RU2659197C2 - Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого - Google Patents
Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого Download PDFInfo
- Publication number
- RU2659197C2 RU2659197C2 RU2016129359A RU2016129359A RU2659197C2 RU 2659197 C2 RU2659197 C2 RU 2659197C2 RU 2016129359 A RU2016129359 A RU 2016129359A RU 2016129359 A RU2016129359 A RU 2016129359A RU 2659197 C2 RU2659197 C2 RU 2659197C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- lung tissue
- mycobacterium tuberculosis
- isolation
- tuberculosis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 title claims abstract description 13
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 title claims abstract description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 14
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims abstract description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 claims description 4
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 abstract description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 6
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 5
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229910020366 ClO 4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241001302239 Mycobacterium tuberculosis complex Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000677647 Proba Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000036981 active tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000004177 elastic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано в лабораторной диагностике туберкулеза легких. Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого заключается в добавлении к образцу ткани легкого, находящемуся в пробирке, содержащей стеклянные шарики, деконтаминирующего лизирующего буфера состава 5 М GuSCN, 100 мМ TRIS HCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, 100 мМ NaCl, 0,5% SDS, с последующими центрифугированием и осаждением спиртом. Изобретение обеспечивает высокую эффективность выделения ДНК, характеризующуюся концентрацией образца в среднем 116,031 нг/мкл, высокое качество выделения ДНК, характеризующееся отношением А260/А280, равным 1,83, и быстроту процесса выделения ДНК. 1 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к медицине и молекулярной биологии, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано в лабораторной диагностике туберкулеза легких.
Возбудителем туберкулеза легких являются различные виды микобактерий из группы Mycobacterium tuberculosis complex. По данным ВОЗ туберкулез остается одной из самых больших угроз здравоохранению в мире: в 2014 году 9,6 миллиона человек заболели туберкулезом и 1,5 миллиона человек умерли от этой болезни [1]. Туберкулез может поражать как легкие, так и другие органы и ткани человека: глаза, кости, кожу, мочеполовую систему, кишечник [2].
Обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в биологических материалах является одним из основных диагностических критериев во фтизиатрии [3]. В настоящее время традиционные микробиологические методы выявления возбудителя по своей эффективности уже не удовлетворяют клиницистов. Быстрый метод бактериоскопии обладает низкой чувствительностью: для обнаружения микобактерий туберкулеза (МВТ) необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 тыс. микробных клеток. Люминесцентная микроскопия увеличивает чувствительность бактериоскопии на 10-30%. Чувствительность бактериологического посева значительно выше - 20-100 МВТ, однако исследование занимает длительное время - один-два месяца. В связи с этим МВТ в нашей стране выявляют в среднем лишь у 50-60% больных активным туберкулезом. Определение устойчивости микобактерий классическими бактериологическими методами занимает 1-2 мес, которые можно считать «потерянными» для больного [4]. В настоящее время разработан ряд методов, позволяющих идентифицировать микобактерию и диагностировать ее лекарственную устойчивость микобактерий с использованием различных молекулярно-генетических подходов, например ПЦР, гибридизация ДНК, секвенирование [1]. Методы идентификации и выявления лекарственной резистентности, основанные на анализе ДНК микобактерий, выполняются в течение нескольких часов, показывают достаточную специфичность и чувствительность. Таким образом, существует насущная необходимость уменьшения их цены, упрощения их выполнения, увеличения их надежности и адаптации к клинико-диагностическим лабораториям фтизиатрических учреждений.
Важным этапом ПЦР диагностики туберкулеза является выделение ДНК изолятов из клинического образца. Для выделения используются: легочные и внелегочные образцы, стул, кровь, моча, сыворотка, бронхоальвеолярный лаваж. Особую трудность представляет собой выделение ДНК Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого, причиной этому является несколько факторов: в основном тест-системы подразумевают добавление лизирующего буфера без гомогенизации, состав лизирующего буфера не известен, сама микобактерия имеет плотную «воскоподобную» оболочку, что требует тщательного подбора состава самого буфера.
