KR20050085079A - 분화되지 않은 중배엽 세포를 이용한 조직의 치료 - Google Patents

분화되지 않은 중배엽 세포를 이용한 조직의 치료 Download PDF

Info

Publication number
KR20050085079A
KR20050085079A KR1020057009147A KR20057009147A KR20050085079A KR 20050085079 A KR20050085079 A KR 20050085079A KR 1020057009147 A KR1020057009147 A KR 1020057009147A KR 20057009147 A KR20057009147 A KR 20057009147A KR 20050085079 A KR20050085079 A KR 20050085079A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tissue
umc
fibroblasts
autologous
composition
Prior art date
Application number
KR1020057009147A
Other languages
English (en)
Inventor
올가 말코
윌리암 케이. 주니어. 보스
Original Assignee
아이솔라겐 테크놀로지스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아이솔라겐 테크놀로지스, 인코포레이티드 filed Critical 아이솔라겐 테크놀로지스, 인코포레이티드
Publication of KR20050085079A publication Critical patent/KR20050085079A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)

Abstract

본 발명은 개체의 피부, 연부 조직, 뼈에서 미용적, 심미적, 퇴행적 결함을 교정하기 위한 조성물과 방법을 제시한다. 특히, 본 발명의 방법은 결함에 인접한 부위 또는 결함 부위에서 조직(가령, 피하 조직)으로 자가조직 중배엽 세포(UMC), 섬유아세포 및/또는 각화세포의 주사 또는 이식을 수반한다. 본 발명에 제시된 바와 같이 주사되는 세포는 개체와 조직적합성(가령, 자가조직)이고, 세포 배양 시스템에서 계대배양으로 확대되었다.

Description

분화되지 않은 중배엽 세포를 이용한 조직의 치료{TREATMENT OF TISSUE WITH UNDIFFERENTIATED MESENCHYMAL CELLS}
본 발명은 분화되지 않은 중배엽 세포를 함유하는 조성물 및 분화되지 않은 자가조직 중배엽 세포로 치아 결함, 피부와 연부 조직, 뼈 결함을 치료하는 방법에 관한다.
피부, 뼈, 연부 조직, 치아 조직의 결함은 상처, 질병, 노화와 같은 요인에 의해 유발될 수 있다. 이런 이상으로 영향을 받은 조직을 회복시키거나 강화시키기 위한 방법이 설계되긴 했지만, 흉터를 피하면서 조직 성장을 강화시키는 개선된 방법이 유용하다(참조: U.S. Patent No. 5,591,444, 5,660,850, 5,665,372, 5,858,390 및 U.S. application No. 09/678,047).
요약
본 발명은 개체의 피부, 연부 조직, 뼈에서 미용적, 심미적, 퇴행적 결함을 교정하기 위한 조성물과 방법을 제시한다. 특히, 본 발명의 방법은 결함에 인접한 부위 또는 결함 부위에서 조직(가령, 피내 조직)으로 분화되지 않은 자가조직 중배엽 세포(UMC), 섬유아세포 및/또는 각화세포의 주사 또는 이식을 수반한다. 이런 방법으로 교정될 수 있는 결함은 주름, 튼살, 파인 흉터, 비-외상 기원의 피부 함몰, 여드름 흉터, 입술의 형성부전, 치주 결함, 연부 조직 결함, 예를 들면, 연인두 기능부전과 피하 위축, 뼈 결함, 화상이다. 본 발명에 제시된 바와 같이 주사되는 세포는 개체와 조직적합성이고, 세포 배양 시스템에서 계대배양으로 확대된다. 적절하게는, 주사된 세포는 자가조직 세포이다. 또한, 본 발명은 UMC를 보유하는 세포 개체군을 발생시키는 시험관내 방법을 제시한다.
한 구체예에서, 조성물은 계대배양된 자가조직 UMC와 계대배양된 자가조직 섬유아세포 모두를 함유할 수 있다. 이런 세포는 예로써 개체로부터 획득된 하나이상의 생검 시료의 배양액으로부터 유래될 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물은 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 존부하에, 생물분해성 무세포 기질과 함께 계대배양된 자가조직 UMC를 함유할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 존부하에, 생물분해성 무세포 충전제와 함께 계대배양된 자가조직 UMC를 함유할 수 있다. 다른 구체예는 기질 또는 충전제의 존부하에, 계대배양된 자가조직 각화세포와 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유한다.
