CN114369640A - 一种快速高效去除动物源性宿主核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种快速高效去除动物源性宿主核酸的方法，该方法包括(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解；(2)去除核酸酶。本发明将宿主细胞裂解和核酸酶降解宿主核酸合并为一步，同时用PBS漂洗来代替蛋白酶K消化步骤，从而避免了对微生物的细胞壁或细胞膜造成损伤而损失微生物核酸。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种快速高效去除动物源性宿主核酸的方法。
背景技术
宏基因组是由Handelsman等1998年提出的，即环境中全部微小生物遗传物质的总和，它包含可培养的和未可培养的微生物总和。近年来随着高通量测序技术的发展，使用高通量测序技术对直接从环境中提取的DNA进行序列测定，从而达到种类鉴定、多样性研究、种群结构分析、进化关系分析等。依赖于高通量测序技术的宏基因组学研究，无需对微生物分离培养，从而避开了将不可培养的微生物丢失问题。
病原微生物作为重要的传染源，由于其种类繁多、遗传模式特殊、传播与变异速率快，经常会造成较大规模的暴发与流行。病原学的诊断对于目标性的治疗、指导用药、避免耐药等方面意义重大。基于宏基因组新一代测序技术(mNGS)不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，能够快速、客观的检测临床样本中的多种病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。
病原样本采样过程中通常无法避免的会带入宿主细胞，比如痰液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液、血液、各类拭纸等通常包含了大量的人源细胞，微生物与宿主细胞的比例从1:0.1-1:1,000,000不等。微生物的基因组平均大小在fg级，而人源细胞的基因组大小为pg级。在一定的测序数据量下，人源基因组的检测reads数可能达到99％以上，而微生物基因组的检测数量不到1％。比如10M或20M reads的测序数据量下，微生物总reads数不到0.1M，这可能造成某些病原微生物的漏检而出现假阴性。如果能够针对性的将人源基因组去除，则可大幅提高微生物检出的reads数，从而提高病原微生物的检出率。
目前市场已有针对动物源性样本的宿主核酸清除专利，比如QIAGEN GMBH公司的PCT/EP2015/058497、MERCK PATENT GMBH公司的PCT/EP2014/002736、Molzym GmbH公司的PCT/B2O1O/OSS628都提供了关于选择性去除人源核酸的方法。
目前现有的去人源核酸专利技术操作步骤一般包括：选择性裂解宿主细胞、核酸酶降解宿主细胞核酸、蛋白酶K消化核酸酶三个步骤，而市场上针对人源核酸进行去除的主要为病原样本。但病原微生物的检测有非常高的时限性要求，并且操作步骤过多，容易引起污染，造成检测结果的假阳性。现有的专利技术的操作步骤较多，时限从40min-1.5h不等，并且还有蛋白酶K消化核酸酶步骤。该步骤不仅耗时，且蛋白酶K消化也会消化微生物细胞壁或者细胞膜上的蛋白，从而使微生物细胞破裂从而造成微生物核酸损失，使检测结果的呈假阴性。
发明内容
本发明提供了一种去除动物源性核酸的方法，该方法将宿主细胞裂解和核酸酶降解宿主核酸合并为一步，同时用PBS(磷酸盐缓冲液)漂洗来代替蛋白酶K消化步骤，从而避免了对微生物的细胞壁或细胞膜造成损伤而损失微生物核酸。本发明提供了一种针对人源或其他动物源性样本的更快速、更简便、特异性更高的宿主核酸清除方法。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
本发明提供了一种将宿主细胞裂解和核酸酶降解核酸合并为一步、使用磷酸盐缓冲液漂洗代替蛋白酶K消化核酸酶的动物源性核酸去除的方案和实验流程。
具体的，本发明的一种快速高效去除动物源性宿主核酸的方法，包括(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解；(2)漂洗核酸酶。
在本发明的一些具体的实施例中，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、1U/ml-1500U/ml核酸酶、0.1％-40％裂解液。
在一些实施例中，所述核酸酶在反应体系中的用量为5U/ml、50U/ml、250U/ml、500U/ml、750U/ml、1000U/ml或1500U/ml。本发明所述的步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解，无需核酸酶buffer。
本发明所述的样品可以按照本领域的常规方法获取。
本发明步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解所用的裂解液为非离子型表面活性剂，包含但不局限于Triton X-100、Triton X-45、Triton X-305、吐温20、吐温80、NP40、皂苷、聚山梨酯20、聚山梨醇酯60、碱木质素中的一种或多种；且非离子型表面活性剂的在反应体系中浓度使用范围为0.1％-40％，优选的为1-25％；在一些实施例中非离子型表面活性剂在反应体系中的浓度可以是1％、3％、5％、9％、10％、20％或30％。所述此处的浓度，对于液体表面活性剂如Triton X-100等表示体积浓度，对于固体表面活性剂如碱木质素等则表示质量浓度。发明人发现，在此优选范围内的非离子型表面活性剂具有最优的选择性裂解效率，且可以保障不对微生物细胞造成损伤，即可以选择性裂解宿主细胞的同时不对微生物细胞造成损伤。当高于该范围，则易造成微生物的损失，低于该范围，则容易造成宿主细胞裂解不充分，从而造成最终的提取产物中宿主核酸残留过高，没有达到去宿主核酸的目的。
本发明步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解中所用的核酸降解酶为非特异性核酸酶，包含但不局限于盐活性核酸酶SAN、沙雷氏菌核酸酶Benzonase、牛胰来源DNaseI或RNase A中的一种或多种；且核酸酶的使用量为1U/ml-1500U/ml，优选为6U/ml-1400U/ml。发明人发现，通过本发明选用的酶的种类和用量可以即很好的实现对宿主核酸清除效率同时避免对下游微生物核酸提取造成损失，此外，宿主细胞裂解和宿主核酸清除合并为一步，通常清除宿主核酸的核酸酶反应效率可能会降低，而本发明通过选择核酸酶的种类和控制核酸酶的量保证了清除效率，如果核酸酶酶量高于本发明的范围，则第二步仅通过磷酸盐缓冲液对核酸酶漂洗容易漂洗不干净，造成的核酸酶残留就会对后续提取微生物核酸造成损失；如果核酸酶酶量低于本发明所述的范围，宿主核酸又清除不干净，这两者之间本发明通过控制核酸酶种类和核酸酶酶量来实现了平衡，使之既可以在一步法进行细胞裂解和核算降解体系中很好的发挥作用，同时后续还可以通过磷酸盐缓冲液无需蛋白酶K进行清除。其中盐活性核酸酶SAN表示降解可在高盐浓度(0.5M NaCl)下进行，可通过市售购买，例如ArcticZymes 70910-202的产品等。
