CN117587100A - 样本核酸释放组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域,尤其涉及样本核酸释放组合物、试剂盒及其应用。本发明提供了样本核酸释放组合物,包括裂解剂和0.2~16.04mM的蛋白抑制剂;所述裂解剂包括:强碱、非离子表面活性剂和离子表面活性剂。本发明在应用上可提供拭子样本直接加入样本释放剂进行裂解,并将裂解溶液直接复溶冻干试剂扩增,无需将拭子先涮入样本保存液,将样本溶液与释放剂按比例混合后再加入扩增试剂,操作上更加简便。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,尤其涉及样本核酸释放组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
核酸快速诊断技术目前已成为核酸检测的一个发展方向,常见的提升核酸快速诊断的技术方案包括快速提取和快速扩增结合。快速提取方案中分支出一种核酸释放剂技术,基本原理为样本不经过复杂的提纯步骤,直接在化学试剂中被裂解,核酸释放,并用于下游PCR或恒温扩增。该释放剂技术可对简单样本进行快速的样本处理,核酸释放,极大的缩短了现有磁珠法或柱提法近20分钟的样本处理时长,核酸释放剂技术只需要1-5分钟即可完成样本核酸释放。同时对于抑制物含量较少的简单拭子样本,该样本释放处理方法与磁珠法或柱提法得到的结果灵敏度几乎相当。
现用于样本核酸释放剂技术主要包括两种,一种是碱裂解的方式,采用碱溶液裂解细胞或病毒蛋白外壳,通过加入一些特定比例的表面活性剂等组分,减少碱溶液对核酸,尤其是对RNA的降解作用;另一种是使用高浓度的表面活性剂裂解的方式,采用多种非离子型或离子型表面活性剂组分裂解细胞或病毒蛋白外壳,加入胍盐等来抑制样本中大量的RNA酶,以避免RNA的快速降解。
目前市面上产品应用方式基本操作方案为样本采集到保存液,取部分采集后的保存液与释放剂按比例混合,再将混合液加入液体扩增试剂中进行下游反应,上述操作需要几步转管加样,临床使用上仍有不便之处。
例如,第一种方式碱溶液可将样本核酸快速释放,使RNA暴露于RNA酶环境中。虽然部分专利中加入了金属离子螯合剂EDTA等,但作用不明显,仍无法避免RNA被RNA酶的降解作用。若碱添加量较少起不到样本裂解效果,若碱的添加量较多,则对PCR有抑制作用,因此应用上仅可实现样本与释放剂按比例混合裂解,使碱溶液得以稀释,不影响PCR扩增。最大可支持样本与释放剂1:1.2体积混合裂解,加入下游扩增反应体系中不影响后续扩增。此种使用方法操作上需要将样本与释放剂先在离心管中混合核酸释放,再取部分或全部加入扩增试剂反应管中进行PCR反应,同时扩增试剂大多数都为液态试剂,需要提前进行体系构建,也限制了加样量,操作上步骤繁琐。
第二种方式表面活性剂裂解细胞或病毒蛋白外壳较温和,需要一定的时间,因此该方式样本处理时间会较长,此外需要高浓度的表面活性剂才会有显著裂解效果,同时搭配高浓度的胍盐抑制RNA酶,这就会导致高浓度的上述两种组分带入下游扩增体系抑制PCR正常扩增,导致假阴性漏检的结果。虽然一些方案中加入了酶的保护剂和稳定剂,但仍无法达到完全不抑制的程度。释放剂应用上仍需采用将样本与释放剂按比例混合,或直接将采集的拭子样本涮入释放剂中释放样本核酸,取部分或全部核酸释放液加入液体扩增试剂中进行下游扩增,扩增试剂需要提前进行体系构建,也限制了加样量,此种操作步骤与第一种一样繁琐。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了样本核酸释放组合物、试剂盒及其应用。本发明技术方案在应用上可提供拭子样本直接加入样本释放剂进行裂解,并将裂解溶液直接复溶冻干试剂扩增,无需将拭子先涮入样本保存液,将样本溶液与释放剂按比例混合后再加入扩增试剂,操作上更加简便。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了样本核酸释放组合物,包括裂解剂和0.2~16.04mM蛋白抑制剂;
所述裂解剂包括:强碱、非离子表面活性剂和离子表面活性剂。
在本发明的一些实施方案中,上述蛋白抑制剂,包括:0.4mM、8.02mM、8.42mM、10.02mM或16.04mM的厄多司坦;和/或0.2mM、3mM或12mM的TCEP。
在本发明的一些实施方案中,上述蛋白抑制剂,包括:0.6~12.03mM的厄多司坦和/或0.5~10mM的TCEP。
