CN100349621C - 骨髓基质干细胞诱导成软骨的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程化软骨移植物，它包括：(a)药学上可接受的生物可降解材料；和(b)软骨细胞和骨髓基质干细胞(bone marrow stemcells，BMSCs)的混合物，所述的软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合比例为1∶9-5∶5。本发明的组织工程化软骨可有效地治疗软骨缺损。本发明还提供了该组织工程化软骨的制备方法和用途。

Description

骨髓基质干细胞诱导成软骨的方法

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及组织工程化软骨及其制备方法和用途。

背景技术

软骨组织作为一种结缔组织主要起支撑、保护、分散应力等作用。组织学上可分为透明软骨(关节软骨、肋软骨、鼻软骨、气管软骨)、弹性软骨(会厌软骨、耳软骨)、纤维软骨(半月板)三类。它们在组织学上都是只含有软骨细胞的单一组织，内部无血管，营养主要依靠组织液的渗透。

从结构上看，软骨细胞被包裹在软骨陷窝内，其周围厚厚的软骨囊作为一道天然屏障，将软骨细胞与周围组织分离开来。因此，软骨组织具有抗原性弱，不易被机体免疫系统识别和攻击而具有较轻免疫排斥反应的特点。早期的研究结果表明，同种异体软骨细胞可以在受体体内存活并保持分泌基质的功能。

软骨病损是临床常见疾病之一，如由创伤、感染、自身免疫、肿瘤等因素引起的各种关节表面疾患；耳廓软骨、鼻、喉软骨支架的缺损、畸形；以及儿童骨骺生长板的创伤、早闭、坏死等。由于软骨组织几乎没有自我修复能力，所以必须利用软骨或其它替代材料进行修复。

自体和异体软骨移植是目前的常用方法。自体软骨组织移植疗效可靠，但必须以牺牲人体正常组织为代价，且患者要多遭受一次手术的痛苦。此外，自体组织来源有限，小块移植物还有易变形的问题。异体和异种移植物又具有免疫原性。

目前，虽然有一些人工合成的软骨组织代用品，还存在着组织相容性、材料机械特性等方面的缺陷，尚不能满足临床上的各项要求。人工合成替代材料只具备充填、支持及维持美观的作用，无生物学功能，尚不能达到真正意义上的结构与功能重建。

组织工程学为软骨组织缺损的治疗开辟了新的途径。组织工程用少量细胞在体外扩增，然后接种到生物可降解材料上，构建成细胞-材料复合物，用于移植，修复缺损。

构建组织工程化软骨组织的重要条件之一是必须获得大量的有功能和活力的软骨细胞。早在1997年，曹谊林就应用组织工程技术在裸鼠的背上成功地再造了精确人耳形态的软骨，之后的大量研究表明，在高等大型哺乳动物甚至人体内也可以利用组织工程技术再生软骨组织，但这些研究所应用的种子细胞均为软骨细胞，且只能用原代或早期传代的软骨细胞，并且体外大量扩增后的软骨细胞易发生老化及去分化，难以在体内形成软骨组织。自体软骨细胞来源极为有限，同种异体及异种软骨细胞又无法杜绝免疫排斥反应，生长因子虽可大量扩增软骨细胞，但其费用昂贵，所形成组织在体内的长期效果尚不肯定，这些都使软骨组织工程难以在临床推广应用。

由此可见，种子细胞来源不足是限制软骨组织工程临床推广应用的主要困难，因而非软骨来源的种子细胞研究成为当代软骨组织工程研究的焦点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)组织来源广，增殖能力强，可获得充足的细胞量并具有多向分化潜能。各国学者对不同组织来源的MSCs进行了大量的研究，发现MSCs可以在体外定向分化为软骨细胞，表达软骨细胞的表型及功能，但这些诱导方法技术上较为复杂。并且由于应用了多种生长因子，致使费用极为昂贵，而且诱导后的MSCs只能在关节部位较好地修复软骨缺损，在皮下则不能形成或只形成极少量的软骨组织，尚不能形成大块的较成熟的软骨组织。

因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、可操作性强的组织工程化软骨移植物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的安全性高、制法简便的组织工程化软骨。

