CN116942913B - 一种脱细胞基质材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
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- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞基质材料及其制备方法和应用，所述制备方法包括：对小肠粘膜下层进行前处理，对前处理后小肠粘膜下层依次进行溶胀处理、冻融处理、氧化酶浸泡处理和表面活性剂处理，得到所述脱细胞基质材料。本发明采用物理溶胀、物理冻融、化学洗脱相结合，保证了较高的脱细胞效率，并且在脱细胞处理过程中适时加入了氧化酶，使氧化酶充分渗透到脱细胞基质中，从而在使用表面活性剂时氧化酶在组织中起到缓冲作用，保证了细胞外基质中胶原结构的完整。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种脱细胞基质材料及其制备方法和应用。
背景技术
随着组织工程的进一步发展和生物补片内源性再生机制的深入研究，生物补片在组织损伤修复中开始崭露头角。生物补片主要结构是由胶原、弹性纤维、糖蛋白、粘连蛋白、蛋白多糖构成的细胞外基质纤维状支架，而正是这种结构为组织再生提供了理想的支架。
生物补片植入机体后会引导组织进行内源性组织再生，主要是补片快速再血管化，循环中的干细胞进入并分化、填充、产生新的细胞外基质，从而修复组织缺损。其中，生物补片的多孔结构便于上述干细胞的生长和贴附，同时，生物补片完全可吸收，不侵蚀临近组织器官，具有较好的耐受感染能力，不增加术后感染的风险，这也是生物补片优于一些传统高分子材料的优势。可用于吻合器加固片、疝补片、硬脑膜补片等。
生物材料需要经过严格的除菌灭活及脱细胞处理后，才能用作合格的补片产品。目前脱细胞技术有物理反复多次冻融、物理溶胀、化学脱细胞、酶解法等，单纯物理反复冻融和溶胀不仅耗时耗力，同时会对胶原结构造成极大的破坏；化学脱细胞法由于化学试剂浓度高，对胶原结构产生破坏，同时会有试剂残留；酶解法的脱细胞效率极低；如CN103272275A公开了一种硬脑膜生物修补片的制备方法，包括分离出小肠粘膜下层、病毒灭活以及脱细胞，脱细胞在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，将小肠粘膜下层置于氢氧化钠溶液中处理。
综上所述，如何开发全新脱细胞基质材料的制备方法，以获得更优质的脱细胞材料，仍是组织工程领域亟需解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种脱细胞基质材料及其制备方法和应用，加工得到的脱细胞基质材料生物相容性较好、孔隙率大且组织胶原结构完整，制备方法可有效减少外源性致敏抗原且过程相对温和。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种脱细胞基质材料的制备方法，所述制备方法包括：
对小肠粘膜下层进行前处理，对前处理后小肠粘膜下层依次进行溶胀处理、冻融处理、氧化酶浸泡处理和表面活性剂处理，得到所述脱细胞基质材料。
本发明中，采用物理溶胀、物理冻融、化学洗脱相结合，保证了较高的脱细胞效率，并且在脱细胞处理过程中适时加入了氧化酶，使氧化酶充分渗透到脱细胞基质中，从而在使用表面活性剂时氧化酶在组织中起到缓冲作用，保证了细胞外基质中胶原结构的完整。
可以理解，哺乳动物如猪、牛、羊、等的小肠组织下层均适用于本发明，可采用本领域通用方式处理小肠组织获取小肠组织下层。
优选地，所述前处理包括清洗和干燥处理。
优选地，所述前处理还包括细菌和病毒灭活处理。
优选地，所述细菌和病毒灭活处理包括：对小肠粘膜下层进行紫外光照射，然后使用抗生素溶液进行孵育处理，清洗并使用过氧乙酸进行孵育处理。
优选地，所述抗生素溶液含有庆大霉素、万古霉素、青霉素、链霉素、头孢西丁或氯霉素中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述抗生素溶液总浓度为1～100mg/L，包括但不限于2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、20mg/L、50mg/L、60mg/L、80mg/L、90mg/L、92mg/L、95mg/L、97mg/L或99mg/L。
优选地，所述溶胀处理包括：将小肠粘膜下层与高渗溶液混合并孵育。
优选地，所述高渗溶液包括ZnCl2溶液、NaCl溶液、CaCl2溶液、KCl溶液或MgCl2溶液等溶液中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述孵育的时间2～5小时，温度为20～40℃(例如可以是21℃、22℃、25℃、26℃、27℃、28℃、37℃、38℃或39℃)。
本发明中，使用高渗ZnCl2溶液进行溶胀，能膨胀到较大的体积，从而导致孔隙结构更大，增大组织孔隙率，并且ZnCl2具有一定的氧化性，可以去除组织中的脂肪或者未清理干净的表皮结构，进一步提高孔隙率和净化效果。
优选地，所述ZnCl2溶液的浓度为3～6M，包括但不限于4M或5M。
