CN114377206A - 一种脱细胞基质生物材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种脱细胞基质生物材料的制备方法，采用特定的前处理、脱脂、消毒、脱细胞、去α‑Gal抗原以及灭菌的方法相结合，在有效去除动物组织抗原性物质的同时，还能最大限度的保留材料中生物活性成分和结构的完整性，从而获得一种具有低免疫原性、高生物活性的脱细胞基质生物材料。此外，采用本申请的方法制备的脱细胞基质生物材料有效降低了免疫原成分，具有良好的生物相容性和生物安全性，表面有利于细胞粘附、聚集、增殖，其可以作为一种高活性的生物基质材料应用于皮肤软组织缺损、牙龈退缩及牙周软组织的修复。

Description

一种脱细胞基质生物材料的制备方法
技术领域
本申请涉及生物医用材料技术领域，特别是涉及一种脱细胞基质生物材料的制备方法。
背景技术
脱细胞基质生物材料是用适当的方法将组织/器官进行脱细胞处理，去除组织中可能引起排斥反应的细胞及其他抗原分子，保留三维结构和功能蛋白，具有生物诱导功能，可以在体内/体外形成特定的功能化组织，可用于组织损伤修复/重建的一种新型生物材料。目前应用较多的脱细胞生物材料主要是异种去细胞基质，这类天然生物材料的原材料主要来源于动物小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、羊膜、腹膜及真皮层。脱细胞基质生物材料广泛应用于医药领域，相比不可吸收材料或者传统的高分子材料，它具有诱导组织再生的能力，因此被认为是理想的组织修复材料。但动物源性生物材料也存在一些风险，一方面在于其携带的外源残留DNA、脂肪等免疫原性物质，在植入人体后可能会引起免疫反应；另一方面在于其处理过程中用到的试剂容易破坏细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的三维结构，使其在体内失去了诱导组织再生的能力。
关于脱细胞基质中的有效活性成分，因使用不同的去细胞试剂或方式，脱细胞基质中保留的有效活性成分差异很大。现有技术中的去细胞方法主要有：1)物理法：例如反复冻融法，此方法属于物理方法进行脱细胞处理，由于其所需周期太长，现在基本已经不用；2)化学法：主要有酸、碱、除垢剂(也称表面活性剂)，除垢剂例如SDS、Triton X-100、CHAPS，上述都是化工合成或半合成的，去污力强，去细胞效果好，但是通常采用这类去细胞试剂制备的生物补片，其保留的有效活性成分少，ECM立体结构损伤大，因此其诱导组织再生能力差，另一方面，加工助剂残留会导致细胞毒性、刺激和免疫反应，从而影响组织修复效果，专利CN101366975公开了一种脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法，其中使用0.1-1M的NaOH进行脱细胞，但是由于NaOH为强碱性试剂，对ECM的胶原结构影响较大，同时NaOH进行脱细胞对ECM结构的破坏导致材料降解较快以及对ECM中生长因子的去除，可能会影响到细胞在基质材料上聚集、增殖和分化的再细胞化过程，从而影响到基质材料引导组织再生的能力；3)酶法：包括蛋白酶消化、核酸酶消化和钙螯合物试剂的使用等，胰蛋白酶是脱细胞过程中最常用的酶，专利CN 110433341在其背景技术中指出“与去污剂比较而言，胰蛋白酶去除细胞的效果也相对较缓慢，同时对ECM中的胶原蛋白和弹力蛋白有着更大的破坏性，即造成对ECM超微结构的破坏，从而直接导致ECM机械性能的下降”；中性蛋白酶也常用于脱细胞过程，但是长时间作用会破坏ECM的超微结构，会降解ECM中纤维连接蛋白和IV型胶原；专利CN 106563173公开了一种脱细胞生物真皮材料的制备方法，其中使用了加有EDTA的胰蛋白酶溶液、中性蛋白酶溶液以及除垢剂溶液进行脱细胞，脱细胞效果良好，但是生物活性成分保留较少，有可能不易于细胞在胶原材料表面粘附、增殖生长，从而影响到基质材料引导组织再生的能力。
发明内容
动物源性生物材料处理工艺的难点在于，如何在去除动物组织携带的免疫原性物质的同时，尽可能的降低对ECM的破坏。因此，如何清除免疫原性物质，提高生物材料结构稳定性，提升生物活性成分的保留，这是目前制备脱细胞生物材料的研究重点。
有鉴于此，本申请的目的在于提供一种脱细胞基质生物材料的制备方法，以实现免疫原物质的高效清除，以及更少地破坏ECM的成分和结构。
本申请第一方面提供了一种脱细胞基质生物材料的制备方法，其包括以下步骤：
前处理：用纯化水洗掉动物组织表层的残渣，将动物组织置于10～40wt％氯化钠溶液中，振荡1-6h，再置于0.05～1wt％氯化钠溶液中，振荡12-20h，利用物理刮除方式去除肌肉层、表皮层，获得基质材料，其中所述动物组织选自牛心包、猪心包、羊胃粘膜、猪腹膜、猪膀胱膜、猪小肠粘膜中的至少一种；
