CN103623464A - 一种自体颅骨回植技术的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自体颅骨回植技术的制备方法，将术后取出的自体颅骨通过去污，病菌灭活，去蛋白，脱脂，脱细胞，冻干，灭菌等工艺方法得到的自体颅骨进行回植。优点是保存时间长，取出的自体骨经过加工后外形不会发生变化，回植后无排异现象等优点。

Description

一种自体颅骨回植技术的制备方法

技术领域

本发明涉及一种自体颅骨回植技术的制备方法。

背景技术

骨修复一直就是临床上的难题，尤其是针对神经外科的去骨瓣减压术是治疗患者由于颅脑外伤/脑出血的有效治疗方法，为了达到手术减压的目的，切除的骨瓣不能复原，因此，该手术后引起大多患者颅骨缺损。通常为了减少由于颅骨缺损给患者所带来的副作用，医生建议患者约3个月后回医院进行颅骨缺损的修补。近10年来，临床医生比较认可的颅骨缺损修补材料多为医用钛网，可是钛网也存在着令患者和医生不够满意的缺点，例如：热传导会引起头痛甚至癫痫症状发作，容易变形而影响美观，MRI检查也受到不同程度的影响。

在很多年前也有学者将自体的颅骨埋藏在患者自体的体内(例如大腿内侧、腹部等)，可以几个月后取出来使用的时候出现了自体骨吸收的现象，导致无法修补原来的缺损，当然，将自体的颅骨埋藏在自体的其它部位会出现新的创伤和感染的风险。

本专利的目的在于克服目前颅骨修补材料的副作用和不足，采用脱细胞技术去除颅骨组织中容易变性和坏死的细胞及免疫原组织，保留颅骨本身的骨的无机成分和骨胶原结构，而且通过脱细胞处理后自体颅骨的形状大小不改变，便于进行自体颅骨瓣复位术。由于复原的是患者自己的骨瓣，也避免了免疫排斥反应，因此，对于医生和患者来说都是安全和非常愿意接受的治疗技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种自体颅骨回植技术的制备方法，它是通过术后取出的自体骨为原料，通过脱细胞的制作方法，达到消除骨内的细胞及其抗原性，保留骨的必须成分的目的，具有不用塑形，无排斥反应的特点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种自体颅骨回植技术的制备方法，它包括如下步骤：

(1)去污工艺：采用普通洗涤剂将骨的表面的油污等杂质清洗干净，然后在用蒸馏水冲洗干净，晾干后获得完全的自体颅骨基质。

(2)病毒灭活工艺：在室温条件下，用10g/L过氧乙酸和体积分数24％乙醇组成的过氧乙酸-乙醇混合液，微波震荡浸泡自体颅骨基质4-6小时。

(3)去蛋白工艺：在室温条件下，将自体颅骨基质放入浓度为10～20％的双氧水H₂O₂中微波震荡浸泡48～72小时，然后再用纯化水冲洗干净。

(4)脱酯工艺：用95％的酒精，乙醚，及洗洁净浸泡脱脂和纯化水冲洗，把自体颅骨基质放入离心机脱水后，在常温下自然干燥。

(5)脱细胞工艺：在2～5℃条件下，将上述去酯步骤后获得的骨头基质放入浓度为0.5～1.0％的十二烷基硫酸钠SDS和浓度为0.8～1.2％的蛋白酶抑制剂PMSF的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡24～48小时，然后再用纯化水循环冲洗24～48小时。

