CN1954890A

CN1954890A - 一种组织工程骨软骨复合物制备方法及其应用

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Publication number: CN1954890A
Application number: CN 200510015576
Authority: CN
Inventors: 葛薇; 李长虹
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2005-10-24
Filing date: 2005-10-24
Publication date: 2007-05-02

Abstract

本发明公开了一种组织工程骨软骨复合物制备方法及其应用，用组织工程的方法分别构建骨和软骨复合物，然后用一种黏性产物将这两部分粘接起来，将成骨的部分做成一个楔子，插入损伤部位深处，使其可以牢固的固定在损伤局部，同时进行骨和软骨的修复。本发明是一种应用多潜能干细胞构建优良的组织工程骨软骨的方法，同时可以解决组织工程修复关节软骨缺损方法中组织工程复合物容易脱落的难题。

Description

一种组织工程骨软骨复合物制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种组织工程复合物的制备方法及其应用，尤其是一种组织工程骨软骨复合物的制备方法及其应用。

背景技术

关节软骨的损伤和缺损是临床骨科的常见疾病，连接替代和骨软骨缺损重建对于恢复骨和软骨功能是非常重要的，目前临床上通常采用非生物替代物，异种和同种异体的骨软骨移植物来治疗软骨缺损。但是，非生物替代物的连接替代的效果不能持久，经常磨损和松脱；自体供者组织的可用性和供体的损伤限制了自体移植的应用，异体移植又存在免疫排斥和病毒感染等危险性，都无法达到令人满意的效果。组织工程学是近年来发展起来的一种结合了细胞生物学、工程学和材料科学和外科领域的发展的、提供了一种新的用活细胞、生物材料和信号分子来构建功能性的组织的新的学科。目前应用组织工程的手段修复关节软骨缺损的研究中存在三个难点，一是种子细胞的选择，种子细胞必须满足一定的数量，并且能够维持良好的生物学特性；二是支架材料的选择，支架材料必须具备优良的生物相容性，生物可降解性和可塑性；三是组织工程组织的固定方法，组织工程复合物必须稳固地固定于缺损局部，才能达到良好的修复效果。

由于构建骨软骨组织工程复合物需要不同组织来源的细胞，应用新鲜的骨和软骨细胞的两个不利因素是不能得到足够数量的细胞和取材的局限性，一些研究指出，软骨细胞在体外单层培养中的去分化也影响其接种到支架上以后软骨细胞功能的发挥。研究证实：累及软骨下骨的缺损，其周围的软骨细胞不参与细胞再生，修复组织主要起源于髓腔内的基质细胞(MSCs)。骨髓MSCs是一簇具有向多系转化潜能的间质干细胞。它在一定的环境及刺激因子的作用下，可以转化为成骨细胞、软骨细胞、骨髓间质细胞、脂肪细胞甚至肌细胞等。它是骨及软骨组织损伤中的主要修复细胞，因而应用组织工程的方法将MSC带到局部损伤部位可以作为一种非常有潜力的治疗方法。用该种组织工程软骨移植物修复关节软骨缺损具有如下优点：(1)细胞来源方便，诱导前的MSCs为干细胞表现型，经体外长期传代增殖后，不丢失表现型及多潜能转化活性。(2)属于自体移植，没有免疫原性。(3)诱导后的细胞除部分骨和软骨细胞外，还含有较多的定向性骨和软骨起源细胞，它具有在体内发育成骨和软骨的能力。(4)其软骨形成过程是一个类似于胚胎的软骨发育过程，有可能使软骨缺损得到根本修复。因此应用MSC的在不同的培养条件下可分化为软骨和骨组织的潜能，可以分别构建骨和软骨组织，同时从临床应用的角度来看，骨髓的采集相对简单，损伤小的，费用低，具有很好的实用性。

支架材料的选择也是影响组织工程组织构建效果的一个重要因素，支架材料分为天然的生物材料和合成材料，天然生物材料具有良好的生物相容性，但机械性能稍差。合成材料虽然具有良好的空隙率和可塑性功能，但生物相容性较差，细胞黏附性不好。一般认为良好的支架材料应该具有良好的生物相容性、可塑性及可降解性。I型胶原是天然的骨软骨基质成分，已在许多研究中被用于MSC的载体构建软骨或修复关节软骨缺损，结果显示其可以给细胞提供黏附、分化、细胞外基质分泌和软骨组织形成的环境。脱钙骨基质是天然骨质脱钙后的成分，具有很好的支持成骨细胞生长和分泌骨基质的能力，也显示出支持MSC成骨的能力，具有良好的成软骨效果。

