CN105194731A - 一种体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方及制备方法，配方包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、凝血酶，添加剂为维生素C、亚油酸、胆固醇、地塞米松、转铁蛋白、生物素等。通过使用该配方及方法制备的支架，使得在体外培养的软骨细胞保持原代活性，且在软骨组织工程临床应用中能根据病人软骨缺损形状，提供塑性的凝胶状支架。

Description

一种体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方及制备方法

技术领域

本发明涉及软骨修复领域，尤其涉及一种软骨组织工程支架及其制备方法。

背景技术

关节软骨损伤，无论是外伤还是病理原因造成的损伤都不能自发修复，而且通常都会导致软骨的退行性病变，进而造成骨性关节炎。目前，应用软骨组织工程技术能够治疗此类外伤性(或剥脱性骨软骨炎)的膝关节面软骨缺损，近几年，人们也利用生物工程化支架材料作为细胞运送载体的优势，开发出新的关节镜设备，并且应用于软骨组织工程技术中。

例如：中国专利公开号为CN103877615B的专利公开一种软骨组织工程支架及其制备方法，方法包括，制备脱钙骨基质，配制天然高分子水凝胶溶液，将所述天然高分子水凝胶溶液注射至所述脱钙骨基质中，使得所述天然高分子水凝胶溶液完全渗入所述脱钙骨基质中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到所述软骨组织工程支架。通过上述的技术方案，可以制得软管工程支架，但是不能较好的维持细胞原代活性。

申请人研究发现，无论在动物实验中还是临床病例里，软骨细胞在体外培养的过程中其表达二型胶原(透明软骨细胞主要功能蛋白)能力会明显下降，而一型胶原(软骨组织工程主要并发症纤维化主要表达蛋白)表达明显上升，如何使软骨细胞在体外培养能到一定的数量级、且使其能保持原代活性一直是研究的重点。事实上，软骨细胞来源一般取自患者自体非负重区域的软骨，需要越多的软骨细胞，就需要取越多的软骨，会给病人造成二次损伤，对于大面积的软骨缺损，软骨组织工程有很好的疗效，但由于上述原因，尽管等待关节软骨方面治疗的数量庞大，但现有的可行性的细胞治疗手段不能有效满足这一要求。此外，传统的软骨细胞体外培养条件——以自体血清或牛血清(研究用)作为培养基添加成分，常常会引发培养细胞的非生理反应，这是因为人体内的软骨组织是在没有血供的情况下生存的，仅依赖细胞自分泌或旁分泌因子来维持代谢平衡。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提出了一种能使在体外培养的软骨细胞保持原代活性，且在软骨组织工程临床应用中能根据病人软骨缺损形状塑性的凝胶状支架配方及制备方法。

一种能够维持细胞原代活性的工程软骨用的凝胶状支架配方及制备方法。

本发明的技术方案为:

一种体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方，其特征在于，包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、凝血酶；所述添加剂在培养基的浓度为：

维生素C：233μM～287μM，亚油酸：3.7μM～8.9μM，胆固醇：9μM～17μM，地塞米松：6nM～15nM，乙酰半胱氨酸：43μM～58μM，转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL，亚硒酸钠:22nM～52nM，泛酸钠:13μM～24μM，生物素:28μM～43μM，胰岛素:7μg/mL～18μg/mL，表皮生长因子:2ng/mL～9ng/mL，成纤维生长因子:2ng/mL～9ng/mL，血小板衍生生长因子:2ng/mL～9ng/mL，人血清白蛋白0.5％～2.5％。

进一步，纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml。。

进一步，所述培养基为DMEM/F12。

制备方法，其特征在于，所述方法包括：

1)将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，转铁蛋白，亚硒酸钠，泛酸钠，生物素，胰岛素，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长因子，人血清白蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：233μM～287μM，亚油酸：3.7μM～8.9μM，胆固醇：9μM～17μM，地塞米松：6nM～15nM，乙酰半胱氨酸：43μM～58μM，转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL，亚硒酸钠:22nM～52nM，泛酸钠:13μM～24μM，生物素:28μM～43μM，胰岛素:7μg/mL～18μg/mL，表皮生长因子:2ng/mL～9ng/mL，成纤维生长因子:2ng/mL～9ng/mL，血小板衍生生长因子:2ng/mL～9ng/mL，人血清白蛋白0.5％～2.5％；

2)将纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶用步骤1)中配置的溶液溶解稀释，使其终浓度为纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml。