또한, 본 발명은 배양 배지(즉, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)에 존재하는 면역원성 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가조직 UMC, 섬유아세포, 각화세포를 제공하고, 이들 세포를 이용하여 면역 반응을 자극하지 않으면서 개체에서 결함을 교정하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 혈청(가령, 소 태아 혈청(FBS)) 함유 배지에서 배양이후 일정한 시간동안 혈청-없는 배지에서 확대된 UMC, 섬유아세포, 각화세포, 또는 하나이상의 이들 세포 개체군을 보유하는 생물분해성 무세포 기질을 배양하는 단계를 수반한다. 다른 구체예에서, 세포 또는 세포-보유 생물분해성 무세포 기질은 혈청-없는 배지 또는 자가조직 혈청-함유 배지에서만 배양된다.
본 발명은 결함 부위 또는 결함에 인접한 부위에서 피부, 피하 조직, 뼈와 같은 조직을 확대하는데 자가조직 세포가 이상적이라는 발견에 부분적으로 기초한다. 또한, 본 발명은 자가조직 세포의 풍부한 공급이 결함의 치료에 앞서 개체로부터 획득된 생검 시료를 배양함으로써 달성될 수 있다는 인식에 기초한다. 더 나아가, 본 발명은 이종 혈청-보유 조직 배양 배지에서 확장이후, 자가조직 세포가 이종 혈청으로부터 유래된 상당한 양의 면역원성 단백질을 보유하지만 개체에 주사하기에 앞서 이들 면역원성 단백질이 제거될 수 있다는 인식에 기초한다.
한 측면에서, 본 발명은 조직을 회복하기 위한 세포 조성물을 제조하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 분화되지 않은 중배엽 세포(UMC)-보유 조직의 생검을 제공하여 출발 세포를 수득하고;
(b) 상기 생검으로부터 상기 출발 세포를 분리하고;
(c) 상기 출발 세포를 배양하고;
(d) 상기 배양액으로부터 비-부착성 유도 세포 개체군을 수거하고, 여기서 상기 비-부착성 유도 세포는 UMC를 포함한다. 상기 방법은 단계 (c)와 (d)를 반복하고 이전 라운드로부터 수거된 비-부착성 유도 세포의 개체군을 출발 세포로 이용하는 1회 이상(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 100, 또는 그 이상)의 유도체화 단계가 추가로 포함된다. 1회 이상의 추가 유도체화는 예로써 1 내지 20회를 포함할 수 있다. UMC-보유 조직은 피부 조직, 지방 조직, 연결 조직, 근막, 점막고유층, 골수에서 선택될 수 있다. 상기 방법은 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF)의 존재하에 비-부착성 세포를 배양하는 단계가 추가로 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 조직을 회복하기 위한 조성물을 제시한다. 상기 조성물은 계대배양된 자가조직 UMC를 함유하고, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 또한, 상기 조성물은 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유할 수 있다. 자가조직 섬유아세포는 개체의 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래된다. UMC 또는 섬유아세포는 활성화 화합물, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, C-MED 100?(Optigene-X LLC, Shrewsbury, NJ), 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, 디하이드로에피안드로스테론(DHEA), 디메틸아미노 에탄올(DMAE), α-토코페롤, 골 형성 단백질(BMP), 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 또는 성장 인자[가령, 인간 성장 호르몬, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린, 긴 형태의 R3 IGF-I]와 같은 다른 촉진성 첨가제로 처리될 수 있다. UMC 또는 섬유아세포는 저에너지 레이저 광에 노출될 수도 있다. 상기 조성물은 생물분해성 무세포 기질을 추가로 함유할 수 있는데, UMC와 섬유아세포는 상기 기질 내에서 통합된다. 생물분해성 무세포 기질은 UMC와 섬유아세포와의 혼합에 앞서, 아래에서 선택되는 하나이상의 물질을 보유할 수 있다: 콜라겐(가령, 소 콜라겐, 돼지 콜라겐, 인간 콜라겐, 가공된 콜라겐, 또는 글루타르알데하이드로 가교-결합된 콜라겐과 글리코사미노글리칸), 글리코사미노글리칸, 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선(cat gut), 탈염된 뼈, 수산화인회석, 히알루론, 히알루론산, 산호, 탈유기질 뼈. 충분한 UMC 및/또는 섬유아세포가 기질 내에서 통합하여 세포에 의해 이용가능한 기질내 공간을 실질적으로 채울 수 있다. 대안으로, 조성물은 생물분해성 무세포 주사가능 충전제를 함유할 수 있다. 생물분해성 무세포 주사가능 충전제는 UMC 및/또는 섬유아세포와의 혼합에 앞서, 아래에서 선택되는 하나이상의 물질을 보유할 수 있다: (a) 자가조직 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐(가령, 소 콜라겐, 글루타르알데하이드로 가교-결합된 재구성된 소 콜라겐 섬유, 또는 자가조직 콜라겐); (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 염화나트륨 용액에 분산된 돼지 젤라틴 분말과 아미노 카프로산 및 상기 개체로부터 혈장의 분량;(g) 히알루론산.