目前已有很多研究者尝试应用MSCs与各种支架材料复合在体内外构建组织工程软骨，取得了不同程度的修复效果。如王万明，胡蕴玉.骨髓基质细胞源性软骨细胞修复兔全层关节软骨缺损。中国修复重建外科杂志，2004，18：58-62。但是应用组织工程软骨复合物在软骨损伤的修复还存在一个不容忽视的问题，那就是用于修复的组织工程软骨复合物不易固定，很容易脱落，造成修复的不良，由于软骨细胞的自身修复能力非常有限，因此限于软骨层面的损伤基本不能修复。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种应用多潜能干细胞构建优良的组织工程骨软骨的方法，同时解决组织工程修复关节软骨缺损方法中组织工程复合物容易脱落的难题。

由于深达软骨下骨的损伤可以依靠骨髓中的间质干细胞得到不同程度的修复。所以，我们设想用组织工程的方法分别构建骨和软骨复合物，然后用一种黏性产物将这两部分粘接起来，将成骨的部分做成一个楔子，插入损伤部位深处，使其可以牢固的固定在损伤局部，同时进行骨和软骨的修复。I型胶原已在许多研究中被用于MSCs的载体去形成软骨或修复关节软骨缺损，结果显示其可以给细胞提供黏附、分化、细胞外基质分泌和软骨组织形成的环境。脱钙骨基质也显示出支持MSCs成骨的能力。

这种组织工程组织复合物构建的一个关键是如何在体内移植和组织处理过程中连接不同的材料和维持完整的结构。用于这个目的的材料应该是可再吸收性的和生物相容性的，在最近的研究中，纤维蛋白原(FS)由于其生物来源和广泛的临床用途受到很多关注，FS的是模仿机体凝血机制的最后阶段，液相的纤维蛋白原与凝血酶接触后，在XIII因子的作用下，最终聚合成三维立体网状结构的纤维蛋白。由于其具有在一定条件下在液态和固态之间转化的特点，具有良好的融合性以及在接种后6周可再吸收的特点，提示这种封闭剂作为两种不同的生物材料的一种连接载体是适宜和有效的。

因此，我们将这两种材料的优势结合起来构建骨和软骨的复合物，来修复兔骨软骨损伤。数据提示用MSC和支持软骨和骨分化的不同的生物材料和生物反应因子来进行组织工程骨和软骨复合物的构建是可行的。

应用淋巴细胞分离液密度梯度离心的方法体外分离和扩增骨髓多潜能干细胞(BMSCs)，当BMSCs第2-3代达到汇合后，消化，计数，按照3×10⁷-6×10⁷/100mm²的密度接种，分别用不同的软骨和骨的诱导体系来进行初步的软骨和骨起源的诱导。

取新西兰兔髂骨、膝关节，进行一系列的脱钙处理，制备脱钙骨基质；然后分别将脱钙骨基质和I型胶原海绵切成3×3×3mm-4×4×4mm大小，预先包被人纤维连接蛋白并干燥过夜。培养在不同诱导体系中的BMSCs分别接种到脱钙骨基质立方体和I型胶原中，接种了细胞的材料在构建复合物前置于培养箱中孵育1-2h。然后接种了细胞的支架表面直接用无菌医用纱布擦干，按照修复的结构将两种支架放于一个合适大小的模子中，中间留有缝隙，分别滴加5-10μl纤维蛋白溶液形成一个薄膜，然后再滴加等体积的凝血酶溶液中，让这两个成分之间发生反应在5-10秒中之内形成凝胶。再将两种支架细胞复合物轻轻的挤压，促进这两种材料紧密的接触。这种复合移植物放于37℃，30min后用于关节软骨缺损的修复。制备兔关节软骨缺损的模型，用构建的组织工程骨软骨复合物进行修复治疗。

本发明的有益效果是：在胶原中形成了软骨组织而在脱钙骨基质中形成了骨组织，在这两种材料之间有胶原分泌来进行结构连接。实验证明它在体内关节滑液及力学环境的作用下，可迅速转变为成熟的骨和软骨细胞，并分泌基质，形成了与周围关节软骨无明显差异的透明软骨，促进了软骨下骨板的早期形成，阻止或延缓了透明软骨组织的退化。同时组织工程复合物在本实验的12周观察期内，所形成的软骨基本稳定。