本发明的另一目的就是提供所述组织工程化软骨的制法和用途。

在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化软骨移植物，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料；

(b)软骨细胞和骨髓基质干细胞(BMSCs)的混合物，所述的软骨细胞和BMSCs的混合比例为1∶9-5∶5。较佳地，所述的软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合比例为2∶8-3∶7，更佳地为4∶6-5∶5。

在另一优选例中，所述的软骨细胞是自体的或同种异体的，而骨髓基质干细胞是自体的。

在另一优选例中，所述的移植物为液态，且软骨细胞和BMSCs在混合物中的含量为2×10⁷个细胞/ml-5×10⁷个细胞/ml。

在另一优选例中，所述的移植物为固态，且软骨细胞和BMSCs在混合物中的含量为2×10⁷个细胞/cm³-5×10⁷个细胞/cm³。

在另一优选例中，所述软骨细胞来源于自体非功能区软骨或3-10月龄自然流产人胎儿软骨。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、Pluronics、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。

在本发明的第二方面，提供了一种制备组织工程化软骨移植物的方法，包括步骤：

将软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合物与药学上可接受的生物可降解材料混合，形成移植物，其中所述的软骨细胞和BMSCs的混合比例为1∶9-5∶5。

在一优选例中，移植物中软骨细胞和BMSCs在混合物中的含量为2×10⁷-5×10⁷个细胞/ml或2×10⁷-5×10⁷个细胞/cm³。

附图说明

图1A显示了体内10周时各组部分结果的大体标本。

其中，A：30％软骨细胞+70％BMSCs；B：40％软骨细胞+60％BMSCs；C：3∶7混合培养的两种细胞；D：纯软骨细胞(正常浓度)；E：单纯BMSCs(正常浓度)；F：低软骨细胞浓度(本次无组织形成)。

图1B显示了接种了不同接种物后10周时，裸鼠体内的新生软骨的各组平均体积。

图1C显示了接种了不同接种物后10周时，裸鼠体内的新生软骨的各组平均湿重。

图2显示了体内10周时各组组织学HE染色结果。

图3显示了体内10周时各组组织学Safranin O染色的部分结果。

图4显示了体内10周时各组组织学Massion三色染色的部分结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究发现，关节软骨微环境对软骨形成具有重要作用，在这一微环境中MSCs可以继续分化并形成较成熟的软骨组织并修复关节软骨缺损。再进一步分析发现，许多能诱导MSCs表达软骨细胞表型及功能的诱导因子如转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)1、2、3、骨形态发生蛋白(bone morphorgenetic protein，BMP)2、6、7、软骨源性形态发生蛋白(cartilage-derived morphorgentic protein，CDMP)1、2等恰好几乎都能由软骨细胞自分泌产生。这说明软骨细胞能同时分泌多种有诱导作用的因子，软骨细胞可能成为一个诱导MSCs表达软骨细胞表型的综合诱导因素，甚至可能会提供诱导MSCs表达软骨细胞表型所需的全部因子。因此，将骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs，MSCs的一种)与软骨细胞混合形成混合物，以软骨细胞作为诱导因素，可以有效地诱导BMSCs在体内异位成软骨。在此基础上完成了本发明。

术语

术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽，例如纯化的细胞因子，或分离的软骨细胞。

术语“异种移植”指将所需生物活体材料(如BMSCs)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。

术语“自体移植”指将所需生物活体材料(如BMSCs)从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。

术语“异体移植”指将所需生物活体材料(如软骨细胞)从某个体中取出并再施用于同物种另一不同个体的方法。

骨髓基质干细胞(BMSCs)

本发明中骨髓基质干细胞的来源没有特别限制，一种优选的来源是来自自体的骨髓。通常，本发明的软骨细胞是来自自体或同种异体。

分离获得骨髓基质干细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是全麻下骨髓穿刺抽取自体骨髓，以密度梯度离心法分离出其中的有核细胞，加入适合的培养液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco，GlandIsland，NY，USA)条件培养液)，制成细胞悬液，以约1×10⁵/cm²的密度接种于培养皿，于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下培养。48小时后首次换液，加入条件培养液继续培养隔日换液。待细胞生长近汇合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×10⁴/cm²的密度接种进行细胞传代。优选第2～15代细胞用于制备人工软骨。