다른 측면에서, 본 발명은 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복하기 위한 조성물을 제조하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 상기 개체로부터 UMC-보유 조직의 생검을 제공하고;
(b) 상기 생검으로부터 자가조직 UMC를 분리하고;
(c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 UMC가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 UMC를 배양하고;
(d) UMC의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가조직 UMC를 노출시킨다. UMC-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택될 수 있다. UMC의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 인간이나 비-인간 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양 및 (2) 혈청-없는 배양 배지에서 배양을 포함할 수 있다. 대안으로, UMC의 배양은 혈청-없는 배지에서만 진행될 수 있다. UMC의 부유를 유도하는 조건은 단백분해 효소, 예를 들면, 트립신의 이용을 포함할 수 있다. 다른 단백분해 효소는 디스파제와 콜라게나제이다. 대안으로, UMC의 부유를 유도하는 조건은 EDTA의 이용을 포함할 수 있다. 상기 방법은 아래의 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(e) 상기 개체로부터 섬유아세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
(f) 상기 생검으로부터 자가조직 섬유아세포를 분리하고;
(g) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 섬유아세포가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 섬유아세포를 배양하고;
(h) 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가조직 섬유아세포를 노출시키고;
(i) 상기 UMC 부유물과 상기 섬유아세포 부유물을 혼합한다. 자가조직 섬유아세포-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택될 수 있다. 섬유아세포의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 인간이나 비-인간 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양 및 (2) 혈청-없는 배양 배지에서 배양을 포함할 수 있다. 대안으로, 섬유아세포의 배양은 혈청-없는 배지에서만 진행될 수 있다. 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건은 단백분해 효소, 예를 들면, 트립신의 이용을 포함할 수 있다. 다른 단백분해 효소는 디스파제와 콜라게나제이다. 대안으로, 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건은 EDTA의 이용을 포함할 수 있다. UMC 또는 섬유아세포는 혼합에 앞서, 활성화 화합물, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, C-MED 100?, 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, 디하이드로에피안드로스테론(DHEA), 디메틸아미노 에탄올(DMAE), α-토코페롤, 골 형성 단백질(BMP), 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 또는 성장 인자[가령, 인간 성장 호르몬, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린, 긴 형태의 R3 IGF-I]와 같은 다른 촉진성 첨가제에 노출될 수 있다. UMC 또는 섬유아세포는 저에너지 레이저 광에 노출될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복하기 위한 조성물을 제조하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 계대배양된 자가조직 UMC를 제공하고;
(b) 생물분해성 무세포 기질을 제공하고;
(c) 상기 자가조직 UMC를 상기 생물분해성 무세포 기질과 함께 배양하여, 상기 UMC를 상기 생물분해성 무세포 기질에 통합시키고, 여기서, 상기 배양은 조직을 회복시키는 조성물을 산출하고, 상기 배양의 조건은 상기 조성물에서 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않도록 한다. 계대배양된 자가조직 UMC의 부유물을 제공하는 과정은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 상기 개체로부터 UMC-보유 조직의 생검을 제공하고;
(b) 상기 생검으로부터 자가조직 UMC를 분리하고;
(c) 상기 UMC를 배양하고;
(d) UMC의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 UMC를 노출시킨다. UMC-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택될 수 있다. 생물분해성 무세포 기질은 UMC 부유물과의 혼합에 앞서, 아래에서 선택되는 하나이상의 물질을 보유할 수 있다: 콜라겐(가령, 글루타르알데하이드로 가교-결합된 콜라겐과 글리코사미노글리칸, 소 콜라겐 또는 돼지 콜라겐), 글리코사미노글리칸, 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선(cat gut), 탈염된 뼈, 수산화인회석, 산호, 탈유기질 뼈. 배양 조건은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 인간이나 비-인간 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양 및 (2) 혈청-없는 배양 배지에서 배양을 포함할 수 있다. 대안으로, 배양은 혈청-없는 배지에서만 진행될 수 있다. 충분한 UMC가 생물분해성 무세포 기질 내에서 통합하여 세포에 의해 이용가능한 생물분해성 무세포 기질내 공간을 실질적으로 채울 수 있다.