附图说明

图1.本发明的骨软骨组织构建流程图

图2.分离培养的BMSC

图3.软骨诱导7天II型胶原染色

图4.软骨诱导7天甲苯胺兰染色

图5.成骨诱导7天碱性磷酸酶染色

图6.成骨诱导7天I型胶原免疫组化染色

图7.I型胶原支架

图8.脱钙骨基质支架

图9.实施例1支架对照组修复软骨效果图

图10.实施例1实验组修复软骨效果图

图11.实施例1支架对照组修复软骨甲苯胺兰染色

图12.实施例1实验组修复软骨甲苯胺兰染色

图13.实施例2支架对照组修复软骨效果图

图14.实施例2实验组修复软骨效果图

图15.实施例2支架对照组修复软骨甲苯胺兰染色

图16.实施例2实验组修复软骨甲苯胺兰染色

图17.实施例3支架对照组修复软骨效果图

图18.实施例3实验组修复软骨效果图

图19.实施例3支架对照组修复软骨甲苯胺兰染色

图20.实施例3实验组修复软骨甲苯胺兰染色

图21.实施例4支架对照组修复软骨效果图

图22.实施例4实验组修复软骨效果图

图23.实施例4支架对照组修复软骨HE染色

图24.实施例4实验组修复软骨HE染色

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

如图1所示，本发明的组织工程骨软骨复合物制备方法，包括以下步骤：

1)应用淋巴细胞分离液密度梯度离心的方法体外分离和扩增骨髓多潜能干细胞BMSCs，当BMSCs第2-3代达到汇合后，消化，计数，按照3×10⁷-6×10⁷/100mm²的密度接种，分别用不同的软骨和成骨的诱导体系来进行初步的软骨和骨起源的诱导；

2)取新西兰兔新鲜的髂骨、膝关节，进行脱钙处理，制备脱钙骨基质；

3)然后分别将脱钙骨基质和I型胶原海绵切成所需大小的立方体支架，预先包被人纤维连接蛋白并干燥过夜；

4)将步骤1中培养在不同诱导体系中的BMSCs分别接种到步骤3中制备的脱钙骨基质支架和I型胶原支架中，接种了细胞的材料置于培养箱中孵育1-2h；

5)将接种了细胞的支架表面直接用无菌医用纱布擦干，按照修复的结构将两种支架放于一个合适大小的模子中，中间留有缝隙，分别滴加5-10μl纤维蛋白溶液形成一个薄膜，然后再滴加等体积的凝血酶溶液中，让这两个成分之间发生反应，在5-10秒中之内形成凝胶；

6)将两种支架细胞复合物轻轻的挤压，促进这两种材料紧密的接触；这种复合移植物放于37℃，30min后用于关节软骨缺损的修复。

下面对具体的实施例进行更详细的说明：

实施例1 应用间充质干细胞制备组织工程软骨修复关节软骨缺损

1)骨髓多潜能干细胞的体外分离和扩增：经骨髓穿刺抽取兔骨髓，应用密度梯度离心的方法用淋巴细胞分离液(比重1.077)分离单个核细胞，按照4×10⁷/100mm²的密度接种于培养瓶中，培养基为含60％的DMEM-LG/F/12，40％MCDB-201(Gibco)，2％FBS，10ng/ml EGF，10ng/mlPDGF-bb(Peprotech)成分。置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。24～72小时后，弃除悬浮细胞，加入新鲜培养基继续培养，每隔3天换液一次，至细胞长至80％汇合后，以含0.25％胰酶-0.1％EDTA 37℃消化细胞，计数，以3×10⁴-5×10⁴/cm²的密度接种细胞，按上述条件继续培养及传代。

2)软骨起源细胞的诱导：当MSC第一代达到汇合，消化，计数，按照5×10³/mm²的密度培养于含10％胎牛血清，TGF-β1 10ng/ml，地塞米松100nmol/L，维生素C50μg/ml，胰岛素10U/ml，牛血清白蛋白1.25mg/ml，脯氨酸40μg/ml，丙酮酸盐100μg/ml的DMEM-LG培养体系中，每3天换液1次，14d后收集细胞接种到I型胶原海绵材料上用于软骨组织的构建。

3)I型胶原海绵的准备：清华大学材料系制备。75％乙醇消毒备用，使用前以无菌生理盐水清洗3次，每次10min，风干后应用。

4)体外软骨复合移植物的构建：I型胶原海绵切成3×3×3mm大小，MSC用滴加的方法分别接种到I型胶原中，这种接种了细胞的材料在构建复合物前置于培养箱中37℃，2小时后用于关节软骨缺损的修复。