优选地，所述冻融处理包括：将小肠粘膜下层置于-80℃～-20℃(例如可以是-79℃、-75℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃、-24℃、-23℃、-22℃或-21℃)中孵育2～24小时(例如可以是3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、15小时、20小时、21小时、22小时或23小时)，随后置于20～30℃(例如可以是21℃、22℃、23℃、25℃、26℃、27℃、28℃或29℃)生理盐水中融化，重复3～5次。
优选地，所述氧化酶包括脂肪氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶或L-α-羟基酸氧化酶中任意一种或至少两种的组合。
本发明中，使用氧化酶渗透到基质组织中对组织起到缓冲作用，有利于保护基质的胶原蛋白结构不被破坏。
优选地，所述氧化酶工作浓度为0.05～10mg/mL，包括但不限于0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL或9mg/mL。
优选地，所述表面活性剂包括皂化物、聚乙二醇或吐温中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述聚乙二醇包括PEG400～PEG2000等。
优选地，所述吐温包括吐温60～吐温80等。
优选地，所述表面活性剂工作浓度为0.05～5mg/mL，包括但不限于0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、4.8mg/mL或4.9mg/mL。
优选地，小肠粘膜下层与各处理液(如生理盐水、抗生素溶液、高渗溶液和氧化酶溶液等等)的比例均在1:(50～200)(v/v)之间，包括但不限于1:100、1:150、1:160、1:180或1:190。
优选地，所述表面活性剂处理后还包括固定成型和真空冷冻干燥的步骤。
优选地，所述固定成型包括：将至少一层小肠粘膜下层放置在模具上。
优选地，所述真空冷冻干燥包括：将装有小肠粘膜下层的模具在真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
优选地，所述冷冻干燥的程序包括：预冻至-45℃～-25℃，并保温1～2小时；设置压强为20～25Pa，并调节温度至-25℃～-15℃，保温5～7小时；最后调节温度至0℃，保温4～6小时。
作为优选的技术方案，所述脱细胞基质材料的制备方法包括以下步骤：
(1)对小肠粘膜下层进行清洗和干燥处理；
(2)取步骤(1)处理后小肠粘膜下层进行紫外光照射，然后使用抗生素溶液进行孵育处理，清洗并使用过氧乙酸进行孵育处理，清洗并干燥；
(3)对步骤(2)处理后小肠粘膜下层与3～6M ZnCl2溶液与混合并于20～30℃孵育2～5小时，清洗；随后将小肠粘膜下层置于-80℃～-20℃中孵育2～24小时，随后置于20～30℃生理盐水中融化，重复3～5次；随后将小肠粘膜下层与0.05～10mg/mL氧化酶的溶液于2～6℃混合20～30小时；随后取出小肠粘膜下层与0.05～5mg/mL表面活性剂的溶液于30～40℃混合1～5小时，清洗并干燥；
(4)将步骤(3)处理后小肠粘膜下层放置在模具上，将装有小肠粘膜下层的模具在真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥；所述冷冻干燥的程序包括：预冻至-45℃～-25℃，并保温1～2小时；设置压强为20～25Pa，并调节温度至-25℃～-15℃，保温5～7小时；最后调节温度至0℃，保温4～6小时。
第二方面，本发明提供一种脱细胞基质材料，所述脱细胞基质材料由第一方面所述的脱细胞基质材料的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供第二方面所述的脱细胞基质材料在制备医疗植入材料中的应用。
本发明制备的脱细胞基质材料为微观多孔结构，为细胞生长提供了支架，可用于任意吻合器修复的组织，如肺部组织、胃部组织、肠道组织、皮肤组织，起到了创面保护、防渗漏、促进修复的作用。除此之外还可以用于各种组织的缺损，包括但不限于口腔、硬脑膜、盆腔、输尿管、膀胱、腹股沟疝、子宫、乳房等组织。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用物理溶胀、物理冻融、化学洗脱相结合，并且在脱细胞处理过程中适时加入了氧化酶，各步骤有效协同，保证了较高的脱细胞效率，细胞外基质中胶原结构的完整，此外，巧妙选用ZnCl2溶液进行溶胀，进一步提高孔隙率和净化效果。
附图说明
图1为实施例1所制备的脱细胞基质材料的电镜形貌图；
图2为实施例2所制备的脱细胞基质材料的电镜形貌图；
图3为实施例3所制备的脱细胞基质材料的电镜形貌图；
图4为对比例1所制备的脱细胞基质材料的电镜形貌图；
图5为对比例2所制备的脱细胞基质材料的电镜形貌图；
图6为对比例3所制备的脱细胞基质材料的电镜形貌图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例制备脱细胞基质材料，包括以下步骤：
(A1)基质材料的前处理
取猪的小肠组织，选择柔软光滑、无破损溃烂、无病变的小肠，将小肠壁组织部分用生理盐水清洗，滤干，再将该组织部分的浆膜层、肌肉层以及粘膜层去除，然后用生理盐水对保留下来的小肠粘膜下层冲洗至看不到多余的组织或污渍，滤干。
(A2)细菌和病毒的灭活
