CN110404113A - 一种制备无细胞医用植入材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医用修复材料领域，涉及一种制备无细胞医用植入材料的方法。本发明的制备无细胞材料的方法，既没有使用化学合成的去污剂去细胞，也没有使用蛋白酶类产品；而是采用植物源非离子表面活性剂作为去细胞试剂，避免了化学去污剂、蛋白酶制剂等对ECM立体结构的损坏和导致ECM中有效活性成份的较多流失；采用此方法制得的无细胞医用材料，不仅能较好地维护ECM立体三维结构，并且能让ECM存留较多的有效活性成份，以及较好的力学性能，因而诱导宿主细胞趋化和分化的能力更强，促进组织修复再生的效果会更好。

Description

一种制备无细胞医用植入材料的方法

技术领域

本发明涉及一种医用植入材料的制备方法，具体涉及一种制备无细胞医用植入材料的方法。

背景技术

临床上植入性医学生物材料，正从传统的不可吸收材料，向天然、可降解、而且能够主动诱导组织再生的新型生物材料变革；而基于组织工程学原理，以动物组织为原料，去除组织中的细胞，保留较完整的细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)，以此为原料制备的去细胞医用材料，用于组织修复和再生，是今后外科医学的一个主要发展方向。

去细胞ECM通常具有立体三维结构，并含有各类大分子物质如胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖（包括透明质酸等）、生长因子等多种成分，能为细胞的生存及生长提供适宜的场所和微环境，并能够参与调节各种细胞的生长、表型表达、形状形成、新陈代谢、迁移、增殖和分化，进而调控组织和器官的功能。去除动物组织中的细胞成分，以及其他免疫原性成份，保留其他ECM中的有效成分，能够开发出较理想的无细胞医用材料，行业内称作组织源去细胞医用材料；目前已有不少这类去细胞基质材料，在硬膜损伤、腹壁修复、烧伤、盆底修复、肌腱修复、神经修复等领域成功进入临床应用。

理想无细胞医用材料应具备下列条件：①具有安全性，无毒性，无感染性。②组织相容性好，无免疫排斥反应。③致密性好，无渗透性。④具有韧性，易牢固缝合。⑤能促使组织再生，不发生粘连。⑥使用方便，手术简单，易于消毒灭菌。⑦取材广泛，价格低廉。⑧具有稳定的生物学惰性的，不引起急慢性炎症反应。

目前应用较多的无细胞医用材料，主要是异种去细胞基质，这类医用材料，也称为组织去细胞材料，其初始原料主要来源于猪、牛、羊、马等哺乳动物的小肠粘膜下层、真皮、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜等组织；通过一系列加工处理，包含重要的工艺步骤如去细胞；有的还采用专门的试剂来进一步去DNA，去α-Gal抗原等免疫原成分。这种方法获得的去细胞基质支架（或称为补片），一方面能够保留三维立体结构，同时也含有一些重要活性成份。由去细胞基质制备而成的理想生物去细胞材料，应具有良好的生物适应性，可降解性、可吸收性；力学强度适宜性，无毒性，无免疫性；能够为宿主细胞的趋化、附着、增殖、分化提供理想的空间支架和适宜的微（营养）环境，有利于靶组织的结构修复和功能重建。在临床应用中，以猪小肠粘膜下层(SIS)制成的去细胞材料是目前产业界和学术界双公认的较理想的无细胞医用材料，其次是应用较早也较多的是真皮组织（dermal tissue）源医用材料。

对去细胞医学生物材料而言，去细胞工艺是制备优质生物医用材料中的第一大技术难点。去细胞工艺直接关系到植入体内的生物材料的质量，即生物材料的有效性和安全性。如果去细胞不彻底，则会导致去细胞生物材料仍残留有动物源细胞，则导致具有较强的免疫源性，会引起免疫排斥反应和炎症，如材料植入后易发生桨液肿等不良反应，存在一定的安全隐患；另一方面，如果为了充分保证将从组织中的细胞彻底去除干净，往往会使用去细胞作用方式较猛烈的试剂，或者是长时间地将去细胞液与组织反复作用（如浸泡、振荡、灌注等），这样会导致不同程度地影响ECM天然的三维结构稳定性，破坏ECM中的各类生长因子的功能结构域(如成纤细细胞生长因子、转化生长因子，血管内皮生长因子等)，同时还会引起活性成份（如透明质酸HA等）的损耗和流失。