상기 방법은 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 제공하는 과정을 포함할 수 있는데, 상기 자가조직 섬유아세포를 상기 생물분해성 무세포 기질과 함께 배양하여, 상기 섬유아세포를 상기 생물분해성 무세포 기질에 통합시키고, 여기서, 상기 배양은 조직을 회복시키는 조성물을 산출하고, 상기 배양의 조건은 상기 조성물에서 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않도록 한다. 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 부유물을 제공하는 과정은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 상기 개체로부터 섬유아세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
(b) 상기 생검으로부터 자가조직 섬유아세포를 분리하고;
(c) 상기 섬유아세포를 배양하고;
(d) 상기 섬유아세포를 부유시킨다. 섬유아세포-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택될 수 있다. 충분한 UMC와 섬유아세포가 생물분해성 무세포 기질 내에서 통합하여 세포에 의해 이용가능한 생물분해성 무세포 기질내 공간을 실질적으로 채울 수 있다. UMC 및/또는 섬유아세포는 생물분해성 무세포 충전제와 함께 배양에 앞서, 활성화 화합물, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, C-MED 100?, 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, 디하이드로에피안드로스테론(DHEA), 디메틸아미노 에탄올(DMAE), α-토코페롤, 골 형성 단백질(BMP), 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 또는 성장 인자[가령, 인간 성장 호르몬, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린, 긴 형태의 R3 IGF-I]와 같은 다른 촉진성 첨가제에 노출될 수 있다. UMC 또는 섬유아세포는 저에너지 레이저 광에 노출될 수 있다. UMC 또는 섬유아세포는 생물분해성 무세포 기질과 함께 배양되거나, 또는 생물분해성 무세포 기질에 별개로 첨가된다.
다른 측면에서, 본 발명은 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복하기 위한 조성물을 제조하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 계대배양된 자가조직 UMC를 제공하고, 상기 UMC는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
(b) 생물분해성 무세포 충전제를 제공하고;
(c) 상기 계대배양된 자가조직 UMC와 상기 생물분해성 무세포 충전제를 혼합한다. 계대배양된 자가조직 UMC의 부유물을 제공하는 과정은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 상기 개체로부터 UMC-보유 조직의 생검을 제공하고;
(b) 상기 생검으로부터 자가조직 UMC를 분리하고;
(c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 UMC가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 UMC를 배양하고;
(d) UMC의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 섬유아세포를 노출시킨다. UMC-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택될 수 있다. UMC의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 인간이나 비-인간 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양 및 (2) 혈청-없는 배양 배지에서 배양을 포함할 수 있다. 대안으로, UMC의 배양은 혈청-없는 배지에서만 진행될 수 있다. UMC의 부유를 유도하는 조건은 단백분해 효소, 예를 들면, 트립신의 이용을 포함할 수 있다. 다른 단백분해 효소는 디스파제와 콜라게나제이다. 대안으로, UMC의 부유를 유도하는 조건은 EDTA의 이용을 포함할 수 있다. 생물분해성 무세포 충전제는 UMC와의 혼합에 앞서, 아래에서 선택되는 하나이상의 물질을 보유할 수 있다: (a) 자가조직 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐(가령, 소 콜라겐, 글루타르알데하이드로 가교-결합된 재구성된 소 콜라겐 섬유, 또는 자가조직 콜라겐); (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 염화나트륨 용액에 분산된 돼지 젤라틴 분말과 아미노 카프로산 및 상기 개체로부터 혈장의 분량;(g) 히알루론산.