对步骤(A1)中得到的小肠粘膜下层浸泡在生理盐水中并紫外光照射15分钟，小肠粘膜下层与生理盐水的体积比为1：200，取出小肠粘膜下层并浸泡于由10mg/L青霉素、10mg/L链霉素和10mg/L氯霉素组成的抗生素25℃水溶液中24小时，小肠粘膜下层与抗生素水溶液的体积比为1：150，取出小肠粘膜下层用无菌水清洗三次，每次10分钟，然后将小肠粘膜下层浸泡于质量浓度5％的过氧乙酸25℃水溶液中2小时，小肠粘膜下层与过氧乙酸水溶液的体积比为1：120，取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A3)修复性脱细胞
将经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸入ZnCl2水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时(ZnCl2溶液浓度为6M)，小肠粘膜下层与ZnCl2水溶液的体积比为1：200，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟；
将上述小肠粘膜下层在-80℃下孵育2小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环4次；
取出小肠粘膜下层并浸泡于由1mg/mL的D-氨基酸氧化酶、1mg/mL的L-氨基酸氧化酶组成的4℃的氧化酶水溶液中24小时，小肠粘膜下层与氧化酶水溶液的体积比为1：200；
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于由0.5mg/mL的吐温60、0.7mg/mL的PEG400组成的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：200；
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将2层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-25℃并保温2小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为25Pa，并调节温度至-15℃保温7小时，最后调节温度至0℃保温4小时，即完成加工得到脱细胞基质材料。
对脱细胞基质材料进行扫描电镜检测，扫描电镜为蔡司Sigma 300ASAP，扫描参数：电压是3.00kV、工作距离14.5mm、放大倍数是8000倍。扫描部位为补片的表面形貌图，如图1所示。
实施例2
本实施例制备脱细胞基质材料，包括以下步骤：
(A1)基质材料的前处理
取猪的小肠组织，选择柔软光滑、无破损溃烂、无病变的小肠，将小肠壁组织部分用生理盐水清洗，滤干，再将该组织部分的浆膜层、肌肉层以及粘膜层去除，然后用生理盐水对保留下来的小肠粘膜下层冲洗至看不到多余的组织或污渍，滤干；
(A2)细菌和病毒的灭活
对步骤(A1)中得到的小肠粘膜下层浸泡在生理盐水中并紫外光照射20分钟，小肠粘膜下层与生理盐水的体积比为1：160，取出小肠粘膜下层并浸泡于35℃的由15mg/L青霉素、10mg/L万古霉素组成的抗生素水溶液中12小时，小肠粘膜下层与抗生素水溶液的体积比为1：150，取出小肠粘膜下层用无菌水清洗三次，每次10分钟，然后将小肠粘膜下层浸泡于质量浓度5％的过氧乙酸25℃水溶液中2小时，小肠粘膜下层与过氧乙酸水溶液的体积比为1：150，取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A3)修复性脱细胞
将经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸入ZnCl2水溶液中并于摇床中20℃下孵育5小时(ZnCl2溶液浓度为4.5M)，小肠粘膜下层与ZnCl2水溶液的体积比为1：180，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟，
将上述小肠粘膜下层在-40℃下孵育7小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环3次，
取出小肠粘膜下层并浸泡于0.05mg/mL的L-α-羟基酸氧化酶的4℃氧化酶水溶液中24小时，小肠粘膜下层与氧化酶水溶液的体积比为1：160，
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于0.05mg/mL的吐温80的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：120，
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将单层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-35℃并保温2小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为20Pa，并调节温度至-20℃保温5小时，最后调节温度至0℃保温6小时，即完成加工得到脱细胞基质材料，电镜形貌图如图2所示。
实施例3
本实施例制备脱细胞基质材料，包括以下步骤：
(A1)基质材料的前处理
