CN112516387B - 一种脱细胞气管支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脱细胞气管支架的制备方法。本发明通过0.25％胰酶‑EDTA联合去污剂‑核酶消化法制备脱细胞气管支架，结果显示该气管基质微结构保留完整，能够去除气管支架中的细胞及残留物，而且清除效果好，免疫排斥反应低、机械性能良好。通过本发明的制备方法，7‑10天左右时间即可获得脱细胞气管基质，消化的时间减少，且在体外种植细胞培养三天后细胞贴壁生长良好，力学和生物相容性检测无明显差异，可以作为组织工程气管支架的选择。

Description

一种脱细胞气管支架的制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种脱细胞气管支架的制备方法。
背景技术
组织工程是一个新的领域，其在没有免疫排斥和免疫抑制风险的情况下，可以潜在的提供可选择的治疗方式以用于解决有缺陷的器官。目前主要采用脱细胞化基质作为潜在的支架以获得有功能的组织工程器官。在维持细胞外基质完整性并提供充足机械性能维持气道通气的同时，气管移植物需要经过一系列的处理以移除抗原性以避免免疫排斥反应。
去细胞支架制备的常用方法包括低压冻干和去污剂方法。低压冻干法处理气管，可以破坏保持机械支撑性能的蛋白聚糖和胶原等组成软骨的成分，导致脱细胞气管基质的超微结构如软骨结构的完整性发生改变，影响细胞生长，不适合用于促进功能性气管组织的完全再生。去垢剂-酶消化法获得完全的脱细胞化气管基质时，动物气管的基质特征在超显微结构和物质本身性质方面未改变，与原有组织相似，而且作为同种异体或异种移植物被使用时很少产生排斥反应。常用的去垢剂-酶消化法使用的化学物如脱氧胆酸钠、脱氧核糖核酸酶I(DNase-I)、十二烷基硫酸钠(SDS)、胰酶-EDTA和TritionX-100等。脱氧胆酸钠、DNase-I进行脱细胞处理，上皮细胞和腺体消失，MHC抗原的表达减少。十二烷基硫酸钠(SDS)脱细胞处理能获得一个完全的缺失细胞的组织结构，并可保留细胞外基质的主要成分，然而，SDS脱细胞处理所残留的化学物质影响细胞生长。胰酶-EDTA和TritionX-100消化后体内试验显示没有明显的气管狭窄、气管软化或炎症，同时保存了同种异体移植物软骨的活性。在17个去污剂-酶消化法(脱氧胆酸钠和脱氧核糖核酸酶I，持续35天左右)循环后，生物工程气管基质显示出与机体具有近似的机械特性，同种异体及异种移植后的30天里也未出现免疫反应，显示对于未来组织工程气管的替代具有极大的潜力，但这种方法并不能完全的去除气管软骨细胞，残留的细胞核仍存在于软骨组织，脱细胞时间长。
总之，尽管目前使用脱细胞方法处理供者的气管作为支架，可行，而且效果良好，但是用不同化学成分的脱细胞方法处理气管后，脱细胞气管基质仍面临着脱细胞时间长、气管力学性能降低、脱细胞不彻底，残留的细胞、抗原成分仍有可能在长期预后中因引起宿主免疫排斥反应而影响生活质量等难题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于动物气管脱细胞处理的试剂，该试剂可用于动物气管脱细胞处理，且清除细胞和细胞核成分的效率更高，抗原成分去除更完全，气管基质微结构保留完整，力学性能和生物相容性良好。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种用于动物气管脱细胞处理的试剂，包括消化液A、消化液B、消化液C和消化液D；
所述消化液A为含有胰酶的EDTA消化液，且所述消化液A中胰酶的质量百分比为0.25％；
所述消化液B为含有NaCl的Tris-HCl缓冲液，所述消化液B的pH＝8.0，所述消化液B中Tris的浓度为0.05M，NaCl浓度为87.7g/L；
所述消化液C为含有TritonX-100的Tris-HCl缓冲液，所述消化液C的pH＝7.4，所述消化液C中Tris的浓度为0.05M，TritonX-100的浓度为10mL/L；
