖苷配基基团可为皂苷配基，即含有三萜烯/三萜类化合物或甾类。优选地，在本技术中使用的皂苷包括(或者为)单糖链皂苷，和/或包括(或者为)基于皂苷配基的皂苷(优选包括三萜类化合物)。优选地，例如，皂苷为(或者包括)CAS号为8047-15-2的皂苷(例如，来自TokyoChemical Industry的皂苷S0019[RTM])。

优选地，皂苷以至少0.001％(以重量计[w:w])，诸如至少0.01％(尤其对于痰涎)、至少0.05％(尤其对于血液)、至少0.10％、或至少0.50％并且直至0.50％、1％、2％、3％、5％或10％的终浓度用在反应混合物中。优选的浓度范围包括0.001％和5％之间，0.01％和3％之间，以及0.05％和1％之间，例如0.1％(尤其对于痰涎)或0.5％(尤其对于血液)。对于血液的最低浓度往往是对于痰涎的约5倍。

DNase

DNase可以是核酸外切酶，或优选核酸内切酶，和/或具有RNase活性。

优选地，DNase是盐活性的核酸酶。盐活性的DNase是例如这样的DNase：在含有100mM或更高(直至例如1M、2M或5M)NaCl和/或KCl的缓冲液中(在例如不含样品测定中)，使用50μg/ml小牛胸腺DNA，10ng的该DNase在37℃下于30分钟内提供0.0175或更高(例如0.0875或更高、0.175或更高、0.35或更高，或者0.875或更高)的ΔAbs₂₆₀(在260nm处吸光度的变化)。

优选的DNase是具有序列SEQ ID NO:1的DNase或其活性变体。

SEQ ID NO.1:

APPSSFSKAKKEAVKIYLDYPTEFYCGCDITWKNKKKGIPELESCGYQVRKQEKRASRIEWEHVVPAWQFGHQRQCWQKGGRKNCTRNDKQFKSMEADLHNLVPAIGEVNGDRSNFRFSQWNGSKGAFYGQCAFKVDFKGRVAEPPAQSRGAIARTYLYMNNEYKFNLSKAQRQLMEAWNKQYPVSTWECTRDERIAKIQGNHNQFVYKACTK

具有SEQ ID NO：1序列的DNase也被称为HL-SAN DNase(热不稳定性盐活性核酸酶，例如可由Arcticzymes[RTM]提供)。HL-SAN DNase是同时具有DNase活性和RNase活性的核酸内切酶。HL-SAN DNase对应于杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)核酸内切酶I(VsEndA)，缺少其初始N端信号肽，并且特征在于在位于野生型序列中紧邻高度保守FYCGC五肽基序的N端的S处具有S到E取代。

进一步优选的DNase是具有序列SEQ ID NO:2的DNase或其活性变体。

SEQ ID NO.2:

APISFSHAKNEAVKIYRDHPVEFYCGCEIRWQGKKGIPDLESCGYQVRKNENRASRIEWEHVVPAWQFGHQLQCWQQGGRKNCTRTSPEFNQMEADLHNLVPAIGEVNGDRSNFRFSQWNSKGAFYGQCAFKVDFKGRVAEPPAQSRGAIARTYLYMSEQYGLRLSKAQNQLMQAWNNQYPVSEWECVRDQKIEKVQNSNRFVREQCPN

具有SEQ ID NO：2序列的DNase也被称为M-SAN DNase(例如可由Arcticzymes[RTM]提供)。M-SAN DNase是同时具有DNase活性和RNase活性的核酸内切酶。M-SAN DNase对应于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)核酸内切酶I(VcEndA)，缺少其初始N端信号肽，并且特征在于在位于野生型序列中紧邻高度保守FYCGC五肽基序的N端的S处具有S到E取代。

尤其在高盐浓度下，HL-SAN DNase和M-SAN DNase提供宿主细胞核酸(尤其是DNA)的高效降解(消化)。

HL-SAN DNase的活性变体是保留例如至少10％、优选至少25％、优选至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少95％的HL-SAN DNase的变体。活性可通过以下来测量：例如在不含样品测定中，通过在合适的缓冲液中(例如由25mM Tris-HCl，pH 8.5(例如25℃)，5mM MgCl₂，500mM NaCl组成)中，利用(例如50μg/ml)(例如小牛胸腺)DNA，在指定温度(例如37℃)下的指定时间段(例如30分钟)内吸光度(例如在260nm处)的增加。

