CN113425900A - 一种胶原水凝胶材料及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料领域,具体涉及一种取自基因编辑动物的胶原水凝胶材料及其制备方法和用途。利用本发明加工制备的胶原水凝胶材料,通过基因编辑技术从原材料源头降低其免疫原性,使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性。本发明的胶原水凝胶材料免疫原性低、生物活性好,用于临床不同组织/器官的修复再生。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域,特别涉及一种胶原水凝胶材料及其制备方法和用途。
背景技术
胶原蛋白简称胶原,是细胞外基质的主要成分,占动物体内蛋白质总量的20-30%,广泛存在于动物的结缔组织(骨、软骨、皮肤、腱、韧带等)中,对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用。在一般外科、皮肤、骨科、口腔外科、神经外科、心脏血管外科、美容整形、药物运输等医疗卫生领域广泛应用。胶原水凝胶具有组织相似的结构和成分,通常用于填充修复材料等。
虽然胶原本身的免疫原性很低,但在实际提取过程中由于无法彻底清除杂蛋白和多糖等,可能引起免疫排斥反应。针对这一潜在问题,本发明通过基因编辑技术彻底敲除动物源性胶原材料中的某些特定抗原(如a-Gal抗原),从原材料源头降低其免疫原性,使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种胶原水凝胶材料及其制备方法和用途。利用本发明加工制备的胶原水凝胶材料,通过基因编辑技术从原材料源头降低其免疫原性,使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性。本发明的胶原水凝胶材料免疫原性低、生物活性好,用于临床不同组织/器官的修复再生,在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种胶原水凝胶材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1、繁育基因编辑动物;
步骤2、采集步骤1动物的胶原原材料作为原料;
步骤3、取步骤2制得的所述原料脱细胞;
步骤4、取步骤3制得的材料分解;
步骤5、取步骤4制得的分解产物,纯化,调节pH值、温度或交联化,制得胶原水凝胶材料;
其中,步骤3具体为:
浸没于0.001~2wt.%中性蛋白酶溶液中,温度为10~40℃,振荡频率为100~1000rpm,处理时间为2~12h;中性蛋白酶的酶活为800~10000U/g,工作浓度范围为0.6~2.4U/ml;
超声波清洗,40~100KHz处理3~24h,功率300W~5KW,温度为0~40℃;
浸没于0.001~5wt.%SDS溶液中3~24h,振荡频率为100~3000rpm,温度为10~40℃;
超声波清洗,60~100KHz处理3~12h,功率5~10KW,温度为0~40℃;
步骤4具体为:
浸没于0.001~10wt.%胃蛋白酶溶液中6~24h,振荡频率为300~1000rpm,处理温度为0~40℃;胃蛋白酶的酶活为1000~10000U/g;
超声波20~100KHz处理3~12h,功率1~10KW,温度为0~40℃;
浸没于0.001~20wt.%乙酸溶液中6~24h,振荡频率为100~1000rpm,温度为0~40℃;
超声波50~100KHz处理3~12h,功率1~10KW,温度为0~40℃。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤3具体为:
浸没于0.08wt.%中性蛋白酶溶液中,温度为25℃,震荡频率为100rpm,处理时间为8h;
浸没于超声波清洗器中,110KHz处理30min,功率1KW,温度为10℃;
浸没于0.1wt.%SDS溶液中12h,震荡频率为1000rpm,温度为30℃;
浸没于超声波清洗器中,20KHz处理200min,功率5KW,温度为30℃。
步骤4具体为:将胶原原材料进行如下分解处理:
浸没于1wt.%胃蛋白酶溶液中10h,震荡频率为500rpm,处理温度为37℃;
浸没于超声波装置中,80KHz处理6h,功率8KW,温度为20℃;
浸没于1wt.%乙酸溶液中12h,震荡频率为600rpm,温度为30℃;
浸没于超声波装置中,120KHz处理3h,功率5KW,温度为30℃。
在本发明的一些具体实施方案中,步骤3具体为:
浸没于2wt.%中性蛋白酶溶液中,温度为10℃,振荡频率为1000rpm,处理时间为12h;中性蛋白酶的酶活为800U/g,工作浓度范围为2.4U/ml;