良好的去细胞工艺，就是要尽量去除动物源组织中各类细胞，同时又要维护完整的ECM三维多孔结构，以及尽可能保留ECM中能促进组织再生的各类细胞生长因子和有效成份的活性；因此这不仅需要考虑动物源组织本身的内在因素，如组织的厚薄和细胞密度的多少，更重要的是，要事先充分了解各类去细胞试剂与方法的优缺点，在精通熟悉每种去细胞试剂的主要技术参数的基础上，综合比较与平衡，科学合理选择，精心优化去细胞方案。

现有技术中的去细胞方法主要有：物理方法、化学方法和消化酶法，实际应用中会将几种方法组合或联合使用：

1)物理法去细胞：包括搅拌震荡、反复冻融、超声波处理、高压或超高压、灌注等；

2)化学法去细胞：需要用到去污剂（也称除垢剂或表面活性剂）、酸性或碱性溶剂；

3)消化酶法去细胞：如使用胰蛋白酶、中性蛋白酶等来进行去细胞处理。

在制备去细胞生物材料过程中，最重要的一步就是如何有效去细胞，现有在制备材料中的去细胞方法的专利文献有：

赵子建申请号201811545271.X的专利，名称为一种去细胞血管基质及其制备方法；方法是将血管组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得血管基质。

赵博申请号为201710126703.2的专利，名称为一种生物组织基质材料、制备方法及其用途，其方法中使用的去细胞液包括胰蛋白酶和PBS溶液，同时去细胞液还包括EDTA、EDTA 2Na或EDTA 4Na；在多频超声环境中用去细胞液处理进行去细胞。

李花琼申请号为201810140944.7的专利，名称为一种骨材料去细胞的方法及制备去细胞骨粉的方法；其方法为经过Tris Hcl溶液孵化、胰蛋白酶溶液作用、含有十二烷基硫酸钠（SDS）的Tris Hcl溶液孵化、含有乙二胺四乙酸及蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液清洗、含有十二烷基硫酸钠的Tris Hcl溶液孵化、酶解、PBS缓冲液清洗等步骤。

王文加申请号为201710864637.9的专利，名称为一种真皮深层填充物及其制备方法和应用，其方法包括以下步骤：以分娩后的羊膜为原料，经胰蛋白酶联合Triton X 100去细胞处理后，再在液氮冷冻条件下，用高速研磨仪研磨成颗粒碎片，钴60辐照消毒，得到羊膜颗粒；将脐带间充质干细胞接种于羊膜颗粒上，联合培养8～10h，得到干细胞 羊膜颗粒混合物，再取离体的血液样品，制备富含血小板的血浆，即PRP；临用前，向干细胞 羊膜颗粒混合物中加入PRP，得到PRP 干细胞 羊膜颗粒三者混合物，即真皮深层填充物。

杨帅申请号为201710247775.2的专利，名称为一种医用去细胞真皮基质及其制备方法，制备方法包括将动物皮肤去肉后，依次进行消毒、清洗、高渗盐处理后，放入碱液和过氧化氢的混合溶液中浸泡；然后再浸泡在胰蛋白酶溶液中进行酶消化处理，再使用交联剂进行胶原蛋白的交联处理。

孙新君申请号为200310110871.0的专利，名称为一种异种去细胞骨基质材料及制备方法，其方法将猪的肋骨或四肢骨经过理化处理、并经过优选的几种蛋白水解酶之一联合Triton-X100作用后去去细胞及组织中的异种蛋白。

非专利文献有：Xiaofeng Ye等在2016年发表的文章“Impact ofdecellularization on porcine myocardium as scaffold for tissue engineeredheart tissue”；该文献报道中，采用胰蛋白酶试剂来去除组织中的细胞，胰蛋白酶是从牛、羊、猪的胰脏中提取的一种丝氨酸蛋白水解酶，是一种肽链内切酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断,即主要识别精氨酸和赖氨酸相邻的肽链，并针对此位点水解切分成独立的小肽链；胰蛋白酶对蛋白质的消化降解作用，不受蛋白质的品种类型和来源所限，对蛋白质本身不具有针对性和选择性，胰蛋白酶对各类蛋白质上的相应酶切位点具有普适性；因此在使用胰蛋白酶去细胞时，不可避免地会降解破坏组织中的胶原蛋白、弹性蛋白，粘蛋白以及其他蛋白类成份如纤连蛋白和层连蛋白等，正是由于胰蛋白酶对细胞外基质中的结构蛋白和功能蛋白有一定的降解和破坏作用，所以胰蛋白酶在去细胞的过程中，应该慎用、少用或者不用。