M-SAN DNase的活性变体是保留例如至少10％、优选至少25％、优选至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少95％的M-SAN DNase的变体。活性可通过以下来测量：例如在不含样品测定中，通过在合适的缓冲液中(例如由25mM Tris-HCl，pH 7.2(例如37℃)，2.5mM或5mM MgCl₂，150mM或175mM NaCl组成)中，利用(例如50μg/ml)(例如小牛胸腺)DNA，在指定温度(例如37℃)下的指定时间段(例如30分钟)内吸光度(例如在260nm处)的增加。

“其活性变体”在其范围内包括HL-SAN DNase或M-SAN DNase的片段。优选地，所选的HL-SAN DNase或M-SAN DNase的片段为至少10％长度的HL-SAN DNase或M-SAN DNase蛋白序列，优选至少20％、优选至少30％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％，且最优选至少95％长度的HL-SAN DNase或M-SANDNase蛋白序列。

“其活性变体”在其范围内还包括与HL-SAN或M-SAN DNase蛋白序列具有同源性的蛋白序列，例如，例如与整个HL-SAN DNase或M-SAN DNase序列或与代表至少10％长度的HL-SAN DNase或M-SAN DNase蛋白序列，优选至少20％、优选至少30％、优选至少40％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少90％且最优选至少95％长度的HL-SAN或M-SAN DNase蛋白序列长度的连续氨基酸残基区域中具有至少50％一致性，优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少97％且最优选至少99％一致性。测量蛋白质同源性的方法在本领域中是众所周知的，并且本领域技术人员将理解，在本文中，同源性是基于氨基酸一致性来计算的(有时被称为“硬同源性”)。

同源活性HL-SAN DNase或M-SAN DNase变体通常通过取代、插入或缺失而与HL-SAN DNase或M-SAN DNase蛋白序列不同，例如1、2、3、4、5至8个或更多个取代、缺失或插入。取代优选地是“保守的”，也就是说，氨基酸可被相似的氨基酸取代，其中相似的氨基酸共享以下组之一：芳族残基(F/H/W/Y)、非-极性脂肪族残基(G/A/P/I/L/V)、极性不带电脂肪族(C/S/T/M/N/Q)和极性带电脂肪族(D/E/K/R)。优选的子组包括：G/A/P；I/L/V；C/S/T/M；N/Q；D/E；和K/R。

HL-SAN DNase或M-SAN DNase或其活性变体(如上所述)可以具有添加到N-末端和/或C-末端的任意数量的氨基酸残基，前提是蛋白保留DNase活性。优选地，在一端或两端添加不超过300个氨基酸残基，更优选不超过200个氨基酸残基，优选不超过150个氨基酸残基，优选不超过100个氨基酸残基，优选不超过80、60或40个氨基酸残基，最优选不超过20或10或5个氨基酸残基。

优选地，DNase(例如HL-SAN DNase或其活性变体)以每μl至少0.01单位(U/μl)，例如至少0.05U/μl、至少0.1U/μl或至少0.5U/μl，且直至1U/μl、5U/μl或10U/μl的终浓度用在反应混合物中。优选的浓度范围包括0.01U/μl或0.05U/μl和5U/μl之间，以及0.1U/μl和1U/μl之间，例如0.5U/μl。一个单位可选地定义为：在例如由a)25mM Tris-HCl、pH 8.5(25℃)、5mM MgCl₂、500mM NaCl(尤其对于HL-SAN DNase)，或者由b)25mM Tris-HCl、pH 7.2(37℃)、2.5或5mM MgCl₂、150或175mM NaCl(尤其对于M-SAN DNase)组成的缓冲液中，利用50μg/ml小牛胸腺DNA在37℃下30分钟内，在260nm处的吸光度增加1A。