取猪的小肠组织，选择柔软光滑、无破损溃烂、无病变的小肠，将小肠壁组织部分用生理盐水清洗，滤干，再将该组织部分的浆膜层、肌肉层以及粘膜层去除，然后用生理盐水对保留下来的小肠粘膜下层冲洗至看不到多余的组织或污渍，滤干；
(A2)细菌和病毒的灭活
对步骤(A1)中得到的小肠粘膜下层浸泡在生理盐水中并紫外光照射20分钟，小肠粘膜下层与生理盐水的体积比为1：130，取出小肠粘膜下层并浸泡于由8mg/L链霉素、6mg/L万古霉素和12mg/L氯霉素组成的抗生素25℃水溶液中20小时，小肠粘膜下层与抗生素水溶液的体积比为1：200，取出小肠粘膜下层用无菌水清洗三次，每次10分钟，然后将小肠粘膜下层浸泡于质量浓度5％的过氧乙酸25℃水溶液中2小时，小肠粘膜下层与过氧乙酸水溶液的体积比为1：140，取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A3)修复性脱细胞
将经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸入ZnCl2水溶液中并于摇床中40℃下孵育2小时(ZnCl2溶液浓度为3M)，小肠粘膜下层与ZnCl2水溶液的体积比为1：150，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟；
将上述小肠粘膜下层在-20℃下孵育24小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环4次；
取出小肠粘膜下层并浸泡于由7.5mg/mL的尿酸氧化酶、2.5mg/mL的D-氨基酸氧化酶组成的4℃的氧化酶水溶液中24小时，小肠粘膜下层与氧化酶水溶液的体积比为1：100；
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于由2.5mg/mL的吐温80、2.5mg/mL的PEG400组成的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：160；
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将两层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-45℃并保温1小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为25Pa，并调节温度至-20℃保温7小时，最后调节温度至0℃保温5小时，即完成加工得到脱细胞基质材料，电镜形貌图如图3所示。
实施例4
与实施例2相比，区别仅在于在(A3)修复性脱细胞的溶胀操作中，使用氯化钠替代氯化锌，其余操作均同实施例2：
(A3)修复性脱细胞
将实施例2中经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸入NaCl水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时(NaCl溶液浓度为4.5M)，小肠粘膜下层与NaCl水溶液的体积比为1：180，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟；
将上述小肠粘膜下层在-40℃下孵育7小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环3次；
取出小肠粘膜下层并浸泡于2.5mg/mL的L-α-羟基酸氧化酶的4℃氧化酶水溶液中24小时，小肠粘膜下层与氧化酶水溶液的体积比为1：160；
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于1.8mg/mL的吐温80的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：120；
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将单层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-35℃并保温2小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为20Pa，并调节温度至-20℃保温5小时，最后调节温度至0℃保温6小时，即完成加工得到脱细胞基质材料。
实施例5
与实施例2相比，区别仅在于在(A3)修复性脱细胞的溶胀操作中，使用氯化钙替代氯化锌，其余操作均同实施例2：
(A3)修复性脱细胞
将实施例2中经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸入CaCl2水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时(CaCl2溶液浓度为4.5M)，小肠粘膜下层与CaCl2水溶液的体积比为1：180，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟；
将上述小肠粘膜下层在-40℃下孵育7小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环3次；
取出小肠粘膜下层并浸泡于2.5mg/mL的L-α-羟基酸氧化酶的4℃氧化酶水溶液中24小时，小肠粘膜下层与氧化酶水溶液的体积比为1：160；
