CN1903382A - 一种脱细胞基质异种骨的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱细胞基质异种骨的制作方法，它包括普通洗涤剂去污蒸馏水冲洗、双氧水H₂O₂去蛋白双蒸水冲洗、氯仿、甲醇混合液去酯双蒸水循环冲洗、十二烷基硫酸钠SDS、蛋白酶抑制剂PMSF及胰蛋白酶脱细胞双蒸水循环冲洗、环氧乙烷或Co⁶⁰杀菌消毒等工艺步骤，使通过该方法处理的异种骨在完全保留骨的有机成分和无机成分情况下，细胞完全脱出，从而获得了脱细胞基质异种骨。该脱细胞基质异种骨排斥性几率非常小，植入后对受体的全身及局部免疫无明显影响，具有较好的相容性及骨传导性。该方法具有原料来源丰富、制作成本低，效益明显的优点，与市场同类产品相比更具有竞争力。

Description

一种脱细胞基质异种骨的制作方法

技术领域

本发明涉及一种脱细胞骨，特别是涉及一种脱细胞基质异种骨的制作方法。

背景技术

脱细胞组织基质是应用物理或化学方法将异体或异种组织进行脱细胞处理，从而去除组织移植过程中引起排斥反应的相关抗原，以用于修复损伤组织的一种新型生物材料。随着社会的飞速发展，交通运输、机械化程度的不断提高，高速、高能量的创伤所导致严重的复杂的骨折，常引起骨缺损、骨折不愈合。自体骨移植是最理想的骨移植方法，但由于骨源及供骨部位有限，同时自体组织塑型困难等缺陷，限制了其在临床的推广应用；同种异体骨移植有传播人类疾病的危险，有一定的免疫排斥反应，使人们应用时顾虑重重，同时，来源也有限。目前临床应用的人工骨，成本高、价格昂贵，患者不易接受。脱细胞基质异种骨，它取自动物，如猪、牛等，具有来源丰富，易于大量获取和加工存贮，这些骨组织保留了天然的密集的孔隙结构，具有良好的骨生长支架作用，为细胞的增殖、分化、成骨提供了天然的三维空间结构，具有良好的骨诱导活性及与新骨生长速度相配的降解率，但是，由于异种骨抗原主要存在于骨细胞内，必须进行脱细胞的处理，而现有的脱细胞处理方法造成了这些异种骨价格昂贵，从而影响了这些植骨材料的推广应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种脱细胞基质异种骨的制作方法，达到消除异种骨内的细胞及其抗原性，保留骨里的必须成分的目的，具有成本低，效益明显，排斥性几率非常小的特点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种脱细胞基质异种骨的制作方法，它包括如下步骤；

a.去污：采用普通洗涤剂将异种骨的骨头表面的油污等杂质洗净，然后再用蒸馏水冲洗干净，凉干后获得完全的骨头基质；

b.去蛋白：在室温或37℃烤箱的条件下，将上述去污步骤后获得的骨头基质放入浓度为15～20％的双氧水H₂O₂中浸泡24～48小时，然后再用双蒸水冲洗至干净无泡沫为止；

c.去酯：在室温条件下，将上述去蛋白步骤后获得的骨头基质放入1∶1～3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持续震荡的方式浸泡24～48小时，然后再用双蒸水循环冲洗至无氯仿和甲醇的味道为止；

d.脱细胞：在2～5℃条件下，将上述去酯步骤后获得的骨头基质放入浓度为0.5～1.0％的十二烷基硫酸钠SDS和浓度为0.8～1.2％的蛋白酶抑制剂PMSF的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡24～48小时，然后再用双蒸水循环冲洗24～48小时；

在2～5℃条件下，再将骨头基质放入浓度为0.1～0.4％的胰蛋白酶中浸泡12～24小时，然后再用双蒸水循环冲洗20～28小时，获得脱细胞基质异种骨；

e.杀菌消毒、包装：采用冻干机冻干的方式将脱细胞基质异种骨冻干，然后进行封装，采用环氧乙烷或Co⁶⁰进行杀菌消毒。

本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法，所采用的双氧水H₂O₂的浓度不宜过浓，若超过20％，容易破坏骨头的强度。

本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法，在去酯步骤中，采用了持续震荡的方式，可以通过完全的混合，达到更好的去酯效果。