额外的步骤

优选地，该方法进一步包括从反应混合物(或其等分试样)提取剩余(优选非宿主)核酸的步骤。部分或全部剩余核酸(尤其是非宿主核酸)将是完整且可识别的。

通常，提取过程将涉及离心步骤以收集特别是可从中获得核酸的非宿主细胞/颗粒(例如病原体)(病毒颗粒和/或特别是细菌和/或非动物(例如非哺乳动物)(例如单细胞)真核细胞，诸如真菌)。可以选择离心条件使得细菌和非动物细胞沉淀而病毒颗粒不沉淀，或者使得除了细菌和非动物细胞之外的病毒颗粒沉淀。如果是前者，则可以对上清液进行标准病毒检测测试。(实际上，在本方法的步骤a)之前，可对临床样品进行离心，保留含细胞的沉淀(用于当前技术的方法)，并保留上清液以使用标准程序进行病毒检测，存在或不存在使用本技术进行富集)。

核酸可以使用本领域已知的方法从病原体中获得，并且可能涉及添加裂解缓冲液、裂解酶(降解或消除细胞膜、细胞壁和/或病毒衣壳)，和/或蛋白酶，例如蛋白酶K。优选的裂解酶包括溶菌酶、变溶菌素、溶葡球菌素、几丁质酶和溶细胞酶。

任选地，使提取出的核酸(或其等分试样)经受例如本领域已知的纯化处理。在DNA纯化过程中，任选地使用RNase以促进后续DNA测序的优化。但是，如果对非宿主(例如病原体)RNA提取感兴趣(例如后续RNA测序)，则任何纯化步骤都将省略RNase(并且可能使用DNase来有助于纯化)。

优选地，特别是在生物样品是血液样品的情况下，使提取出的核酸(或其等分试样)经受扩增过程，诸如全基因组扩增，以增加核酸的拷贝数/量。对于RNA，这可能涉及对RNA直接扩增或使其转化为cDNA，然后扩增cDNA。

优选地，该方法进一步包括对提取出的核酸(RNA、DNA或cDNA)(或其等分试样)进行核酸扩增测试(例如靶向PCR扩增过程、等温扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA))的步骤；或者，优选地，使用例如纳米孔或Illumina(RTM)测序对提取出的核酸(或其等分试样)进行测序过程，诸如(例如短读或长读)DNA或RNA测序。

优选地，在先被消化的核酸(尤其是宿主核酸)将不会被任何扩增过程扩增和/或(尤其是)通过任何测序过程测序。

本技术的优选结果特征包括来自哺乳动物宿主的生物样品内的宿主DNA的倍数消耗为10或更高、10²或更高、5×10²或更高、10³或更高、5×10³或更高、10⁴或更高、5×10⁴或更高，诸如10⁵或更高(例如10⁶或更高)。尤其优选地，在开展本发明的方法后，宿主核酸(例如DNA)是不可检测的(例如经由qPCR)。例如，优选的结果特征包括来自哺乳动物宿主的痰涎样品中宿主DNA的倍数消耗为5×10²或更高、10³或更高、5×10³或更高，或者10⁴或更高；或者来自哺乳动物宿主的血液样品中的宿主DNA的倍数消耗为5×10³或更高、10⁴或更高、5×10⁴或更高，或者10⁵或更高。

新方法提供了快速且高度有效(例如，痰涎中约10³或10⁴消耗)和选择性(即留下完整的非宿主核酸)地消耗宿主核酸，引起优异的非宿主(例如病原体)核酸富集，足以满足后续基于测序(例如基于下一代测序[NGS])(例如病原体)的诊断。更一般地说，快速和选择性消耗宿主核酸使得能够富集非宿主核酸，且因此改进了对非宿主生物体的识别。因此，该技术适用于医学微生物学以外的领域，例如生物研究、兽医/诊断，以及农业/食品安全。

本方法提供了其中可以部分、大体上、基本上或完全平行(即同时)进行裂解步骤和核酸消耗(例如消化)步骤的条件，因此被称为“一步”和/或“一锅”消耗方法，这与采用连续/串联的单独裂解步骤和消耗步骤的现有技术方法(“两步”方法)相反。这种布置显著减少了完成宿主核酸消耗所需的时间，且这样做具有高度且选择性的消耗结果。将皂苷和DNase在“高盐”中结合的条件是令人惊讶的，这不仅在于皂苷在“高盐”条件下DNase保持活性，而且在于DNase在皂苷(这可能是预计会对酶的构象产生不利影响并因此影响活性)的存在下仍然保持活性。