与去污剂比较而言，胰蛋白酶去除细胞的效果也相对较缓慢，同时对细胞外基质中的胶原蛋白和弹力蛋白有着更大的破坏性，即造成对细胞外基质超微结构的破坏，从而直接导致ECM机械性能的下降。

使用胰蛋白酶来去细胞，与浓度高低、作用时间长短密切相关；宜采用低浓度、短时间作用，但这样去细胞的效果又很不理想；如对于较薄但是组织密度较高的组织，比如心脏瓣膜的去细胞，则需要采用较高浓度的胰蛋白酶，且需要长时间地作用，才能有效且彻底地去细胞。有文献报道，相对于胰蛋白酶，中性蛋白酶的去细胞程度更高，但同时也伴随着对ECM超微结构更高程度的破坏；蛋白酶类去细胞试剂，通常只能有效的去除组织表面的细胞，而对于较厚组织内部的细胞，单纯使用消化酶是很难去干净的，基本是做不到的；需要配合其他方法一起使用。

在制备去细胞生物补片过程中，去除组织中细胞所使用的试剂，除了消化酶制剂，有机溶剂和酸碱之外，使用的表面活性剂类（即去污剂类）试剂，有如下几种：

1)Triton X-100，-200，化学名称，聚乙二醇辛基苯基醚，是一种化工合成的去污剂；2)SDS，化学名称十二烷基硫酸钠，也是一种常用的离子型去垢剂，HLB为40，属于亲水基表面活性剂；可使细胞膜崩解，但其能与膜蛋白疏水部分结合，并使其与膜分离，但SDS低浓度会限制组织中对细胞的去除效率；较高浓度的SDS还可以破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键，造成对组织ECM三维多孔结构的破坏，及对蛋白质类成份构象的损伤。

Triton X和SDS都是化工合成的去污剂，这类去细胞方法具有一定的优势，但由于是化工合成产品，活性强或较强，可能存在残留的试剂对宿主细胞的长入有不良/副面影响；同时在去细胞过程中，会不同程度对各类功能性生长因子（活性功能蛋白质类成份）以及ECM三维立体结构有所破坏，并导致有效成份丧失活性或流失；有的处理方法会导致基质的生物力学强度减弱；有的虽然也是温和型表面活性剂，但都是采用化工方法合成的，难免存在化学试剂残留，安全性存在一定的隐患。

前述Xiaofeng Ye等在2016年发表的文章，其结论明确表明，通过采用扫描电子显微镜(Scanning Electronic Microscopy，SEM)、原子力显微镜(Atomic ForceMicroscope，AFM)和激光扫描显微镜（Laser Scanning Microscopy,LSM）等多种方式比较发现，SDS试剂在组织中去细胞的效果以及后续种子细胞生长的效果方面来看，要明显比胰蛋白酶处理组和Triton X-100处理组的效果要明显地好。

去细胞的试剂和方法已有很多文献报道；有的技术方案要使用多种有机溶剂，有的要使用高强度酸或碱，有的试剂残留过多，有的对细胞外基质成分破坏很严重；有的溶剂残留会对宿主细胞有毒性，从而影响组织修复的效果。

去细胞材料中的有效活性成份含量，因不同去细胞方式（机械法、化学法、酶法）及使用不同的去细胞试剂，在去细胞材料中保留的有效活性成份差异很大；ThomasW.Gilbertetal在杂志《Biomaterials》27(2006)第3677中表1对不同去细胞方法和去细胞试剂做了详细比较。

组织去细胞所使用的试剂及方法比较如下表1

目前在制备各类去细胞生物材料的文献中，有较多的去细胞技术报道，但均有一定的缺陷：

采用各类消化酶（包括微生物源蛋白质酶，植物源蛋白质酶，动物源蛋白酶）作为去细胞试剂，因为其作用的广泛性，选择性和针对性不强，在去细胞的同时，会对ECM结构（包括胶原蛋白）及各类功能性蛋白有较大破坏；有的还需要额外添加酶抑制剂类成份来使蛋白酶反应中止；有的会有试剂残留，较难完全清洗。