5)动物模型的制备：5个月龄的日本大耳白兔36只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg，平均分为2组，每组18只。于股骨髁部滑车槽内钻孔，直径3mm，深6mm，深达软骨下骨。用无菌PBS液冲洗缺损部位，将培养的软骨细胞复合物来填充，用纤维蛋白封闭剂封闭创面四周，A组为移植上述制备的组织工程软骨移植物组，B组为移植无细胞的单纯载体对照组。修复12周后的大体和甲苯胺兰染色图片见图9-12，可见对照组缺损没有修复，显示明显的圆形缺损外观，骨质裸露或以少量纤维组织覆盖缺损。实验组没有见到明显的软骨修复，缺损边缘清晰可见，表层为纤维组织而且向宿主两端延伸，缺损出底端有海绵状骨生成。两组修复效果没有明显差别。

实施例2 应用骨髓间充质干细胞制备组织工程骨软骨复合物修复关节软骨缺损

1)骨髓多潜能干细胞的体外分离和扩增：经骨髓穿刺抽取兔骨髓，淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞，按照5×10⁷/100mm²的密度接种于培养瓶中，培养基为含60％的DMEM-LG/F/12，40％MCDB-201(Gibco)，2％FBS，10ng/ml EGF，10ng/mlPDGF-bb(Peprotech)成分。置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。2-3天后，弃除悬浮细胞，加入新鲜培养基继续培养，每隔3天换液一次，至细胞长至80％汇合后，以含0.25％胰酶-0.1％EDTA 37℃消化细胞，计数，以3×10⁴-5×10⁴/cm²的密度接种细胞，按上述条件继续培养及传代。

2)软骨起源细胞的诱导当MSC第一代达到汇合，消化，计数，按照5×10³/mm²的密度培养于含10％胎牛血清，TGF-β1 10ng/ml，地塞米松100nmol/L，维生素C50μg/ml，胰岛素10U/ml，牛血清白蛋白1.25mg/ml，脯氨酸40μg/ml，丙酮酸盐100μg/ml的DMEM-LG培养体系中，每3天换液1次，14d后收集细胞接种到I型胶原海绵材料上用于软骨组织的构建。

3)骨起源细胞的诱导当BMSC第2-3代达到汇合后，消化，计数，按照5×10³/mm²的密度培养在含有100nm地塞米松，10nmβ-磷酸甘油，和0.05mM的V-C，10％胎牛血清的DMEM-LG培养体系中，每周换液2次。7d后收集细胞接种于脱钙骨基质中用于构建组织工程骨。

4)脱钙骨基质的制备：新西兰兔髂骨、膝关节取材，去净周围软组织、骨膜及表面软骨，预冷生理盐水冲洗骨髓腔，彻底去除残存骨髓和血块。然后进行如下处理：①25℃，1∶1氯仿2甲醇1h；②4℃，0.6mmol/L盐酸72h；③4℃，2mmol/L氯化钙1h；④4℃，0.5mmol/L EDTA 1h；⑤4℃，8mmol/L氯化锂1h；⑥55℃，水浴4h。每步完成后，均以预冷蒸馏水漂洗3次，每次10min。标本冻干，75％乙醇消毒备用。使用前以无菌生理盐水清洗3次，每次10min，风干后应用。

5)I型胶原海绵的准备：清华大学材料系制备。75％乙醇消毒备用，使用前以无菌生理盐水清洗3次，每次10min，风干后应用。

6)体外骨和软骨复合移植物的构建：脱钙骨基质和I型胶原海绵被切成合适大小。培养在不同诱导体系中的BMSC用滴加的方法分别接种到脱钙骨基质立方体和I型胶原中，接种了细胞的材料在构建复合物前置于培养箱中37℃，2h。接种了细胞的支架表面直接用无菌医用纱布擦干，少量的纤维蛋白溶液覆盖于支架表面，形成一个薄膜，等体积的凝血酶溶液继而滴加于纤维蛋白层上，这两个成分之间发生反应在几秒中之内形成凝胶。I型胶原海绵继而放于这个凝胶中，轻轻的挤压促进这两种材料紧密的接触。这种复合移植物放于37℃，30min后用于关节软骨缺损的修复。