所述消化液D为含有DNAseI、RNAseI、MgCl2、CaCl2的Tris-HCl缓冲液，所述消化液D的pH＝7.6，所述消化液D中Tris的浓度为0.01M，DNAseI的浓度为2mg/L，RNAseI为2mg/L，MgCl2的浓度为1.22g/L，CaCl2浓度为1.11g/L。
本发明的消化液A可以破坏气管粘膜上皮细胞等成分，并且有助于气管组织与细胞分离；消化液B可以溶解和破坏细胞核，清除细胞成分；消化液C可有效的溶解含有主要组织相容性抗原成分的细胞膜，通过它们的相互协作，可以完全的将气管组织的抗原、细胞和细胞核等成分去除；采用消化液D进行脱细胞处理使上皮细胞和腺体消失、MHC抗原的表达减少，同时DNAase和RNAase可以浸入、分离基底膜。
本发明的试剂所选材料的生物学特性如毒性、生物相容性、耐受性、细胞粘附特性及尽可能多的具有模仿本身气管功能的能力；保持结构完整性的同时移除具有免疫原性的细胞等成分；支持细胞粘附和繁殖，对于细胞的生长展现出良好的环境。
通过优选上述特定组分及其浓度，本发明得到的试剂可用于动物气管脱细胞处理，且清除细胞和细胞核成分的效率更高，抗原成分去除更完全，气管基质微结构保留完整，力学性能和生物相容性良好。
本发明还提供了一种脱细胞气管支架制备方法，包括以下步骤：
(1)取哺乳动物的气管并进行预处理；
(2)采用上述试剂对气管进行脱细胞处理。
本发明通过上述特定的试剂，即采用0.25％胰酶-EDTA联合去污剂-核酶消化法制备的脱细胞气管支架，结果显示该气管基质微结构保留完整，能够去除气管支架中的细胞及残留物，而且清除效果好，免疫排斥反应低、机械性能良好。通过本发明的制备方法，7-10天左右时间即可获得脱细胞气管基质，消化的时间减少，且在体外种植细胞培养三天后可见细胞贴壁生长良好，力学和生物相容性检测无明显差异，可以作为组织工程气管支架的选择。
进一步地，步骤(1)中，将新西兰大白兔处死后，采用75％的乙醇消毒头、颈和胸部，依次分离皮肤、筋膜和肌肉，充分暴露气管，沿环状软骨下0.5-1cm处横向切断气管1-4cm，放入含有PBS缓冲液的培养皿中，去除气管表面异物，采用青霉素和链霉素双抗浸泡5-10min，75％酒精消毒0.5-1小时，放入含青霉素和链霉素双抗的冷D-Hanks缓冲液，在4℃摇床震荡冲洗3-5次，摇床转速100-200转/分钟，每次5-20分钟，冲洗后放入含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液，在4℃保存备用。
进一步地，步骤(2)中，采用无菌D-Hanks液对气管进行震荡洗涤后，再进行脱细胞处理，脱细胞处理具体包括以下步骤：
(2.1)在气管中加入消化液A，在4℃震荡12-24小时，转速100-200转/分钟，每4-8小时换液一次；
(2.2)去除消化液A，加入消化液B，在4℃震荡24小时，转速100-200转/分钟，每4-8小时换液一次；
(2.3)去除消化液B，加入含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液，在4℃震荡洗涤3-5次，每次5-20分钟，转速100-200转/分钟；
(2.4)去除D-Hanks液，加入消化液C，4℃恒温摇床震荡12-24小时，转速100-200转/分钟，每4-8小时换液一次；
(2.5)去除消化液C，加入含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液，在4℃震荡洗涤3-5次，每次5-20分钟，转速100-200转/分钟；
(2.6)去除D-Hanks液，加入消化液D，在37℃震荡4-10小时，转速100-200转/分钟，每2-6小时换液一次；
(2.7)去除消化液D，加入消化液C，在4℃震荡12-24小时，转速100-200转/分钟，每4-10小时换液一次；
