CN105833348A - hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法及其应用 - Google Patents

hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法，该制备方法使用0.125mm3大小的透明软骨颗粒，对hBMSCs进行诱导培养后，制备hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物，用于修复软骨表面的缺损，可以同时重建坚强的软骨下骨支撑，又可以恢复完整平滑的关节软骨表面，可以填充软骨下骨小梁间隙，并可与毗邻的缺损形成无缝隙连接。透明软骨颗粒的存在可以在修复组织内形成模拟正常的部分软骨细胞外基质，以及部分正常的软骨细胞，有利于加速重建过程，并增强表面的修复组织强度，采用的hBMSCs可以可起到双重作用，可延缓关节面的磨损和临近关节面的退变。

Description

hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法及其 应用
技术领域
本发明涉及一种hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法及其应用。
背景技术
关节内骨软骨复合缺损和损伤是临床常见疾病且难以治疗，骨软骨复合组织缺损是指同时包含关节面软骨组织缺损和软骨下骨缺损的复合式缺损，透明软骨组织缺乏自我修复能力，将导致骨性关节炎的结局。目前常用的治疗方式有软骨下骨钻孔、微骨折、自体或异体软骨移植以及软骨细胞移植，组织工程软骨组织移植等。都存在着修复能力有限、修复组织为纤维软骨成分，无法同时修复软骨下骨缺损，修复组织机械强度不足，疾病传播、供区有限、步骤繁琐、费用昂贵等不足且并发症多。目前国内外治疗骨软骨复合组织缺损的现状是尚无能同时满足软骨下骨支撑和光滑软骨面的理想方法。
发明内容
在临床上治疗关节内骨软骨复合组织损伤或缺损的关键因素在于既能重建坚强的软骨下骨支撑，又能再造光滑的关节软骨面，这样才能获得良好的效果。传统的方法如同种异体软骨移植、软骨下骨钻孔、微骨折、组织工程等单一方法都有各种并发症和缺陷，影响着这种常见疾病的治疗效果。为此，本发明提出一种hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法及其应用，该方法制备的复合物在制备治疗骨软骨复合组织缺损中的应用，用于组合式修复骨软骨复合组织缺损，方便临床应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法，该制备方法使用0.125mm3大小的透明软骨颗粒。
上述hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法具体采用以下步骤：
（1）同种异体或自体透明软骨颗粒的制备：
将切取的自体关节内非负重区股骨远端滑车沟两侧的透明软骨或同种异体透明软骨切成0.125mm3大小的颗粒状；
（2）hBMSCs（自体骨髓间充质干细胞）的诱导液培养：
髂嵴部位消毒后，用肝素预处理过的16号穿刺针于髂嵴处穿刺抽取骨髓20ml , 置于含有15ml条件诱导培养液（α—MEM培养基，内含终浓度为10％胎牛血清，100 u/ml青霉素钠，100μg/ml链霉素、20ng/ml hIGF-1、10 ng/ml hTGF-β、20ng/ml hBMP-2、地塞米松40ng/ml），和104U/ml终浓度的肝素的液体中混匀；分3部分接种于10cm 培养皿，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；第5日首次换液去除大部分未贴壁的细胞，之后隔日换液一次；15～20d细胞长至接近80％融合时传代；传代方法：0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合液，37℃消化3min；细胞变圆，透亮度和细胞间隔增大后，加入DMEM培养基5ml 终止消化，离心收集细胞悬液；PBS洗涤一次细胞，细胞沉淀稀释至5×105／ml接种培养；
（3）自体骨髓间充质干细胞/透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备：
消化收集hBMSCs，将5×107细胞以1 ml 1.2％藻酸钠充分悬浮，加入5g透明软骨颗粒搅拌均匀；37℃培养箱内保存备用；使用时20ml注射器内吸入hBMSCs/藻酸钠/透明软骨颗粒悬液，另一个注射器吸入终浓度为102mM CaCl2，同时向缺损内注入，静置15min使凝胶充分交联，吸弃多余液体；