脱脂：按照料液质量比1：5～20将所述基质材料与脱脂剂混合，振荡30-180min；其中，所述脱脂试剂选自2～10wt％十二烷基磺酸钠溶液、0.1～1wt％氢氧化钠溶液、10～100wt％异丙醇溶液、20～80wt％正丙醇溶液、20～60wt％三氯甲烷和40～80wt％乙醇混合溶液、30～50wt％二氯甲烷和50～70wt％乙醇混合溶液或10～65wt％石油醚溶液的至少一种；
消毒：按照料液质量比1：3～10将所述基质材料与消毒剂混合，振荡30-180min；其中，所述消毒剂选自0.02～0.2wt％过氧乙酸与10～40wt％乙醇的混合溶液、0.02～0.2wt％过氧乙酸溶液、5～10wt％双氧水溶液、0.25～2.5wt％次氯酸钠溶液或者75～95wt％乙醇溶液；
脱细胞：按照料液质量比1：3～10将所述基质材料与0.01～0.5wt％碱性蛋白酶溶液混合，振荡60-240min；
在一些实施方式中，所述碱性蛋白酶的优选浓度为0.01～0.2wt％。
去α-Gal抗原：选自反复冻融清洗、机械破碎清洗或用α-半乳糖苷酶溶液清洗中的至少一种方式进行；
在一些实施方式中，去α-Gal抗原的步骤为：按照料液质量比1：5～10将所述基质材料与0.25～5U/mLα-半乳糖苷酶溶液混合，25-37℃，振荡12-48h。
灭菌：采用辐照灭菌或环氧乙烷灭菌的方式，对所述基质材料进行灭菌处理，获得所述脱细胞基质生物材料。
本申请第二方面提供了本申请第一方面的方法制备的脱细胞基质生物材料。
本申请提供的脱细胞基质生物材料的制备方法，采用特定的前处理、脱脂、消毒、脱细胞、去α-Gal抗原以及灭菌的方法相结合，在有效去除动物组织抗原性物质的同时，还能最大限度的保留材料中生物活性成分和结构的完整性从而获得一种具有低免疫原性、高生物活性的脱细胞基质生物材料，进一步地，本方法制备条件简单、质量可控、成本低廉。
此外，采用本申请的方法制备的脱细胞基质生物材料的生物相容性良好，表面有利于细胞聚集、增殖，其可以作为一种高活性的生物材料应用于组织的修复，可作为理想的生物材料广泛满足临床需求。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。
图1A和图1B为实施例1的脱细胞基质生物材料在不同放大倍数下的苏木精-伊红染色图(HE染色)；
图2为实施例2的脱细胞基质生物材料的苏木精-伊红染色图(HE染色)；
图3A-3E分别为对比例1-4的脱细胞基质生物材料与新鲜羊胃基质材料的苏木精-伊红染色图(HE染色)；
图4为实施例1、对比例1、对比例2的脱细胞基质生物材料细胞增殖实验的MTT结果图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案、及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对本申请进一步详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员基于本申请中的实施例所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请第一方面提供了一种脱细胞基质生物材料的制备方法，其包括以下步骤：
前处理：用纯化水洗掉动物组织表层的残渣，将动物组织置于10～40wt％氯化钠溶液中，振荡1-6h，再置于0.05～1wt％氯化钠溶液中，振荡12-20h，利用物理刮除方式去除肌肉层、表皮层，获得基质材料，其中所述动物组织选自牛心包、猪心包、羊胃粘膜、猪腹膜、猪膀胱膜、猪小肠粘膜中的至少一种；
脱脂：按照料液质量比1：5～20将所述基质材料与脱脂剂混合，振荡30-180min；其中，所述脱脂试剂选自2～10wt％十二烷基磺酸钠溶液、0.1～1wt％氢氧化钠溶液、10～100wt％异丙醇溶液、20～80wt％正丙醇溶液、20～60wt％三氯甲烷和40～80wt％乙醇混合溶液、30～50wt％二氯甲烷和50～70wt％乙醇混合溶液或10～65wt％石油醚溶液的至少一种；
消毒：按照料液质量比1：3～10将所述基质材料与消毒剂混合，振荡30-180min；其中，所述消毒剂选自0.02～0.2wt％过氧乙酸与10～40wt％乙醇的混合溶液、0.02～0.2wt％过氧乙酸溶液、5～10wt％双氧水溶液、0.25～2.5wt％次氯酸钠溶液或者75～95wt％乙醇溶液；
脱细胞：按照料液质量比1：3～10将所述基质材料与0.01～0.5wt％碱性蛋白酶溶液混合，振荡60-240min；