本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法，在脱细胞步骤中，采用了十二烷基硫酸钠SDS和蛋白酶抑制剂PMSF，十二烷基硫酸钠是一种常用的阴离子表面活性剂，具有很强的去污力，它的泡沫很丰富，从感官上也给人以很强的去污力；蛋白酶抑制剂本身为固体，需利用丙酮酸进行溶解；在脱细胞的过程中，是采用了低渗的方法使细胞胀破，从而破坏了细胞膜结构，只保留细胞外基质。该方法可以防止细胞在低渗条件下胀破后，释放细胞内蛋白酶类，分解细胞外基质蛋白，因而基本保留了细胞外基质的有机和无机成份，而去除了细胞的成份，在去除细胞膜结构的同时也去除了膜上的抗原成分，减少了抗原性。实现了在完全保留骨的有机成分和无机成分情况下，使细胞完全脱出。

本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法，在脱细胞过程中要选择低温条件下进行，这样，才能防止在骨头的处理过程中出现骨头腐坏的现象发生。

本发明的有益效果是，由于采用了普通洗涤剂去污蒸馏水冲洗、双氧水H₂O₂去蛋白双蒸水冲洗、氯仿、甲醇混合液去酯双蒸水循环冲洗、十二烷基硫酸钠SDS、蛋白酶抑制剂PMSF及胰蛋白酶脱细胞双蒸水循环冲洗、环氧乙烷或Co⁶⁰杀菌消毒等过程来处理异种骨，使异种骨在完全保留骨的有机成分和无机成分情况下，细胞完全脱出，从而获得了脱细胞基质异种骨；该脱细胞基质异种骨排斥性几率非常小，植入后对受体的全身及局部免疫无明显影响，具有较好的相容性及骨传导性；该方法具有原料来源丰富、制作成本低，效益明显的优点，与市场同类产品相比更具有竞争力。

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明；但本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法不局限于实施例。

具体实施方式

实施例一，本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法，它采用如下步骤制作而成：

第一步，去污：采用普通洗涤剂将异种骨的骨头表面的油污等杂质洗净，然后再用蒸馏水冲洗干净，凉干后获得完全的骨头基质。

第二步，去蛋白：在室温或37℃烤箱的条件下，将上述去污步骤后获得的骨头基质放入浓度为18％的双氧水H₂O₂中浸泡35小时，然后再用双蒸水冲洗至干净无泡沫为止；所采用的双氧水H₂O₂的浓度不宜过浓，若超过20％，容易破坏骨头的强度。

第三步，去酯：在室温如25℃条件下，将上述去蛋白步骤后获得的骨头基质放入2∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持续震荡的方式浸泡35小时，然后再用双蒸水循环冲洗至无氯仿和甲醇的味道为止；在该步骤中，采用了持续震荡的方式，可以通过氯仿、甲醇的完全混合，达到更好的去酯效果。

第四步，脱细胞：在4℃条件下，将上述去酯步骤后获得的骨头基质放入浓度为0.5％的十二烷基硫酸钠SDS和浓度为1％的蛋白酶抑制剂PMSF的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡35小时，然后再用双蒸水循环冲洗24小时；

在4℃条件下，再将骨头基质放入浓度为0.25％的胰蛋白酶中浸泡18小时，然后再用双蒸水循环冲洗24小时，获得脱细胞基质异种骨。

第五步，杀菌消毒、包装：采用冻干机冻干的方式将脱细胞基质异种骨冻干，然后进行封装，采用环氧乙烷或Co⁶⁰进行杀菌消毒。

本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法，在脱细胞步骤中，采用了十二烷基硫酸钠SDS和蛋白酶抑制剂PMSF，十二烷基硫酸钠是一种常用的阴离子表面活性剂，具有很强的去污力，它的泡沫很丰富，从感官上也给人以很强的去污力；蛋白酶抑制剂本身为固体，需利用丙酮酸进行溶解；在脱细胞的过程中，是采用了低渗的方法使细胞胀破，从而破坏了细胞膜结构，只保留细胞外基质。该方法可以防止细胞在低渗条件下胀破后，释放细胞内蛋白酶类，分解细胞外基质蛋白，因而基本保留了细胞外基质的有机和无机成份，而去除了细胞的成份，在去除细胞膜结构的同时也去除了膜上的抗原成分，减少了抗原性。实现了在完全保留骨的有机成分和无机成分情况下，使细胞完全脱出。

本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法，在脱细胞过程中要选择低温条件下进行，这样，才能防止在骨头的处理过程中出现骨头腐坏的现象发生。