（4）软骨下骨重建：
对于软骨面缺损而软骨下骨量尚可但有硬化情况，将原有硬化的软骨下骨凿出，制备成约1mm3大小的骨粒，混合同样大小的自体骨粒，或骨替代制品如硫酸钙、磷酸三钙等，打压入原有缺损处，使新形成的骨面超出毗邻关节软骨面1.5-2mm高度。如软骨下骨量明显不足，仅适用自体骨粒，或骨替代制品进行软骨下骨打压植骨。同时根据拟修复缺损的大小，切取关节内非负重区如滑车沟两侧的透明软骨备用。
（5）软骨面的重建：
在重建的软骨下骨的表面，均匀涂抹上述制备的自体骨髓间充质干细胞-透明软骨颗粒-藻酸钙凝胶复合物，使最终形成的表面高于临近关节软骨面0.5mm。
该制备方法使用0.125mm3大小的透明软骨颗粒作为修复骨软骨复合缺损的成分，使用自体骨髓间充质干细胞/透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物修复骨软骨复合缺损，对骨软骨复合组织缺损的软骨下骨缺损进行1mm3大小颗粒骨打压植骨重建。
上述自体骨髓间充质干细胞/透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法制得的复合物在制备治疗骨软骨复合组织缺损中的应用，该治疗方法是一种组合式修复骨软骨复合组织缺损的方法。
与现有技术相比,本发明具有以下优点和积极效果:
本发明的hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物，首次提出用于制备治疗骨软骨复合组织缺损的药物，利用组合式修复骨软骨复合组织缺损的方法，可以一期或者二期同时重建坚强的软骨下骨支撑，又可以恢复完整平滑的关节软骨表面，且修复重建的表面为透明软骨表面，其耐磨性和生物力学性能接近正常软骨。注射覆盖的方法可以填充软骨下骨小梁间隙，并可与毗邻的缺损形成无缝隙连接，在加强软骨下支撑强度的同时可以重塑平滑表面。透明软骨颗粒的存在可以在修复组织内形成模拟正常的部分软骨细胞外基质，以及部分正常的软骨细胞，有利于加速重建过程，并增强表面的修复组织强度。采用的自体骨髓间充质干细胞可以在软骨下骨的环境中分化为骨样细胞，在软骨表面的关节腔内环境中分化为软骨细胞，并且在诱导培养基的环境中更有利于向软骨细胞分化，如此可起到双重作用。发挥正常关节软骨面的功能，可延缓关节面的磨损和临近关节面的退变，延缓或阻止骨性关节炎的发生。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例针对在临床上治疗关节内骨软骨复合组织损伤或缺损的传统方法存在各种并发症和缺陷的问题，提出一种hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法，该制备方法制得的复合物用于制备治疗骨软骨复合组织缺损，既能重建坚强的软骨下骨支撑，又能再造光滑的关节软骨面，取得了良好的效果。具体来讲，
一种hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法，具体采用以下步骤：
（1）同种异体或自体透明软骨颗粒的制备：
将切取的自体关节内非负重区股骨远端滑车沟两侧的透明软骨或同种异体透明软骨切成0.125mm3大小的颗粒状；
（2）hBMSCs（自体骨髓间充质干细胞）的诱导液培养：
髂嵴部位消毒后，用肝素预处理过的16号穿刺针于髂嵴处穿刺抽取骨髓20ml , 置于含有15ml条件诱导培养液（α—MEM培养基，内含终浓度为10％胎牛血清，100 u/ml青霉素钠，100μg/ml链霉素、20ng/ml hIGF-1、10 ng/ml hTGF-β、20ng/ml hBMP-2、地塞米松40ng/ml），和104U/ml终浓度的肝素的液体中混匀；分3部分接种于10cm 培养皿，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；第5日首次换液去除大部分未贴壁的细胞，之后隔日换液一次；15～20d细胞长至接近80％融合时传代；传代方法：0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合液，37℃消化3min；细胞变圆，透亮度和细胞间隔增大后，加入DMEM培养基5ml 终止消化，离心收集细胞悬液；PBS洗涤一次细胞，细胞沉淀稀释至5×105／ml接种培养；