采用去污剂TritonX-100、Tween、SDS去细胞，其残留试剂难清洗，对ECM结构破坏较大。

采用NaCl或EDTA高低渗溶液反复作用，去细胞试剂较难清洗，对胶原纤维破坏亦较大。

采用反复冻融及超声方法进行细胞去除，该方法去细胞效果不佳。

采用强酸、强碱或长时间的酸或碱处理等对材料破坏较大，影响ECM材料的完整性完美性。

通常去细胞程度和活性因子保留程度成负相关，在去细胞的同时，不同程度地伴随着活性因子的丢失；一般来讲，生物补片中去细胞越彻底，可能越会导致ECM中有效成份的流失和结构的破坏。

而去细胞试剂，如果处理时间短或者是使用的剂量过小，则会导致细胞成分残留较多，易引起机体免疫排斥反应，并可能伴有局部组织的粘连或组织包裹钙化等不良反应；若去细胞时，使用大剂量试剂，长时间的处理，的确能将细胞除去干净，但同时又会对超微立体结构本身造成损伤；因此，如何较彻底清除细胞和DNA成分，同时尽可能降低对超微立体结构、生物活性成份和力学特性等方面的破坏和损伤，这是当前制备质去细胞基质的研究重点。

为了解决去细胞工艺的技术难题，需要采用一种无副作用或副作用低的去细胞方式，以便制备更安全更高效的去细胞生物补片。

同时伴随而生的另一个技术难题是：由于为了确保生物补片的高度地安全性，通常各生产企业在实际操作中都要求彻底地去细胞，因此去细胞工艺都很苛刻，甚至有点过度，这会不同程度地导致ECM中有效活性成份的较多流失，以及对ECM三维立体结构的破坏；进而削弱去细胞材料的力学性能。

目前有的生物材料在实际应用中，可能正是由于在去细胞过程中，使用的酸、碱或蛋白酶来进行处理，这种处理方式方法对ECM立体结构有损伤，进而导致生物材料在力学性能上有较明显地下降；以至于达不到某些特定部位组织修复所需要的力学强度；例如疝补片，因为正常腹壁负荷力度为19N左右，若补片力学强度偏小，则存在发生撕裂的较大风险；因此在制备这类去细胞生物补片过程中，还需要额外注意去细胞后这类医用生物材料的力学性能；目前有通过额外地交联方式或其他物理方式，如将单层片横向或纵向，多层交叉部分重叠放置来增强力学性能。

发明内容

本发明的目的之一是：在尽可能完全去除细胞的同时，尽可能保留更多的ECM中有效活性成份（如HA），这样有助于诱导宿主细胞的趋化、附着、增殖、以及成熟与分化。

本发明的目的之二是：在尽可能完全去除细胞的同时，尽可能维持ECM三维立体结构的仿真性和完整性，这样有助于受损组织结构的修复再生，以及功能地全面康复。

本发明的目的之三是：去细胞过程中，尽可能避免使用化学合成性试剂，一方面避免这些成份如合成性去污剂所导致的ECM中有效成份较多流失，以及对ECM三维立体结构较多损伤和破坏；另一方面，避免这些化学性试剂可能的残留及对宿主细胞潜在的伤害。

为了有效解决上述技术问题，进一步提高医用生物材料的安全性和有效性；发明人仔细分析研究，现有去细胞试剂和方法所存在的各自优缺点；全面且充分地分析，ECM中有效活性成份的技术特征，和ECM三维立体结构的完整性、仿真性等关键技术特征，通过不断地阅读国内外的专业文章，结合对学术理论的深入研判，采用独特的植物源非离子表面活性剂，作为主要的去细胞试剂，简单且方便地解决了去细胞过程中所遇到的技术难题。

为了达到避免去细胞材料ECM中有效成份（如透明质酸HA）较多流失，减少去细胞过程中对ECM三维立体结构的破坏，以及尽可能保持原有材料的稳定性和力学强度。本发明的制备方法主要创新点就是，在去细胞这一关键步骤中，使用植物源天然试剂，优选使用非离子表面活性剂，来替代化学性或半合成的去污剂；也不使用蛋白质酶来达到去细胞目的；次要创新点是控制在低温条件下去细胞即破坏细胞，这样可以大大减少并减缓，因细胞破碎后释放出来的内源酶可能会产生的对ECM所产生的一些降解、破坏作用。

本发明的创新点，就是在去细胞过程中，使用植物源非离子型表面活性剂，如天然皂素，这类试剂，去细胞方式针对性很强，主要是通过破坏脂质细胞膜和细胞器的膜，去细胞效果不仅彻底，而且作用方式温和，既不对ECM结构有明显损伤，也不会引起ECM中有效活性成份的明显流失，故而能保留ECM中更多的有效活性成份，包括各类细胞生长因子（如FGF-2，VEGF等）和有效活性成份（如透明质酸HA、肝素等），进而更有利于诱导细胞趋化、生长和组织修复再生。