在本发明的一些实施方案中,上述蛋白抑制剂,包括:8.02mM的厄多司坦和/或3mM的TCEP。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述裂解剂包括10~50mM的强碱、0.1~6%(v/v)的非离子表面活性剂、0.002~0.6%(m/v)离子表面活性剂。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述裂解剂包括30~50mM的强碱、0.2~5%(v/v)的非离子表面活性剂、0.005~0.5%(m/v)离子表面活性剂。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述裂解剂包括30mM、40mM、44.6mM或45mM的强碱。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述裂解剂包括0.1%(v/v)、0.2%(v/v)、2%(v/v)、5%(v/v)或6%(v/v)的非离子表面活性剂。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述裂解剂包括0.002%(m/v)、0.005%(m/v)、0.05%(m/v)或0.06%(m/v)的离子表面活性剂。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述裂解剂中所述强碱、所述非离子表面活性剂和所述离子表面活性剂的浓度均为终浓度。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述强碱包括KOH和/或NaOH。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述NaOH的终浓度为30~45mM。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述NaOH的终浓度为30mM、40mM、44.6mM或45mM。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述非离子表面活性剂包括35和/或TritonX-100。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述35也称为L23或聚氧乙烯月桂基醚是一种非离子型表面活性剂,可降低非特定蛋白质的吸附;TritonX-100又名聚乙二醇辛基苯基醚,可穿透细胞膜和核膜,非特异性地溶解细胞膜,溶解蛋白,别名:4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇,t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇,聚乙二醇叔辛基苯醚,线性分子式:t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH,x=9-10)。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述离子表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述蛋白抑制剂包括厄多司坦和/或TCEP。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述厄多司坦又名羧甲司坦,英文名Erdosteine。为一种新型的黏液溶解药,可使痰液的黏滞度显著下降,并显著减少痰液中岩藻糖(黏液糖蛋白的一种标志物)的水平和痰液中大分子的干重。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述TCEP英文名为Tris(2-carboxyethyl)phosphine,中文化学名为三(2-羧乙基)膦。TCEP在不同PH值范围内均可作为一种强还原剂,还原蛋白结构中的二硫键,使蛋白失活。室温下反应时间不超过5分钟。同时TCEP没有难闻的气味,而且在空气中易被氧化。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,还包括:RN A酶抑制剂,所述RNA酶抑制剂包括2~100μg/mL的聚乙烯磺酸钠和/或0.5~3mM的金属离子螯合剂。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述RNA酶抑制剂包括:5~80μg/mL的聚乙烯磺酸钠和/或1.75~3mM的金属离子螯合剂。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述RNA酶抑制剂包括:2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL或100μg/mL的聚乙烯磺酸钠。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述RNA酶抑制剂包括:1.75mM、2mM或3mM的金属离子螯合剂。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述金属离子螯合剂包括:EGTA和/或EDTA。