（3）自体骨髓间充质干细胞/透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备：
消化收集hBMSCs，将5×107细胞以1 ml 1.2％藻酸钠充分悬浮，加入5g透明软骨颗粒搅拌均匀；37℃培养箱内保存备用；使用时20ml注射器内吸入hBMSCs/藻酸钠/透明软骨颗粒悬液，另一个注射器吸入终浓度为102mM CaCl2，同时向缺损内注入，静置15min使凝胶充分交联，吸弃多余液体；
（4）软骨下骨重建：
对于软骨面缺损而软骨下骨量尚可但有硬化情况，将原有硬化的软骨下骨凿出，制备成约1mm3大小的骨粒，混合同样大小的自体骨粒，或骨替代制品如硫酸钙、磷酸三钙等，打压入原有缺损处，使新形成的骨面超出毗邻关节软骨面1.5-2mm高度。如软骨下骨量明显不足，仅适用自体骨粒，或骨替代制品进行软骨下骨打压植骨。同时根据拟修复缺损的大小，切取关节内非负重区如滑车沟两侧的透明软骨备用。
（5）软骨面的重建：
在重建的软骨下骨的表面，均匀涂抹上述制备的自体骨髓间充质干细胞-透明软骨颗粒-藻酸钙凝胶复合物，使最终形成的表面高于临近关节软骨面0.5mm。
上述自体骨髓间充质干细胞/透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法制得的复合物在制备治疗骨软骨复合组织缺损中的应用，该治疗方法是一种组合式修复骨软骨复合组织缺损的方法。该制备方法使用0.125mm3大小的透明软骨颗粒作为修复骨软骨复合缺损的成分，使用自体骨髓间充质干细胞/透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物修复骨软骨复合缺损，对骨软骨复合组织缺损的软骨下骨缺损进行1mm3大小颗粒骨打压植骨重建。
组合式修复骨软骨复合组织缺损的方法重建动物骨软骨复合缺损模型：
一、动物分组：成年山羊24只，体重18kg～25kg，按体重随机分为3组。组I（修复组）：组合式修复骨软骨复合组织缺损；组II：hBMSCs组：仅将hBMSCs复合藻酸钙凝胶修复骨软骨缺损；组III：对照组：制造缺损不修复。
二、动物自体骨髓间充质干细胞/透明软骨颗粒/纤维蛋白凝胶复合物的制备：无菌条件下穿刺抽取山羊骨髓20ml , 置于含有15ml条件诱导培养液（α—MEM培养基，内含终浓度为10％胎牛血清，100 u/ml青霉素钠，100μg/ml链霉素、20ng/ml hIGF-1、10 ng/mlhTGF-β、20ng/ml hBMP-2、地塞米松40 ng/ml），和104U/ml终浓度的肝素的液体中混匀。接种于10cm 培养皿。37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，15～20d细胞长至接近80％融合时传代。消化收集hBMSCs，将5×107细胞以1 ml 人纤维蛋白原溶液充分悬浮，加入5g透明软骨颗粒搅拌均匀。37℃培养箱内保存备用。
三、动物手术：山羊肌注速眠新0.1ml/kg麻醉后，常规消毒铺单，取膝关节正中切口，长约7cm ，依次切开皮肤、浅筋膜、深筋膜，髌旁内侧入路将髌骨向外侧翻开，显露股骨滑车及股骨髁。用特制的6mm 直径空心钻钻取深为6mm 的骨软骨缺损，填塞止血。自动物髂嵴取自体松质骨粒，混合以磷酸三钙颗粒，打压入原有缺损处，使新形成的骨面超出毗邻关节软骨面1mm高度。在重建的软骨下骨的表面，均匀涂抹上述制备的自体骨髓间充质干细胞-透明软骨颗粒纤维蛋白凝胶复合物，使最终形成的表面高于临近关节软骨面0.5mm。冲洗关节腔后，彻底止血，修复离断的肌肉、韧带及筋膜组织，逐层关闭切口。
四、术后检测：
1. 大体观察：术后4周、8周、16周分别切开关节进行大体观察修复效果。
2. 组织学检查：取各周组修复组织标本，2％甲醛液脱钙，水充分冲洗后，石蜡包埋切片行如下染色检查：
（1）HE染色：切片常规梯度酒精入水，蒸馏水洗，苏木素染色；水洗后盐酸酒精分化，水洗后梯度脱水，伊红溶液染色，依次过高浓度酒精，二甲苯透明两次，封片镜检。
（2）甲苯胺蓝染色：切片梯度酒精入水，蒸馏水漂洗，甲苯胺蓝乙醇溶液染色12～15min，水浸洗后95％酒精分化适当；100％酒精脱水两次；二甲苯透明两次；封片镜检。
（3）Masson’s三色染色：石蜡切片脱蜡；蒸馏水洗；哈里斯氏明矾苏木精染色10～20min；蒸馏水洗变蓝；酸性复红、丽春红、橙黄G稀释液5 min；0.2％醋酸水略洗；5％磷钨酸液分化媒染5 min；0.2％醋酸水略洗；亮绿液5 min；0.2％醋酸水略洗；脱水、透明、封片镜检。