一类优选的骨髓基质干细胞是体外培养的第二代～第六代的骨髓基质干细胞。此时的骨髓基质干细胞有较强的增殖能力并具有多向分化的潜能，包括向软骨细胞分化的潜能。

软骨细胞

本发明中软骨细胞的来源没有特别限制，通常，本发明的软骨细胞是来自自体或同种异体的。一种优选的来源是来自自然流产的人胎儿，以3-10个月胎龄为佳。获取软骨的部位也没有特别限制，可以是关节软骨、肋软骨或其他软骨。

分离获得软骨细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是通过胶原酶消化进行分离，即用无血清F-12培养基(GIBCO公司)将胶原酶浓度调整至0.5-3mg/ml(较佳地约为1mg/ml)，37℃±0.5℃恒温振荡器内消化约4-16h。检测时，可采用台盼蓝染色，显微镜下计数。通常，原代细胞活力＞80％即可。

软骨细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将软骨细胞在CO₂培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)F-12培养基(GIBCO公司)+10％胎牛血清；2)F-12培养基(GIBCO公司)+20％小牛血清；3)F-12培养基(GIBCO公司)+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进软骨细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。

一类特别优选的软骨细胞是体外培养的原代～第二代软骨细胞。此时的软骨细胞经免疫组织化学染色证明有II型胶原表达，RT-PCR及原位杂交检测证明有II型胶原mRNA及聚集蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA的表达。

软骨细胞/骨髓基质干细胞的混合物

可以将软骨细胞和骨髓基质干细胞相互混合，形成用于制备人工软骨的细胞混合物。混合比例通常是软骨细胞∶骨髓基质干细胞为1∶9至5∶5，较佳地为2∶8至3∶7，更佳地为4∶6至5∶5。

此外，软骨细胞/骨髓基质干细胞可以混合培养。其方法通常是将原代的或早期传代的软骨细胞与传代培养后的骨髓基质干细胞分别计数，以3∶7，4∶6等所需的各种比例混均，以2.0×10⁴个细胞/cm²的密度接种于培养皿，以含地塞米松的条件培养液(通常与培养骨髓基质干细胞的培养液相同)培养，隔日换液，约3～4天可达融合状态，消化收集与可降解生物材料混合用于制备人工软骨移植物。

生物可降解材料

可用于本发明的组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；

(c)可注射性材料，如Pluronic(一种市售的聚环氧乙丙烯商品)、藻酸钙凝胶等；

(d)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。

优选的医学上可接受的生物可降解材料是可注射性的材料，例如藻酸钙凝胶、Pluronic凝胶等。

本发明组织工程化软骨中的软骨细胞和骨髓基质干细胞混合物的细胞浓度通常约为2×10⁷/ml至5×10⁷/ml或更高。当材料为可注射性材料时，以该液体材料调整软骨细胞浓度；当材料为固体性材料时，以培养液调整软骨细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例没有特别限制，但是以该固体材料所能够吸附培养液的最大量为准。

在本发明的组织工程化软骨移植物中，还可添加或复合其他各种细胞因子、生长因子、各种转基因成分，从而保持软骨细胞表型、促进软骨细胞生长或基质合成能力等。

制备方法

本发明的组织工程化软骨的制备方法简便，将一定数量的所述软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合物与药学上可接受的生物可降解材料混合即可。

用本发明方法形成的组织工程化软骨，分为两类，一类是软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合物与可注射性生物材料构成的复合物，该复合物可直接注射到皮下、软骨缺损处等体内各部位。另一类是软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合物与非可注射性生物材料构成的复合物，该复合物可直接植入体内皮下、软骨缺损处等体内各部位。

在一优选例中生物可降解材料为固态。此时，可用上述细胞与培养液制成浓度为5×10⁷/ml的细胞悬液，然后与生物材料聚羟基乙酸/聚乳酸支架(PGA/PLA)形成复合物，该复合物大小、形状依照软骨缺损的大小及形状确定。体外培养一周至三周，每一至二天换液一次，以保证细胞营养，当体外组织工程化软骨初步形成时植入体内皮下、软骨缺损处等体内各部位。