组合物

在本方法中，外源反应混合物组分可分别/独立地加入至生物样品(如上所限定)。然而，在此，可以制备并提供一系列(“预混合”，液体)组合物，以及反应混合物本身。

例如，提供了一种含皂苷和DNase的组合物。其可任选地例如与NaCl/KCl(提供浓度为至少0.2M的NaCl/KCl)(加入或不加入Mg盐/Mn盐以得到至少1.0mM的浓度)结合，然后加入至样品。

然而，优选地，提供包含皂苷和浓度为至少0.2M的NaCl和/或KCl的组合物。然后可以以任何的顺序加入或混合其他外源组分和样品以提供反应混合物。因此，优选地，组合物进一步包括浓度为至少0.2M的Mg盐和/或Mn盐，和/或DNase，和/或生物样品。尤其优选地，组合物(“预反应混合物”)包括所述NaCl/KCl(且任选地所述Mg盐/Mn盐)，所述皂苷和所述DNase；该组合物可在一个步骤中加入至样品以形成反应混合物。通常，最后将DNase加入至预反应混合物。

这些组合物的优选特征可以在上文，尤其是关于例如各种盐、皂苷以及DNase的性质和浓度的部分中找到。

试剂盒

还提供了一种试剂盒(例如，试剂盒套件(a kit of parts))，包括：i)含浓度为至少0.2M的NaCl和/或KCl的(液体)组合物；ii)含皂苷的组合物。组合物彼此独立(例如容纳在独立的[例如密封]容器中)，但彼此关联(例如通过物理方式)成试剂盒，例如均包含在包装产品中。包含皂苷的组合物可以是固体或液体。优选地，该试剂盒包括iii)含DNase的(独立)组合物。任选地，组合物i)或(特别是当为液体形式时)组合物ii)进一步包含浓度为至少1.0mM的Mg盐和/或Mn盐。

还提供了这样的试剂盒(如上所限定)，包括：i)含皂苷和浓度为至少0.2M的NaCl和/或KCl的组合物；ii)含DNase的组合物。任选地，组合物i)进一步包含浓度为至少1.0mM的Mg盐和/或Mn盐。

这些试剂盒的组合物的优选特征可以在上文，尤其是关于例如各种盐、皂苷以及DNase的性质和浓度的部分中找到。

一般性描述

请注意的是，本文任何位置使用的术语“包括/含”，也应考虑替代为使用术语“由……组成”或“基本上由……组成”的选项。此外，请注意的是，本文使用的术语“蛋白”可以与术语“多肽”互换使用。并且，上文所述的任何和所有液体组合物都可以是水性溶液。还要注意的是，每当短语“至少”用于值X时，这是对a)X和b)大于X的两个替代选项中的每一个公开(例如，“至少0.2M”等同于“0.2M或大于0.2M”)。

实施例

在此，描述了开发简单、快速(“一步”)且高效的人类DNA消耗方法以启动下游宏基因组测序(以及其他分子应用，例如PCR)，用于例如检测和识别病原体和相关抗生素耐药性标记物的过程。

为了对感染进行高效、快速且经济有效地的宏基因组诊断，人类DNA消耗或病原体DNA富集是必不可少的。我们采用的方法涉及消耗人类DNA，聚焦于人类细胞的差异性裂解(使用皂苷)，以及人类DNA的去除(使用DNase)，产生完整的例如人类病原体用于进一步分析。

每个实验中均增加未消耗的对照品(UC)，其为从200μl痰涎/血液中提取的且未进行消耗过程的DNA。对临床痰涎样品进行处理，并使用16S rRNA基因片段qPCR来确保病原体DNA在该方法中不会被无意地降解。

随后，通过以下来提取DNA(除非在实验过程中另有说明)：

1.将细菌裂解缓冲液(最大体积为700μl)加入至处理过的样品中。向UC中，加入500μl的细菌裂解缓冲液。将样品转移至为微珠搅拌管(紫色盖子-基质裂解E管(MPBiomedicals LLP))并且以50o/s微珠搅拌3分钟(Qiagen TissueLyser LT)。