Целью данной работы являлось создание методики для выделения ДНК изолятов Mycobacterium tuberculosis ткани легкого (операционный материал), а именно подбор состава деконтаминирующего и лизирующего буфера для выделения ДНК из тканей легкого (операционный материал) с использованием гомогенизатора в специальных пробирках, содержащих стеклянные и керамические шарики.
Аналогом предлагаемого способа является метод выделения ДНК с использованием коммерческого лизирующего буфера «DNAzol® Reagent» (Thermo Fisher Scientific, США), имеющего в своем составе гуанидин [6]. Далее следует преципитация спиртом и растворение полученной ДНК в растворе 8 мМ NaOH. Время выделения ДНК при использовании данного набора незначительно, эффективность выделения геномной ДНК варьирует в зависимости от типа образца: клеток, цельной крови или ткани, состав лизирующего буфера является «коммерческой тайной».
Наиболее близким к заявленному способу – прототипом - является способ выделения ДНК, предложенный Holmes D.S. и Bonner J. [5]. В данной работе лизирующий буфер имеет следующий состав: 7М Urea, 100 мМ Tris HCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, 350 мМ NaCl, 2% SDS. Образец ткани подвергается гомогенизации при добавлении лизирующего буфера, далее следует фенол-хлороформная экстракция с незначительным добавлением изоамилового спирта (фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (ФХИ)=25:24:1), и дальнейшая преципитация спиртом. Данный метод обладает как преимуществами, так и недостатками. К достоинствам метода нужно причислить относительную дешевизну и быстроту выделения ДНК, к недостаткам стоит отнести меньшее количество ДНК, нежели при использовании Протеиназы К, а также наличие стадии фенол-хлороформной экстракции, что требует наличия вытяжного шкафа.
Задачей предлагаемого изобретения является увеличение эффективности выделения ДНК из ткани легкого, быстроты выделения. Особое внимание уделялось наличию доступных реактивов для российских клинических лабораторий.
Способ основан на использовании лизирующего, деконтаминирующего буфера, следующего состава: 5М GuSCN, 100 мМ TRIS HCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, 100 мМ NaCl, 0.5% SDS; а также на использовании специальных пробирок, содержащих стеклянные, керамические шарики, соударение которых с образцом в процессе осцилляции ротора гомогенизатора MagNA (Roche, Швейцария) позволяет быстро и эффективно выделить ДНК, использовать реактивы, коммерчески доступные для клинических лабораторий.
Вначале нами был подобран лизирующий, деконтаминирующий буфер с учетом «воскоподобной» стенки микобактерий, богатой миколовыми кислотами. В качестве хаотропного агента был выбран гуанидин изотиоцианат (5М GuSCN), как более активный в ряду «активности» (эффективности) при экстракции белков из мембран: CCl3COO->SCN->гуанидин>ClO4 ->Br->NO3 ->мочевина [7]. При этом мочевина обладает большим солюбилизирующим действием при 0°C, чем при 25°C. Додецил сульфат натрия относится к анионным поверхностно-активным веществам, обладает бактерицидным действием, разрушая стенки грамотрицательных бактерий, используется для отделения белков от нуклеиновых кислот, солюбилизирует белки. Мы снизили процент SDS в лизирующем буфере до 0.5% для уменьшения новообразования при гомогенизации. В качестве хелатирующего агента была использована этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), предотвращающая воздействие на ДНК клеточных нуклеаз, поскольку связывает необходимые для их работы катионы Mg2+ [8]. Для образования осадка нуклеиновых кислот при преципитации спиртом мы добавляли 100 мМ NaCl.