超声波清洗,100KHz处理24h,功率5KW,温度为40℃;
浸没于1wt.%SDS溶液中10h,振荡频率为500rpm,温度为20℃;
超声波清洗,60KHz处理6h,功率56KW,温度为20℃;
步骤4具体为:将胶原原材料进行如下分解处理:
浸没于2wt.%胃蛋白酶溶液中12h,振荡频率为1000rpm,处理温度为37℃;胃蛋白酶的酶活为1000U/g;
超声波100KHz处理6h,功率5KW,温度为10℃;
浸没于5wt.%乙酸溶液中12h,振荡频率为500rpm,温度为20℃;
超声波50KHz处理6h,功率1KW,温度为20℃;
在本发明的一些具体实施方案中,步骤3具体为:
浸没于0.1wt.%中性蛋白酶溶液中,温度为20℃,振荡频率为300rpm,处理时间为6h;中性蛋白酶的酶活为1000U/g,工作浓度范围为1.2U/ml;
超声波清洗,60KHz处理14h,功率1KW,温度为40℃;
浸没于1wt.%SDS溶液中12h,振荡频率为1000rpm,温度为30℃;
超声波清洗,80KHz处理6h,功率8KW,温度为20℃;
步骤4具体为:将胶原原材料进行如下分解处理:
浸没于5wt.%胃蛋白酶溶液中12h,振荡频率为400rpm,处理温度为20℃;胃蛋白酶的酶活为2000U/g;
超声波20KHz处理3h,功率10KW,温度为20℃;
浸没于10wt.%乙酸溶液中20h,振荡频率为500rpm,温度为25℃;
超声波50KHz处理12h,功率1KW,温度为5℃。
在本发明的一些具体实施方案中,所述基因编辑包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中,所述基因编辑包括基因敲除和/或基因转入;
所述基因敲除中敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2或PERV中的至少一种;
基因转入中转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI或EPCR中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中,所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种;所述动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物。在另一些具体实施方案中,选用基因编辑后稳定传代4代的动物。
所述鱼包括淡水鱼类。
所述海洋生物包括海洋动物和海洋植物;所述海洋动物包括海洋哺乳动物、海洋爬行动物、海洋鱼类、海洋节肢动物、藤壶、海洋软体动物、海洋棘皮动物或海洋腔肠动物中的一种或多种。所述海洋哺乳动物包括蓝鲸、抹香鲸、虎鲸、齿鲸、海豚、海豹、海狮、儒艮中的一种或多种。所述海洋爬行动物包括海蛇、海龟中的一种或多种。所述海洋鱼类包括前口蝠鲼、电鳐、刺鳐、星鳐、何氏鳐、中国团扇鳐、瞻星鱼、电鳗、康吉鳗、电鲶、箱鲀、鲂鮄、海马、石首鱼类、象鼻鱼、鲨鱼、蝴蝶鱼、刺盖鱼、甲尻鱼、石斑鱼、粗皮鲷、躄鱼、蝙蝠鱼、小丑鱼、带鱼、龙头鱼、烛光鱼、翻车鱼中的一种或多种。所述海洋节肢动物包括鲎、虾、蟹中的一种或多种。所述海洋软体动物包括石鳖、螠蛏、海兔中的一种或多种。所述海洋棘皮动物包括海星、海胆、海参中的一种或多种。所述海洋腔肠动物包括水母、薮枝螅、海蜇、珊瑚或海葵中的一种或多种。所述海洋植物包括浮游藻和底栖藻;所述底栖藻包括绿藻类、褐藻类和红藻类。
在本发明的一些具体实施方案中,所述胶原原材料包括真皮、筋膜、巩膜、被膜、腱、纤维软骨、骨、牙本质;透明软骨和弹性软骨;网状纤维、平滑肌、神经内膜、动脉、肝、脾、肾、肺、子宫;基膜、晶状体囊;胎膜、肌、腱鞘中的至少一种。
在上述研究的基础上,本发明还提供了所述的方法制得的胶原水凝胶材料。
本发明还提供了所述的胶原水凝胶材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。
在上述研究的基础上,本发明还提供了组合物,包括本发明所述的胶原水凝胶材料以及医学或药学上可接受的活性分子或活细胞,所述活性分子包括生长因子;所述活细胞包括干细胞。
本发明还提供了所述的组合物在组织工程、再生医学、转化医学中的应用。
本发明提供了一种胶原水凝胶材料的制备方法,以及由此方法制备的胶原水凝胶材料及其用途。(1)“基因编辑技术”,通过基因编辑技术获得低免疫原性动物,采集胶原原材料,即通过基因编辑技术从材料来源上降低胶原材料的免疫原性;(2)“渐次脱细胞技术”,不同于常规方法(如高浓度试剂一次性脱细胞),采用“少量多次”的原则进行脱细胞处理,比如,通过多次循环使用中性蛋白酶溶液浸泡、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液浸泡、反复冻融、超声等步骤脱除原材料中的细胞、多糖等活性成分,从而降低胶原原材料的免疫原性,同时尽量降低处理过程中对材料活性等影响;(3)“渐次分解技术”,通过多次循环使用胃蛋白酶溶液浸泡、乙酸溶解、超声等步骤逐步分解胶原原材料。本发明的胶原水凝胶材料用于临床不同组织/器官的修复再生。