在本发明的一些实施方案中,上述样本核酸释放组合物中,所述RNA酶抑制剂包括:5~80μg/mL的聚乙烯磺酸钠和1.75~3mM的EGTA。
本发明还提供了上述样本核酸释放组合物在制备核酸提取和/或检测的试剂盒中的应用。
本发明还提供了核酸扩增的方法,以上述样本核酸释放组合物与待测样本混合后,取部分混合液作为核酸模板进行核酸扩增;所述混合不包括与保存液混合的步骤;所述核酸扩增包括PCR或等温扩增。
在本发明的一些实施方案中,上述核酸扩增的方法中,所述保存液包括:细胞保存液、TE缓冲液、生理盐水、UTM保存液、VTM保存液。
本发明还提供了核酸提取和/或检测的试剂盒,包括上述样本核酸释放组合物以及可接受的助剂或载体。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒,所述可接受的助剂包括:扩增剂、防腐剂和/或消泡剂中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒,还包括:缓冲液和/或0.2~5%(v/v)Tween20。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述扩增剂包括:0.5~5%(v/v)的DMSO和1~10%(m/v)的甘露醇。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述扩增剂包括:0.5%(v/v)、2%(v/v)、4%(v/v)或5%(v/v)的DMSO。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述扩增剂包括:1%(m/v)、4%(m/v)、6%(m/v)或10%(m/v)的甘露醇。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述扩增剂包括:2%(v/v)的DMSO和4%(m/v)的甘露醇。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述扩增剂还包括:1~5%(w/v)的海藻糖和0.5~5mg/mL的BSA。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述扩增剂还包括:4~4.7%(w/v)的海藻糖和1.3~2.5mg/mL的BSA。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述扩增剂还包括:4%(w/v)、4.2%(w/v)、4.4%(w/v)、4.5%(w/v)或4.7%(w/v)的海藻糖。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述扩增剂还包括:1.3mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL或2.5mg/mL的BSA。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述防腐剂包括:0.01~0.1%(v/v)NaN3。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述防腐剂包括:0.05%(v/v)NaN3。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述消泡剂包括:0.05~0.5%(v/v)SE-15。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述消泡剂包括:0.3%(v/v)SE-15。
在本发明的一些实施方案中,上述试剂盒中,所述缓冲液包括:5~100mM Tricine缓冲液和/或Hepes缓冲液。
本发明的有益效果包括:
(1)、本发明样本释放剂加入了增强裂解能力的组分,提升样本裂解能力;
(2)、本发明样本释放剂加入了高效RNA酶抑制剂PVSA,避免样本RNA被RNA酶快速降解。
(3)、本发明技术方案在应用上可提供拭子样本直接加入样本释放剂进行裂解,并将裂解溶液直接复溶冻干试剂扩增,无需将拭子先涮入样本保存液,将样本溶液与释放剂按比例混合后再加入扩增试剂,操作上更加简便。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示市面现有技术流程与本发明技术流程比对;其中:左示市面现有技术流程;右示本发明技术流程。
具体实施方式
本发明公开了样本核酸释放组合物、试剂盒及其应用。