Ткань легкого (операционный материал) может содержать в себе эпителий, кровеносные сосуды, эластичные волокна, соединительную ткань, потому необходима тщательная гомогенизация образца. В качестве гомогенизатора мы использовали MagNA Lyser (Roche, Швейцария), который в автоматическом режиме гомогенизирует образцы и разрушает клетки, облегчая процесс получения супернатанта, используемого для последующего выделения и очистки нуклеиновых кислот (http://roche-applied-science.ru/producte/vyibor-produkta/proba/pribor-magna-lyser/). В прибор помещаются специальные пробирки («Вектор-Бест», Новосибирск, РФ), содержащие керамические и стеклянные шарики, исследуемый материал и лизирующий буфер. В процессе осцилляции ротора происходит соударение шариков с тканью легкого (операционным материалом) и, как следствие, гомогенизация образца и разрушение клеток. Гомогенизация проходит в специальной герметично закрытой пробирке, благодаря чему предотвращает контакт пользователя с инфицированным материалом, что немаловажно при работе с микроорганизмами 3-4 групп патогенности.
Метод выделения ДНК из тканей легкого заключается в следующем:
1. Поместить в специальные пробирки, содержащие керамические шарики, ткань легкого (операционный материал) массой около 0,25 г; пробирки предварительно подписать нестираемым перманентным маркером.
2. Добавить в пробирки 500 мкл лизирующего буфера (5М GuSCN, 100 мМ TRIS HCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, 100 мМ NaCl, 0.5% SDS);
3. Поместить пробирки в гомогенизатор MagNA (Roche, Швейцария).
4. Установить следующие параметры для гомогенизации: 7000 об/мин, 60 секунд. Включить гомогенизатор.
5. Центрифугировать пробирки на скорости 6000 об/мин 5 минут.
6. Перенести супернатант в чистые, подписанные перманентным маркером 1,5 мл пробирки типа «Eppendorf».
7. Провести преципитацию изопропиловым спиртом из расчета 0.8 V на образец (примерно, 400 мкл), аккуратно перемешать, поставить на 20 минут на - 18°C, в морозилку.
8. Центрифугировать при 13000 об/мин в течение 10 минут.
9. Промыть 500 мкл холодного 75% этилового спирта, после чего центрифугировать 5 минут на 13000 об/мин.
10. Сушить на 37°С в течение 30 мин при раскрытых крышках до исчезновения запаха спирта.
9. Добавить в пробирки 400 мкл 10 mM Tris-HCl, рН 8.0.
10. Поставить в шейкер на 65°С в течение 15 мин при 400 об/мин.
В плане инфекционного контроля все манипуляции проводили с учетом требований СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическим агентами III-IV групп патогенности». Работу с патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности проводили в боксе биологической безопасности II-го класса защиты.
Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически по оптической плотности раствора при длине волны 260 нм в сравнении со стандартным раствором (10 mM Tris-HCl, рН 8.0). Концентрация образцов в среднем составляла 116.031 нг/мкл, при этом отношение А260/А280 в среднем составляло 1.83.
Все выделенные таким способом ДНК были использованы в качестве матриц при постановке ПЦР в режиме «реального времени». В качестве целевого фрагмента был использован фрагмент гена домашнего хозяйства (AIR12776.1), кодирующего ДНК геликазу. Размер целевого фрагмента составлял 91 н.о. При выборе олигонуклеотидных праймеров для ПЦР учитывали следующие требования: (1) олигонуклеотидные праймеры должны фланкировать последовательность AIR12776.1; (2) зонд должен быть комплементарен выбранной последовательности; (3) пары праймеров не должны образовывать праймер-димеры и неспецифичные продукты ПЦР. В результате выбрана пара праймеров и последовательность зонда, обеспечивающие наиболее специфичную и эффективную амплификацию (Таблица 1).
ПЦР в режиме «реального времени» с использованием технологии TaqMan проводили в объеме 20 мкл, содержащем 67 мМ трис-HCl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония, 2,5 мМ MgCl2, 0,01% Твин 20, 0,2 мМ дНТФ, 0,3 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 0,1 мкМ раствор зонда, 5 нг геномной ДНК и 1 ЕД/акт Taq-полимеразы («Fermentas», США). Реакцию проводили на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США) с начальной денатурацией при 96°C в течение 3 мин, далее 49 циклов с денатурацией при 96°C в течение 8 с, отжигом праймеров при 60°C в течение 40 с и последующем съемом флуоресценции на канале HEX (фильтр возбуждения /детекции - 535nm/555nm). В качестве положительного контроля использовали заведомо положительный образец ДНК Mycobacterium tuberculosis (ДНК (+)), в качестве отрицательного контроля использовали воду MillyQ (ДНК (-)). Результат амплификации целевого фрагмента оценивали по графику накопления флуоресценции (рис. 1).