进一步，添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：250μM，亚油酸：4.5μM，胆固醇：13μM，地塞米松：10nM，乙酰半胱氨酸：50μM，转铁蛋白：25μg/mL，亚硒酸钠:30nM，泛酸钠:17μM，生物素:33μM，胰岛素:10μg/mL，表皮生长因子:5ng/mL，成纤维生长因子:5ng/mL，血小板衍生生长因子:5ng/mL，人血清白蛋白1％。

进一步，培养基为DMEM/F12。

本发明提供的技术方案所带来的有益技术效果是：

本发明提供了一种体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方及制备方法，通过使用该配方及方法制备的支架，能使在体外培养的软骨细胞保持原代活性，且在软骨组织工程临床应用中能根据病人软骨缺损形状，提供塑性的凝胶状支架。该支架配方包括纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、维生素C、亚油酸、胆固醇、地塞米松、转铁蛋白、生物素等，在培养过程中只需用基础培养基，不用添加血清，避免了以自体血清或牛血清(研究用)作为培养基添加成分而引发的培养细胞的非生理反应。再次，在凝胶支架中体外培养的第三代软骨细胞特异性基因表达亦能得到原代水平，使得软骨组织工程软骨细胞体外培养易去分化、扩增效率低等问题可能得到解决。

附图说明

图1是软骨组织工程支架的软骨诱导能力对比示意图；

图2是软骨特异性基因检测图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合图示与具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：

本实施例提供了体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方，包括凝胶和添加剂，其中凝胶包括纤维蛋白100mg/ml、胶原蛋白25mg/ml、透明质酸5％、凝血酶50U/ml；添加剂在DMEM/F12(1:1)基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：233μM～287μM，亚油酸：3.7μM～8.9μM，胆固醇：9μM～17μM，地塞米松：6nM～15nM，乙酰半胱氨酸：43μM～58μM，转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL，亚硒酸钠:22nM～52nM，泛酸钠:13μM～24μM，生物素:28μM～43μM，胰岛素:7μg/mL～18μg/mL，表皮生长因子:2ng/mL～9ng/mL，成纤维生长因子:2ng/mL～9ng/mL，血小板衍生生长因子:2ng/mL～9ng/mL，人血清白蛋白0.5％～2.5％。

纤维蛋白和凝血酶混合时，模拟凝血链级反应的最后一步，通过凝血酶对纤维蛋白原的激活作用，使纤维蛋白原逐渐聚合，最终形成纤维蛋白固化物；胶原蛋白的作用是模拟软骨细胞在体内的生长环境；透明质酸的作用是固定添加剂，使添加剂能有效存在胶原支架中。

实施例2：

本实施例提供了体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架的制备方法，包括：

1)将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，转铁蛋白，亚硒酸钠，泛酸钠，生物素，胰岛素，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长因子，人血清白蛋白添加到基础培养基DMEM/F12，使得添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：233μM～287μM，亚油酸：3.7μM～8.9μM，胆固醇：9μM～17μM，地塞米松：6nM～15nM，乙酰半胱氨酸：43μM～58μM，转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL，亚硒酸钠:22nM～52nM，泛酸钠:13μM～24μM，生物素:28μM～43μM，胰岛素:7μg/mL～18μg/mL，表皮生长因子:2ng/mL～9ng/mL，成纤维生长因子:2ng/mL～9ng/mL，血小板衍生生长因子:2ng/mL～9ng/mL，人血清白蛋白0.5％～2.5％；

2)将纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶用步骤1)中配置的溶液溶解稀释，使其终浓度为纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml。纤维蛋白和凝血酶混合时，模拟凝血链级反应的最后一步，通过凝血酶对纤维蛋白原的激活作用，使纤维蛋白原逐渐聚合，最终形成纤维蛋白固化物；胶原蛋白的作用是模拟软骨细胞在体内的生长环境；透明质酸的作用是固定添加剂，使添加剂能有效存在胶原支架中。

实施例3：

将添加剂：维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，转铁蛋白，亚硒酸钠，泛酸钠，生物素，胰岛素，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长因子，人血清白蛋白按比例溶解到基础培养基DMEM/F12(1:1)中；使得各添加组分在基础培养基中的最终浓度为：维生素C：250μM，亚油酸：4.5μM，胆固醇：13μM，地塞米松：10nM，乙酰半胱氨酸：50μM，转铁蛋白：25μg/mL，亚硒酸钠:30nM，泛酸钠:17μM，生物素:33μM，胰岛素:10μg/mL，表皮生长因子:5ng/mL，成纤维生长因子:5ng/mL，血小板衍生生长因子:5ng/mL，人血清白蛋白1％。

将纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶用上一步配置的溶液溶解稀释，使其终浓度为纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml。按照培养容器大小添加厚度约为2mm，室温静置5分钟，凝结成凝胶；

以兔为实验对象，取兔股骨软骨200mg，用含庆大霉素(40U/ml)的无菌PBS浸泡一小时，之后将软骨组织切成1mm×1mm×1mm大小的小块；将粉碎的软骨块置于0.2％II型胶原酶中，37℃消化8—12小时,过滤，离心；沉淀细胞用无菌PBS洗涤两次；当软骨细胞长到80％进行传代，用0.25％的胰酶37℃消化3-5分钟，离心，铺板，取第三代的细胞代用；

将第三代细胞分为a、b、c、d4组进行对照实验：

a组、将软骨细胞按1.5×10⁴个/ml种到1.2制备的凝胶中，用无血清培养基定期换液；

b组、将软骨细胞按1.5×10⁴个/ml种到1.2制备的凝胶中，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(1:1)定期换液；

c组、将软骨细胞按1.5×10⁴个/ml种到普通培养皿中，用无血清培养基进行定期换液；

d组、将软骨细胞按1.5×10⁴个/ml种到普通培养皿中，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12(1:1)定期换液。

如图1所示，以细胞扩增到自身5倍所花的时间为对象，我们可发现a组用凝胶支架+无血清培养基的实验室组，软骨细胞扩增到5倍所需要的时间明显少于另外3个对照组。

当所有细胞都扩增至5倍时，收获4组细胞，做软骨特异性基因检测，结果如图2所示，在相同细胞量的情况下，实验组a的软骨特异性基因表达量明显高于其他组，说明其他组的细胞在体外开始退分化，而a组细胞维持较好的软骨细胞原代活性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (6)

1.一种体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方，其特征在于，包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、凝血酶；所述添加剂在培养基的浓度为：

维生素C：233μM～287μM，亚油酸：3.7μM～8.9μM，胆固醇：9μM～17μM，地塞米松：6nM～15nM，乙酰半胱氨酸：43μM～58μM，转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL，亚硒酸钠:22nM～52nM，泛酸钠:13μM～24μM，生物素:28μM～43μM，胰岛素:7μg/mL～18μg/mL，表皮生长因子:2ng/mL～9ng/mL，成纤维生长因子:2ng/mL～9ng/mL，血小板衍生生长因子:2ng/mL～9ng/mL，人血清白蛋白0.5％～2.5％。

2.根据权利要求1所述的一种体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方，其特征在于，纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml。

3.根据权利要求1所述的一种体外构建组织工程软骨用的凝胶状支架配方，其特征在于，所述培养基为DMEM/F12。

4.制备方法，其特征在于，所述方法包括：

1)将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，转铁蛋白，亚硒酸钠，泛酸钠，生物素，胰岛素，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长因子，人血清白蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：233μM～287μM，亚油酸：3.7μM～8.9μM，胆固醇：9μM～17μM，地塞米松：6nM～15nM，乙酰半胱氨酸：43μM～58μM，转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL，亚硒酸钠:22nM～52nM，泛酸钠:13μM～24μM，生物素:28μM～43μM，胰岛素:7μg/mL～18μg/mL，表皮生长因子:2ng/mL～9ng/mL，成纤维生长因子:2ng/mL～9ng/mL，血小板衍生生长因子:2ng/mL～9ng/mL，人血清白蛋白0.5％～2.5％；

2)将纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶用步骤1)中配置的溶液溶解稀释，使其终浓度为纤维蛋白100mg/ml；胶原蛋白25mg/ml；透明质酸5％；凝血酶50U/ml。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，添加剂在基础培养基中的最终浓度为：

维生素C：250μM，亚油酸：4.5μM，胆固醇：13μM，地塞米松：10nM，乙酰半胱氨酸：50μM，转铁蛋白：25μg/mL，亚硒酸钠:30nM，泛酸钠:17μM，生物素:33μM，胰岛素:10μg/mL，表皮生长因子:5ng/mL，成纤维生长因子:5ng/mL，血小板衍生生长因子:5ng/mL，人血清白蛋白1％。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，培养基为DMEM/F12。