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于1.8mg/mL的吐温80的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：120；
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将单层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-35℃并保温2小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为20Pa，并调节温度至-20℃保温5小时，最后调节温度至0℃保温6小时，即完成加工得到脱细胞基质材料。
实施例6
与实施例2相比，区别仅在于在(A3)修复性脱细胞的溶胀操作中，使用氯化钾替代氯化锌，其余操作均同实施例2：
(A3)修复性脱细胞
将实施例2中经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸入KCl水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时(KCl溶液浓度为4.5M)，小肠粘膜下层与KCl水溶液的体积比为1：180，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟；
将上述小肠粘膜下层在-40℃下孵育7小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环3次；
取出小肠粘膜下层并浸泡于2.5mg/mL的L-α-羟基酸氧化酶的4℃氧化酶水溶液中24小时，小肠粘膜下层与氧化酶水溶液的体积比为1：160；
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于1.8mg/mL的吐温80的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：120；
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将单层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-35℃并保温2小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为20Pa，并调节温度至-20℃保温5小时，最后调节温度至0℃保温6小时，即完成加工得到脱细胞基质材料。
实施例7
与实施例2相比，区别仅在于在(A3)修复性脱细胞的溶胀操作中，使用氯化镁替代氯化锌，其余操作均同实施例2：
(A3)修复性脱细胞
将实施例2中经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸入MgCl2水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时(MgCl2溶液浓度为4.5M)，小肠粘膜下层与MgCl2水溶液的体积比为1：180，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟；
将上述小肠粘膜下层在-40℃下孵育7小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环3次；
取出小肠粘膜下层并浸泡于2.5mg/mL的L-α-羟基酸氧化酶的4℃氧化酶水溶液中24小时，小肠粘膜下层与氧化酶水溶液的体积比为1：160；
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于1.8mg/mL的吐温80的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：120；
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将单层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-35℃并保温2小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为20Pa，并调节温度至-20℃保温5小时，最后调节温度至0℃保温6小时，即完成加工得到脱细胞基质材料。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于在(A3)修复性脱细胞中，先进行表面活性剂处理，再进行氧化酶处理，其余操作均同实施例1；
(A3)修复性脱细胞
将实施例1中经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸入ZnCl2水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时(ZnCl2溶液浓度为6M)，小肠粘膜下层与ZnCl2水溶液的体积比为1：200，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟；
将上述小肠粘膜下层在-80℃下孵育2小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环4次；