Таким образом, предлагаемый способ, заключающийся в одновременном действии химических и физических факторов, а именно с применением лизирующего, деконтаминирующего буфера следующего состава: 5М GuSCN, 100 мМ TRIS НСl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, 100 мМ NaCl, 0.5% SDS, и с применением пробирок, содержащих керамические и стеклянные шарики, обладает высокой эффективностью выделения ДНК (в среднем 116,031 нг/мкл), качеством выделения (А260/А280 - 1.83), быстротой (процесс выделения ДНК занимает около 2-х часов).
Список литературы
[1] "Report global tuberculosis," 2015.
[2] C.S. Restrepo, R. Katre, and A. Mumbower, "Imaging Manifestations of Thoracic Tuberculosis," Radiol. Clin. North Am., vol. 54, no. 3, pp.453-473, 2016.
[3] У.Г. Бочкарев, "Актуальные вопросы генодиагностики туберкулеза," Иммунопатология, аллергология, инфектология, vol. 1, pp.92-96, 2000.
[4] D. Laurenzo and S.A. Mousa, "Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis and current status of rapid molecular diagnostic testing.," Acta Trop., vol. 119, no. 1, pp.5-10, Jul. 2011.
[5] D.S. Holmes and J. Bonner, "Preparation, molecular weight, base composition, and secondary structure of giant nuclear ribonucleic acid.," Biochemistry, vol. 12, no. 12, pp.2330-8, Jun. 1973.
[6] E.M. Santos, J.F.R. Paula, P.M.C. Motta, M.B. Heinemann, R.C. Leite, J.P.A. Haddad, H.L. Del Puerto, and J.K.P. Reis, "Comparison of three methods of DNA extraction from peripheral blood mononuclear cells and lung fragments of equines.," Genet. Mol. Res., vol. 9, no. 3, pp.1591-8, 2010.
[7] К.Д.P. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, Справочник биохимика. Издательство "Мир," 1991.
[8] В.А. Беликов, Молекулярная биология. Практическое руководство. Издательский центр "Наука," 2013.
Claims (1)
- Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого путем центрифугирования и последующим осаждением спиртом, отличающийся тем, что к образцу, находящемуся в пробирке, содержащей стеклянные шарики, добавляют деконтаминирующий лизирующий буфер следующего состава: 5 М GuSCN, 100 мМ TRIS HCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, 100 мМ NaCl, 0,5% SDS.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016129359A RU2659197C2 (ru) | 2016-07-18 | 2016-07-18 | Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016129359A RU2659197C2 (ru) | 2016-07-18 | 2016-07-18 | Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016129359A RU2016129359A (ru) | 2018-01-23 |
| RU2659197C2 true RU2659197C2 (ru) | 2018-06-28 |
Family
ID=61024037
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016129359A RU2659197C2 (ru) | 2016-07-18 | 2016-07-18 | Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2659197C2 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110964842B (zh) * | 2019-12-31 | 2023-11-03 | 广州金域医学检验集团股份有限公司 | 一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核分枝杆菌的核酸扩增方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5130423A (en) * | 1990-07-13 | 1992-07-14 | Microprobe Corporation | Non-corrosive compositions and methods useful for the extraction of nucleic acids |
| WO1995034574A1 (en) * | 1994-06-16 | 1995-12-21 | Microprobe Corporation | Rapid and sensitive detection of antibiotic-resistant mycobacteria using oligonucleotide probes specific for ribosomal rna precursors |
| WO2006088895A2 (en) * | 2005-02-17 | 2006-08-24 | Istituto Nazionale Per Le Malattie Infettive Irccs Lazzaro Spallanzani | Compositions and methods for detecting pathogen specific nucleic acids in urine |