现有技术中宿主细胞裂解和宿主核酸清除合并为一步，通常清除宿主核酸的核酸酶反应效率会降低，因此，现有技术中均为分步进行，以保证核酸酶的反应效率，而本发明的反应体系保证了清除效率，实现将宿主细胞裂解和宿主核酸降解合并为一步来达到宿主核酸去除，且无需核酸酶buffer；且由于反应体系简单，后续仅需要磷酸盐缓冲液进行清洗即可，更好了保护了微生物信息。在一些实施例中，本发明步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解的反应时间为5-60min，优选的为10-40min。
在本发明的一些具体的实施例中，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-1000U/ml核酸酶SAN、0.5％-10％吐温(v/v)；在一些优选的实施例中，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、50U/ml-100U/ml核酸酶SAN、3％-6％吐温(v/v)。
在本发明的一些具体的实施例中，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、300U/ml-1500U/ml沙雷氏菌核酸酶、0.1-0.3g/ml皂苷；在一些优选的实施例中，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、300U/ml-400U/ml沙雷氏菌核酸酶、0.17-0.22g/ml皂苷。
在本发明的一些具体的实施例中，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-100U/ml核酸酶SAN、3％-10％NP40(v/v)；在一些优选的实施例中，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-10U/ml核酸酶SAN、2％-4％NP40(v/v)。
本发明步骤(2)漂洗核酸酶中所用的漂洗液为磷酸盐缓冲液，通过磷酸盐缓冲液漂洗来替代蛋白酶K降解核酸酶可以降低微生物的损失，蛋白酶K在降解核酸酶的同时也会降解微生物细胞膜表面的蛋白，从而造成微生物细胞破裂，微生物的核酸被损失。而本发明选用磷酸盐缓冲液漂洗只会去除蛋白酶K而不会对微生物细胞造成损伤，从而避免了微生物核酸的损失。
在本发明的一些实施例中，磷酸盐缓冲液用量为0.5-2ml，优选1～1.5ml，磷酸盐缓冲液的漂洗次数为1、2、3、4或5次，优选为1或2次。本发明所述的磷酸盐缓冲液的用量和磷酸盐缓冲液漂洗的次数可以最大限度去除核酸酶的同时降低微生物损失。
本领域技术人员知晓，本发明的PBS溶液的配制可依据本领域的多种配方和方法配制，不影响本发明技术效果实现的PBS配方和配制方法都纳入本发明的保护范围。示例性的配方和配制方法如下：
(1)
A液：0.1mol/L磷酸二氢钾：
磷酸二氢钾(KH2PO4，MW136.09)1.361g，加双蒸水至100ml。
B液：0.1mol/L磷酸氢二钠：
酸酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O，MW177.99)1.78g，加双蒸水至100ml。
或者酸酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O，MW358.14)3.58g，加双蒸水至100ml。
| pH | A液(ml) | B液(ml) |
| 5.60 | 9.50 | 0.25 |
| 7.17 | 3.00 | 7.00 |
| 7.38 | 2.00 | 8.00 |
| 7.73 | 1.00 | 9.00 |
根据需要稀释获得实现本发明技术效果所需的PBS。
(2)
母液的配制：
0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml水
0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml水
各种浓度PBS(pH＝7.4)的配制：
先配0.2M PBS(pH＝7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的NaH2PO4，81ml 0.2mol/L的Na2HPO4,即可。
然后只需将0.2M PBS(pH＝7.4)按相应比例适当稀释即可，如：
0.1M PBS(PH＝7.4)：取500ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml即可。
0.01M PBS(PH＝7.4)：取50ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml即可。
0.02M PBS(PH＝7.4)：取100ml 0.2M PB，加水稀释至1000ml即可。
根据需要对上述溶液进行稀释获得与本发明相同效果的PBS即可，且可根据需要加入NaCl或KCl。
本发明的一个方面的一个实施方案，提供一种去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，包括(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解；(2)去除核酸酶。