（4）脱钙石蜡切片Ⅱ型胶原免疫组化染色：取标本后，10％甲醛固定48h；水洗，10％甲酸脱钙；5％Na2SO4浸泡48h；水洗后入70％酒精，丙酮固定，入二甲苯两次；石蜡包埋切片按试剂盒操作说明行II型胶原免疫组化染色。以不加一抗作为空白对照，正常关节软骨作为阳性对照。
3. 电镜观察：取16周修复组织，进行扫描电镜和透射电镜检查。
透射电镜观察：2％戊二醛PBS固定液4℃前固定2h；PBS缓冲液漂洗2次×10min；1％锇酸PBS固定液后固定2h；PBS缓冲液漂洗10min×2次；30％～50％～70％乙醇逐级脱水；70％乙醇含醋酸双氧铀4℃快染；80％～95％～100％乙醇梯度脱水；环氧丙烷置换10min×2次；618包埋后，LKB V型超薄切片机切片；枸橼酸铅染色液染色；H－500透射电镜观察超微结构。
扫描电镜观察：切取组织用4℃PBS洗涤2次，2％戊二醛磷酸缓冲液中前固定24h，1％锇酸后固定2h，乙醇逐级脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥（HITACHI， HCP－2），粘附于载物台上，BAL－TEC离子溅射，在QUANTA－200扫描电镜（Philip Holland）上观察修复组织表面形态。
4. 修复组织蛋白聚糖含量测定：切取16周各组标本正常软骨及修复软骨组织，用爱茜蓝法测定其中蛋白聚糖（glycosaminoglycans，GAG）含量。同时测定正常软骨中蛋白聚糖含量与之相比较。称取50mg组织，加裂解液（50mmol/L Tris· Cl PH=8.0、150mmol/LNaCl、100mg/L苯基甲基磺酰氯、1mg/L抑蛋白酶肽、1%吐温－20、0.5%去氧胆酸钠、0.1%SDS）研磨至成糜状，－60℃冻干，冻干产物以 1ml磷酸盐缓冲液（PBS）溶解。取50μl样本与50μl8mol/L GnCl混匀。依次加入50μl溶液1 (0.054 mol/L H2SO4 、0.75％Triton X100 )、750μｌ溶液 2 (5ｍｌ爱茜蓝贮液中加入1.0ml 1.8 mol/L H2SO4、8. 0ml 8mol/L GnCl、2.5ml10% Triton X100,最后加ddH2O定容至100ml ) ，振荡混匀，4℃反应 1h 。离心后加入750μl二甲基亚砜（DMSO）洗液（40%DMSO、0.05mol/LMgCl2）室温振洗30min，离心后以100μl溶解液（4.0mol/LGnCl、33%异丙醇）重溶爱茜蓝－蛋白聚糖沉淀复合物，移入 96孔板中，酶标仪在600nm波长处测定吸光值。各样本至少检测 3次，以ddH2O作为空白对照，裂解液作为阴性对照。结果采用ｔ检验。制作硫酸软骨素（CS）标准曲线：将CS贮液（0.5 g/L）梯度稀释至1、2、10、20、30、40g/L ，爱茜蓝法检测吸光值，标准曲线在相同条件下重复 3次。
5. X－ray观察：取16周实验组和对照组山羊完整膝关节摄前后位X线片观察骨软骨柱愈合情况。
6. MRI观察：取16周各组标本行MRI成像检测缺损修复情况。
7. 统计分析：使用SAS 6.12统计软件包进行数据处理，数据以均数±标准差表示，采用两样本均数比较t检验，p<0.05选定为有显著性差异标准。
五、结果分析。
1. 动物术后均无感染，伤口愈合良好。术后4小时山羊自行饮水，第二天可自主进食。动物不行外固定，自由笼中活动。手术肢体可部分负重，第4～5天可完全负重。
2. 大体观察：4周时：修复组：骨软骨缺损表面较光整，充填以色白质韧的新生软骨样组织，分布不均，质地较坚韧。hBMSCs组：骨软骨缺损大部分未被充填，部分缺损充填以暗灰色质软组织，缺损界限可分辨。对照组：缺损存在，无明显修复迹象，周缘软骨面轻度压陷，形成“火山口”样变化，缺损底部覆盖有薄层深红色纤维肉芽组织，质软。8周时：修复组：骨软骨缺损被完全填充修复，新生组织颜色及质地接近正常软骨，表面平滑，色白质硬。hBMSCs组：缺损基底覆盖暗红色再生组织，质软。对照组：缺损无明显修复，周缘软骨压陷加剧，局部软骨面变黄软化，缺损底部覆盖有薄层结缔组织，色暗红，质软，缺损对侧胫骨平台部分关节面磨损，软骨变薄。16周时：修复组：骨软骨缺损处的关节面平滑，新生软骨组织色白质硬，类似于正常软骨。hBMSCs组：缺损大部分仍存在，局部髁部关节面稍变平。对照组：缺损稍缩小，局部髁关节面变平，周围软骨压陷明显，软骨退变，底部有薄层色暗红的结缔组织，质软，缺损对侧胫骨平台面软骨磨损严重，遗留轻度跛行。