2.以最大速度(～20000xg)离心所有样品1分钟。将澄清的上清液(2x200μl)转移至装有20μl蛋白酶K的新管中，并通过涡旋来混合。

3.将所有样品在65℃、1000rpm下孵育5分钟。

4.随后在MagNAPure(RTM)上进行纯化。

对于所有实验，使用qPCR对人类核酸和细菌核酸进行定量。设计水解探针测定来检测人类靶向RNA聚合酶II基因。16S rRNA qPCR测定被用于样品中细菌的相对定量。所有qPCR结果均以定量循环(Cq)值(其代表荧光信号增加至背景以上的循环，其中背景与起始模板浓度的量直接相关)来呈现。利用ΔCq(每3.3次循环代表浓度中的10倍差异；Cq值越高，样品中存在的启示模板DNA越少)来计算样品中DNA的相对浓度。

比较例—两步式方案(痰涎)

1.将200μl的痰涎以12000xg离心5分钟。

2.弃去上清液(不要搅动沉淀，剩余<50μl上清液)，并且将沉淀重新悬浮在200μl的PBS中。通过上下吸取来充分混合。

3.加入20μl的1％皂苷(S0019，来自Tokyo Chemical Industry[RTM])，通过吸取充分混合，并在37℃、1000rpm下孵育15分钟。

4.以12000xg离心5分钟。

5.弃去上清液(不要搅动沉淀)，并通过吸取将沉淀重新悬浮在200μl的PBS中。

6.加入200μl的HLSAN缓冲液(在分子水中：5.5M NaCl和100mM MgCl₂)和10μl的HLSAN DNase(25U/μl，购自Arcticzymes[RTM])。短暂涡旋。

7.在37℃、1000rpm下孵育10分钟。

8.加入1.5ml的PBS并以12000xg离心5分钟。

9.弃去上清液，通过吸取重新悬浮在1.5ml的PBS中。

10.以12000xg离心5分钟。

11.弃去上清液，将沉淀重新悬浮在600μl的BLB(来自Roche[RTM]的细菌裂解缓冲液)中。

12.转移到微珠搅拌管(紫色盖子-基质裂解E管)。以50o/s微珠搅拌3分钟。

13.以最大速度(～20000xg)离心1分钟。

14.将2x150μl澄清上清液转移到装有100μl BLB和20μl蛋白酶K的新管中。

15.短暂涡旋，并在65℃下孵育5分钟。

16.DNA提取。

实施例1-一步式方案(痰涎)

1.向200μl的痰涎中加入40μl的1％皂苷(细节如上)、200μl的HLSAN缓冲液(在分子水中：5.5M NaCl和100mM MgCl₂)以及10μl的HLSAN DNase(细节如上)，通过吸取充分混合，并在37℃、1000rpm下孵育10分钟。

2.加入1ml的PBS，并以12000xg离心3分钟。

3.将沉淀重新悬浮在700μl的BLB(来自Roche[RTM]的细菌裂解缓冲液)中。

4.转移到微珠搅拌管(紫色盖子-基质裂解E管)。以50o/s微珠搅拌3分钟。

5.以最大速度(～20000xg)离心1分钟。

6.将2x200μl澄清上清液转移到装有20μl蛋白酶K的新管中。

7.短暂涡旋，并在65℃、1000rpm下孵育5分钟。

8.DNA提取。

使用qPCR测定与16S qPCR测定一起来监测人类DNA消耗，以观察细菌损失/增益(40qPCR循环)：

结论：将皂苷和核酸酶步骤组合在一起(保留核酸酶的高盐缓冲液)在没有细菌DNA损失的情况下，产生同等水平的宿主DNA消耗。因此，这种流水线式组合(一步)方法是可重复的，并且样品利用ONT Flongle(RTM)平台进行测序。

实施例2-一步式方案(痰涎)，然后进行纳米孔测序

在临床宏基因组学中使用一步/一锅宿主DNA消耗方法(实施例1)将需要下游DNA测序。因此，使用该方法(实施例1)处理新鲜临床痰涎样品并使用来自Oxford NanoporeTechnologies(ONT)(RTM)的Flongle测序平台进行测序。