应该理解,表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合,除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义,除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”,包括其语法同义语的使用,通常应该被理解为开放性和非限制性的,例如不排除其他未叙述的要素或步骤,除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解,只要本发明仍可操作,步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外,两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用,仅仅打算更好地说明本发明,并且除非提出权利要求,否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外,用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值,此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而,任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此,除非另有明确的说明,应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处,“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。
本发明提供的样本释放剂含有六种不同功能的组分,分别为:
(1)、具有样本裂解功能的10~300mM碱溶液,增强裂解功能的非离子表面活性剂0.2%~5%Brij35、0.2%~5%TritonX-100、离子型表面活性剂0.005%~0.05%SDS,其中碱溶液可以是KOH或NaOH。
(2)、具有RNA酶抑制剂功能的组分,0.5mM~3mM EDTA/EGTA、5μg/mL~80μg/mL聚乙烯磺酸钠PVSA中的一种或几种。
(3)、具有黏蛋白抑制功能的组分:0.6~12.03mM厄多司坦、0.5mM~10mM TCEP。
(4)、具有降低RNA在碱性环境降解功能的组分:0.2%~5%Tween20。
(5)、具有缓冲功能的组分:5mM~100mM Tricine/Hepes缓冲液中的一种。
(6)、具有酶保护、PCR或等温扩增增强组分:0.5%~5%DMSO、1%~10%甘露醇、1%~8%甘油、1%~5%海藻糖、0.5mg/mL~1.5mg/mL BSA、1M~5M甜菜碱。
(7)、具有防腐剂和消泡剂组分:防腐剂0.01%~0.1%NaN3、消泡剂0.05%~0.5%SE-15。
具体应用为:
本发明技术方案的样本释放剂可直接采集拭子样本进行样本裂解核酸释放,将释放后的核酸溶液直接取20-50ul复溶冻干试剂,复溶后的冻干试剂经离心后可直接进行PCR扩增。该冻干试剂可以为qPCR扩增试剂或等温扩增试剂。现有技术需要将拭子提前采集到保存液中,取部分保存液与释放剂按比例混合裂解,裂解后的样本混合液中释放剂组分具有PCR抑制作用,无法直接复溶冻干试剂进行下一步扩增,需要加入液体扩增试剂中进行扩增,以降低释放剂组分的体系终浓度,降低扩增抑制。
本发明技术方案是通过以下几种方法的结合实现的:
①降低碱溶液的浓度,在具有一定裂解效果的浓度下,同时不会对下游PCR起抑制作用的较低浓度,10~50mM碱溶液,其中碱溶液可以是KOH或NaOH。通过添加增强裂解功能的表面活性剂,保证裂解效果,SDS可裂解细胞表面蛋白外壳,但SDS是PCR强抑制剂,而TritonX-100可降低SDS对PCR的抑制作用,实现裂解细胞蛋白外壳,同时不抑制PCR扩增的作用,各组分在释放剂中的添加浓度如上。拭子中含有大量的杂质和黏蛋白,如前面裂解消化不充分,将带入下游扩增中较多的黏蛋白,导致扩增抑制,本技术方案为实现可以裂解后样本直接复溶冻干试剂,即加入更多的裂解样本的操作,在释放剂中加入黏蛋白抑制组分:厄多司坦、TCEP。厄多司坦是用于治疗慢性支气管炎、支气管哮喘等疾病引起的痰液粘稠、咳痰困难患者的祛痰药,是一种粘液溶解剂,可消化粘液蛋白,降低粘液粘稠度,降低黏液对扩增的抑制,同时裂解溶液也更易吸取,不易堵住枪头。体系中加入量为0.6~12.03mM,>12.03mM的厄多司坦的加入也会导致PCR扩增的抑制。TCEP是一种还原剂,其可以通过断裂黏蛋白的二硫键,从而改变粘液流变特性,降低粘液粘稠度。TCEP的添加浓度在0.5~10mM。