去α-Gal抗原：选自反复冻融清洗、机械破碎清洗或用α-半乳糖苷酶溶液清洗中的至少一种方式进行；
灭菌：采用辐照灭菌或环氧乙烷灭菌的方式，对所述基质材料进行灭菌处理，获得所述脱细胞基质生物材料。
在本申请的一些实施方式中，所述碱性蛋白酶浓度为0.01～0.5wt％，优选为0.01～0.2wt％。
在本申请的一些实施方式中，所述去α-Gal抗原的步骤为：按照料液质量体积比1：5～10将所述基质材料与0.25～5U/mLα-半乳糖苷酶溶液混合，25-37℃，振荡12-48h。
发明人发现，采用本申请的脱脂方法以及脱脂试剂，制备的脱细胞基质生物材料中脂肪质量含量更低，为0.05-0.24wt％。
在研究中，发明人发现采用本申请特定浓度的碱性蛋白酶进行特定时间的脱细胞处理，脱细胞基质生物材料的基底膜基本保留了完整的结构，基质成分也基本未受影响，振荡时间太短、浓度太低会导致细胞去除不充分，时间太长、浓度太高则损伤脱细胞基质生物材料立体结构，此外，糖胺聚糖、角蛋白、层粘连蛋白等生物活性成分都有所保留；进一步地，采用本申请的脱细胞方法，胶原蛋白的质量含量可达到90-98wt％。
发明人还发现，采用本申请的去α-Gal抗原的方法，得到的脱细胞基质生物材料中，α-Gal抗原含量可低于0.6×1013个/mg，去α-Gal抗原的效果显著。
ECM主要包括胶原蛋白、非胶原蛋白、糖胺聚糖等。胶原蛋白是构成ECM骨架的重要成分，它具有良好的生物相容性；胶原蛋白还具有可降解的生物学特性，能够在体内一定时间内分解成易于吸收的小分子和短肽；胶原蛋白与其它生物活性组分在一起使用，具有协同效应，易于细胞在胶原材料表面粘附、增殖生长，因此，胶原分子作为组织修复的支架材料中重要成分，具有其它成分无法替代的优越性。非胶原蛋白，例如层粘连蛋白是能结合胶原分子、硫酸乙酰肝素和整体蛋白受体从而在细胞和基底膜或ECM之间形成重要连接的ECM蛋白。角蛋白是一类典型的上皮细胞中间丝蛋白，具有分子多样性的特点，其在维持上皮细胞机械稳定性和组织完整性中参与重要作用，除了结构性功能外，角蛋白还具有新的调节功能，如参与细胞凋亡，炎症反应，创伤应答和组织重塑。糖胺聚糖对动物源ECM生物学性能起着至关重要的作用，可赋予ECM材料及产品优异的生物活性，其具有保持疏松结缔组织中的水分、调节多种阳离子在组织中的分布、在一定程度上促进机体创伤愈合等优点，个别糖胺聚糖如透明质酸有很大的黏滞性，附在关节面上具有润滑和保护作用，是组织修复再生非常重要的参与者。
本申请采用特定的前处理、脱脂、消毒、脱细胞、去α-Gal抗原以及灭菌的方法相结合，在去除免疫原性物质的同时，有效的保留了胶原蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖等活性成分及微结构，从而获得一种具有低免疫原性和高生物活性的脱细胞基质生物材料。
需要说明的是，本申请中的制备方法中，在完成前处理之后，所述脱脂、消毒、脱细胞和去α-Gal抗原的各个步骤并不表示其先后顺序，可以根据需要按照不同顺序进行。示例性地，本申请的制备方法可以按照以下任何顺序进行：1)前处理、脱脂、消毒、脱细胞、去α-Gal抗原、灭菌；2)前处理、消毒、脱脂、去α-Gal抗原、脱细胞、灭菌；3)前处理、脱细胞、消毒、脱脂、去α-Gal抗原、灭菌；4)前处理、脱细胞、消毒、去α-Gal抗原、脱脂、灭菌。
在本申请的一些实施方式中，所述脱脂、消毒、脱细胞及去α-Gal抗原步骤完成后，各自还包括采用清洗剂进行清洗。
在本申请的一些实施方式中，所述清洗剂选自0.1～1M磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)、1～4mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES)缓冲液、0.1～1wt％氯化钠溶液、0.1～1wt％硫酸钠溶液或0.1～1wt％硝酸钾溶液中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，所述清洗包括按照料液质量比1：3～10加入清洗剂，振荡10-20min，清洗1-10次。
在本申请的一些实施方式中，所述辐照灭菌为钴60辐照灭菌，辐照剂量为10-40kGy，优选为20-30kGy。
在本申请中，所述振荡为本领域的常规操作，本申请在此不做限定，能实现本申请的目的即可，例如可以使用气浴摇床振荡，振荡频率为100-200rpm。
本申请中，如无特别说明，所述料液质量比(W/W)的单位均是g/g，指投入物料的质量(g)与加入处理液的质量(g)的比。
本申请中，石油醚溶液的溶剂为异丙醇，其他溶液如无特别说明，均指水溶液。