상기 방법은 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 제공하는 과정을 추가로 포함할 수 있는데, 상기 계대배양된 자가조직 섬유아세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고, 생물분해성 무세포 충전제와 혼합된다. 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 부유물을 제공하는 과정은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 상기 개체로부터 섬유아세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
(b) 상기 생검으로부터 자가조직 섬유아세포를 분리하고;
(c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 섬유아세포가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 섬유아세포를 배양하고;
(d) 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 섬유아세포를 노출시킨다. 섬유아세포-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택될 수 있다. 섬유아세포의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 인간이나 비-인간 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양 및 (2) 혈청-없는 배양 배지에서 배양을 포함할 수 있다. 대안으로, 섬유아세포의 배양은 혈청-없는 배지에서만 진행될 수 있다. 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건은 섬유아세포와 단백분해 효소, 예를 들면, 트립신의 접촉을 포함할 수 있다. 다른 단백분해 효소는 디스파제와 콜라게나제이다. 대안으로, 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건은 EDTA의 이용을 포함할 수 있다. UMC 또는 섬유아세포는 생물분해성 무세포 충전제와의 혼합에 앞서, 활성화 화합물, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, C-MED 100?, 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, 디하이드로에피안드로스테론(DHEA), 디메틸아미노 에탄올(DMAE), α-토코페롤, 골 형성 단백질(BMP), 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 또는 성장 인자[가령, 인간 성장 호르몬, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린, 긴 형태의 R3 IGF-I]와 같은 다른 촉진성 첨가제에 노출될 수 있다. UMC 또는 섬유아세포는 저에너지 레이저 광에 노출될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 조직을 회복시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 계대배양된 자가조직 UMC를 함유하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
(b) 상기 개체에서 조직 결함이나 조직 퇴행의 부위를 확인하고;
(c) 상기 조성물을 상기 부위에 위치시켜 상기 조직 결함이나 조직 퇴행을 회복시킨다. 상기 조직 결함이나 퇴행은 연부 조직 결함, 경구 점막의 결함, 경구 점막에 대한 외상, 치주 질환, 당뇨병, 피부 궤양, 정맥혈 울체, 피부의 미용적 결함을 포함할 수 있다. 연부 조직 결함은 안면 함몰(facial depression), 유방의 발육부전, 유방의 부재, 성대 결함, 연인두 기능부전(velopharyngeal incompetence), 폴랜드 증후군(Poland's syndrome), 음경의 발육부전, 입술의 형성부전, 피하 위축이나 근육 위축에서 선택될 수 있다. 구강 점막에 대한 외상은 발치에 기인한 발치 구멍(extraction socket)일 수 있다. 치주 질환은 치주 퇴행, 치은염, 또는 구개 점막이나 잇몸 점막의 치유되지 않는 상처일 수 있다. 뼈 결함은 반안면 외소증(hemifacial microsomia), 뼈의 외상후 비-치유, 안구함몰(enophthalmos), 롬베르크병(romberg's disease), 두개공(crania burr hole) 결함, 두개골 손실, 둔상(blunt trauma)에 기이한 결함, 관절염에 기이한 결함에서 선택될 수 있다. 미용적 결함은 주름, 파인 흉터, 비-외상 기원의 피부 함몰, 눈언저리 주름살, 튼살, 주름살, 상처 흉터, 여드름 흉터, 피하 위축에서 선택될 수 있다. 조직 결함은 입술이나 구순 추벽(lip fold)의 형성부전일 수 있다. 자가조직 MUC는 개체의 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래될 수 있다. 상기 조성물이 생물분해성 기질을 추가로 함유할 수 있는데, MUC가 상기 기질 내에서 통합된다. 상기 조성물은 생물분해성 무세포 충전제를 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유할 수도 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 조직을 회복시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 계대배양된 자가조직 UMC와 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
(b) 상기 개체에서 조직 결함이나 조직 퇴행의 부위를 확인하고;
(c) 상기 조성물을 상기 부위에 위치시켜 상기 조직 결함이나 조직 퇴행을 회복시킨다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 조직 결함을 회복시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다;
(a) (1) 계대배양된 자가조직 UMC, (2) 계대배양된 자가조직 섬유아세포, (3) 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물을 제공하고, 여기서 상기 제약학적 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
(b) 치과 또는 치주 결함, 피부의 미용적 결함, 뼈 결함에서 선택되는 조직 결함이나 조직 퇴행 부위를 상기 개체에서 확인하고;
(c) 상기 제약학적 조성물의 치료 효과량을 상기 조직 결함이나 퇴행 부위에 인접하여 주사하고, 여기서 상기 주사는 상기 조직 결함이나 퇴행의 회복을 유도한다. UMC-보유 조직과 섬유아세포-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택될 수 있다. UMC 또는 섬유아세포의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 인간이나 비-인간 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양 및 (2) 혈청-없는 배양 배지에서 배양을 포함할 수 있다. 대안으로, UMC 또는 섬유아세포의 배양은 혈청-없는 배지에서 진행될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 조성물을 개체의 퇴행 부위에 위치시켜 조직을 회복시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 (1) 계대배양된 자가조직 UMC, (2) 계대배양된 자가조직 섬유아세포, (3) 생물학적 기질을 함유할 수 있는데, 상기 UMC 또는 섬유아세포는 기질 내에서 통합되고, 상기 조성물에는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다.