根据上述实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的步骤中包含使用非离子型表面活性剂作为裂解液，优选的非离子型表面活性剂为Triton X-100、Triton X-45、Triton X-305、吐温20、吐温80、NP40、皂苷、聚山梨酯20、聚山梨醇酯60、碱木质素中的一种或多种。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述的核酸酶为非特异性核酸酶，优选为核酸酶SAN、沙雷氏菌核酸酶Benzonase、牛胰来源DNaseI或RNase A中的一种或多种。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：1U/ml-1500U/ml核酸酶、0.1％-40％的裂解液；优选的，裂解液为1-25％；优选的，核酸酶的使用量为6U/ml-1400U/ml。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：40-70％体积百分比的样品(v/v)、1U/ml-1500U/ml核酸酶、0.1％-40％的裂解液；优选的，裂解液为1-25％；优选的，核酸酶的使用量为6U/ml-1400U/ml。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：5U/ml-1000U/ml核酸酶SAN、0.5％-10％吐温；优选的，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、50U/ml-100U/ml核酸酶SAN、3％-6％吐温。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-1000U/ml核酸酶SAN、0.5％-10％吐温；优选的，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、50U/ml-100U/ml核酸酶SAN、3％-6％吐温。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：300U/ml-1500U/ml沙雷氏菌核酸酶、10％-30％皂苷；优选的，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、300U/ml-400U/ml沙雷氏菌核酸酶、17％-22％皂苷。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、300U/ml-1500U/ml沙雷氏菌核酸酶、10％-30％皂苷；优选的，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、300U/ml-400U/ml沙雷氏菌核酸酶、17％-22％皂苷。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：5U/ml-100U/ml核酸酶SAN、3％-10％NP40；优选的，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-10U/ml核酸酶SAN、2％-4％NP40。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-100U/ml核酸酶SAN、3％-10％NP40；优选的，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-10U/ml核酸酶SAN、2％-4％NP40。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应时间为5-60min，优选的为10-40min。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(2)去除核酸酶中所用的漂洗液为磷酸盐缓冲液。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(2)去除核酸酶中所用的漂洗液为磷酸盐缓冲液，其中所述磷酸盐缓冲液中包含磷酸二氢盐和磷酸氢二盐，所述磷酸二氢盐选自磷酸二氢钾和磷酸二氢钠中的至少一种，所述磷酸氢二盐选自磷酸氢二钠和磷酸氢二钾中的至少一种。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述磷酸二氢盐的在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为0.01mM～5mM，例如0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM；所述磷酸氢二盐在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为0.04mM～20mM，例如0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.04mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述磷酸二氢盐的在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为2mM，所述磷酸氢二盐在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为8mM。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(2)去除核酸酶中所用的漂洗液为磷酸盐缓冲液，其中所述磷酸盐缓冲液中包含氯化钠和/或氯化钾。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述氯化钠在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为10mM～200mM，例如10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、130mM、135mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM；所述氯化钾在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为0.1mM～5mM，例如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、2mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述氯化钠在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为136mM，所述氯化钾在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为2.6mM。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH约为6-8，优选的pH约为7.4。
一种去除动物源性宿主核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上述任一实施方案中的宿主细胞裂解液、核酸酶和磷酸盐缓冲液。