采用本申请的方法制备的脱细胞基质生物材料可通过冻干的方式进行干燥，其中冻干为本领域的常规操作，本申请在此不做限定。冻干步骤可以在本申请的灭菌处理之前或之后完成。例如，本申请的方法可以包括以下步骤：前处理、脱脂、消毒、脱细胞、去α-Gal抗原、灭菌和冻干。
本申请第二方面提供了本申请第一方面的方法制备的脱细胞基质生物材料。
发明人在研究中发现，采用本申请的制备方法获得的脱细胞基质生物材料，免疫原性物质少，三维立体结构完整，生物活性成分如胶原蛋白、糖胺聚糖、层粘连蛋白等得到保留，可以为各种细胞的生存及活动提供适宜的场所及微环境，可作为一种高活性生物材料应用于组织的修复。
在本申请的一些实施方式中，所述活性物质包括胶原蛋白、糖胺聚糖、层粘连蛋白和角蛋白，其中，胶原蛋白质量含量高达90-98wt％；其中，所述胶原蛋白包含胶原蛋白I、胶原蛋白III和胶原蛋白V。Ⅰ型与Ⅲ型胶原蛋白主要分布在皮肤真皮层，I型胶原蛋白作为胶原蛋白中含量最多的蛋白，其具有较好的力学性能和重要的生物学性质，III型胶原蛋白可以促进材料在体内的血管化，Ⅴ型胶原分布在细胞周围以及Ⅰ型胶原的周围，可以在基膜和结缔组织之间起着桥梁作用。发明人发现，采用本申请的方法制备的脱细胞基质生物材料，胶原蛋白含量高，胶原蛋白I、胶原蛋白III和胶原蛋白V都得以有效保留，进而所述脱细胞基质生物材料具有较高的生物活性，有利于细胞的粘附、增殖，从而有利于组织的再生修复。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步解释说明。
实施例1
1)前处理：用纯化水洗掉羊胃表层的残渣，将羊胃置于20wt％氯化钠溶液中，振荡6h，再置于0.9wt％氯化钠溶液中，振荡18h，取出后再利用物理刮除方式去除肌肉层、表皮层，获得羊胃基质材料；
2)脱脂：按照料液质量比1：10将羊胃基质材料与50％异丙醇溶液混合，振荡180min，弃去异丙醇溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
3)消毒：按照料液质量比1：10将脱脂后的羊胃基质材料与0.2wt％过氧乙酸与40wt％乙醇的混合溶液混合，振荡60min，弃去过氧乙酸与乙醇的混合溶液，再加入0.1MPBS缓冲液，振荡清洗3次，每次20min；
4)脱细胞：按照料液质量比1：5将消毒后的羊胃基质材料与0.05wt％碱性蛋白酶溶液混合，振荡120min，弃去碱性蛋白酶溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
5)去除α-Gal抗原：按照料液质量比1：10将脱细胞后的羊胃基质材料与5U/mLα-半乳糖苷酶溶液混合，37℃，振荡48h，弃去α-半乳糖苷酶溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
6)冻干：将去除α-Gal抗原的羊胃基质材料平铺在钢板模具中，冷冻干燥后包装；
7)灭菌：将包装的羊胃基质材料在25kGy辐照灭菌后在常温保存。
实施例2
1)前处理：用纯化水洗掉羊胃表层的残渣，将羊胃置于20wt％氯化钠溶液中，振荡6h，再置于0.9wt％氯化钠溶液中，振荡18h，取出后再利用物理刮除方式去除肌肉层、表皮层，获得羊胃基质材料；
2)脱脂：按照料液质量比1：10将羊胃基质材料与50％异丙醇溶液混合，振荡180min，弃去异丙醇溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
3)消毒：按照料液质量比1：10将脱脂后的羊胃基质材料与0.2wt％过氧乙酸与40wt％乙醇的混合溶液混合，振荡60min，弃去过氧乙酸与乙醇的混合溶液，再加入0.1MPBS缓冲液，振荡清洗3次，每次20min；
4)脱细胞：按照料液质量比1：10将消毒后的羊胃基质材料与0.01wt％碱性蛋白酶溶液混合，振荡120min，弃去碱性蛋白酶溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
5)去除α-Gal抗原：按照料液质量比1：10将脱细胞后的羊胃基质材料与5U/mLα-半乳糖苷酶溶液混合，37℃，振荡48h，弃去α-半乳糖苷酶溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
6)冻干：将去除α-Gal抗原的羊胃基质材料平铺在钢板模具中，冷冻干燥后包装；
7)灭菌：将包装的羊胃基质材料经25kGy辐照灭菌后常温保存。
实施例3
1)前处理：用纯化水洗掉羊胃表层的残渣，将羊胃置于20wt％氯化钠溶液中，振荡6h，再置于0.9wt％氯化钠溶液中，振荡18h，取出后再利用物理刮除方式去除肌肉层、表皮层，获得羊胃基质材料；