使用qPCR测定与16S qPCR测定一起来再次监测人类DNA消耗，以观察细菌损失/增益(40qPCR循环)：

在测序后2小时内识别了病原体铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，并且其在分类读数中占主导地位：

总读数：51000

分类的：47703

未分类的：3297

人类：289(分类读数的0.6％)

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)：29612(分类读数的62.1％)

结论：

我们开发了一种快速的一步/一锅宿主DNA消耗方法(～13分钟)，能够在没有细菌损失的情况下消耗痰涎～10³倍的宿主DNA。这可应用于使用PCR或测序(临床宏基因组学)有效诊断人类/动物样品中的病原体。

实施例3-一步式方案(血液)

在掺有大肠杆菌(E.coli)(最常见的败血症病原体之一)的血液中测试该一步式方案。对于血液中的所有实验，使用qPCR通过特定的水解探针测定(单拷贝基因靶标；分别为RNA聚合酶II和cyaA)对人类和大肠杆菌的核酸进行定量。

1.向200μl的血液中加入40μl的1％皂苷(细节如上)、200μl的HLSAN缓冲液(在分子水中：5.5M NaCl和100mM MgCl₂)以及10μl的HLSAN DNase(细节如上)，通过吸取充分混合，并在37℃、1000rpm下孵育10分钟。

2.加入1ml的PBS，并以12000xg离心3分钟。

5.以最大速度(～20000xg)离心1分钟。

6.将2x200μl澄清上清液转移到装有20μl蛋白酶K的新管中。

7.短暂涡旋，并在65℃、1000rpm下孵育5分钟。

8.DNA提取。

下表中示出了来自qPCR(40次循环)的结果：

结论：使用皂苷的快速一步/一锅宿主DNA消耗方法能够在没有细菌损失的情况下在血液中消耗～10⁵倍的宿主DNA。

实施例4-一步式方案(痰涎)，其中改变盐

在痰涎样品中重复一步式方案，其中变化HLSAN缓冲液中的盐：

1.向200μl的痰涎中加入40μl的1％皂苷、200μl的HLSAN缓冲液(在分子水中：1～4M KCl和100mM MgCl₂；或者在分子水中：1～5M(NH₄)₂SO₄和100mM MgCl₂)以及10μl的HLSANDNase，通过吸取充分混合，并在37℃、1000rpm下孵育10分钟。

2.加入1ml的PBS，并以12000xg离心3分钟。

5.以最大速度(～20000xg)离心1分钟。

6.将2x200μl澄清上清液转移到装有20μl蛋白酶K的新管中。

7.短暂涡旋，并在65℃、1000rpm下孵育5分钟。

8.DNA提取。

使用qPCR测定与16S qPCR测定一起来监测人类DNA消耗，以观察细菌损失/增益：

结论：用KCl代替HL-SAN缓冲液中的NaCl，在一步式方案中在没有细菌损失下产生了同等水平的宿主消耗。在一步式方案中，用硫酸铵代替HL-SAN缓冲液中的NaCl产生了较低水平的宿主消耗，尽管没有细菌损失。

实施例5—一步式方案(痰涎)，其中改变DNase

在痰涎样品中重复一步式方案，其中使用不同的DNase，具体是M-SAN DNase(以27.6U/μl，购自于Arcticzymes[RTM])：

1.向200μl的痰涎中加入40μl的1％皂苷、200μl的M-SAN缓冲液(在分子水中：2x缓冲液，即350mM NaCl和5mM MgCl₂，或者10x缓冲液，即1.75MNaCl和12.5mM MgCl₂)以及10μl的M-SAN DNase，通过吸取充分混合，并在37℃、1000rpm下孵育10分钟。

2.加入1ml的PBS，并以12000xg离心3分钟。

5.以最大速度(～20000xg)离心1分钟。

6.将2x200μl澄清上清液转移到装有20μl蛋白酶K的新管中。

7.短暂涡旋，并在65℃、1000rpm下孵育5分钟。

8.DNA提取。

用不同痰涎样品进行重复:

结论：M-SAN DNase被证明是HL-SAN DNase的合适替代品，至少当在用于M-SANDNase的DNase缓冲液中使用5x推荐盐时，在没有细菌损失下消耗与在缓冲液中使用2x推荐的盐相比，增加6.3Cq(78.8倍)。