本发明另一方面的一个实施方案，提供一种去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，包括步骤(1)宿主细胞裂解；(2)宿主核酸降解；和(3)去除核酸酶。
根据上述实施方案1所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述宿主细胞裂解步骤中包含使用非离子型表面活性剂作为裂解液，优选的非离子型表面活性剂为Triton X-100、Triton X-45、Triton X-305、吐温20、吐温80、NP40、皂苷、聚山梨酯20、聚山梨醇酯60、碱木质素中的一种或多种。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述宿主核酸降解步骤使用核酸酶对宿主核酸进行降解，优选的核酸酶为非特异性核酸酶，进一步优选为核酸酶SAN、沙雷氏菌核酸酶Benzonase、牛胰来源DNaseI或RNase A中的一种或多种。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，去除核酸酶步骤中所用的漂洗液为磷酸盐缓冲液。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，去除核酸酶步骤中所用的漂洗液为磷酸盐缓冲液，其中所述磷酸盐缓冲液中包含磷酸二氢盐和磷酸氢二盐，所述磷酸二氢盐选自磷酸二氢钾和磷酸二氢钠中的至少一种，所述磷酸氢二盐选自磷酸氢二钠和磷酸氢二钾中的至少一种。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述磷酸二氢盐的在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为0.01mM～5mM，例如0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM；所述磷酸氢二盐在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为0.04mM～20mM，例如0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.04mM、0.9mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述磷酸二氢盐的在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为2mM，所述磷酸氢二盐在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为8mM。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，去除核酸酶步骤中所用的漂洗液为磷酸盐缓冲液，其中所述磷酸盐缓冲液中包含氯化钠和/或氯化钾。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述氯化钠在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为10mM～200mM，例如10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、130mM、135mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM；所述氯化钾在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为0.1mM～5mM，例如0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、2mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述氯化钠在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为136mM，所述氯化钾在磷酸盐缓冲液中的终浓度约为2.6mM。
根据上述任一实施方案所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH约为6-8，优选的pH约为7.4。
一种去除动物源性宿主核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上述任一实施方案中的宿主细胞裂解液、核酸酶和磷酸盐缓冲液。
本发明的有益效果：
本发明所述方法通过步骤(1)选用的裂解剂和核酸酶的种类和用量结合步骤(2)漂洗液的改变实现了快速、高效、特异性高、微生物损失少、操作便捷的动物源性宿主核酸清除的方法，对于提高mNGS技术在临床检测病原微生物的应用来说，在节约测序成本的同时提高了微生物检测的灵敏度。
若无特别说明，本发明的名词具有以下含义：
宏基因组测序(mNGS)：是以特定环境样品中整个微生物群落基因组作为研究对象，无需分离培养，直接提取环境样本的DNA进行高通量测序。
病原微生物：指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，包括朊毒体、寄生虫、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒等。
Reads数：指测序出来的序列数目。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1口腔拭子样本人源核酸去除
1.干净的拭子在口腔中刮取3次后均置于3ml PBS(pH7.4，2mM的KH2PO4、8mM的Na2HPO4、136mM的NaCl、2.6mM的KCl)中浸泡涮洗形成实验样品，投入1ml样本进行本实施例实验；
2.取1ml样本至2ml离心管中，分别加入500μl非离子型表面活性剂溶液(纯水配制)，5μl核酸酶，室温上下颠倒孵育20min(无需核酸酶buffer)。
3.将步骤2中的离心管于高速离心机中10,000×g离心3min，使用移液器小心弃去上清液，剩余约50μl上清以避免造成微生物损失。
4.向步骤3离心管中加入1ml PBS，振荡重悬菌体。
5.将步骤4离心管于高速离心机中10,000×g离心2min。
6.使用移液器小心弃去上清液，剩余约50μl上清以避免造成微生物损失。
对比例1口腔拭子样本人源核酸去除方案
1.将实施例1的样品，投入1ml进行本实施例实验；
2.取1ml样本至2ml离心管中，分别加入500μl非离子型表面活性剂溶液(终浓度为20％皂苷的水溶液)，室温上下颠倒孵育20min。