2)脱脂：按照料液质量比1：10将羊胃基质材料与50％异丙醇溶液混合，振荡180min，弃去异丙醇溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
3)消毒：按照料液质量比1：10将脱脂后的羊胃基质材料与0.2wt％过氧乙酸与40wt％乙醇的混合溶液混合，振荡60min，弃去过氧乙酸与乙醇的混合溶液，再加入0.1MPBS缓冲液，振荡清洗3次，每次20min；
4)脱细胞：按照料液质量比1：5将消毒后的羊胃基质材料与0.1wt％碱性蛋白酶溶液混合，振荡120min，弃去碱性蛋白酶溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
5)去除α-Gal抗原：按照料液质量比1：10将脱细胞后的羊胃基质材料与5U/mLα-半乳糖苷酶溶液混合，37℃，振荡48h，弃去α-半乳糖苷酶溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
6)冻干：将去除α-Gal抗原的羊胃基质材料平铺在钢板模具中，冷冻干燥后包装；
7)灭菌：将包装的羊胃基质材料在25kGy辐照灭菌后在常温保存。
实施例4
1)前处理：用纯化水洗掉羊胃表层的残渣，将羊胃置于20wt％氯化钠溶液中，振荡6h，再置于0.9wt％氯化钠溶液中，振荡18h，取出后再利用物理刮除方式去除肌肉层、表皮层，获得羊胃基质材料；
2)脱脂：按照料液质量比1：10将羊胃基质材料与50％异丙醇溶液混合，振荡180min，弃去异丙醇溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
3)消毒：按照料液质量比1：10将脱脂后的羊胃基质材料与0.2wt％过氧乙酸与40wt％乙醇的混合溶液混合，振荡60min，弃去过氧乙酸与乙醇的混合溶液，再加入0.1MPBS缓冲液，振荡清洗3次，每次20min；
4)脱细胞：按照料液质量比1：5将消毒后的羊胃基质材料与0.2wt％碱性蛋白酶溶液混合，振荡120min，弃去碱性蛋白酶溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
5)去除α-Gal抗原：按照料液质量比1：10将脱细胞后的羊胃基质材料与5U/mLα-半乳糖苷酶溶液混合，37℃，振荡48h，弃去α-半乳糖苷酶溶液，再加入0.1M PBS缓冲液，振荡清洗3次，每次10min；
6)冻干：将去除α-Gal抗原的羊胃基质材料平铺在钢板模具中，冷冻干燥后包装；
7)灭菌：将包装的羊胃基质材料经25kGy辐照灭菌后常温保存。
对比例1
除采用0.05wt％胰蛋白酶替代碱性蛋白酶，其余与实施例1相同。
对比例2
除采用0.05wt％中性蛋白酶替代碱性蛋白酶，其余与实施例1相同。
对比例3
1)预处理：取羊胃，充分洗净，机械刮除羊胃的肌肉层、表皮层，分离出羊胃粘膜下层，冲洗干净后，按照料液质量体积比1:5(W/V)将羊胃粘膜下层置于0.5％醋酸溶液中浸泡30min，弃去醋酸溶液，再使用纯化水浸泡3次，得到羊胃基质材料；
2)消毒：按照料液质量体积比1:10(W/V)将基质材料与1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合溶液混合，室温条件下超声浸泡100min，弃去过氧乙酸与乙醇的混合溶液，再加入纯化水超声清洗3次；
3)脱脂：按照料液质量体积比1:10(W/V)将消毒后的基质材料与90％的乙醇溶液混合，室温条件下超声浸泡2h，弃去乙醇溶液，使用注射用水超声清洗3次；
4)去细胞：按照料液质量体积比1:10(W/V)将脱脂后的基质材料与含0.25％皂素的溶液(源自Quil-A，以纯皂素含量来计算工作浓度)混合，在4℃和超声条件下浸泡30min，弃去皂素溶液，再用同样浓度0.5％皂素溶液冲洗基质材料10min，弃去皂素溶液，再用PBS缓冲液浸泡基质材料20min，完成后重复前述去细胞步骤一次；
5)去DNA和去α-Gal抗原：按照料液质量体积比1:5(W/V)将去细胞后的基质材料与含5U/ml DNA酶溶液混合，在37℃条件下超声浸泡20min，弃去DNA酶溶液，再使用PBS缓冲液冲洗3次；按照料液质量体积比1:5(W/V)将去DNA后的基质材料与含5U/mlα-半乳糖苷酶溶液混合，30℃和超声条件下浸泡20min，弃去α-半乳糖苷酶溶液，再使用PBS缓冲液冲洗；
6)按照料液质量体积比为1:20(W/V)将去DNA和去α-Gal抗原的基质材料和10mM的NaOH溶液混合，常温条件下超声浸泡50min，弃去NaOH溶液，再使用PBS缓冲液超声清洗直至中性；