7)动物模型的制备：5个月龄的日本大耳白兔36只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg，平均分为3组，每组12只。于股骨髁部滑车槽内钻孔构建关节软骨缺损模型，用无菌PBS液冲洗缺损部位，将培养的骨软骨细胞复合物来填充，成骨端插入骨软骨损伤的深部，成软骨端在外部，与正常关节组织结构相吻合。A组为移植上述制备的组织工程软骨移植物组，B组为移植无细胞的单纯载体对照组。修复12周后的大体及组织学染色图片见图13-16，可见对照组缺损没有修复，显示明显的圆形缺损外观，缺损表面不规则，填充处主要为纤维组织填充。实验组可见缺损有部分修复，但仍可见明显缺损，表层外周有少量软骨形成，但软骨细胞排列不规则，中间以纤维组织覆盖。

实施例3 应用骨髓间充质干细胞制备组织工程骨软骨复合物修复关节软骨缺损

1)采用实施例2制备的软骨和骨起源细胞。

2)采用实施例2制备的软骨和骨支架材料。

3)体外骨和软骨复合移植物的构建：脱钙骨基质和I型胶原海绵被切成合适大小。培养在不同诱导体系中的BMSC用滴加的方法分别接种到脱钙骨基质立方体和I型胶原中，接种了细胞的材料在构建复合物前置于培养箱中37℃，2h。接种了细胞的支架表面直接用无菌医用纱布擦干，按照修复的结构将两种支架放于一个合适大小的模子中，中间留有2-4mm的缝隙，分别滴加7μl纤维蛋白溶液，使其形成一个薄膜，然后再滴加等体积的凝血酶溶液中，让这两个成分之间发生反应在5-10秒中之内形成凝胶。然后将两种支架细胞复合物轻轻的挤压，促进这两种材料的接触。将这种复合移植物放于37℃，30min后用于关节软骨缺损的修复。

4)采用实施例2制备的动物模型。修复12周后的大体及组织学图片见图17-20，可见对照组缺损没有修复，显示明显的圆形缺损外观，底部被纤维组织填充，实验组可见缺损有大部分修复，但仍可见较为明显缺损，缺损表层有薄层软骨形成，未形成软骨下骨板，底部有少量海绵状骨生成。说明实验组达到部分修复效果。

实施例4 应用骨髓间充质干细胞制备组织工程骨软骨复合物修复关节软骨缺损

1)骨髓多潜能干细胞的体外分离和扩增：经骨髓穿刺抽取兔骨髓，淋巴细胞分离液(比重1.077)分离单个核细胞，按照5×10⁷/100mm²的密度接种于培养瓶中，培养基为含60％的DMEM-LG/F/12，40％MCDB-201，2％FBS，10ng/ml EGF，10ng/mlPDGF-bb等成分。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。24～72小时后，弃除悬浮细胞，加入新鲜培养基继续培养，每隔3天换液一次，至细胞长至80％汇合后，以含0.25％胰酶-0.1％EDTA37℃消化细胞，计数，以3×10⁴-5×10⁴/cm²的密度接种细胞，按上述条件继续培养及传代。体外培养的BMSC见图2，可见细胞呈梭形，呈涡旋样生长。

2)软骨起源细胞的诱导：当BMSCs第一代达到汇合，消化，计数，按照5×10³/mm²的密度培养于含有TGF-β1 10ng/ml，地塞米松100nmol/L，维生素C50μg/ml，胰岛素10U/ml，牛血清白蛋白1.25mg/ml，脯氨酸40μg/ml，丙酮酸盐100μg/ml的含10％胎牛血清的DMEM-LG培养体系中，每3天换液1次，7d后收集细胞接种到I型胶原海绵材料上用于软骨组织的构建。诱导7天的BMSC见图3，图4，可见诱导后细胞免疫组化染色显示II型胶原分泌阳性，并分泌软骨细胞特异性的甲苯胺兰异染性的糖胺多糖。

3)骨起源细胞的诱导：消化第1代BMSCs细胞，培养在含有100nmol/L地塞米松，10nmol/L β-磷酸甘油，和0.05mol/L的V-C，含10％胎牛血清的DMEM-LG培养体系中，每周换液2次。7d后收集细胞接种于脱钙骨基质中用于构建组织工程骨。诱导7天的BMSC见图5，图6，可见诱导后的细胞碱性磷酸酶染色阳性，并表达成骨细胞特异性的I型胶原。