(2.8)去除消化液C，加入D-Hanks液，在4℃震荡洗涤3-5次，每次5-20分钟，转速100-200转/分钟，然后去液加入75％酒精常温下消毒0.5-1小时；
(2.9)去除酒精，加入D-Hanks液，在4℃震荡洗涤12-48小时，转速100-200转/分钟；每4-10小时换液一次，将气管在4℃D-Hanks液保存备用。
本发明通过优化脱细胞处理的步骤及参数选择，清除细胞和细胞核成分的效率更高,抗原成分去除更完全。
进一步地，步骤(2.1)中的消化液A、步骤(2.2)中的消化液B、步骤(2.4)中的消化液C、步骤(2.6)中的消化液D和步骤(2.7)中的消化液C的体积用量比为1:1:1:1:1，在此范围内，清除细胞和细胞核成分的效率更高，抗原成分去除更完全，气管基质微结构保留完整，力学性能和生物相容性良好。
进一步地，步骤(2.1)中的消化液A、步骤(2.2)中的消化液B、步骤(2.3)中的含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液、步骤(2.4)中的消化液C、步骤(2.5)中的含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液、步骤(2.6)中的消化液D、步骤(2.7)中的消化液C、步骤(2.8)中的D-Hanks液和步骤(2.9)中的D-Hanks液的体积用量比为1:1:1:1:1:1:1:1:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明特定的试剂和方法进行脱细胞处理，获得脱细胞气管基质需要时间更短，获得的气管基质其余杂质去除更彻底，存留的结构更完整，力学性能和生物相容性良好，无排斥反应，适合种植干细胞生长，可以成为具有细胞生存的、有功能性的组织工程气管。
附图说明
图1为未处理的正常气管(a)和实施例2(b)经脱细胞处理后气管(原图为彩图)。
图2为未处理的正常气管(a)和实施例2(b)经脱细胞处理后气管的HE染色结果(原图为彩图)。
图3为未处理的正常气管(a)和实施例2(b)经脱细胞处理后气管的Masson染色结果(原图为彩图)。
图4为未处理的正常气管(a)和实施例2(b)经脱细胞处理后气管的DAPI免疫荧光染色结果(原图为彩图)。
图5为未处理的正常气管(a)和实施例2(b)经脱细胞处理后气管的免疫组化染色结果(原图为彩图)。
图6为未处理的正常气管(a、c)和实施例2(b、d)经脱细胞处理后气管的SEM图。
图7为压缩实验前(a)、压缩实验中(b)和压缩实验后(c)的气管。
图8为进行拉伸实验的未处理的正常气管(a)和实施例2(b)经脱细胞处理后气管。
图9为未处理的正常气管和实施例2经脱细胞处理后气管的拉断负荷(A)、抗拉强度(B)、断裂伸长率(C)和弹性模量(D)，P＞0.05。
图10为实施例2脱细胞处理的气管在体外种植干细胞培养1天的SEM图。
图11为实施例2脱细胞处理的气管在体外种植干细胞培养3天的SEM图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
对以下实施例选用的动物及材料进行如下说明：
1.动物：
新西兰大白兔，15只，2月龄左右，约2kg，雌雄不限。
2.主要试剂：
MgCl2、CaCl2
双抗(青霉素G，100U/ml，链霉素，100μg/ml；Gibico公司)
DMEM/F12培养基(Gibico公司)
0.25％胰酶-EDTA消化液(Gibico公司)
脱氧核糖核酸酶I(Roche)
核糖核酸酶I(Amresco)
Triton-100(Amresco)
Tris碱(Roche)
实施例1
一种用于动物气管脱细胞处理的试剂，包括消化液A、消化液B、消化液C和消化液D，
所述消化液A为含有胰酶的EDTA消化液，且所述消化液A中胰酶的质量百分比为0.25％；