本发明胶原水凝胶材料的制备方法,涉及基因编辑技术,与常规方法不同(通过物理、化学、生物方法对既有动物组织/器官进行处理),基因编辑技术是对目标基因进行定点“编辑”,实现对特定DNA片段的修饰,从胶原材料的源头(采集动物)降低其免疫原性。此过程中,根据具体组织材料的特点,经过筛选确定编辑系统、目标基因、动物种类等,其中目标基因范围包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2和PERV等敲除基因,以及hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI和EPCR等转入基因。以α-Gal为例,当胶原材料中残留的异种抗原进入人体内时,会引发超急性免疫排斥反应,这种免疫排斥反应的主要靶抗原被认为是由存在于动物组织中的a-Gal抗原引起的,a-Gal抗原存在于除人和高等灵长动物以外的大部分哺乳动物体内;通过基因编辑技术开发a-Gal抗原敲除(GTKO)胶原材料,可以明显降低其免疫原性。
另一方面,本发明胶原水凝胶材料的制备方法,涉及脱细胞技术和交联技术,与常规方法不同(如高浓度SDS溶液单次脱细胞或高浓度戊二醛单次交联),根据基因编辑技术降低其免疫原性的效果,将优化脱细胞处理和交联处理,比如,低浓度SDS溶液多次脱细胞或低浓度戊二醛多次交联,通过温和的处理方式尽量减小处理过程中对材料生物活性等影响。
因此,本发明提供的胶原水凝胶材料及其制备方法和用途具有重要的现实意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1与对比例1的免疫组化检测结果;
图2示实施例1与对比例1的组织相容性测试结果;
图3示实施例2与对比例2的免疫组化检测结果;
图4示实施例2与对比例2的组织相容性测试结果;
图5示实施例3与对比例3的免疫组化检测结果;
图6示实施例3与对比例3的组织相容性测试结果。
具体实施方式
本发明公开了一种胶原水凝胶材料及其制备方法和用途,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种胶原水凝胶材料的制备方法,包括如下步骤:
a.繁育基因编辑技术动物;
b.采集胶原原材料;
c.将胶原原材料进行多次循环脱细胞处理,比如,处理方式包括超声、中性蛋白酶溶液浸泡、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液浸泡;
d.将胶原原材料进行多次循环分解处理,处理方式包括胃蛋白酶溶液浸泡、乙酸溶解、超声;
e.通过超滤提纯胶原材料;
f.通过调控pH值、温度或加入交联剂制备胶原水凝胶。
在一些实施例中,所述基因编辑技术包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。
在一些实施例中,所述基因编辑技术包括基因敲除和基因转入两种,其中,敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2和PERV中的至少一种,转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI和EPCR中的至少一种。
在一些实施例中,所述动物包括猪、牛、羊、猴、狗、兔、鼠、鱼、海洋生物、驴中的至少一种;所述用于制备胶原水凝胶材料的动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物,进一步的,选用基因编辑后稳定传代4代的动物制备胶原水凝胶材料。
在一些实施例中,所述胶原原材料取自真皮、筋膜、巩膜、被膜、腱、纤维软骨、骨、牙本质;透明软骨和弹性软骨;网状纤维、平滑肌、神经内膜、动脉、肝、脾、肾、肺、子宫;基膜、晶状体囊;胎膜、肌、腱鞘中的至少一种。