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于由0.5mg/mL的吐温60、0.7mg/mL的PEG400组成的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：200；
取出小肠粘膜下层并浸泡于由1mg/mL的D-氨基酸氧化酶、1mg/mL的L-氨基酸氧化酶组成的4℃的氧化酶水溶液中24小时，小肠粘膜下层与氧化酶水溶液的体积比为1：200；
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将2层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-25℃并保温2小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为25Pa，并调节温度至-15℃保温7小时，最后调节温度至0℃保温4小时，即完成加工得到脱细胞基质材料，电镜形貌图如图4所示。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于在(A3)修复性脱细胞中，在溶胀前进行氧化酶处理，其余操作均同实施例1：
(A3)修复性脱细胞
将实施例1中经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸泡于由1mg/mL的D-氨基酸氧化酶、1mg/mL的L-氨基酸氧化酶组成的4℃的氧化酶水溶液中24小时，小肠粘膜下层与氧化酶水溶液的体积比为1：200，
取出小肠粘膜下层并浸入ZnCl2水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时(ZnCl2溶液浓度为6M)，小肠粘膜下层与ZnCl2水溶液的体积比为1：200，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟；
将上述小肠粘膜下层在-80℃下孵育2小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环4次；
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于由0.5mg/mL的吐温60、0.7mg/mL的PEG400组成的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：200；
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将2层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-25℃并保温2小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为25Pa，并调节温度至-15℃保温7小时，最后调节温度至0℃保温4小时，即完成加工得到脱细胞基质材料，电镜形貌图如图5所示。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于在(A3)修复性脱细胞中，未进行氧化酶处理，其余操作均同实施例1：
(A3)修复性脱细胞
将实施例1中经过步骤(A2)处理的小肠粘膜下层浸入ZnCl2水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时(ZnCl2溶液浓度为6M)，小肠粘膜下层与ZnCl2水溶液的体积比为1：200，取出小肠粘膜下层并用生理盐水清洗3次，每次5分钟，
将上述小肠粘膜下层在-80℃下孵育2小时后，置于足量的25℃生理盐水中融化，反复循环4次，
取出小肠粘膜下层，将其浸泡于由0.5mg/mL的吐温60、0.7mg/mL的PEG400组成的表面活性剂水溶液中并于摇床中37℃下孵育2小时，小肠粘膜下层与表面活性剂水溶液的体积比为1：200，
取出小肠粘膜下层并在超声条件下清洗3次，每次10分钟，然后滤干；
(A4)固定成型
将2层步骤(A3)中得到的小肠粘膜下层放置在模具上；
(A5)真空冷冻干燥
将步骤(A4)中装有小肠粘膜下层的模具置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-25℃并保温2小时，然后开启真空泵调节腔室内的压强为25Pa，并调节温度至-15℃保温7小时，最后调节温度至0℃保温4小时，即完成加工得到脱细胞基质材料，电镜形貌图如图6所示。
测试例
本测试例对上述实施例和对比例所制备的脱细胞基质材料进行检测，分别用高性能全自动压汞仪检测了脱细胞基质的孔隙率。使用光学显微镜100倍视野观察视野中细胞数量；使用PCR法检测DNA残留量；使用扫描电镜检测胶原蛋白结构。结果如表1所示，可以看到本发明中控制特定的制备流程，严格控制依次进行溶胀处理、冻融处理、氧化酶浸泡处理和表面活性剂处理，能够显著提高脱细胞基质材料孔隙率，且视野细胞数量、DNA残留量更低，表明本发明采用物理溶胀、物理冻融、化学洗脱相结合，并且在脱细胞处理过程中适时加入了氧化酶，各步骤有效协同，保证了较高的脱细胞效率，细胞外基质中胶原结构的完整，从各实施例和各对比例中可以看到实施例中胶原骨架更加完整，而对比例中部分胶原骨架坍塌，而在后续补片植入后胶原蛋白骨架完整的更加利于细胞的长入以及伤口的恢复，此外，巧妙选用ZnCl2溶液进行溶胀，进一步提高孔隙率和净化效果。