本发明中所述皂素又称皂甙或皂角苷（英文都是Saponins），皂苷是糖苷类的化合物，苷（glycosides）又称配糖体，是由糖和非糖物质结合而成的一类化学成分。皂素的水溶液振摇后可产生持久的蜂窝状泡沫，与肥皂泡沫相似，因而得名。皂素因其糖上含有多羟基极性较大，易溶于水、含水丁醇、乙酸乙酯、热甲醇和乙醇；皂素是天然优质的非离子表面活性剂，具双功能基团，分子结构中既包含水溶性基团，又具有脂溶性基团, 是天然的清洁剂或表面活性剂。皂素能结合细胞膜上的胆固醇及脂类，从而破坏细胞表面结构；另外皂苷有助溶性，可促进其他成分在水中的溶解。

皂甙在植物，特别是在中药材中分布非常广泛（如著名的人参，三七等主要活性成份都是皂甙），近些年来，在中药领域，对皂甙的研究不断深入和广泛，例如目前已从人参中分离提纯出十八种人参单体皂甙，如Rb1、Rb2、Rd、Rc、Re、Rg1、Rg2、Rh1，并发现Rg1和Rb1最具药物活性；皂苷化合物，如美国Antigenis公司著名的疫苗佐剂 QS-21，单体分子量为1990。目前已确认皂素具有多种多样的药理活性和生物活性，如抗菌、消炎、双向免疫调节，降低血浆胆固醇，降血压等方面的药理作用; 同时皂素是一种非常好的天然表面活性剂，能降低液体表面张力，因此有人还将其可以作为发泡剂、乳化剂，增味剂和抗氧化剂使用。

皂素根据结合于糖（己糖、戊糖或糖醛酸）上的皂素配基的性质不同，可将它们分为两类：三萜烯皂素(triterpenoidal saponins，C27，三萜通过碳氧键与糖链相连)和类固醇皂素(steroidal saponins，C30，类固醇通过碳氧键与糖链相连) 两大类。

三萜烯皂素是由三萜苷元与糖及其衍生物脱水而成的苷类化合物，其皂甙元为30个碳原子组成的三萜类衍生物，大多数含有COOH基，故又称酸性皂甙。含三萜皂素的植物有人参、三七、柴胡等，也包括来自山茶科植物籽或粕的提取物，茶皂素。三萜皂苷按皂苷元的基本骨架结构可以分为两大类：五环三萜（pentacycli triterpenoids）及四环三萜(tetracyclic triterpenoids)。五环三萜类皂苷和四环三萜类皂苷。五环三萜类皂苷又可分为（1）β-香树脂醇型，（2）α--香树脂醇型，（3）羽扇豆烷型（lupane type）等；四环三萜类皂苷又可分为（1）羊毛脂甾烷型（lanostane type），（2）达玛烷型（dammarane type），（3）葫芦烷型(cucurbitane type)等。

三萜烯皂素可选择源自南美皂树皮的提取物（South American Quillajasaponaria Molina tree, Quillaja Saponins，bark extract），该产品目前广泛应用于医药，化妆品，饮料等，并根据提取物纯度的不同，又有Quil-A（半纯品），以及QS-7，QS-8， QS-21等精制单体纯品（依据在HPLC图谱上出现的先后次序命名）;商业化的皂素产品Quil-A，CAS号8047-15-2，其临界胶束浓度（CMC,Criticalmicelleconcentration）>0.03%，可从多种商业化渠道购得，包括Sigma公司，BerghausenCorporation，SergeantChemical公司(Clifton，NJ)，Superfosa/s(Vedbaek，Denmark)，以及BrenntagBiosector(Frederikssund，Denmark)；Quil-A理化特性可参见Superfos的题为PurifiedSaponinAdjuvantQuil-A的商业出版物。

而国内价廉物美的三萜烯皂素是油茶皂素（TeaSaponin），从山茶油加工副产品茶粕中通过精制提取而成；90%以上茶皂素（HPLC级纯度）容易制备和获得，如金德国的发明专利，申请号为CN201610990197，名称是：一种高纯茶皂素的生产方法；另外还可以选择无患子科植物来源的皂素。