在一些实施例中,在多次循环脱细胞处理中,所述超声处理中低频频率范围为10~40KHz,低频处理时间为5min~24h,高频频率范围为60~120KHz,高频处理时间为5min~24h,超声功率为100W~10KW,超声温度为0~40℃;所述中性蛋白酶处理中中性蛋白酶浓度范围为0.001~5wt.%,中性蛋白酶酶活为800~10000U/g,工作浓度范围为0.6~2.4U/ml,处理温度为0~40℃,振荡频率为50~3000rpm,处理时间为0.5~24h;所述SDS处理中SDS浓度范围为0.001~5wt.%,振荡频率为100~3000rpm,处理温度为0~40℃,处理时间为0.5~24h;所述多次循环处理是将上述处理方法进行组合使用,每种处理方法的使用次数为0~10次。在多次循环分解处理中,所述超声处理中低频频率范围为10~40KHz,低频处理时间为1~24h,高频频率范围为60~120KHz,高频处理时间为1~24h,超声功率为1~10KW,超声温度为0~40℃;所述胃蛋白酶溶液处理中胃蛋白酶浓度范围为0.001~10wt.%,酶活为1000~10000U/g,振荡频率为100~3000rpm,处理温度为0~40℃,处理时间为0.5~48h;所述乙酸处理中乙酸浓度为0.001~20wt.%;所述多次循环处理是将上述处理方法进行组合使用,每种处理方法的使用次数为0~10次。
在一些实施例中,所述交联剂包括化学交联剂和生物交联剂中的至少一种;进一步的,化学交联剂包括醛类、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)、马来酰亚胺类、卤乙酰基类、二硫代联吡啶、酰肼类、碳二亚酰胺类中的至少一种;更进一步的,醛类包括戊二醛、多聚甲醛中的至少一种;生物交联剂包括原花青素、京尼平中的至少一种。
本发明还提供了所述的方法制备的胶原水凝胶材料。
本发明还提供了所述的胶原水凝胶材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。
本发明提供的胶原水凝胶在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞,活性分子包括生长因子;活细胞包括干细胞。
本发明提供的胶原水凝胶材料及其制备方法和用途中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1
一种胶原水凝胶材料及其制备方法和组织工程应用。
制备方法如下:
a.通过TALEN系统基因编辑制备敲除GGTA1,转入hCD55的猪,使用稳定传代5代的基因编辑猪;
b.采集基因编辑猪皮作为胶原提取原材料;
c.将胶原原材料进行如下脱细胞处理:
c1.浸没于0.08wt.%中性蛋白酶溶液中,温度为25℃,震荡频率为100rpm,处理时间为8h;
c2.浸没于超声波清洗器中,110KHz处理30min,功率1KW,温度为10℃;
c3.浸没于0.1wt.%SDS溶液中12h,震荡频率为1000rpm,温度为30℃;
c4.浸没于超声波清洗器中,20KHz处理200min,功率5KW,温度为30℃。
d.将胶原原材料进行如下分解处理:
d1.浸没于1wt.%胃蛋白酶溶液中10h,震荡频率为500rpm,处理温度为37℃;
d2.浸没于超声波装置中,80KHz处理6h,功率8KW,温度为20℃;
d3.浸没于1wt.%乙酸溶液中12h,震荡频率为600rpm,温度为30℃;
d4.浸没于超声波装置中,120KHz处理3h,功率5KW,温度为30℃;
e.超滤提纯胶原材料;
f.通过1wt.%戊二醛交联制备胶原水凝胶材料。
通过以上步骤制备的胶原水凝胶材料,用于骨修复填充材料。
对比例1
采集普通猪皮制备胶原水凝胶材料。将猪皮加入0.5M乙酸溶胀10h,振荡频率为500rpm,处理温度为37℃,即得到猪皮胶原的酸粗提取液。通过10℃超滤提取得到胶原材料。通过1wt.%戊二醛交联制备胶原水凝胶材料。
效果例1免疫原性测试
1.1Gal含量检测:通过人α半乳糖苷酶(αGAL)ELISA试剂盒定量检测样品中Gal含量。
结果如下:
参照行业标准《组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留αGal抗原检测》(YY/T1561-2017)中的方法,按照中检院器械所质量评价室的“动物源医疗器槭中残留α-Gal抗原含量和Gal抗原清除率检测标准操作规范”(NIFDC-SOP-F-T-3001)进行检测,敲除GGTA1的猪(GTKO猪,实施例1用猪)皮肤样品的Gal抗原含量低于最低检测限(湿重),对照组野生猪(对比例1用猪)Gal抗原含量为2.03±0.28×1015个/mg(湿重),最低检测限为0.03125(相对于Gal-BSA)ug/mL(相当于8.25×1011个抗原表位/每个反应)。说明实施例1样品具有更低的免疫原性。
1.2免疫组化检测:在大鼠皮下植入样品,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围皮肤组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,用CD3单抗做免疫组化染色。
结果如图1所示:
CD3单抗进行免疫组化染色,主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的T细胞(深棕色)。结果表明,经过1个月大鼠皮下植入,实施例1样品发现少量T细胞,而对比例1发现大量T细胞,说明实施例1样品的免疫原性低于对比例1。