4)脱钙骨基质的制备：新西兰兔髂骨、膝关节取材，去净周围软组织、骨膜及表面软骨，预冷生理盐水冲洗骨髓腔，彻底去除残存骨髓和血块。然后进行如下处理：①25℃，1∶1氯仿2甲醇1h；②4℃，0.6mmol/L盐酸72h；③4℃，2mmol/L氯化钙1h；④4℃，0.5mmol/L EDTA 1h；⑤4℃，8mmol/L氯化锂1h；⑥55℃，水浴4h。每步完成后，均以预冷蒸馏水漂洗3次，每次10min。标本冻干，75％乙醇消毒备用。使用前以无菌生理盐水清洗3次，每次10min，风干后应用。制备的脱钙骨基质材料见图7。

5)I型胶原海绵的准备：清华大学材料系制备。75％乙醇消毒备用，使用前以无菌生理盐水清洗3次，每次10min，风干后应用。制备的I型胶原海绵见图8。

6)体外骨和软骨复合移植物的构建脱钙骨基质和I型胶原海绵被切成3×3×3mm大小，预先包被人纤维连接蛋白(100μl/ml)并干燥过夜。培养在不同培养基中的MSC用抽真空的方法分别接种到脱钙骨基质立方体和I型胶原中，每毫克脱钙骨基质黏附接近2500个细胞，而每毫克I型胶原海绵黏附3600-4500个细胞，这种接种了细胞的材料在构建复合物前置于培养箱中37℃，2h。纤维蛋白封闭剂是一种商业产品，由两种组分构成，纤维蛋白溶液(75-115mg/ml纤维蛋白原和3000U/mL纤维蛋白融解抑制剂)和凝血酶溶液(500U凝血酶和40μmol/L)的氯化钙)。接种了细胞的支架表面直接用无菌医用纱布擦干，按照修复的结构将两种支架放于一个合适大小的模子中，中间留有2-4mm的缝隙，分别滴加7μl纤维蛋白溶液形成一个薄膜，然后再滴加等体积的凝血酶溶液中，让这两个成分之间发生反应在几秒中之内形成凝胶。然后将两种支架细胞复合物轻轻的挤压，促进这两种材料紧密的接触。这种复合移植物放于37℃，30min后用于关节软骨缺损的修复。

7)动物模型的制备：5个月龄的日本大耳白兔36只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg，平均分为2组，每组18只。于股骨髁部滑车槽内钻孔，直径3mm，深6mm，深达软骨下骨。用无菌PBS液冲洗缺损部位，将培养的骨软骨细胞复合物来填充，成骨端插入骨软骨损伤的深部，成软骨端在外部，与正常关节组织结构相吻合。A组为移植上述制备的组织工程软骨移植物组，B组为移植无细胞的单纯载体对照组。修复12周后的大体图片见图21-22，可见对照组缺损没有修复，显示明显的圆形缺损外观。实验组缺损表面已被一层薄薄的软骨膜修复，修复组织与正常组织连接，没有炎性组织增生，厚度稍薄于正常软骨。修复后组织切片HE染色见图23-24，对照组仍有很大缺损没有修复，缺损内充满了纤维组织，以纤维组织修复为主。实验组可见典型的透明软骨，软骨下骨厚度接近正常，新生软骨与正常软骨结合密切，软骨细胞呈串状排列，可见软骨陷窝。但显微镜下仍可见修复的关节软骨表面有微小凹陷。

当然，通过上面的动物实验证明在胶原中形成了软骨组织而在脱钙骨基质中形成了骨组织，在这两种材料之间有胶原分泌来进行结构连接。本结果也可用于人的组织工程骨软骨复合物制备。

Claims

1、一种组织工程骨软骨复合物制备方法，包括以下步骤：

2、根据权利要求1所述的组织工程骨软骨复合物制备方法，其特征在于步骤1中所述的软骨的诱导体系是DMEM-LG培养液，其中含10％胎牛血清，TGF-β1 10ng/ml、地塞米松100nmol/L、维生素C 50μg/ml、胰岛素10U/ml、牛血清白蛋白1.25mg/ml、脯氨酸40μg/ml、丙酮酸盐100μg/ml。

3、根据权利要求1所述的组织工程骨软骨复合物制备方法，其特征在于步骤1中所述的成骨的诱导体系是100nmol/L的地塞米松，10nmol/L β-磷酸甘油，0.05mol/L维生素C和10％胎牛血清的DMEM-LG培养液。

4、根据权利要求1所述的组织工程骨软骨复合物制备方法，其特征在于所述的脱钙骨基质和I型胶原海绵的支架立方体为3×3×3mm-4×4×4mm。

5、根据权利要求1所述的组织工程骨软骨复合物制备方法，其特征在于所述的留有缝隙为2-4mm。

6、权利要求1所制备的骨软骨复合物，用于关节软骨缺损的修复。