另一比较例1-一步式方案(痰涎)其中变化DNase条件(MNase缓冲液中的MNase)

重复一步式方案，但使用在MNase缓冲液(包含CaCl₂和Tris-HCl)中的微球菌核酸酶(MNase)：

1.向200μl的痰涎中加入40μl的1％皂苷、200μl的MNase缓冲液(在分子水中：2x缓冲液，即10mM CaCl₂和100mM Tris-HCl pH 8.0；或者10x缓冲液，即50mM CaCl₂和500mMTris-HCl pH 8.0)以及2μl的MNase(以≥100U/μl，购自于Thermo Scientific[RTM])，通过吸取充分混合，并在37℃、1000rpm下孵育10分钟。

2.加入1ml的PBS，并以12000xg离心3分钟。

4.转移到一个微珠搅拌管(紫色盖子-基质裂解E管)。以50o/s微珠搅拌3分钟。

5.以最大速度(～20000xg)离心1分钟。

6.将2x200μl澄清上清液转移到装有20μl蛋白酶K的新管中。

7.短暂涡旋，并在65℃、1000rpm下孵育5分钟。

8.DNA提取。

结论：使用在CaCl₂和Tris-HCl缓冲液中的MNase代替在NaCl或KCl缓冲液中的HL-SAN DNase导致宿主消耗不足。细菌没有损失。

另一比较例2—一步式方案(痰涎)其中变化DNase条件(在Benzonase缓冲液中的 Benzonase)

重复一步式方案，但使用在Benzonase缓冲液(包含Mg²⁺)中的Benzonase：

1.向200μl的痰涎中加入40μl的1％皂苷、200μl的Benzonase缓冲液(在分子水中：2x缓冲液，即4mM Mg²⁺；或者10x缓冲液，即20mM Mg²⁺)以及2μl的Benzonase(以≥250U/μl，购自于Sigma-Aldrich[RTM])，通过吸取充分混合，并在37℃、1000rpm下孵育10分钟。

2.加入1ml的PBS，并以12000xg离心3分钟。

5.以最大速度(～20000xg)离心1分钟。

6.将2x200μl澄清上清液转移到装有20μl蛋白酶K的新管中。

7.短暂涡旋，并在65℃、1000rpm下孵育5分钟。

8.DNA提取。

结论：使用在Mg²⁺缓冲液中的Benzonase代替NaCl或KCl缓冲液中的HL-SAN DNase导致宿主消耗不足。细菌没有损失。

序列表

<110> 东安格利亚大学企业有限公司

<120> 用于消化样品中核酸的方法

<130> 1711788P/PCT

<150> GB1917101.6

<151> 2019-11-25

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HL-SAN DNase

<400> 1

Ala Pro Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Lys Lys Glu Ala Val Lys Ile

1 5 10 15

Tyr Leu Asp Tyr Pro Thr Glu Phe Tyr Cys Gly Cys Asp Ile Thr Trp

20 25 30

Lys Asn Lys Lys Lys Gly Ile Pro Glu Leu Glu Ser Cys Gly Tyr Gln

35 40 45

Val Arg Lys Gln Glu Lys Arg Ala Ser Arg Ile Glu Trp Glu His Val

50 55 60

Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Arg Gln Cys Trp Gln Lys Gly

65 70 75 80

Gly Arg Lys Asn Cys Thr Arg Asn Asp Lys Gln Phe Lys Ser Met Glu

85 90 95

Ala Asp Leu His Asn Leu Val Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn Gly Asp