效果例2生物活性测试
2.1组织相容性检测:将样品植入大鼠肌肉内,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围肌肉组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,进行HE染色。
结果如图2所示:
HE染色表明,经过1个月大鼠肌肉植入,与对比例1样品比较,实施例1样品和周围肌肉组织融合更好,说明实施例1样品的生物活性更好。
实施例2
一种胶原水凝胶材料及其制备方法和组织工程应用。
制备方法如下:
a.通过CRISPR/Cas系统基因编辑制备敲除GGTA1的牛,使用稳定传代4代的基因编辑猪;
b.采集基因编辑牛皮作为胶原提取原材料;
c.将胶原原材料进行如下脱细胞处理:
c1.浸没于2wt.%中性蛋白酶溶液中,温度为10℃,振荡频率为1000rpm,处理时间为12h;中性蛋白酶的酶活为800U/g,工作浓度范围为2.4U/ml;
c2.超声波清洗,100KHz处理24h,功率5KW,温度为40℃;
c3.浸没于1wt.%SDS溶液中10h,振荡频率为500rpm,温度为20℃;
c4.超声波清洗,60KHz处理6h,功率56KW,温度为20℃;
d.将胶原原材料进行如下分解处理:
浸没于2wt.%胃蛋白酶溶液中12h,振荡频率为1000rpm,处理温度为37℃;胃蛋白酶的酶活为1000U/g;
超声波100KHz处理6h,功率5KW,温度为10℃;
浸没于5wt.%乙酸溶液中12h,振荡频率为500rpm,温度为20℃;
超声波50KHz处理6h,功率1KW,温度为20℃;
e.超滤提纯胶原材料;
f.通过调节胶原溶液pH值中性在37℃形成胶原水凝胶材料。
通过以上步骤制备的胶原水凝胶材料,用于软骨再生材料。
对比例2
采集普通牛皮制备胶原水凝胶材料。采集牛皮真皮层加入1M盐酸溶胀12h,振荡频率为1000rpm,处理温度为20℃,即得到牛皮胶原的酸粗提取液。通过20℃超滤提取得到胶原材料。通过调节胶原溶液pH值中性在37℃形成胶原水凝胶材料。
效果例3免疫原性测试
3.1免疫组化检测:在大鼠皮下植入样品,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围皮肤组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,用CD68单抗做免疫组化染色。
结果如图3所示:
CD68单抗进行免疫组化染色,主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的巨噬细胞(深棕色)。结果表明,经过2个月大鼠皮下植入,实施例2样品发现少量巨噬细胞,而对比例2发现大量巨噬细胞,说明实施例2样品的免疫原性低于对比例2。
效果例4生物活性测试
4.1组织相容性检测:将样品植入大鼠肌肉内,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围肌肉组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,进行HE染色。
结果如图4所示:
HE染色表明,经过1个月大鼠肌肉植入,与对比例2样品比较,实施例2样品和周围肌肉组织融合更好,说明实施例2样品的生物活性更好。
实施例3
一种胶原水凝胶材料及其制备方法和组织工程应用。
制备方法如下:
a.通过ZFNs系统基因编辑制备敲除GGTA1、转入hCD55的马,使用稳定传代3代的基因编辑马;
b.采集基因编辑马跟腱作为胶原提取原材料;
c.将胶原原材料进行如下脱细胞处理:
浸没于0.1wt.%中性蛋白酶溶液中,温度为20℃,振荡频率为300rpm,处理时间为6h;中性蛋白酶的酶活为1000U/g,工作浓度范围为1.2U/ml;
超声波清洗,60KHz处理14h,功率1KW,温度为40℃;
浸没于1wt.%SDS溶液中12h,振荡频率为1000rpm,温度为30℃;
超声波清洗,80KHz处理6h,功率8KW,温度为20℃;
d.将胶原原材料进行如下分解处理:
浸没于5wt.%胃蛋白酶溶液中12h,振荡频率为400rpm,处理温度为20℃;胃蛋白酶的酶活为2000U/g;
超声波20KHz处理3h,功率10KW,温度为20℃;
浸没于10wt.%乙酸溶液中20h,振荡频率为500rpm,温度为25℃;
超声波50KHz处理12h,功率1KW,温度为5℃;
e.超滤提纯胶原材料;
f.通过0.5wt.%京尼平制备胶原水凝胶材料。
通过以上步骤制备的胶原水凝胶材料,用于药物缓释载体材料。
对比例3