在另一优选例中，生物可降解材料是可注射性材料(Pluronic凝胶、藻酸钙凝胶等)。以该液体材料调整细胞浓度为5×10⁷/ml，直接用于皮下注射或体内缺损的修复。

应用方法

当生物可降解材料是可注射性材料时，细胞与生物材料复合物可直接植入皮下或体内软骨缺损处。当生物可降解材料为固态时，细胞与生物材料在体外复合，在生物反应器内形成适合各种软骨缺损大小和形状的组织工程化软骨后，再植入体内软骨缺损处。

本发明的主要优点在于：

(1)应用自体细胞，且一次取材既可获得足够的细胞量；

(2)骨髓穿刺操作简单，对病人损伤极小，无需住院，且可以重复取材；

(3)体外培养方法简单易学，便于推广应用；

(4)可按软骨缺损大小和形状预制移植物的大小和形状，以达到精确的修复。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

骨髓基质干细胞的获取和培养

实验动物：幼猪5头，体重约10kg，成年裸鼠10只，均由川沙养殖厂提供。

(1)取材

动物以氯氨酮10～20mg/kg、阿托品0.5～1mg肌注麻醉诱导及抑制腺体分泌，耳缘静脉缓慢静推水合氯醛(10％)1ml/kg或戊巴比妥钠(2.5％)1ml/kg麻醉，常规消毒铺巾，16号穿刺针于股骨近端穿刺，抽取骨髓6～8ml，置于肝素化的离心管中。

(2)分离有核细胞(密度梯度离心法)

将抽取的骨髓先后用5ml和1ml空针反复抽吸数次，转移至另一离心管内，加入少量的无血清DMEM培养液，混匀，3000rpm离心10分钟，轻轻吸除脂肪及大部分上清液，注意不要搅动下方的沉淀物，重新振荡混匀，在另一15ml离心管内加入新鲜配制的Percol分离液(Pharmacia公司)，分离液表面轻轻加入上述的骨髓细胞悬液(体积为分离液的一半)，900g离心30分钟，此时离心管内液体分为四层：第一层主要是血清和少量的培养液，第二层为有核细胞层，第三层为Percol分离液，第四层主要是沉淀下来的红细胞。轻轻吸取第二层的有核细胞转移至另一离心管内，加入适量的无血清DMEM培养液洗涤离心二次。

(3)接种

弃上清，细胞以含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco，GlandIsland，NY，USA)条件培养液制成细胞悬液，取少量细胞悬液用4％乙酸等体积稀释破坏残存的红细胞，常规计数有核细胞数，以2.5×10⁵/cm²的密度接种于培养皿，常用的100mm塑料培养皿接种有核细胞1.5×10⁷左右，加入细胞悬液9～10ml既可。

(4)培养与传代

将接种好的培养皿置于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下，培养48小时后首次换液，此时在低倍镜下可清楚地见到多个克隆形成，吸除旧培养液，PBS洗涤2～3次，加入新鲜条件培养液，继续在相同的条件下培养，隔日更换三分之二量的培养液，一般4～5天后可达到融合状态，可继续传代培养。传代时吸除培养液，以少量PBS洗涤一次，加入1.5-2.0ml的消化液(含0.02％EDTA及0.25％胰蛋白酶的PBS)，镜下见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后，轻轻吸除消化液，加入适量的含血清的DMEM条件培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以1.5×10⁴/cm²细胞密度接种于新的培养皿内，继续在相同的条件下培养。隔日更换三分之二量的培养液，一般4～5天后又可达到融合状态，可继续传代培养。以第2～6代细用于实验效果较佳。