또한, 본 발명은 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 (1) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가조직 UMC 및 (2) 생물분해성 무세포 주가가능 충전제를 함유하는 조성물을 개체의 퇴행 부위에 주사하여 조직을 회복시키는 단계를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 계대배양된 자가조직 UMC를 상기 개체의 조직 퇴행 부위에 주사하고, 여기서 상기 UMC는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
(b) 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 상기 개체의 조직 결함이나 원하는 조직 강화 부위에 주사하고, 여기서 상기 섬유아세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
(c) 생물분해성 무세포 충전제를 상기 부위에 주사한다. 상기 질환, 질병 또는 결함은 치아 또는 치주 결함, 피부의 미용적 결함, 뼈 결함에서 선택되는 결함일 수 있다. 자가조직 UMC와 섬유아세포는 개체의 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직으로부터 유래될 수 있다. 자가조직 UMC와 섬유아세포는 동시에 주사될 수 있다. 자가조직 UMC, 자가조직 섬유아세포, 생물분해성 무세포 충전제는 동시에 주사될 수 있다. 자가조직 UMC와 섬유아세포는 별개로 주사될 수 있다. 자가조직 UMC와 섬유아세포는 생물분해성 무세포 충전제와 별개로 주사될 수 있다. 자가조직 UMC와 섬유아세포의 개체 주사와 생물분해성 무세포 충전제의 개체 주사 사이의 지속 기간은 대략 2주일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 화상 상처를 회복시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 계대배양된 자가조직 각화세포와 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 부유물을 제공하고, 상기 부유물을 화상 상처 부위에 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 계대배양된 자가조직 각화세포와 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 부유물을 제공하는 과정은 아래의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 상기 개체로부터 각화세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
(b) 상기 생검으로부터 자가조직 각화세포를 분리하고;
(c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 각화세포가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 각화세포를 배양하고;
(d) 각화세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 각화세포를 노출시키고;
(e) 상기 개체로부터 섬유아세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
(f) 상기 생검으로부터 자가조직 섬유아세포를 분리하고;
(g) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 섬유아세포가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 섬유아세포를 배양하고;
(h) 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 섬유아세포를 노출시키고;
(i) 상기 부유된 각화세포와 부유된 섬유아세포를 혼합한다. 각화세포-보유 조직은 피부, 구강 점막, 잇몸, 협측 조직, 식도 조직, 외경부 조직, 결막 조직에서 선택될 수 있다. 각화세포의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 인간이나 비-인간 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양 및 (2) 혈청-없는 배양 배지에서 배양을 포함할 수 있다. 대안으로, 각화세포의 배양은 혈청-없는 배지에서만 진행될 수 있다. 섬유아세포-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택될 수 있다. 섬유아세포의 배양은 (1) 대략 0.1% 내지 20% 인간이나 비-인간 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양 및 (2) 혈청-없는 배양 배지에서 배양을 포함할 수 있다. 대안으로, 섬유아세포의 배양은 혈청-없는 배지에서만 진행될 수 있다. 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건은 섬유아세포와 단백분해 효소, 예를 들면, 트립신의 접촉을 포함할 수 있다. 다른 단백분해 효소는 디스파제와 콜라게나제이다. 대안으로, 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건은 EDTA의 이용을 포함할 수 있다. 섬유아세포는 각화세포와의 혼합에 앞서, 활성화 화합물, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, C-MED 100?, 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, 디하이드로에피안드로스테론(DHEA), 디메틸아미노 에탄올(DMAE), α-토코페롤, 골 형성 단백질(BMP), 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 또는 성장 인자[가령, 인간 성장 호르몬, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린, 긴 형태의 R3 IGF-I]와 같은 다른 촉진성 첨가제에 노출될 수 있다. 섬유아세포는 개체 투여에 앞서 저에너지 레이저 광에 노출될 수도 있다. 부유물은 대략 1:3의 비율로 자가조직 각화세포와 자가조직 섬유아세포를 함유할 수 있다. 주사는 화상 상처의 중심 부위에 부유물을 주사하는 단계를 포함할 수 있다. 부유물은 계대배양된 자가조직 UMC를 추가로 함유할 수 있다. 상기 방법은 상처 부위에 강화 화합물을 주사하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 연부 조직 결함, 경구 점막의 결함, 경구 점막에 대한 외상, 치주 질환, 당뇨병, 피부 궤양, 정맥혈 울체에서 선택되는 조직 결함이나 퇴행의 치료에 사용되는 약물의 제조를 위한 분화되지 않은 중배엽 세포(UMC)의 용도를 제시하는데, 상기 약물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가조직 UMC를 함유한다. 적절하게는, 조성물은 계대배양된 자가조직 UMC, 계대배양된 자가조직 섬유아세포, 선택적으로 계대배양된 자가조직 각화세포를 제외한 다른 세포가 실질적으로 존재하지 않는다.