7)定型、冻干、灭菌：将去细胞后的片状原料，四片间纵横交叉，重叠固定于模具上，冷冻干燥后，包装，最后进行辐照灭菌，得到脱细胞基质生物材料。
对比例4
1)前置处理：将羊胃去除胃内内容物，用蒸馏水冲洗干净，切成所需片段，将其置于含有0.2％过氧乙酸和10％乙醇的混合溶液中浸泡消毒1h，弃去过氧乙酸和乙醇的混合溶液，用PBS缓冲液漂洗干净；机械刮除羊胃的肌肉层、表皮层，再用PBS缓冲液漂洗干净，获得羊胃基质材料；
2)脱细胞：将前置处理的基质材料置入0.5M的NaOH溶液中，于6±2℃条件下浸泡20min，弃去NaOH溶液，用PBS缓冲液漂洗至中性；
3)酶处理：将脱细胞后的基质材料置入含有40U/ml DNA酶和10U/mlα-半乳糖苷酶的混合溶液中，于35℃条件下浸泡1h，弃去DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液，用PBS缓冲液漂洗干净；
4)脱细胞基质生物材料的制备：将酶处理后的基质材料浸泡于冷冻保护液中30min，冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加有1％葡聚糖、2％蔗糖、4％聚维酮、2％棉子糖(均为重量比)；再将基质材料十层叠加铺展，经真空冷冻干燥后形成脱细胞基质生物材料，环氧乙烷灭菌。
生物化学成分及含量分析
本申请采用蛋白质谱分析、糖胺聚糖检测(Biocolor BlyscanGlycosaminoglycan Assay，B1000，Biocolor公司)试剂盒对脱细胞基质生物材料中成分含量进行分析，实施例1-4和对比例1-4的脱细胞基质生物材料主要生物化学成分及含量如表3所示。
蛋白质谱分析：
仪器与材料
表1蛋白质谱分析主要仪器
Figure BDA0003431062820000131
毛细管液相色谱条件：
1)预柱：300μm i.d.×5mm,填料Acclaim PepMap RPLC C18,5μm,
Figure BDA0003431062820000132
2)分析柱：75μm i.d.×150mm,填料Acclaim PepMap RPLC C18,3μm,
Figure BDA0003431062820000133
3)流动相A：0.1％甲酸，2％乙腈(ACN)；
4)流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；
5)流速：300nL/min；
6)液相色谱梯度：每个组分分析时间：120min；
表2蛋白质谱分析液相色谱梯度组分含量
时间(min) B相
0 4％
5 10％
85 22％
110 40％
111 95％
120 95％
7)质谱条件：
一级质谱参数：
分辨率(Resolution)：70,000
自动增益控制目标(AGC target)：3e6
最大离子注入时间(Maximum IT)：40ms
扫描范围(Scan range)：300to 1800m/z
二级质谱参数：
分辨率(Resolution)：17,500
自动增益控制目标(AGC target)：1e5
最大离子注入时间(Maximum IT)：60ms
Top N：20
NCE/stepped NCE：27
扫描范围(Scan range)：50to 1500m/z
Figure BDA0003431062820000151
免疫原性物质分析
取本申请实施例1-4的脱细胞基质生物材料，以及对比例1-4的脱细胞基质生物材料、新鲜羊胃基质材料分别作为待测样品，采用下述方法进行免疫原性物质分析。
宿主细胞残留量：用5％中性福尔马林固定待测样品，石蜡包埋，切成0.4μm的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，HE染色，显微镜下观察实施例1、实施例2、对比例1-4的脱细胞基质生物材料以及新鲜羊胃基质材料的结构形态及细胞残留情况结果如图1A、图1B、图2、图3A-3E及表4所示。
DNA含量：依据YY/T 0606.25-2014《动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》进行检测，结果见表4。
α-Gal抗原含量：依据YY/T1561-2017《组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测》进行检测，结果见表4。
脂肪含量：GB/T 5009.6-2016中第二法规定的酸水解处理进行检测，结果见表4。
Figure BDA0003431062820000171