②拭子样本中同样含有大量的RNA酶,当样本裂解核酸暴露后极容易被大量的RNA酶降解而降低核酸检出率,为了提升核酸检出率,一是可以通过提高核酸加样量,本技术方案通过裂解的样本核酸直接复溶冻干试剂,以增大加样量提升检测灵敏度。二是可在释放剂中添加RNA酶抑制剂,本技术方案发现一种高效低成本的RNA酶抑制剂PVSA(聚乙烯磺酸钠),但PVSA是PCR的强抑制剂,100μg/mL即可对PCR完全抑制。发明人意外发现极少量的PVSA对RNA酶仍具有抑制作用,当释放剂中加入量为0.5μg/mL~80μg/mL时,可满足样本直接释放剂裂解后复溶冻干试剂的操作,对下游扩增无抑制。同时,释放剂中还加入了EGTA/EDTA,可螯合金属离子,使含金属离子的RNA酶被抑制。
③在以上多种具有PCR抑制的裂解组分复合作用下,对扩增试剂是一大挑战,因此已公开的技术方案应用中,均是将拭子样本采集到保存液中后,与释放剂按比例混合,取一部分或全部加入液体扩增试剂中。其目的是为了降低上述具有一定抑制PCR的组分在扩增体系中的浓度,而本技术方案加入了一定量的PCR增强剂组分以提升对上述组分的耐抑制能力。其中甘油和甘露醇含有大量的多羟基结构,可以竞争抑制样本中大量盐离子对酶和双链DNA链间盐桥结合的破坏,提升试剂的耐高盐抑制物的能力。海藻糖可在扩增酶表面形成保护膜,降低抑制物对酶的损伤,DMSO可提高扩增酶的扩增效率,甜菜碱可提供等温扩增的激活剂。
④通过加入消泡剂降低核酸溶液复溶冻干试剂后所产生的气泡,减少荧光干扰。
本技术方案在应用上实现了拭子样本直接加入释放剂中裂解,拭子样本涮入释放剂的量可为400μL~5mL,裂解后样本随即复溶冻干试剂后即可上机扩增,简化了操作步骤,增加了样本加入量,提升了检测灵敏度。复溶冻干试剂的样本加样量为20~50μL,加样量<20μL将导致扩增体系中样本加入量少而灵敏度降低,加样量>50μL则导致扩增体系中抑制物量较多带来扩增抑制。
冻干试剂是由冻干液体试剂经冻干后得到,冻干液体试剂的量可为5μL~80μL。满足样本直接加入冻干试剂进行扩增的操作流程,样本加样量与冻干试剂量的比值应为1:4~10:1。
所述冻干试剂配方为:冻干试剂配方为棉子糖3%,β-环糊精1%,甘露醇2%,BSA2%,PEG200001.5%。
本发明实施例1~实施例8中,所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1 SDS和TritonX-100结合实现裂解样本的效果。
一定浓度下的SDS与TritonX100混合,可实现既可以裂解又不抑制下游扩增。样本使用沙眼衣原体临床阳性和阴性阴道拭子样本,用1mL无菌水配制一定浓度的SDS和TritonX100混合液,得到释放剂1~28,见表1,以水溶液作为对照。试剂采用自建15μL冻干粉沙眼衣原体PCR扩增试剂,操作方法为取沙眼衣原体临床阳性阴道拭子样本涮入3mL生理盐水中震荡混匀得到阳性样本稀释液,取28例阴性阴道拭子样本分别涮入1mL释放剂1~28中震荡混匀,再将每个释放剂中加入阳性样本稀释液100μL得到模拟真实临床阳性阴道拭子样本,震荡混匀静置1分钟,取25μL加入15μL冻干粉扩增试剂中,复溶后直接在快速扩增仪中进行扩增反应。
结果如表2所示,当释放剂中SDS浓度在0.005%-0.05%时,同时Triton X100浓度在0.2%~5%时,具有不同程度的样本裂解效果,同时可以减弱SDS对PCR扩增的抑制作用。
表1
表2 SDS和TritonX100提升样本裂解效果检测
实施例2SDS和TritonX-114组合与SDS和TritonX-100组合的裂解效果对比
样本使用沙眼衣原体临床阳性和阴性阴道拭子样本,用1mL无菌水配制一定浓度的SDS和TritonX114混合液,SDS和TritonX100混合液。试剂采用自建15μL冻干粉沙眼衣原体PCR扩增试剂,操作方法为取沙眼衣原体临床阳性阴道拭子样本涮入3mL生理盐水中震荡混匀得到阳性样本稀释液,取6例阴性阴道拭子样本分别涮入1mL释放剂中震荡混匀,再将每个释放剂中加入不同阳性样本稀释液100μL得到模拟真实临床阳性阴道拭子样本1-样本6,震荡混匀静置1分钟,取25μL加入15μL冻干扩增试剂中,复溶后直接在快速扩增仪中进行扩增反应。
结果如表4所示,当释放剂中SDS和TritonX114组合时,释放剂对样本的裂解效果减弱,较SDS和TritonX100组合时扩增Ct值延后2-3个,表明SDS和TritonX100组合时具有更强的样本裂解能力。
表3
表4 SDS和TritonX100与SDS和TritonX114样本裂解对比检测
实施例3不同浓度Brij35提升样本裂解能力检测。