实施例二，本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法，它采用如下步骤制作而成：

第一步，去污：采用普通洗涤剂将异种骨的骨头表面的油污等杂质洗净，然后再用蒸馏水冲洗干净，凉干后获得完全的骨头基质。

第二步，去蛋白：在室温或37℃烤箱的条件下，将上述去污步骤后获得的骨头基质放入浓度为15％的双氧水H₂O₂中浸泡48小时，然后再用双蒸水冲洗至干净无泡沫为止。

第三步，去酯：在室温如25℃条件下，将上述去蛋白步骤后获得的骨头基质放入1∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持续震荡的方式浸泡48小时，然后再用双蒸水循环冲洗至无氯仿和甲醇的味道为止。

第四步，脱细胞：在2℃条件下，将上述去酯步骤后获得的骨头基质放入浓度为0.85％的十二烷基硫酸钠SDS和浓度为0.8％的蛋白酶抑制剂PMSF的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡24小时，然后再用双蒸水循环冲洗35小时；

在5℃条件下，再将骨头基质放入浓度为0.1％的胰蛋白酶中浸泡12小时，然后再用双蒸水循环冲洗20小时，获得脱细胞基质异种骨。

第五步，杀菌消毒、包装：采用冻干机冻干的方式将脱细胞基质异种骨冻干，然后进行封装，采用环氧乙烷或Co⁶⁰进行杀菌消毒。

实施例三，本发明的一种脱细胞基质异种骨的制作方法，它采用如下步骤制作而成：

第一步，去污：采用普通洗涤剂将异种骨的骨头表面的油污等杂质洗净，然后再用蒸馏水冲洗干净，凉干后获得完全的骨头基质。

第二步，去蛋白：在室温或37℃烤箱的条件下，将上述去污步骤后获得的骨头基质放入浓度为20％的双氧水H₂O₂中浸泡24小时，然后再用双蒸水冲洗至干净无泡沫为止。

第三步，去酯：在室温如25℃条件下，将上述去蛋白步骤后获得的骨头基质放入3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持续震荡的方式浸泡24小时，然后再用双蒸水循环冲洗至无氯仿和甲醇的味道为止。

第四步，脱细胞：在5℃条件下，将上述去酯步骤后获得的骨头基质放入浓度为1.0％的十二烷基硫酸钠SDS和浓度为1.2％的蛋白酶抑制剂PMSF的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡48小时，然后再用双蒸水循环冲洗48小时；

在2℃条件下，再将骨头基质放入浓度为0.4％的胰蛋白酶中浸泡24小时，然后再用双蒸水循环冲洗28小时，获得脱细胞基质异种骨。

第五步，杀菌消毒、包装：采用冻干机冻干的方式将脱细胞基质异种骨冻干，然后进行封装，采用环氧乙烷或Co⁶⁰进行杀菌消毒。

Claims (1)

1.一种脱细胞基质异种骨的制作方法，其特征在于：它包括如下步骤；

a.去污：采用普通洗涤剂将异种骨的骨头表面的油污等杂质洗净，然后再用蒸馏水冲洗干净，凉干后获得完全的骨头基质；

b.去蛋白：在室温或37℃烤箱的条件下，将上述去污步骤后获得的骨头基质放入浓度为15～20％的双氧水H₂O₂中浸泡24～48小时，然后再用双蒸水冲洗至干净无泡沫为止；

c.去酯：在室温条件下，将上述去蛋白步骤后获得的骨头基质放入1∶1～3∶1的氯仿∶甲醇的混合液中采用持续震荡的方式浸泡24～48小时，然后再用双蒸水循环冲洗至无氯仿和甲醇的味道为止；

d.脱细胞：在2～5℃条件下，将上述去酯步骤后获得的骨头基质放入浓度为0.5～1.0％的十二烷基硫酸钠SDS和浓度为0.8～1.2％的蛋白酶抑制剂PMSF的混合液中采用搅拌震荡的方式浸泡24～48小时，然后再用双蒸水循环冲洗24～48小时；

在2～5℃条件下，再将骨头基质放入浓度为0.1～0.4％的胰蛋白酶中浸泡12～24小时，然后再用双蒸水循环冲洗20～28小时，获得脱细胞基质异种骨；

e.杀菌消毒、包装：采用冻干机冻干的方式将脱细胞基质异种骨冻干，然后进行封装，采用环氧乙烷或Co⁶⁰进行杀菌消毒。