在2～5℃条件下，再将自体颅骨基质放入浓度为0.1～0.4％的胰蛋白酶中浸泡12～24小时，然后再用纯化水循环冲洗20～28小时，获得脱细胞基骨。

(6)冻干工艺：将经脱细胞工艺后制备好的自体颅骨，放入冷冻干燥机冻干。

(7)包装、灭菌工艺：在洁净间内封装，采用环氧乙烷或Co⁶⁰进行灭菌。

本发明的一种自体颅骨回植技术的制作方法，在脱脂步骤中，采用了微波持续震荡的方式，可以通过充分的混合，达到更好的去酯效果。

本发明的一种自体颅骨回植技术的制作方法，在脱细胞步骤中，采用了十二烷基硫酸钠SDS和蛋白酶抑制剂PMSF，十二烷基硫酸钠是一种常用的阴离子表面活性剂，具有很强的去污力；它的泡沫很丰富，从感官上也给人很强的去污力；蛋白酶抑制剂本身为固体，需利用丙酮酸进行溶解；在脱细胞的过程中，是采用了低渗的方法使细胞胀破，从而破坏了细胞膜结构，只保留细胞外基质。该方法可以防止细胞在低渗条件下胀破后，释放细胞内蛋白酶类，分解细胞外基质蛋白，因而基本保留了细胞外基质的有机和无机成份，而去除了细胞的成分，在去除细胞膜结构的同时也去除了膜上的抗原成分，减少了抗原性。实现了在完全保留骨的有机成分和无机成分情况下，使细胞完全脱出。

本发明的有益效果是，由于采用了普遍洗涤剂去污蒸馏水冲洗、双氧水H₂O₂去蛋白纯化水冲洗、酒精、乙醚浸泡去酯纯化水循环冲洗、十二烷基硫酸钠SDS、蛋白酶抑制剂PMSF及胰蛋白酶脱细胞纯化水循环冲洗、冷冻干燥、环氧乙烷或Co⁶⁰灭菌等过程来处理自体颅骨，使自体颅骨在完全保留骨的有机成分和无机成分情况下，细胞完全脱出，从而获得了脱细胞基质自体颅骨；该脱细胞基质自体颅骨排斥性几率非常小。植入后对受体的全身及局部免疫无明显影像，具有较好的相容性及骨传导性；该方法具有原料来源丰富、制作成本低，效益明显的优点，与市场同类产品相比更具有竞争力。

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明；但本发明的一种脱细胞基质自体颅骨的制作方法不局限于实施例。

具体实施方式

实施例一，本发明一种自体颅骨回植技术的制备方法，它采用如下步骤制作而成；

(1)去污工艺：采用普通洗涤剂将骨的表面的油污等杂质清洗干净，然后在用蒸馏水冲洗干净，晾干后获得完全的自体颅骨基质。

(2)病毒灭活工艺：在室温条件下，用10g/L过氧乙酸和体积分数24％乙醇组成的过氧乙酸-乙醇混合液，微波震荡浸泡自体颅骨基质4-6小时。

(3)去蛋白工艺：在室温条件下，将自体颅骨基质放入浓度为15％的双氧水H₂O₂中微波震荡浸泡60小时，然后再用纯化水冲洗干净。

(4)脱酯工艺：用95％的酒精，乙醚，及洗洁净浸泡脱脂和纯化水冲洗，把自体颅骨基质放入离心机脱水后，在常温下自然干燥。

(5)脱细胞工艺：在3℃条件下，将上述去酯步骤后获得的骨头基质放入浓度为0.8％的十二烷基硫酸钠SDS和浓度为1.0％的蛋白酶抑制剂PMSF的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡40小时，然后再用纯化水循环冲洗40小时。

在3℃条件下，再将自体颅骨基质放入浓度为0.2％的胰蛋白酶中浸泡20小时，然后再用纯化水循环冲洗25小时，获得脱细胞基骨。

(6)冻干工艺：将经脱细胞工艺后制备好的自体颅骨，放入冷冻干燥机冻干。

(7)包装、灭菌工艺：在洁净间内封装，采用环氧乙烷或Co⁶⁰进行灭菌。

本发明的一种脱细胞基质自体颅骨的制作方法，在病毒工艺中采用过氧乙酸-乙醇混合液有效灭活伪狂犬病毒(PRV)，牛腹泻病毒(BVDV)，猪细小病毒(PPV)有效清楚免疫原；在脱细胞步骤中，采用了十二烷基硫酸钠SDS和蛋白酶抑制剂PMSF，十二烷基硫酸钠是一种常用的阴离子表面活性剂，具有很强的去污力，它的泡沫很丰富，从感官上也给人以很强的去污力；蛋白酶抑制剂本身为固体，需利用丙酮酸进行溶解；在脱细胞的过程中，是采用了低渗的方法使细胞胀破，从而破坏了细胞膜结构，只保留细胞外基质。该方法可以防止细胞在低渗条件下胀破后，释放细胞内蛋白酶类，分解细胞外基质蛋白，因而基本保留了细胞外基质的有机物和无机物，而去除了细胞的成分，在去除细胞结构的同时也去除了膜上的抗原成分，减少了抗原性。实现了在完全保留骨的有机成分和无机成分情况下，减少了抗原性。实现了在完全保留的有机成分和无机成分情况下，使细胞完全脱出。