由表3的结果可以看出，实施例1-4采用碱性蛋白酶进行脱细胞处理后，脱细胞基质生物材料中总胶原蛋白质量含量分别高达97.34±1.18wt％、96.24±2.17wt％、91.14±1.77wt％、90.14±1.35wt％，且胶原蛋白I、胶原蛋白III、胶原蛋白V均有效保留，说明碱性蛋白酶对ECM中的胶原蛋白破坏性小，制备的脱细胞基质生物材料具有良好的生物相容性，易于细胞在胶原材料表面粘附、增殖生长，此外，角蛋白、糖胺聚糖、层粘连蛋白也均有效保留。
从表3可以看出对比例1、对比例2的脱细胞基质生物材料层粘连蛋白有保留，但是角蛋白均被破坏，对比例2的脱细胞基质生物材料胶原蛋白也被破坏，此外，从表4中还看出对比例1、对比例2的脱细胞基质生物材料中DNA含量和α-Gal抗原含量远高于实施例1-4的脱细胞基质生物材料，且有大量宿主细胞残留。
对比例3、对比例4分别采用专利CN110433341、CN101366975中的脱细胞方法获得脱细胞基质生物材料，总胶原质量含量分别为88.07±2.24wt％、93.19±3.34wt％，但其中均没有检测到胶原蛋白V、角蛋白、糖胺聚糖、层粘连蛋白，细胞生物活性物质保留不完整，因此其诱导组织再生能力差。
角蛋白是一类典型的上皮细胞中间丝蛋白，具有分子多样性的特点，其在维持上皮细胞机械稳定性和组织完整性中有重要作用，除了结构性功能外，角蛋白还具有新的调节功能，如参与细胞凋亡，炎症反应，创伤应答和组织重塑。由表3的结果可以看出，对比例1-4获得的脱细胞基质生物材料的角蛋白均被破坏，而实施例1-4中采用碱性蛋白酶脱细胞获得的脱细胞基质生物材料角蛋白均有所保留，说明本申请的脱细胞基质生物材料具有更好的生物相容性，对组织的愈合具有更好的促进作用。
不同脱细胞基质生物材料和新鲜羊胃基质材料的不同免疫原性物质含量如表4所示，相较于对比例1-3的脱细胞基质生物材料，本申请采用碱性蛋白酶进行脱细胞对脱细胞基质生物材料中脂肪、α-Gal抗原、DNA去除率更高，获得的脱细胞基质生物材料中脂肪、α-Gal抗原、DNA含量更低，说明碱性蛋白酶进行脱细胞获得的脱细胞基质生物材料的生物安全性更好；从表4还可以看出对比例4的脱细胞基质生物材料中脂肪、α-Gal抗原、DNA含量均很低，也没有宿主细胞残留，但是从它的HE染色图(图3D)可以看出，对比例4的脱细胞基质生物材料结构破坏严重，因此其诱导组织再生能力差。
从图1A-1B、图2可以看出，实施例1的脱细胞基质生物材料未见蓝染核物质和细胞碎片，基底膜结构清晰，实施例2的脱细胞基质生物材料未见蓝染核物质，基底膜结构清晰，仅有少量残留的细胞碎片，说明本申请脱细胞工艺在去除细胞的同时，基本保留了基底膜的完整结构，基质也未受影响。
从图3A-3E可以看出，对比例1、对比例2的脱细胞基质生物材料胶原纤维不连续，均有不同程度断裂，还明显有大量细胞碎片残留，说明采用胰蛋白酶和中性蛋白酶脱细胞不彻底；对比例3的脱细胞基质生物材料胶原纤维保留完整、未见断裂，但有细胞碎片残留，从表4中也能看出其DNA含量高达50.80±1.21ng/mg，生物安全性低；对比例4的脱细胞基质生物材料脱细胞干净，但是材料的结构破坏严重，说明采用对比例3、对比例4的脱细胞工艺得到的脱细胞基质生物材料均有不同程度的缺点。
生物学性能评价
参照GB/T16886标准方法对实施例1-4以及对比例1-4中获得的脱细胞基质生物材料进行生物学性能评估，结果如表5所示，实施例1-4、对比例3和对比例4制备的脱细胞基质生物材料的细胞相对增殖率均大于70％，无潜在细胞毒性，而对比例1和对比例2的细胞相对增殖率均小于70％，存在潜在的细胞毒性，此结果可能由于对比例1和对比例2中材料的脱细胞工艺不彻底，细胞残留量大所导致。但实施例1-4以及对比例1-4均无迟发型超敏反应、无急性全身毒性反应、无热源反应、无皮内刺激反应，以上结果说明通过碱性蛋白酶脱细胞制备的生物材料，其生物相容性良好。
Figure BDA0003431062820000201
脱细胞基质生物材料的细胞增殖实验
将实施例1、对比例1、对比例2获得的脱细胞基质生物材料剪裁成10mm圆片，覆盖于48孔板中，将小鼠L929成纤维细胞(中科院昆明细胞库)按照1×104个/孔的密度接种脱细胞基质生物材料表面，然后放入37℃、5％CO2细胞培养箱中，每隔2天更换一次细胞培养液，分别于3天、7天后，弃去各组细胞上清液，每孔加入50μL MTT溶液，37℃孵育3h，吸去上清液，每孔加入400μL DMSO溶液，振荡10min后，每孔吸出200μL的上清液转至96孔板中，酶标仪测定570nm处的光密度(optical density,OD)值。结果如图4所示，实施例1中获得的脱细胞基质生物材料在第3天时的OD值显著性高于对比例2中获得的脱细胞基质生物材料；实施例1中获得的脱细胞基质生物材料在第7天时的OD值显著高于对比例1、对比例2中获得的脱细胞基质生物材料，说明实施例1中获得的脱细胞基质生物材料其表面再细胞化效果更好，更有利于细胞粘附、增殖。