倒置显微镜下观察，经地塞米松诱导的BMSCs近圆形或多角形，传代后可形成单层，无明显的方向性，胞浆内基质分泌颗粒较未经诱导的BMSCs旺盛。

实施例2

软骨细胞分离与培养

麻醉动物同前，无菌条件取下耳廓，剥去软骨膜，切成5mm×5mm大小碎片，磷酸盐缓冲液(PBS，含青、链霉素各100U/ml)冲洗两遍，按改良的Klagsbrun法，加入2倍体积的1mg/mlII型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床内消化8-12小时，过滤，离心；沉淀细胞用PBS洗涤2次，以含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C 50ug/ml，青、链霉素各100U/ml的DMEM培养液制成细胞悬液，计数，台盼蓝染色检查软骨细胞活力，一般活力＞85％，以2.7×10⁴个细胞/cm²接种于直径为10cm的培养皿，在37℃，5％CO₂及100％饱和湿度的培养箱中连续培养3天后更换培养液，以后隔日换液，原代细胞接种后生长7天达到融合，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化收集细胞，可继续传代或直接用于实验。一般原代到第二代细胞均可用于实验。

倒置显微镜下观察，软骨细胞呈圆形或多角形，可形成单层，基质分泌颗粒密集，有些密集区形成软骨样结节。

实施例3

软骨细胞与骨髓基质干细胞混合培养

软骨细胞与骨髓基质干细胞分别计数，以3∶7的比例混均，以2.0×10⁴个细胞/cm²的密度接种于培养皿，隔日换液，约3～4天可达融合状态，消化收集用于实验。

倒置显微镜下观察，混合培养后两种细胞无法区分，生长特性与软骨细胞相似，基质分泌颗粒较密集。

实施例4

细胞-生物支架复合物形成及体内植入与取材

将混合培养的两种细胞，或将分别培养的两种细胞以30％软骨细胞+70％BMSCs或40％软骨细胞+60％BMSCs混匀，均以5×10⁷个细胞/ml的终浓度与30％Pluronic F-127(一种市售的聚环氧乙丙烯商品)/DMEM混合，按每一样本0.5ml注射到裸鼠皮下及猪自体皮下，以同浓度的纯软骨细胞-Pluronic复合物、同浓度的纯BMSCs-Pluronic复合物及终浓度为1.5×10⁷个细胞/ml的软骨细胞-Pluronic复合物裸鼠皮下及猪自体皮下注射分别作为阳性对照、阴性对照及低浓度对照，10周后取材，分别从重量、体积、蛋白多糖含量及组织学等方面，对所形成的软骨组织进行评价。

(a)大体观察

10周时，30％软骨细胞+70％BMSCs(A组)、40％软骨细胞+60％BMSCs(B组)、混合培养的两种细胞(C组)及纯软骨细胞(D组)与30％Pluronic F-127/DMEM混合注射均可在裸鼠与猪自体皮下形成组织工程化软骨，新生软骨均呈乳白色，质实，有一定的弹性，周围未见明显的血管长入，纯骨髓基质干细胞-Pluronic复合物(E组)与低软骨细胞浓度组(F组)在裸鼠与猪自体皮下注射均无明显的软骨组织形成，只在F组的少数样本中有少量的软骨颗粒形成，E组多数样本形成纤维样组织，质软无弹性，可见较明显的小血管长入(图1A)。

(b)各组新生软骨的平均体积与平均湿重

10周时，各组新生软骨的平均体积与平均湿重结果如表1和表2，以及图1B和1C所示。

            表1  10周时裸鼠体内的新生软骨的各组平均体积

分组	A	B	C	D	F
						平均值标准差	0.360.041	0.4060.057	0.380.037	0.4480.048	0.0360.034

            表2  10周时裸鼠体内的新生软骨的各组平均湿重

分组	A	B	C	D	F
						平均值标准差	0.3460.041	0.3920.056	0.3670.037	0.4340.048	0.0280.027

单因素方差分析结果表明：A、B、C三组间无显著差异(P＞0.05)，A、B、C三组与D组间有显著差异(0.01＜P＜0.05，P＝0.04477)，但A、B、C三组的平均体积与平均湿重均达到了D组的80％以上。A、B、C、D四组均极显著地高于F组(P＜＜0.01)。

(c)、蛋白多糖含量测定

阿利辛蓝法测定蛋白多糖结果表明：各组新生软骨单位质量内蛋白多糖含量无显著差异。

(d)、组织学检查

HE染色：A、B、C、D四组与正常软骨组织学形态相近，均有成熟的软骨陷窝形成，但细胞密度较正常高，核大位于陷窝中央，胞外基质着色较正常稍淡。A、B、C三组可明显地分辨出两种不同核着色的细胞，一种为深兰色核与D组细胞相同，一种为稍浅的兰色核并在核周有明显的红染区，但两种细胞均可形成成熟的软骨陷窝。E组全为纤维样组织，有明显的小血管分布，无软骨陷窝形成。F组呈散在的成熟小软骨团，间有纤维样组织相连(图2)。