| US20100184210A1 (en) * | 2006-08-10 | 2010-07-22 | Peter Rossmanith | Method for isolating cells |
-
2016
- 2016-07-18 RU RU2016129359A patent/RU2659197C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5130423A (en) * | 1990-07-13 | 1992-07-14 | Microprobe Corporation | Non-corrosive compositions and methods useful for the extraction of nucleic acids |
| WO1995034574A1 (en) * | 1994-06-16 | 1995-12-21 | Microprobe Corporation | Rapid and sensitive detection of antibiotic-resistant mycobacteria using oligonucleotide probes specific for ribosomal rna precursors |
| WO2006088895A2 (en) * | 2005-02-17 | 2006-08-24 | Istituto Nazionale Per Le Malattie Infettive Irccs Lazzaro Spallanzani | Compositions and methods for detecting pathogen specific nucleic acids in urine |
| US20100184210A1 (en) * | 2006-08-10 | 2010-07-22 | Peter Rossmanith | Method for isolating cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| D.S. HOLMES, et al. Preparation, Molecular Weight, Base Composition, and Secondary Structure of Giant Nuclear Ribonucleic Acid / Biochemistry, 1973, V.12, pp.2330-2338. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016129359A (ru) | 2018-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6793709B2 (ja) | 目的の核酸の特異的な単離方法 | |
| US8652782B2 (en) | Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids | |
| Donoghue et al. | PCR primers that can detect low levels of Mycobacterium leprae DNA | |
| Wastling et al. | Comparison of two gene amplification methods for the detection of Toxoplasma gondii in experimentally infected sheep | |
| ES2617147T3 (es) | Preservación de ácidos nucleicos fetales en plasma materno | |
| US11046949B2 (en) | Method and system for microbial lysis using periodates | |
| EP1992689B1 (en) | Method for extraction of nucleic acid from biological material | |
| US5731150A (en) | IS6110 based molecular detection of mycobacterium tuberculosis | |
| JPWO2009060847A1 (ja) | 核酸増幅用サンプルの調製方法及び調製キット | |
| ES2660762T3 (es) | Métodos y composiciones para lisis química directa | |
| KR20190100315A (ko) | 포괄적인 세포 용해를 위한 조합된 용해 프로토콜 | |
| EP4065708B1 (en) | Method for digesting nucleic acid in a sample | |
| US20230257811A1 (en) | Methods, compositions, and kits for determining the sex of a fetus | |
| US20180016623A1 (en) | Compositions and methods for detecting nucleic acids in sputum | |
| ES2819903T3 (es) | Aislamiento de ácidos nucleicos | |
| RU2659197C2 (ru) | Способ выделения ДНК клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis из ткани легкого | |
| Pannekoek et al. | PCR assessment of Chlamydia trachomatis infection of semen specimens processed for artificial insemination | |
| US20100092980A1 (en) | Reagent for elimination of red blood cells and hemoglobin in a sample | |
| Handayani et al. | Contribution of NRAMP1 gene expression and protein level in pulmonary and latent TB infection in Indonesia | |
| US10106837B1 (en) | Processes for point of care detection of DNA and RNA | |
| JP5377298B2 (ja) | 輸送培地に曝露した組織、細胞、またはウイルスから増幅可能な核酸を取得するための方法および組成物 | |
| Aslanimehr et al. | Frequency of Chlamydia trachomatis in Endocervical Samples of Women Referred to a Gynecology Hospital in Qazvin, Iran | |
| RU2810593C1 (ru) | Способ удаления РНК энтеровируса в биологическом материале с помощью деконтаминационных растворов | |
| Janavi | Effect of Storage Conditions on the PCR-Quality Genomic DNA Extracted from Saliva: Comparison Between Two Sampling Methods | |
| Zaorska et al. | Multiplexed SNP Typing of DNA after Demineralization and Organic Extraction from a Bone |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20180403 |