表1
| 孔隙率 | 视野细胞数量 | DNA残留量 | |
| 实施例1 | 94％ | 0个 | 2ng/mg |
| 实施例2 | 95％ | 0个 | 2ng/mg |
| 实施例3 | 92％ | 1个 | 3ng/mg |
| 实施例4 | 85％ | 1个 | 2ng/mg |
| 实施例5 | 85％ | 2个 | 3ng/mg |
| 实施例6 | 83％ | 1个 | 3ng/mg |
| 实施例7 | 83％ | 2个 | 1ng/mg |
| 对比例1 | 82％ | 1个 | 2ng/mg |
| 对比例2 | 83％ | 2个 | 1ng/mg |
| 对比例3 | 80％ | 1个 | 3ng/mg |
综上所述，本发明采用物理溶胀、物理冻融、化学洗脱相结合，保证了较高的脱细胞效率，并且在脱细胞处理过程中适时加入了氧化酶，使氧化酶充分渗透到脱细胞基质中，从而在使用表面活性剂时氧化酶在组织中起到缓冲作用，保证了细胞外基质中胶原结构的完整。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
对小肠粘膜下层进行前处理，对前处理后小肠粘膜下层依次进行溶胀处理、冻融处理、氧化酶浸泡处理和表面活性剂处理，得到所述脱细胞基质材料；
所述溶胀处理包括：将小肠粘膜下层与高渗溶液混合并孵育，所述高渗溶液为ZnCl2溶液，所述高渗溶液的浓度为3~6 M；
所述氧化酶包括脂肪氧化酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶或L-α-羟基酸氧化酶中任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述前处理包括清洗和干燥处理；
所述前处理还包括细菌和病毒灭活处理；
所述细菌和病毒灭活处理包括：对小肠粘膜下层进行紫外光照射，然后使用抗生素溶液进行孵育处理，清洗并使用过氧乙酸进行孵育处理；
所述抗生素溶液含有庆大霉素、万古霉素、青霉素、链霉素、头孢西丁或氯霉素中任意一种或至少两种的组合；
所述抗生素溶液总浓度为1~100 mg/L。
3.如权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述孵育的时间2~5小时，温度为20~40℃。
4.如权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述冻融处理包括：将小肠粘膜下层置于-80℃~-20℃中孵育2~24小时，随后置于20~30℃生理盐水中融化，重复3~5次。
5.如权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述氧化酶工作浓度为0.05~10 mg/mL。
6.如权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂包括皂化物、聚乙二醇或吐温中任意一种或至少两种的组合；
所述表面活性剂工作浓度为0.05~5 mg/mL。
7.如权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂处理后还包括固定成型和真空冷冻干燥的步骤；
所述固定成型包括：将至少一层小肠粘膜下层放置在模具上；
所述真空冷冻干燥包括：将装有小肠粘膜下层的模具在真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥；
所述冷冻干燥的程序包括：预冻至-45℃～-25℃，并保温1~2小时；设置压强为20~25Pa，并调节温度至-25℃~-15℃，保温5~7小时；最后调节温度至0℃，保温4~6小时。
8.如权利要求1-7任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）对小肠粘膜下层进行清洗和干燥处理；
（2）取步骤（1）处理后小肠粘膜下层进行紫外光照射，然后使用抗生素溶液进行孵育处理，清洗并使用过氧乙酸进行孵育处理，清洗并干燥；
（3）对步骤（2）处理后小肠粘膜下层与3~6 M ZnCl2溶液混合并于20~30℃孵育2~5小时，清洗；随后将小肠粘膜下层置于-80℃~-20℃中孵育2~24小时，随后置于20~30℃生理盐水中融化，重复3~5次；随后将小肠粘膜下层与0.05~10 mg/mL氧化酶的溶液于2~6℃混合20~30小时；随后取出小肠粘膜下层与0.05~5 mg/mL表面活性剂的溶液于30~40℃混合1~5小时，清洗并干燥；
（4）将步骤（3）处理后小肠粘膜下层放置在模具上，将装有小肠粘膜下层的模具在真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥；所述冷冻干燥的程序包括：预冻至-45℃~-25℃，并保温1~2小时；设置压强为20~25 Pa，并调节温度至-25℃~-15℃，保温5~7小时；最后调节温度至0℃，保温4~6小时。
9.一种脱细胞基质材料，其特征在于，所述脱细胞基质材料由权利要求1-8任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的脱细胞基质材料在制备医疗植入材料中的应用。
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