使用沙眼衣原体临床阳性和阴性阴道拭子样本,用1mL无菌水配制0.1-6%终浓度的Brij35,得到释放剂29~34,以水溶液作为对照。试剂采用自建15μL冻干粉沙眼衣原体PCR扩增试剂,操作方法为取沙眼衣原体临床阳性阴道拭子样本涮入3mL生理盐水中震荡混匀得到阳性样本稀释液,取6例阴性阴道拭子样本分别涮入1mL释放剂29~34中震荡混匀,再将每个释放剂中加入阳性样本稀释液100μL得到模拟真实临床阳性阴道拭子样本,震荡混匀静置1分钟,取20μL加入15μL冻干扩增试剂中,复溶后直接在快速扩增仪中进行扩增反应。
结果如表6所示,当释放剂中Brij35浓度在0.2%-5%时,扩增Ct值均较对照水中样本提前,表明具有不同程度的样本裂解效果,可提升释放样本核酸的能力。
表5
表6不同浓度Brij35提升样本裂解能力检测
Brij35 | Ct-重复1 | Ct-重复2 | Ct-重复3 | Ct-均值 | |
水 | 0% | 36.9 | 36.8 | 36.5 | 36.7 |
释放剂29 | 0.10% | 36.4 | 36.9 | 36.5 | 36.6 |
释放剂30 | 0.20% | 35.4 | 35.2 | 35.8 | 35.5 |
释放剂31 | 1.00% | 33.1 | 34.5 | 34.3 | 34.0 |
释放剂32 | 3.00% | 32.5 | 33.3 | 33.6 | 33.1 |
释放剂33 | 5.00% | 34.6 | 35.7 | 35.4 | 35.2 |
释放剂34 | 6.00% | 35.9 | 36.6 | 36.3 | 36.3 |
阴性质控 | / | 无Ct | 无Ct | 无Ct | 无Ct |
阳性质控 | / | 27.3 | 27.5 | 27.4 | 27.4 |
实施例4 Brij35和Brij58提升样本裂解能力的效果对比。
使用沙眼衣原体临床阳性和阴性阴道拭子样本,用1mL无菌水配制分别含有Brij35和Brij58的释放剂。试剂采用自建15μL冻干粉沙眼衣原体PCR扩增试剂,操作方法为取沙眼衣原体临床阳性阴道拭子样本涮入3mL生理盐水中震荡混匀得到阳性样本稀释液,取6例阴性阴道拭子样本分别涮入1mL两种释放剂震荡混匀,再将每个释放剂中加入不同阳性样本稀释液100μL得到模拟真实临床阳性阴道拭子样本1~样本6,震荡混匀静置1分钟,取20μL加入15μL冻干扩增试剂中,复溶后直接在快速扩增仪中进行扩增反应。
结果如表8所示,释放剂中添加Brij35较释放剂中添加Brij58,扩增Ct值更提前,表明Brij35具有更强的提升样本裂解的能力。
表7
表8 Brij35与Brij58对提升样本裂解效果对比检测
实施例5不同浓度PVSA的RNA酶抑制效果对比。
样本使用新冠咽拭子样本,含不同浓度的PVSA的释放剂35~44,见表9。试剂采用自建15μL冻干粉新冠PCR扩增试剂,操作方法为新冠阳性咽拭子样本涮入3mL生理盐水中震荡混匀得到阳性样本稀释液,取11例阴性咽拭子样本分别涮入1mL释放剂35~44中震荡混匀,再将每个释放剂中加入阳性样本稀释液100μL得到模拟临床阳性咽拭子样本,震荡混匀室温静置2小时,以静置1min为对照组,取20μL加入15μL冻干扩增试剂中,复溶后直接在快速扩增仪中进行扩增反应。
结果如表10所示,结果当释放剂中不添加PVSA时,静置2小时后样本中大量的RNA酶将RNA降解,随着PVSA添加浓度的提高,RNA酶被抑制,扩增Ct与静置1min对照比趋于接近,当PVSA添加量>80μg/mL时,会带来扩增抑制,因此释放剂中一定浓度PVSA具有RNA酶抑制效果,最适添加浓度范围为5μg/mL~80μg/mL。
表9
表10不同浓度PVSA的RNA酶抑制效果对比
实施例6厄多司坦和TCEP对释放剂提升耐受黏液样本的检测。
样本使用新冠鼻拭子样本,释放剂中分别添加不同浓度的厄多司坦和TCEP,得到释放剂45~52。试剂采用自建10μL冻干粉新冠PCR扩增试剂,操作方法采集新冠阳性鼻拭子样本涮入3mL生理盐水中,震荡混匀得到阳性样本稀释液,取1mL释放剂2支,分别涮入1个阴性鼻拭子和2个阴性鼻拭子,震荡混匀,再分别加入阳性样本稀释液100μL得到模拟临床不同黏液浓度的阳性鼻拭子样本,震荡混匀静置1min,取20μL加入10μL冻干扩增试剂中,复溶后直接在快速扩增仪中进行扩增反应。
结果如表12所示,结果当释放剂中含有8.02mM厄多司坦时,可提高试剂对黏液样本耐受能力,当释放剂中含有3mM TCEP时,可提高试剂对黏液样本耐受能力。当叠加添加入释放剂中时,较分别单独添加效果一致,无法带来更强的耐受黏液样本能力。
表11
表12厄多司坦和TCEP对释放剂提升耐受黏液样本的检测
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实施例7DMSO和甘露醇提升扩增试剂耐盐离子能力检测。
样本使用沙眼衣原体阴道拭子样本核酸溶液,25μL冻干扩增试剂中分别添加不同浓度的DMSO和甘露醇,核酸溶液中额外添加等量的20μL扩增体系终浓度为30mM、60mM、100mM的NaCl溶液,取20μL加入25μL冻干扩增试剂中,复溶后直接在快速扩增仪中进行扩增反应。