100 105 110

Arg Ser Asn Phe Arg Phe Ser Gln Trp Asn Gly Ser Lys Gly Ala Phe

115 120 125

Tyr Gly Gln Cys Ala Phe Lys Val Asp Phe Lys Gly Arg Val Ala Glu

130 135 140

Pro Pro Ala Gln Ser Arg Gly Ala Ile Ala Arg Thr Tyr Leu Tyr Met

145 150 155 160

Asn Asn Glu Tyr Lys Phe Asn Leu Ser Lys Ala Gln Arg Gln Leu Met

165 170 175

Glu Ala Trp Asn Lys Gln Tyr Pro Val Ser Thr Trp Glu Cys Thr Arg

180 185 190

Asp Glu Arg Ile Ala Lys Ile Gln Gly Asn His Asn Gln Phe Val Tyr

195 200 205

Lys Ala Cys Thr Lys

210

<210> 2

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> M-SAN DNase

<400> 2

Ala Pro Ile Ser Phe Ser His Ala Lys Asn Glu Ala Val Lys Ile Tyr

1 5 10 15

Arg Asp His Pro Val Glu Phe Tyr Cys Gly Cys Glu Ile Arg Trp Gln

20 25 30

Gly Lys Lys Gly Ile Pro Asp Leu Glu Ser Cys Gly Tyr Gln Val Arg

35 40 45

Lys Asn Glu Asn Arg Ala Ser Arg Ile Glu Trp Glu His Val Val Pro

50 55 60

Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Leu Gln Cys Trp Gln Gln Gly Gly Arg

65 70 75 80

Lys Asn Cys Thr Arg Thr Ser Pro Glu Phe Asn Gln Met Glu Ala Asp

85 90 95

Leu His Asn Leu Val Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn Gly Asp Arg Ser

100 105 110

Asn Phe Arg Phe Ser Gln Trp Asn Ser Lys Gly Ala Phe Tyr Gly Gln

115 120 125

Cys Ala Phe Lys Val Asp Phe Lys Gly Arg Val Ala Glu Pro Pro Ala

130 135 140

Gln Ser Arg Gly Ala Ile Ala Arg Thr Tyr Leu Tyr Met Ser Glu Gln

145 150 155 160

Tyr Gly Leu Arg Leu Ser Lys Ala Gln Asn Gln Leu Met Gln Ala Trp

165 170 175

Asn Asn Gln Tyr Pro Val Ser Glu Trp Glu Cys Val Arg Asp Gln Lys

180 185 190

Ile Glu Lys Val Gln Asn Ser Asn Arg Phe Val Arg Glu Gln Cys Pro

195 200 205

Asn

Claims

1.一种用于消耗生物样品中宿主核酸的方法，所述样品在先已经从动物宿主中获得，其中所述方法包括：

b)在10℃和50℃之间孵育所述反应混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述DNase是盐活性的DNase。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述DNase是具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的DNase或它们的活性变体。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括：将Mg盐和/或Mn盐加入至所述样品中，其中加入的所述Mg盐和/或Mn盐足以确保所述反应混合物中Mg盐和/或Mn盐的终浓度为至少1.0mM。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述皂苷包括单糖链皂苷。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述皂苷包括皂苷配基，并且优选包括三萜类化合物。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括：从所述反应混合物提取剩余核酸的后续步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，进一步包括：使提取出的核酸经受纯化处理的步骤。

9.根据权利要求7或8所述的方法，进一步包括：对提取出的核酸进行扩增的步骤。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，进一步包括：对提取出的核酸进行核酸扩增测试的步骤，或者优选地，对提取出的核酸进行测序处理的步骤。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述生物样品是痰涎样品或血液样品。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法使得所述样品中初始含有的宿主DNA消耗至少10倍，优选至少10²倍，优选至少5×10²倍，优选至少10³倍，优选至少5×10³倍，优选至少10⁴倍，优选至少5×10⁴倍，最优选至少10⁵倍。

13.一种含皂苷，以及浓度为至少0.2M的NaCl和/或KCl的组合物。

14.根据权利要求13所述的组合物，进一步包含浓度为至少1.0mM的Mg盐和/或Mn盐。

15.根据权利要求13或14所述的组合物，进一步包括DNase，优选其中，所述DNase是盐活性的DNase，更优选其中，所述DNase是具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的DNase或它们的活性变体。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的组合物，进一步包括生物样品，所述样品在先已经从动物宿主中获得，优选其中，所述生物样品是痰涎样品或血液样品。

17.一种试剂盒，包括：i)含浓度为至少0.2M的NaCl和/或KCl的组合物；和ii)含皂苷的组合物。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，进一步包括：iii)含DNase的组合物。

19.一种试剂盒，包括：i)含皂苷和浓度为至少0.2M的NaCl和/或KCl的组合物；和ii)含DNase的组合物。

20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中，所述DNase是盐活性的DNase，优选其中，所述DNase是具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的DNase或它们的活性变体。