类固醇皂素其苷元由27个碳原子组成的类固醇衍生物，其分子结构中不含羧基，呈中性，故类固醇皂苷又称中性皂苷。类固醇皂苷按基本碳架又可分为螺环型（spirostanes）、开环型（furostanes）及其他类型。螺环型主要有螺旋甾烷（spirostane）或其异构体异螺旋甾烷（isospirostane）。含有类固醇皂甙的植物主要有龙舌兰（Yucca）、大豆、穿山龙、绵萆薢、粉萆薢、菝葜、土茯苓、知母等。

三萜皂甙和类固醇皂甙之间的鉴别，主要依据是，在产生泡沫后，滴加酸液或加碱液，观察泡沫高度的变化来判定。通常加酸后，泡沫是不变化的;加碱泡沫变少的就是三萜皂甙（其溶液呈酸性，加碱后发生中和反应）。

在本发明中使用的去细胞试剂，皂素，不仅可以选择三萜皂素或类固醇皂素，而且可以选择两类皂素的混合物作为去细胞试剂；做为去细胞试剂时的用量，以纯皂素（saponin）为有效成分来计算，去细胞的工作浓度为0.05%--1%，优选0.25—0.5%。

另外由于皂素作用的方式是温和的，可能存在与细胞膜脂质结合的部分可逆性；若后续的冲洗液或浸泡液因皂素含量低或无皂素，则可能会使去细胞及其碎片效果降低；所以去细胞后的下一步洗液或泡液中也需要使用含有皂素的溶液；可选择原浓度的皂素溶液进行是可洗或浸泡，以利更彻底地去除细胞及其细胞碎片。

发明原理：

原理一：采用纯天然植物源试剂，如天然植物源的非离子表面活性剂，替代化工合成或半化工合成的去污剂，以及动物源性的去污剂（如去氧胆酸盐）；优选植物源皂素作为去细胞试剂，因为皂素是温和型表面活性剂，主要与细胞膜以及细胞器表面的磷脂类成份牢牢结合，进而彻底破坏细胞表面以及细胞内部各类膜的结构，使细胞瓦解分裂；各类脂质细胞碎片也易与皂素牢牢结合，进而形成大小不一的胶束，这些都是可溶性的油包水或水包油性分子结构，并易被冲洗掉，最终真正达到将组织中各类细胞去除干净的效果。

原理二：植物源试剂，这种天然的、温和型的、非离子表面活性剂，不会与对组织中的胶原蛋白、功能性蛋白（纤连蛋白Fibronectin，FN；层连蛋白Laminin，LN）、各类细胞生长因子（如成纤维细胞生长因子GFG等），糖氨聚糖（GAGs）产生破坏和不良影响；从而在彻底地破坏细胞结构的同时，对ECM结构和其中的各类有效成份没有破坏和损伤，生长因子保留率高，无副作用。

原理三：纯天然的植物源试剂，如天然皂素，其本身以及结合细胞脂质成份后所形成的大分子，都具有良好的可溶性，在水相和油相中都能溶解，在组织中去除细胞后，非常容易冲洗干净，没有残留，安全性非常好。，这些与皂角苷结合的细胞成份，易被冲洗，在ECM材料中几乎没有残留，达到ECM材料中无细胞的目的。

有益效果，与现有技术相比，采用本发明的去细胞试剂及去细胞方法，具有以下优势：

1)一方面不仅去细胞较为彻底，基本达到无细胞状态；同时也不损伤ECM三维立体结构；

2)能保留较完整原有ECM立体结构，保留更多生长因子及活性成份，如HA流失较少；

3)使用的去细胞试剂，极易溶于水，极容易洗净，在组织源生物材料中无残留，不会产生副作用和不良反应；

4)去细胞过程中，不使用胰蛋白酶类等消化酶制剂进行消化作用，也不用任何化工合成的去污剂，安全可靠放心；对ECM三维多孔结构、以及其中的各种细胞生长因子和有效活性成份损伤少；

5)采用本方法制备的各类生物材料，可获得无动物源细胞、无DNA等抗原成份性、无免疫原性、无内毒素、有机溶剂溶剂残留，天然无毒的生物材料；组织修复功能好，无不良副反应（粘连、肿胀）；