采集普通马跟腱制备胶原水凝胶材料。采集马跟腱加入1M乙酸溶胀12h,振荡频率为600rpm,处理温度为20℃,即得到牛皮胶原的酸粗提取液。通过10℃超滤提取得到胶原材料。通过0.5wt.%京尼平制备胶原水凝胶材料。
效果例5免疫原性测试
5.1免疫组化检测:在大鼠皮下植入样品,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围皮肤组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,用CD68单抗做免疫组化染色。
结果如图5所示:
CD68单抗进行免疫组化染色,主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的巨噬细胞(深棕色)。结果表明,经过1个月大鼠皮下植入,实施例3样品发现少量巨噬细胞,而对比例3发现大量巨噬细胞,说明实施例3样品的免疫原性低于对比例3。
效果例6生物活性测试
6.1组织相容性检测:将样品植入大鼠肌肉内,经特定时间后,处死实验大鼠,取出植入材料以及周围肌肉组织,用4wt.%多聚甲醛固定液固定,进行HE染色。
结果如图6所示:
HE染色表明,经过1个月大鼠肌肉植入,与对比例3样品比较,实施例3样品和周围肌肉组织融合更好,说明实施例3样品的生物活性更好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种胶原水凝胶材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1、繁育基因编辑动物;
步骤2、采集步骤1动物的胶原原材料作为原料;
步骤3、取步骤2制得的所述原料脱细胞;
步骤4、取步骤3制得的材料分解;
步骤5、取步骤4制得的分解产物,纯化,调节pH值、温度或交联化,制得胶原水凝胶材料;
其中,步骤3具体为:
浸没于0.001~2wt.%中性蛋白酶溶液中,温度为10~40℃,振荡频率为100~1000rpm,处理时间为2~12h;中性蛋白酶的酶活为800~10000U/g,工作浓度范围为0.6~2.4U/ml;
超声波清洗,40~100KHz处理3~24h,功率300W~5KW,温度为0~40℃;
浸没于0.001~5wt.%SDS溶液中3~24h,振荡频率为100~3000rpm,温度为10~40℃;
超声波清洗,60~100KHz处理3~12h,功率5~10KW,温度为0~40℃;
步骤4具体为:
浸没于0.001~10wt.%胃蛋白酶溶液中6~24h,振荡频率为300~1000rpm,处理温度为0~40℃;胃蛋白酶的酶活为1000~10000U/g;
超声波20~100KHz处理3~12h,功率1~10KW,温度为0~40℃;
浸没于0.001~20wt.%乙酸溶液中6~24h,振荡频率为100~1000rpm,温度为0~40℃;
超声波50~100KHz处理3~12h,功率1~10KW,温度为0~40℃。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述基因编辑包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述基因编辑包括基因敲除和/或基因转入;
所述基因敲除中敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2或PERV中的至少一种;
基因转入中转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI或EPCR中的至少一种。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法,其特征在于,所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种;所述动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物;优选的,选用基因编辑后稳定传代4代的动物。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法,其特征在于,所述胶原原材料取自包括真皮、筋膜、巩膜、被膜、腱、纤维软骨、骨、牙本质;透明软骨和弹性软骨;网状纤维、平滑肌、神经内膜、动脉、肝、脾、肾、肺、子宫;基膜、晶状体囊;胎膜、肌、腱鞘中的至少一种。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法制得的胶原水凝胶材料。
7.如权利要求6所述的胶原水凝胶材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。
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