所述消化液B为含有NaCl的Tris-HCl缓冲液，所述消化液B的pH＝8.0，所述消化液B中Tris的浓度为0.05M，NaCl浓度为87.7g/L；
所述消化液C为含有TritonX-100的Tris-HCl缓冲液，所述消化液C的pH＝7.4，所述消化液C中Tris的浓度为0.05M，TritonX-100的浓度为10mL/L；
所述消化液D为含有DNAseI、RNAseI、MgCl2、CaCl2的Tris-HCl缓冲液，所述消化液D的pH＝7.6，所述消化液D中Tris的浓度为0.01M，DNAseI的浓度为2mg/L，RNAseI为2mg/L，MgCl2的浓度为1.22g/L，CaCl2浓度为1.11g/L。
本实施例的用于动物气管脱细胞处理的试剂的配制方法，具体为：
(1)消化液A：0.25％胰酶-EDTA消化液；
(2)消化液B：6.05g Tris碱加入800ml纯水，HCL调至pH＝8.0，高压蒸汽灭菌，无菌环境加入87.7g NaCl，混匀后，加入无菌纯水定容至1000ml，4℃冷藏备用；
(3)消化液C：6.05g Tris碱加入800ml纯水，HCL调至PH＝7.4，高压蒸汽灭菌，无菌环境加入10ml TritonX-100，混匀后，加入无菌纯水定容至1000ml，4℃冷藏备用；
(4)消化液D：1.21gTris碱加入800ml纯水，HCl调至PH＝7.6，高压蒸汽灭菌，无菌环境下，加入经无菌过滤器滤过的DNAseI和RNAseI各2mg、MgCl21.22g、CaCl2 1.11g，混匀后，加入无菌纯水定容至1000ml，4℃冷藏备用。
实施例2
一种脱细胞气管支架制备方法，包括以下步骤：
(1)气管获取及处理
将新西兰大白兔经耳缘静脉注射氯胺酮(25mg/kg)处死后放入超净无菌工作台，仰卧放于工作台中心，75％的乙醇消毒头、颈、胸部，用无菌手术器械依次分离皮肤、筋膜、肌肉，充分暴露气管，沿环状软骨下约0.5cm处横向切断气管约2-4cm，放入含有PBS缓冲液的培养皿中，去除气管表面异物，注意保持气管结构的完整性，双抗(青霉素和链霉素)浸泡5min，75％酒精消毒1小时，放入含双抗的冷D-Hanks缓冲液，4℃摇床震荡冲洗3次(160转/分钟)，每次10-15分钟，冲洗后放入含双抗的D-Hanks液4℃冰箱内保存备用。
(2)脱细胞处理气管
将储存在4℃D-Hanks液中的气管取出，放入无菌锥形瓶中，加入无菌D-Hanks液5-10ml，密封，4℃摇床震荡冲洗(160转/分钟)15分钟。
(2.1)去除锥形瓶中D-Hanks液，加入10ml消化液A，于4℃恒温摇床震荡12-24小时，转速160转/分钟，每6-8小时换液一次；
(2.2)去除消化液A，加入10ml消化液B，4℃恒温摇床震荡24小时，转速160转/分钟，每6-8小时换液一次；
(2.3)去除消化液B，加入10ml含双抗的D-Hanks液，4℃恒温摇床震荡洗涤3次，每次10-15分钟，转速160转/分钟；
(2.4)去除D-Hanks液，加入10ml消化液C，4℃恒温摇床震荡24小时，转速160转/分钟，每6-8小时换液一次；
(2.5)去除消化液C，加入10ml含双抗的D-Hanks液，4℃恒温摇床震荡洗涤3次，每次10-15分钟，转速160转/分钟；
(2.6)去除D-Hanks液，加入10ml消化液D，37℃落地摇床震荡8小时，转速160转/分钟，每4小时换液一次；
(2.7)去除消化液D，加入10ml消化液C，4℃摇床震荡24小时，转速160转/分钟，每8小时换液一次；
(2.8)去除消化液C，加入10ml D-Hanks液，4℃摇床震荡洗涤3次，每次15分钟，转速160转/分钟；然后去液加入10ml 75％酒精常温下消毒1小时；
(2.9)去除酒精，加入10ml D-Hanks液，4℃摇床震荡洗涤48小时，转速160转/分钟；每8小时换液一次，结束后4℃D-Hanks液保存备用。
大体形态学观察