6)提供一种更好的去细胞试剂和方法，将组织中的细胞去得更彻底，同时能仍基本保留原ECM结构的机械力学特征和其中的有效活性成份，以便制备更好、更安全的生物材料；

7)本发明的方法，没有使用合成类去污剂，无残留，不具有潜在细胞毒性；

8)本发明的方法，不使用去污剂或酶制剂，作用方式温和且有针对性，不会对ECM立体结构产生明显破坏，不会引起医用成品力学性能下降；

9)本发明的方法，不使用化工类去污剂，作用方式温和且有针对性，不会导致ECM中有效成份较多流失，能保留较多有效活性成份（如透明质酸HA）。

本发明的目的在于，一种制备无细胞医用植入材料的方法；为达到实现本发明的目的，具体是通过以下技术方案来实现的。

所述无细胞医用材料，其原料是源自动物的结缔组织。

进一步的，所选动物为猪、牛、羊、马等。

进一步的，所述无细胞组织的原料包括小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种原料的组合。

进一步的，优选的动物组织原料为猪的小肠粘膜下层和真皮。

进一步地制备无细胞医用植入材料的方法，其步骤可以包括：

1)取材和洗净；

2)预处理：机械刮除其中的非结缔组织，将靶组织冲洗干净，酸浸泡，得到预处理待用原料；

3)预消毒：用含有弱酸和或醇的混合溶液，浸泡原料，进行消毒；再超声清洗；

4)去脂：使用醇溶液，在超声、常温条件下浸泡组织原料，之后用注射用水超声清洗；

5)去细胞：用含植物源表面活性剂溶液，在低温和超声下浸泡组织原料；接着用新的同浓度植物源表面活性剂溶液对去细胞原料进行浸泡;去细胞原料与溶液的比例为1:10（W/V）；再用PBS-EDTA超声清洗去细胞原料，去细胞原料与溶液的比例为1:10（W/V）；按实际情况可重复去细胞1-3次；

6)去DNA和去α-Gal抗原：分别用含DNA酶的溶液和含α-半乳糖苷酶溶液，浸泡原料；

7)将半成品去细胞材料制成所需物理形态，再干燥，包装、灭菌可得成品。

进一步的，在上述去细胞工艺中，优选以下技术参数：

去细胞：使用含天然皂素的溶液，在4-15℃和超声下浸泡组织原料10—60分钟；去细胞原料与溶液的比例为1:10（W/V）；之后用同浓度新鲜皂素溶液对去细胞原料浸泡5--60分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--60分钟；重复去细胞1-3次。

进一步的，在上述去细胞工艺中，优选以下技术参数：

皂素溶液中有效皂素含量为0.05--1%（W/W），去细胞原料与植物源皂素溶液的比例为1:10，在超声条件下，于低温4℃条件下浸泡20--45分钟；然后用同浓度新鲜皂素溶液再对去细胞原料浸泡10--30分钟；接着用PBS-EDTA进行浸泡10--30分钟；重复去细胞1次。

进一步的，在去细胞工艺中，优选以下技术参数：

皂素溶液中有效皂素的含量为0.25--0.5%（（W/W），去细胞原料与植物源皂素溶液的比例为1:10，在超声条件下，于低温4℃条件下浸泡20―45分钟；

进一步的，植物源表面活性剂是指植物源类固醇皂素、三萜烯皂素之一或其组合物；

进一步的，植物源三萜烯皂素是Quil-A来源、茶皂素之一或其组合物；

进一步的，皂素的工作浓度为0.25--0.5%（W/W），注意，不是按商品来计算有效工作浓度。

进一步的，皂素溶液去细胞所需要浸泡作用时间为20--30分钟；作用温度都是4°C。

除非上下文有清楚的说明，本说明书和所附权利要求中用到的单数形式“一个和“该”包括复数含义。因此，例如，“该方法”包括一或多种方法，和/或步骤，它们属于本文所述类型和/或是本领域技术人员阅读了本文后很明显能认识到的。术语“约”或“接近”是指统计学意义上的范围值，范围可以是在一个数量级之内，通常在指定数值或范围的50％以内，进一步指在20％以内，还更通常在10％以内，甚至更通常在5％以内。术语“约”或“接近”所涵盖的能允许的变化取决于研究的具体体系，是本领域技术人员可以很容易地认识到的。

下面结合具体实施例，以进一步描述本发明的原理和方案；应当理解，这些实施例只是为了举例说明和方便理解本发明的思想，但不能局限于此；实施例并非以任何方式来限制本发明范围，以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中使用的公知常识的方法；也可能包括省略了在医学生物材料领域使用的贯用手法和方法；例如将本发明的构思和原理，以及相应的技术方案，运用到其他哺乳动物如羊、牛等中大型养殖动物，也包括用于制备生物补片的原始去细胞的组织部位，如真皮、心包膜、膀胱膜等结缔组织，显而易见地，都应将这些纳入本发明的保护范围之内。