3.将步骤2中的离心管于高速离心机中10,000×g离心3min，使用移液器小心弃去上清液，剩余约50μl上清以避免造成微生物损失。
4.向步骤3离心管中加入200μl核酸酶buffer(10mM Tris pH7.5(@25℃)、1mMMgCl2、pH7.4的PBS缓冲液、5μl核酸酶(500U沙雷氏菌核酸酶)。
5.振荡重悬菌体，37℃反应30min。
6.于步骤4中加入20μl 20mg/ml蛋白酶K，56℃孵育30min。
实施例2微生物核酸提取
使用Vazyme DC501
Microbial DNA Kit提取剩余的微生物基因组，取1ml实施例1的样本，不进行上述宿主清除步骤直接进行核酸提取作为对比例2，后续微生物核酸提取步骤如下：
1.将实施例1和对比例1的宿主核酸去除的产物和不进行宿主清除的对比例2转移至Lysis Tube中，加入200μl Lysis buffer、40μl Proteinase K、200μl Binding Buffer涡旋混匀，并置于涡旋仪上并以最大转速涡旋10min。
2.将Lysis Tube置于70℃水浴5min。
3.取出Lysis Tube，瞬时离心以消除泡沫，轻轻涡旋混匀，并转移500μl上清液至新的1.5ml离心管中。
4.向步骤3离心管中加入200μl无水乙醇，涡旋混匀。
5.将步骤4的混合液全部转移至FastPure DNA Columns，10,000×g离心1min，弃废液。
6.向FastPure DNA Columns中加入500μl Buffer WA(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，10,000×g离心1min，弃废液。
7.向FastPure DNA Columns中加入600μl Buffer WB(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，17,000×g离心3min，弃废液。
8.将FastPure DNA Columns吸附柱放回收集管中，17,000×g离心1min，以彻底去除FastPure DNA Columns中残留的Buffer WB。
9.将吸附柱转移至新的1.5ml Nuclease-free离心管中，向吸附柱中央部位悬空滴加50μl Nuclease-free H2O，室温放置2-5min，17,000×g离心1min洗脱DNA。
10.弃吸附柱，洗脱产物于-20℃保存。
qPCR定量检测宿主核酸清除效率及微生物损失率
使用人源探针引物及16S rRNA探针引物分别对宿主DNA和微生物DNA进行定量，qPCR试剂为Vazyme Q811。
人源探针引物序列：
正向引物序列(h CYP1A1-F)：5’-CAAATGCAGCTGCGCTCTT-3’
反向引物序列(h CYP1A1-R)：5’-CCCAACCAGACCAGGTAGACA-3’
探针序列(h CYP1A1-P)：5`
6-FAM-TGCTTGAGAGCCCTGAGGCCTAGACTC-3`BHQ1
16S rRNA探针引物序列：
正向引物序列(16S-F)：5’-GCAAACAGGATTAGATACCCTGG-3’
反向引物序列(16S-R)：5’-TTAAACCACATGCTCCACCG-3’
探针序列(16S-P)：5`-6-FAM-CCTGGGGAGTACGGTCGCAAGAT-3`BHQ1
实验结果如下：
结果表明：对比例2不进行宿主清除的样本中，宿主含量高Ct值小，对比例1的蛋白酶K消化法，虽然宿主的Ct值变大，说明宿主被清除，但是微生物的Ct值也变大了，说明该方法的特异性不好，在清除宿主的同时将微生物也损失了。而本申请通过特定的表面活性剂与特定的核酸酶的配比，无需核酸酶buffer，以更加简单的方式提高了宿主的清除效率，同时又特异性的降低了微生物的损失，以更简单的方式实现了二者的更佳的平衡效果，特别是实施例1的方法中，5％吐温搭配100U SAN核酸酶、20％皂苷搭配500U沙雷氏菌核酸酶、3％NP40搭配10U SAN核酸酶，这3个条件对于宿主的清除效率更高且微生物损失更少。
Claims (10)
1.一种去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，包括(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解；(2)去除核酸酶。
2.根据权利要求1所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的步骤中包含使用非离子型表面活性剂作为裂解液，优选的非离子型表面活性剂为Triton X-100、Triton X-45、Triton X-305、吐温20、吐温80、NP40、皂苷、聚山梨酯20、聚山梨醇酯60、碱木质素中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，所述的核酸酶为非特异性核酸酶，优选为核酸酶SAN、沙雷氏菌核酸酶Benzonase、牛胰来源DNaseI或RNaseA中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：40-70％体积百分比的样品(v/v)、1U/ml-1500U/ml核酸酶、0.1％-40％的裂解液；优选的，裂解液为1-25％；优选的，核酸酶的使用量为6U/ml-1400U/ml。
5.根据权利要求1所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-1000U/ml核酸酶SAN、0.5％-10％吐温；优选的，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、50U/ml-100U/ml核酸酶SAN、3％-6％吐温。
6.根据权利要求1所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、300U/ml-1500U/ml沙雷氏菌核酸酶、10％-30％皂苷；优选的，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、300U/ml-400U/ml沙雷氏菌核酸酶、17％-22％皂苷。
7.根据权利要求1所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-100U/ml核酸酶SAN、3％-10％NP40；优选的，反应体系为：40-70％的样品(v/v)、5U/ml-10U/ml核酸酶SAN、2％-4％NP40。