图1为未处理的正常气管，图2为实施例2经脱细胞处理后得到的气管，处理后气管表面颜色由淡红色变为白垩色，气管壁结构完整，管腔未见塌陷。
组织学染色
HE染色
未处理的正常气管以及实施例2经脱细胞处理后得到的气管的HE染色结果分别如图2(a)和图2(b)所示。由图2结果可知，脱细胞处理后气管粘膜层及粘膜下层细胞及腺体消失，外基质成分仍保留，未完全破坏；软骨内软骨细胞几乎完全消失，未见细胞核成分残留。
Masson染色
未处理的正常气管以及实施例2经脱细胞处理后得到的气管的Masson染色结果分别如图3(a)和图3(b)所示。脱细胞处理后气管粘膜层及粘膜下层细胞及腺体消失，细胞外基质成分仍保留，未完全破坏；胶原纤维染成蓝色，未见细胞核。
DAPI免疫荧光染色
未处理的正常气管以及实施例2经脱细胞处理后得到的气管的DAPI免疫荧光染色结果分别如图4(a)和图4(b)所示。由图4可见，脱细胞处理后的气管粘膜层及粘膜下层细胞及腺体消失，细胞外基质成分仍保留，未完全破坏；气管组织中仅见气管软骨轮廓，未见细胞核残留，可见软骨陷窝存在。
免疫组化染色
未处理的正常气管以及实施例2经脱细胞处理后得到的气管的免疫组化染色结果分别如图5(a)和图5(b)所示。结果显示，脱细胞处理后气管几乎完全去除表面抗原成分，气管未见组织染成深红色。
扫描电镜和透射电镜
未处理的正常气管以及实施例2经脱细胞处理后得到的气管的SEM结果分别如图6(a)、6(c)和图6(b)、6(d)所示。SEM结果显示，脱细胞处理后气管表面纤毛等成分消失，可见胶原纤维散乱分布气管表面，气管长轴纵切面扫描电镜示两组气管外基质完整，软骨内可见软骨陷窝密集分布。
透射电镜结果显示经处理后气管粘膜上皮及粘液腺体等成分消失，表面未见纤毛等成分。
生物力学测试
对实施例2经脱细胞处理后得到的气管作为实验组1进行压缩实验，实验前、压缩实验中和实验后的气管分别如图7(a)、图7(b)和图7(c)所示。
以对未处理的正常气管(图8(a))作为对照组，对实施例2(图8(b))经脱细胞处理后得到的气管进行拉伸实验，结果如表1和图9所示。
表1脱细胞气管基质拉伸实验
Figure BDA0002817460790000091
脱细胞处理后的气管，经压缩后，脱细胞基质气管管腔直径较压缩前有所降低，但仍可维持几乎正常管腔的口径(图7(a)、图7(b)和图7(c))。与正常气管相比，脱细胞基质的拉断负荷、抗拉强度、断裂伸长率、弹性模量等相对降低，但是统计分析显示无显著性差异，表明其可维持几乎正常气管拉伸能力。
生物相容性
采用实施例2脱细胞处理的气管作为样品，在体外按(1-5)×106/cm2种植兔骨髓间充质干细胞培养1天和3天后，通过扫描电镜观察种植干细胞后的气管基质。培养1天时部分细胞呈扁平状散在贴壁生长(图10)；3天后大部分细胞呈扁平状贴壁生长，排列较整齐，几乎覆盖气管表面，部分细胞分泌蛋白成分(图11)。
综上所述，采用本发明方法在相对较短时间内完全可以获得更理想的脱细胞气管基质，方法可行。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种脱细胞气管支架制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取哺乳动物的气管并进行预处理；
(2)采用用于动物气管脱细胞处理的试剂对气管进行脱细胞处理；
所述试剂，包括消化液A、消化液B、消化液C和消化液D；
所述消化液A为含有胰酶的EDTA消化液，且所述消化液A中胰酶的质量百分比为0.25％；
所述消化液B为含有NaCl的Tris-HCl缓冲液，所述消化液B的pH＝8.0，所述消化液B中Tris的浓度为0.05M，NaCl浓度为87.7g/L；
所述消化液C为含有TritonX-100的Tris-HCl缓冲液，所述消化液C的pH＝7.4，所述消化液C中Tris的浓度为0.05M，TritonX-100的浓度为10mL/L；