具体实施方式

实施例1 （商品肉猪SIS+0.25%Saponin）

猪小肠粘膜下层无细胞医用材料的制备，具体步骤如下：

1)取材：在屠宰场选取商品肉猪的新鲜小肠作为去细胞原料

2)预处理：使用物理刮除法，除去猪小肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结，分离出粘膜下层，置于0.5%醋酸溶液浸泡30分钟，猪小肠与醋酸溶液的比例为1:5，再使用水浸泡，得到去细胞原料，即小肠粘膜下层，下述简称为SIS材料

3)消毒：使用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合溶液，SIS材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100分钟，进行消毒。之后使用纯化水超声清洗3遍；

4)脱脂：使用浓度为90%的乙醇，SIS原料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡2h；之后使用注射用水超声清洗3遍

5)去细胞：使用含0.25%皂素的溶液（源自Quil-A，以纯皂素含量来计算工作浓度），在4℃和超声条件下浸泡组织原料30分钟；之后用同样浓度0.25%皂素溶液对去细胞原料进行冲洗10分钟；接着再用PBS-EDTA溶液对去细胞材料浸泡20分钟；重复前述去细胞步骤一次，总共计时120分钟左右

6)去DNA和去α-Gal抗原：使用含5U/mlDNA酶的水溶液，SIS材料与DNA酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS冲洗3遍；使用含5U/mlα-半乳糖苷酶的水溶液，SIS材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于30℃条件下浸泡20分钟；之后使用PBS溶液冲洗

7)定型、冻干、灭菌：将去细胞后的片状原料，纵横交叉，重叠固定于模具上，冷冻干燥后，包装，最后进行灭菌。

实施例2 （商品肉猪SIS + 0. 25% SDS）

本实施例中去细胞原料是商品肉猪的小肠组织，制备方法中猪小肠组织的预处理，消毒、脱脂、去细胞、去DNA和去α-Gal抗原、冻干、灭菌等步骤，完全同实施例一；区别只是在去细胞试剂的选择上，本实施例中选用0.25%SDS 替代实施例一中的0. 25%皂素溶液。

实施例3：无细胞医用材料光学观察及有效成份检测。

方法：用福尔马林固定，石蜡包埋，将实施例中的去细胞材料切成薄片，经二甲苯脱蜡、酒精脱水，苏木精—伊红染色，光学显微镜下观察细胞残留情况和基质纤维结构。

结果：二个实施例中获得所有的去细胞医用材料，都没有观察到细胞及其碎片残留；能看到胶原纤维连续，粗细不一，但均无明显地断裂。

对1-2个实施例制备得到的无细胞医用植入材料，采用商业化ELISA法试剂盒对重要活性成份透明质酸（HA）的含量进行检测；产品的预处理方式是采用低温研磨法对各类去细胞材料进行处理，检测结果如下表：

组别	去细胞材料来源及处理方式	透明质酸HA（ug/mg）
			实施例1	商品肉猪SIS + 0.25% 皂素（源自Quil-A）	2.85
实施例2	商品肉猪SIS + 0.25% SDS	0.92

本领域中普通技术人员可根据上述说明，对本发明做出多种简单的变化或调整或组合；因而，在不违反本发明的权利要求宗旨的前提下，实施例中的某些细节，不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。

Claims (10)

1.一种制备无细胞医用植入材料的方法，以动物结缔组织为原料，其特征在于，采用植物源试剂作为主要的去细胞试剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物结缔组织为，小肠粘膜下层、胃粘膜下层、真皮、心包膜、脏器膜、腹膜、膀胱膜中的一种或其组合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物源试剂是指植物源非离子表面活性剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物源试剂是指植物皂素。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物源试剂是指植物源三萜烯皂素、类固醇皂素之一或二者的组合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物源试剂是指Quil-A、茶皂素之一或二者的组合物。

7.根据权利要求1所述的植物源试剂，其特征在于，植物源试剂的有效工作浓度为重量百分比0.05---1%。

8.根据权利要求1所述的植物源试剂，其特征在于，植物源试剂的有效工作浓度为重量百分比0.25—0.5%。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物源试剂去细胞的作用时间为每次10--60分钟，可以重复去细胞1---5次。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物源试剂去细胞的作用温度为4-15℃。