8.根据权利要求1-7任一项所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(1)一步法进行宿主细胞裂解和宿主核酸降解的反应时间为5-60min，优选的为10-40min。
9.根据权利要求1所述的去除动物源性宿主核酸的方法，其特征在于，步骤(2)去除核酸酶中所用的漂洗液为磷酸盐缓冲液。
10.一种去除动物源性宿主核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含前述任一项中所述的宿主细胞裂解液、核酸酶和磷酸盐缓冲液。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117343927A (zh) * | 2023-12-06 | 2024-01-05 | 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 | 一种工程化细胞的核酸提取方法 |
| CN117866038A (zh) * | 2024-03-11 | 2024-04-12 | 北京百力格生物科技有限公司 | 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 |
| CN118421573A (zh) * | 2024-07-02 | 2024-08-02 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080160528A1 (en) * | 2005-03-02 | 2008-07-03 | Lorenz Michael G | Use of Nucleases for Degrading Nucleic Acids in the Presence of Chaotropic Agents and/or Surfactants |
| CN105658806A (zh) * | 2013-10-30 | 2016-06-08 | 默克专利股份公司 | 从复杂样品中分离微生物的方法 |
| CN109072231A (zh) * | 2016-01-08 | 2018-12-21 | 帕特霍奎斯特公司 | 非细胞生物流体中宿主核酸对核酸消化酶的可及性的调节 |
| CN109487345A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-19 | 北京先声医学检验实验室有限公司 | 基于纳米孔测序平台的宏基因组样本建库方法、鉴定方法及试剂盒 |
| CN111471676A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-07-31 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法 |
| WO2021105659A1 (en) * | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Uea Enterprises Limited | Method for digesting nucleic acid in a sample |
-
2022
- 2022-02-17 CN CN202210144784.XA patent/CN114369640B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080160528A1 (en) * | 2005-03-02 | 2008-07-03 | Lorenz Michael G | Use of Nucleases for Degrading Nucleic Acids in the Presence of Chaotropic Agents and/or Surfactants |
| CN105658806A (zh) * | 2013-10-30 | 2016-06-08 | 默克专利股份公司 | 从复杂样品中分离微生物的方法 |
| CN109072231A (zh) * | 2016-01-08 | 2018-12-21 | 帕特霍奎斯特公司 | 非细胞生物流体中宿主核酸对核酸消化酶的可及性的调节 |
| CN109487345A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-19 | 北京先声医学检验实验室有限公司 | 基于纳米孔测序平台的宏基因组样本建库方法、鉴定方法及试剂盒 |
| WO2021105659A1 (en) * | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Uea Enterprises Limited | Method for digesting nucleic acid in a sample |
| CN111471676A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-07-31 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种宏基因组二代测序的建库样本的制备方法 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117343927A (zh) * | 2023-12-06 | 2024-01-05 | 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 | 一种工程化细胞的核酸提取方法 |
| CN117343927B (zh) * | 2023-12-06 | 2024-03-12 | 上海药明巨诺生物医药研发有限公司 | 一种工程化细胞的核酸提取方法 |
| CN117866038A (zh) * | 2024-03-11 | 2024-04-12 | 北京百力格生物科技有限公司 | 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 |
| CN117866038B (zh) * | 2024-03-11 | 2024-05-28 | 北京百力格生物科技有限公司 | 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 |
| CN118421573A (zh) * | 2024-07-02 | 2024-08-02 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺 |
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