Safranin O染色：A、B、C、D四组与正常软骨无明显差别，胞外基质均染成深红色，有大量的空泡样软骨陷窝存在。E组为粉红色纤维样组织，未见软骨陷窝，F组呈散在的深红色小软骨团，间有粉红色纤维样组织相连(图3)。

Massion三色染色：A、B、C、D四组与正常软骨相似，均有大量绿色的胶原沉积，均可见到许多成熟的软骨陷窝。E组也有大量胶原沉积，但排列呈纤维样组织，无成熟的软骨陷窝，可见散在的染成黄色的小血管。F组也有少量胶原沉积，但只可见到散在的成熟软骨陷窝，中间仍为纤维样组织相连(图4)。

讨论

根据本实例结果，以少量的软骨细胞与多量的骨髓基质干细胞共培养后或直接混合后与生物材料混合接种于皮下形成了大块成熟的软骨组织，重量及体积与相同数量的软骨细胞所形成的软骨相近，两者在组织学上也非常相似。而单纯应用同数量的骨髓基质干细胞与生物材料混合接种于皮下不能形成软骨组织，单纯应用少量的软骨细胞与同体积的生物材料混合接种于皮下也不能形成或只形成极少量的软骨组织。这说明在软骨细胞作用下，与软骨细胞混合的或混合培养的骨髓基质干细胞在体内已分化为成熟的软骨细胞并形成了软骨组织，这大大地拓宽了软骨组织工程种子细胞的来源，也首次证实了软骨细胞是一个良好的诱导因素，能有效地诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，这一细胞诱导理论目前国内外尚未见报道。

本发明证实了软骨细胞可以作为一个诱导因素，有效地诱导骨髓基质干细胞在皮下形成成熟的软骨组织。本发明人认为软骨细胞在混合培养或细胞混合物中的作用有二：(1)分泌多种因子以旁分泌的方式诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化；(2)分泌软骨特异性基质，改善新生软骨的生化组成，并将骨髓基质干细胞暴露于软骨细胞外基质中，以利于其在体内形成组织工程化的软骨组织。进一步的工作将对上述可能存在的诱导机制进行深入的研究与探讨。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种组织工程化软骨移植物，其特征在于，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料，其中所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、Pluronics、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物；

(b)软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合物，所述的软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合比例为1∶9-5∶5。

2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的软骨细胞是自体的或同种异体的，而骨髓基质干细胞是自体的。

3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物为液态，且软骨细胞和骨髓基质干细胞混合物在所述软骨移植物中的细胞浓度为2×10⁷个细胞/ml-5×10⁷个细胞/ml。

4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物为固态，且软骨细胞和骨髓基质干细胞混合物在所述软骨移植物中的细胞浓度为2×10⁷个细胞/cm³-5×10⁷个细胞/cm³。

5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述软骨细胞来源于自体非功能区软骨或3-10月龄自然流产人胎儿软骨。

6.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、Pluronics、聚羟基丁酸、聚酸酐、脱细胞基质，及其混合物。

7.一种制备组织工程化软骨移植物的方法，其特征在于，包括步骤：

将软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合物与药学上可接受的生物可降解材料混合，形成移植物，其中所述的软骨细胞和骨髓基质干细胞的混合比例为1∶9-5∶5，

其中所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、Pluronics、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述的移植物为液态时，移植物中软骨细胞和骨髓基质干细胞混合物在移植物中细胞浓度为2×10⁷-5×10⁷个细胞/ml，或当所述的移植物为固态时，移植物中软骨细胞和骨髓基质干细胞混合物在移植物中细胞浓度2×10⁷-5×10⁷个细胞/cm³。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚乳酸、聚羟基乙酸、Pluronics、聚羟基丁酸、聚酸酐、脱细胞基质，及其混合物。

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