所述消化液D为含有DNAseI、RNAseI、MgCl2、CaCl2的Tris-HCl缓冲液，所述消化液D的pH＝7.6，所述消化液D中Tris的浓度为0.01M，DNAseI的浓度为2mg/L，RNAseI为2mg/L，MgCl2的浓度为1.22g/L，CaCl2浓度为1.11g/L；
步骤(2)中，采用无菌D-Hanks液对气管进行震荡洗涤后，再进行脱细胞处理，脱细胞处理具体包括以下步骤：
(2.1)在气管中加入消化液A，在4℃震荡12-24小时，转速100-200转/分钟，每4-8小时换液一次；
(2.2)去除消化液A，加入消化液B，在4℃震荡24小时，转速100-200转/分钟，每4-8小时换液一次；
(2.3)去除消化液B，加入含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液，在4℃震荡洗涤3-5次，每次5-20分钟，转速100-200转/分钟；
(2.4)去除D-Hanks液，加入消化液C，4℃恒温摇床震荡12-24小时，转速100-200转/分钟，每4-8小时换液一次；
(2.5)去除消化液C，加入含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液，在4℃震荡洗涤3-5次，每次5-20分钟，转速100-200转/分钟；
(2.6)去除D-Hanks液，加入消化液D，在37℃震荡4-10小时，转速100-200转/分钟，每2-6小时换液一次；
(2.7)去除消化液D，加入消化液C，在4℃震荡12-24小时，转速100-200转/分钟，每4-10小时换液一次；
(2.8)去除消化液C，加入D-Hanks液，在4℃震荡洗涤3-5次，每次5-20分钟，转速100-200转/分钟，然后去液加入75％酒精常温下消毒0.5-1小时；
(2.9)去除酒精，加入D-Hanks液，在4℃震荡洗涤12-48小时，转速100-200转/分钟；每4-10小时换液一次，将气管在4℃D-Hanks液保存备用。
2.根据权利要求1所述的脱细胞气管支架制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将新西兰大白兔处死后，采用75％的乙醇消毒头、颈和胸部，依次分离皮肤、筋膜和肌肉，充分暴露气管，沿环状软骨下0.5-1cm处横向切断气管1-4cm，放入含有PBS缓冲液的培养皿中，去除气管表面异物，采用青霉素和链霉素双抗浸泡5-10min，75％酒精消毒0.5-1小时，放入含青霉素和链霉素双抗的冷D-Hanks缓冲液，在4℃摇床震荡冲洗3-5次，摇床转速100-200转/分钟，每次5-20分钟，冲洗后放入含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液，在4℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的脱细胞气管支架制备方法，其特征在于，步骤(2.1)中的消化液A、步骤(2.2)中的消化液B、步骤(2.4)中的消化液C、步骤(2.6)中的消化液D和步骤(2.7)中的消化液C的体积用量比为1:1:1:1:1。
4.根据权利要求1所述的脱细胞气管支架制备方法，其特征在于，步骤(2.1)中的消化液A、步骤(2.2)中的消化液B、步骤(2.3)中的含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液、步骤(2.4)中的消化液C、步骤(2.5)中的含青霉素和链霉素双抗的D-Hanks液、步骤(2.6)中的消化液D、步骤(2.7)中的消化液C、步骤(2.8)中的D-Hanks液和步骤(2.9)中的D-Hanks液的体积用量比为1:1:1:1:1:1:1:1:1。
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