图4中，实施例1和对比例1、2的脱细胞基质生物材料在1天、3天、7天时OD值的显著性差异用小写字母表示，不同小写字母之间表示其具有显著性差异，例如a，b，c，d，e五者之间，各小写字母不同，相互之间都有显著性差异。
以上结果说明，采用本申请的方法制备的脱细胞基质生物材料，免疫原性物质少，三维立体结构完整，胶原蛋白、糖胺聚糖、层粘连蛋白等活性成分得以充分保留，可以为各种细胞的生存及活动提供适宜的场所及微环境，可作为一种优良的高活性生物材料应用于组织的修复。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。

Claims (10)

1.一种脱细胞基质生物材料的制备方法，其包括以下步骤：
前处理：用纯化水洗掉动物组织表层的残渣，将动物组织置于10～40wt％氯化钠溶液中，振荡1-6h，再置于0.05～1wt％氯化钠溶液中，振荡12-20h，利用物理刮除方式去除肌肉层、表皮层，获得基质材料，其中所述动物组织选自牛心包、猪心包、羊胃粘膜、猪腹膜、猪膀胱膜、猪小肠粘膜中的至少一种；
脱脂：按照料液质量比1：5～20将所述基质材料与脱脂剂混合，振荡30-180min；其中，所述脱脂试剂选自2～10wt％十二烷基磺酸钠溶液、0.1～1wt％氢氧化钠溶液、10～100wt％异丙醇溶液、20～80wt％正丙醇溶液、20～60wt％三氯甲烷和40～80wt％乙醇混合溶液、30～50wt％二氯甲烷和50～70wt％乙醇混合溶液或10～65wt％石油醚溶液的至少一种；
消毒：按照料液质量比1：3～10将所述基质材料与消毒剂混合，振荡30-180min；其中，所述消毒剂选自0.02～0.2wt％过氧乙酸与10～40wt％乙醇的混合溶液、0.02～0.2wt％过氧乙酸溶液、5～10wt％双氧水溶液、0.25～2.5wt％次氯酸钠溶液或者75～95wt％乙醇溶液；
脱细胞：按照料液质量比1：3～10将所述基质材料与0.01～0.5wt％碱性蛋白酶溶液混合，振荡60-240min；
去α-Gal抗原：选自反复冻融清洗、机械破碎清洗或用α-半乳糖苷酶溶液清洗中的至少一种方式进行；
灭菌：采用辐照灭菌或环氧乙烷灭菌的方式，对所述基质材料进行灭菌处理，获得所述脱细胞基质生物材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述去α-Gal抗原的步骤为：按照料液质量体积比1：5～10将所述基质材料与0.25～5U/mLα-半乳糖苷酶溶液混合，25-37℃，振荡12-48h。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述碱性蛋白酶的浓度为0.01～0.2wt％。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的脱脂、消毒、脱细胞及去α-Gal抗原步骤完成后，各自还包括采用清洗剂进行清洗。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述清洗剂选自0.1～1M PBS缓冲液、1～4mMHEPES缓冲液、0.1～1wt％氯化钠溶液、0.1～1wt％硫酸钠溶液或0.1～1wt％硝酸钾溶液中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述清洗步骤包括按照料液质量比1：3～10加入清洗剂，振荡10-20min，中途换液、重复清洗1-10次。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辐照灭菌为钴60辐照灭菌，辐照剂量为10-40kGy，优选为20-30kGy。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法制备的脱细胞基质生物材料。
9.根据权利要求8所述的脱细胞基质生物材料，其包含胶原蛋白、层粘连蛋白、糖胺聚糖和角蛋白中的一种或多种；其中，基于上述脱细胞基质生物材料的胶原蛋白的质量含量为90-98wt％。
10.根据权利要求9所述的脱细胞基质生物材料，其中，所述胶原蛋白包含胶原蛋白I、胶原蛋白III和胶原蛋白V中的一种或多种。
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