结果如表14所示,结果显示当扩增体系中分别添加0.5%~5%DMSO、1%~10%甘露醇时,可提高扩增试剂对NaCl盐溶液的耐受度,当溶液中同时添加2%DMSO和4%甘露醇时,较对照不添加DMSO和甘露醇比,可提升扩增试剂对NaCl盐溶液的耐受度,使扩增试剂由原可耐受30mMNaCl盐溶液提升至耐受60mMNaCl盐溶液(扩增Ct检出为耐受、不检出为不耐受)。
表13
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表14 DMSO和甘露醇提升扩增试剂耐盐离子能力
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实施例8咽拭子样本新冠检测本技术方案与已上市厂家圣湘生物新冠检测试剂盒处理方式及结果对比。
样本使用新冠阳性咽拭子样本6例,阴性咽拭子样本2例。寻找8名志愿者,每人采集咽拭子2支,分别随机将2支咽拭子涮入圣湘生物保存液、本技术方案1mL释放剂中,得到8支上市试剂盒保存液采集液、8支本方案释放剂采集液。分别向上述两种8支采集液中加入6例新冠阳性咽拭子溶液50μL、2例新冠阴性样本50μL。按各自说明书操作流程进行后续检测,上市试剂盒与本方案操作步骤对比见表8。本方案释放剂53各组分浓度见表16。本方案样本加样量为20μL,冻干试剂量为20μL,样本量与试剂量比例为1:1。
结果显示,本方案采用的操作步骤仅有3步,释放剂裂解咽拭子样本后,复溶冻干球试剂,上机扩增,减少了上市试剂盒需要将咽拭子涮入保存液并与释放剂混合裂解以及扩增试剂配液的过程,操作上更加便捷。
根据表17结果显示,本技术方案与上市试剂盒新冠样本检测的阴阳性符合率为100%。本技术方案与上市厂家扩增Ct值在中值样本差异在1个Ct以内,低值样本本技术方案因为加样本量更多,Ct值较上市厂家提前1个以上,阳性样本6上市厂家复孔间有漏检,本方案全检出。表明本方案具有操作更简便,检测灵敏度更高的优势。
表15上市试剂盒与本方案操作步骤比较
表16释放剂53组分
释放剂53 | 浓度 |
NaOH | 44.6mM |
Brij35 | 4.33% |
SDS | 0.03% |
TritonX100 | 5.00% |
EGTA | 1.75mM |
PVSA | 43μg/mL |
厄多司坦 | 11.23mM |
HEPES | 35mM |
DMSO | 4% |
海藻糖 | 4.4% |
BSA | 1.3mg/mL |
SE-15 | 0.30% |
NaN3 | 0.05% |
表17咽拭子样本新冠检测本技术方案与上市试剂盒处理方式及结果对比
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.样本核酸释放组合物,其特征在于,包括裂解剂和0.2~16.04mM的蛋白抑制剂;
所述裂解剂包括:强碱、非离子表面活性剂和离子表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的样本核酸释放组合物,其特征在于,所述裂解剂包括10~50mM的强碱、0.1~6%(v/v)的非离子表面活性剂、0.002~0.6%(w/v)的离子表面活性剂。
3.根据权利要求1或2所述的样本核酸释放组合物,其特征在于,所述强碱包括KOH和/或NaOH。
4.根据权利要求1至3任一项所述的样本核酸释放组合物,其特征在于,所述非离子表面活性剂包括35和/或TritonX-100。
5.根据权利要求1至4任一项所述的样本核酸释放组合物,其特征在于,所述离子表面活性剂包括十二烷基硫酸钠。
6.根据权利要求1至5任一项所述的样本核酸释放组合物,其特征在于,所述蛋白抑制剂包括厄多司坦和/或TCEP。
7.根据权利要求1至6任一项所述的样本核酸释放组合物,其特征在于,还包括RNA酶抑制剂,所述RNA酶抑制剂包括2~100μg/mL的聚乙烯磺酸钠和/或0.5~3mM的金属离子螯合剂。
8.根据权利要求1至7任一项所述的样本核酸释放组合物在制备核酸提取和/或检测的试剂盒中的应用。
9.核酸扩增的方法,其特征在于,以如权利要求1至7任一项所述的样本核酸释放组合物与待测样本混合后,取部分混合液作为核酸模板进行核酸扩增;
所述混合不包括与保存液混合的步骤;
所述核酸扩增包括PCR或等温扩增。
10.核酸提取和/或检测的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1至7任一项所述的样本核酸释放组合物以及可接受的助剂或载体。
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