3. 组织学观察：修复组：光镜观察可见修复组织新生软骨细胞排列规整，相对密集，甲苯胺蓝染色与毗邻软骨类似，形成的表面较平滑，基质着色深，高倍镜可见基底部细胞分布均匀，排列密集，胞核较大，细胞外基质分布均一，甲苯胺蓝着色较深。II型胶原免疫组化染色可见修复组织基质有深棕黄色着色，分布均匀，细胞排列规整。扫描电镜观察可见16周时修复的骨软骨表面平滑光整，纤维排列规则；对新生软骨横断面扫描电镜观察发现纤维排列规则，纤维间缝隙为致密的细胞外基质填充。透射电镜观察移植软骨存在同源软骨细胞群，细胞突起较多，细胞器丰富，细胞周围胶原纤维排列规整。hBMSCs组：缺损大部分仍存在，部分修复组织细胞排列密集，细胞外基质分布欠均匀。对照组：缺损存在，无明显修复现象，缺损基底部覆盖有薄层纤维结缔组织，甲苯胺蓝无着色，毗邻软骨层甲苯胺蓝着色浅，部分软骨层裂。
4. 软骨蛋白聚糖含量测定：结果正常软骨中GAG含量为18.62±1.35mg／g；修复组织为14.95±1.30mg／g；hBMSCs组为6.85±0.95mg／g；对照组为1.60±0.90mg／g。各组间比较均有显著统计学差异（P<0.05）。
5. X线观察：在术后16周修复组可见软骨下骨愈合良好，内外髁对称，相对关节面平滑；hBMSCs组和对照组则仍可见骨质缺损，相对关节面有局部骨质硬化现象。
6. MRI观察：矢状位T2WI观察修复组软骨下骨质信号均一，软骨层厚度均一，较平滑光整，信号一致。hBMSCs组和对照组股骨髁处可见深达软骨下骨质的大片局部信号增高区，软骨层缺失，边缘软骨层变薄，信号减低。
由上述对成年山羊骨软骨复合缺损的不同分组的实验分析，可见采用本发明的组合式修复骨软骨复合组织缺损的方法术后效果最好，既能重建坚强的软骨下骨支撑，又能恢复完整平滑的关节软骨表面，且修复重建的表面为透明软骨表面，其耐磨性和生物力学性能接近正常软骨。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.一种hBMSCs /透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法，其特征在于，该制备方法使用0.125mm3大小的透明软骨颗粒。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于具体采用以下步骤：
（1）同种异体或自体透明软骨颗粒的制备：
将切取的自体关节内非负重区股骨远端滑车沟两侧的透明软骨或同种异体透明软骨切成0.125mm3大小的颗粒状；
（2）hBMSCs的诱导液培养：
髂嵴部位消毒后，用肝素预处理过的16号穿刺针于髂嵴处穿刺抽取骨髓20ml , 置于含有15ml条件诱导培养液，α—MEM培养基，内含终浓度为10％胎牛血清，100 u/ml青霉素钠，100μg/ml链霉素、20ng/ml hIGF-1、10 ng/ml hTGF-β、20ng/ml hBMP-2、地塞米松40ng/ml，和104U/ml终浓度的肝素的液体中混匀；分3部分接种于10cm 培养皿，37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；第5日首次换液去除大部分未贴壁的细胞，之后隔日换液一次；15～20d细胞长至接近80％融合时传代；传代方法：0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的混合液，37℃消化3min；细胞变圆，透亮度和细胞间隔增大后，加入DMEM培养基5ml 终止消化，离心收集细胞悬液；PBS洗涤一次细胞，细胞沉淀稀释至5×105／ml接种培养；
（3）hBMSCs/透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备：
消化收集hBMSCs，将5×107细胞以1 ml 1.2％藻酸钠充分悬浮，加入5g透明软骨颗粒搅拌均匀；37℃培养箱内保存备用；使用时，20ml注射器内吸入hBMSCs/藻酸钠/透明软骨颗粒悬液，另一个注射器吸入终浓度为102mM CaCl2，同时向缺损内注入，静置15min使凝胶充分交联，吸弃多余液体，得hBMSCs/透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物。
3.上述权利要求1或2所述自体骨髓间充质干细胞/透明软骨颗粒/藻酸钙凝胶复合物的制备方法制得的复合物在制备治疗骨软骨复合组织缺损中的应用。
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