本发明的一种脱细胞基质自体颅骨的制作方法，在脱细胞过程中要选择低温条件下进行，这样，才能防止在骨头的处理过程中出现骨头腐坏的现象发生。

实施例二，本发明的一种脱细胞基质自体颅骨的制作方法，它采用如下步骤制作而成；

(1)去污工艺：采用普通洗涤剂将骨的表面的油污等杂质清洗干净，然后在用蒸馏水冲洗干净，晾干后获得完全的自体颅骨基质。

(2)病毒灭活工艺：在室温条件下，用10g/L过氧乙酸和体积分数24％乙醇组成的过氧乙酸-乙醇混合液，微波震荡浸泡自体颅骨基质4-6小时。

(3)去蛋白工艺：在室温条件下，将自体颅骨基质放入浓度为18％的双氧水H₂O₂中微波震荡浸泡55小时，然后再用纯化水冲洗干净。

(4)脱酯工艺：用95％的酒精，乙醚，及洗洁净浸泡脱脂和纯化水冲洗，把自体颅骨基质放入离心机脱水后，在常温下自然干燥。

(5)脱细胞工艺：在4℃条件下，将上述去酯步骤后获得的骨头基质放入浓度为1.0％的十二烷基硫酸钠SDS和浓度为1.2％的蛋白酶抑制剂PMSF的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡35小时，然后再用纯化水循环冲洗35小时。

在4℃条件下，再将自体颅骨基质放入浓度为0.4％的胰蛋白酶中浸泡15小时，然后再用纯化水循环冲洗23小时，获得脱细胞基骨。

(6)冻干工艺：将经脱细胞工艺后制备好的自体颅骨，放入冷冻干燥机冻干。

(7)包装、灭菌工艺：在洁净间内封装，采用环氧乙烷或Co⁶⁰进行灭菌。

Claims (1)

1.一种自体颅骨回植技术的制作方法，其特征在于：它包括如下步骤：

(1)去污工艺：采用普通洗涤剂将骨的表面的油污等杂质清洗干净，然后在用蒸馏水冲洗干净，晾干后获得完全的自体颅骨基质。

(2)病毒灭活工艺：在室温条件下，用10g/L过氧乙酸和体积分数24％乙醇组成的过氧乙酸-乙醇混合液，微波震荡浸泡自体颅骨基质4-6小时。

(3)去蛋白工艺：在室温条件下，将自体颅骨基质放入浓度为10～20％的双氧水H₂O₂中微波震荡浸泡48～72小时，然后再用纯化水冲洗干净。

(4)脱酯工艺：用95％的酒精，乙醚，及洗洁净浸泡脱脂和纯化水冲洗，把自体颅骨基质放入离心机脱水后，在常温下自然干燥。

(5)脱细胞工艺：在2～5℃条件下，将上述去酯步骤后获得的骨头基质放入浓度为0.5～1.0％的十二烷基硫酸钠SDS和浓度为0.8～1.2％的蛋白酶抑制剂PMSF的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡24～48小时，然后再用纯化水循环冲洗24～48小时。

在2～5℃条件下，再将自体颅骨基质放入浓度为0.1～0.4％的胰蛋白酶中浸泡12～24小时，然后再用纯化水循环冲洗20～28小时，获得脱细胞基骨。

(6)冻干工艺：将经脱细胞工艺后制备好的自体颅骨，放入冷冻干燥机冻干。

(7)包装、灭菌工艺：在洁净间内封装，采用环氧乙烷或Co⁶⁰进行灭菌。