또한, 본 발명은 개체에서 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 퇴행된 조직의 회복을 위한 동시, 순차 또는 개별 투여용 약물의 제조에 사용되는 약물의 제조를 위한 분화되지 않은 중배엽 세포(UMC)의 용도를 제시하는데, 상기 UMC는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 UNC이고; 상기 섬유아세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가조직 섬유아세포이다.
또한, 본 발명은 약물로서 사용되는 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 계대배양된 자가조직 UMC와 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유하고, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 계대배양된 자가조직 UMC와 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유하고, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 조직의 미용적 회복을 위한 조성물 역시 제시된다.
또한, 본 발명은 개체에서 화상 상처의 회복에 사용되는 약물의 제조를 위한 계대배양된 자가조직 각화세포와 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 용도를 제시한다.
달리 정의하지 않는 경우에, 본 명세서에서 모든 기술적ㆍ과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 기술된 방법 과 재료에 유사하거나 동등한 방법과 재료를 이용하여 본 발명을 실행할 수 있긴 하지만, 적절한 방법과 재료를 아래에 기술한다. 본 발명에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 다른 참고문헌은 순전히 참조로 한다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선한다. 이에 더하여, 본 발명에 기술된 재료, 방법, 실시예는 예시를 목적으로 하며, 본 발명을 한정하지 않는다.
본 발명의 하나이상 구체예에 관한 상세는 첨부된 도면과 상세한 설명에서 기술한다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 이점은 아래의 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백하다.
본 발명은 개체에서 조직의 퇴행을 유발하는 질환이나 결함을 치료하기 위한 조성물과 방법을 제시한다. 이런 질환 또는 결함에는 경구 점막의 결함, 경구 점막에 대한 외상(발치에 기인한 발치 구멍), 상악(maxillary)이나 하악(manibular)골과 같은 구강골(oral bone)에 대한 외상, 치주 질환, 당뇨병, 피부 궤양, 정맥혈 울체 등이 포함된다. 조직 퇴행을 유발할 수 있는 치주 질환의 예는 치주 퇴행, 치은염, 또는 구개 점막이나 잇몸 점막의 치유되지 않는 상처 등이다. 본 발명의 조성물과 방법을 이용하여 치료될 수 있는 다른 결함에는 제한없이, 흉터, 주름, 눈언저리 주름살, 튼살, 파인 흉터, 비-외상 기원의 피부 함몰, 여드름 흉터 또는 여드름으로 인한 피하 위축, 외상, 기형(congenital malformation) 또는 노화 등이 포함된다. 본 발명의 조성물과 방법은 입술이나 순면 전정부(labial fold)의 형성부전과 같은 결함, 또는 척추골(spinal bone)과 장골(long bone)을 비롯하여 안와, 관골, 두개골, 구개열 골 결함을 비롯한 안면골(facial bone)과 같은 뼈의 결함을 치료하는 데에도 이용될 수 있다. 뼈 결함에는 예로써 반안면 외소증(hemifacial microsomia), 뼈(가령, 손, 손목, 다리, 척주 또는 안면)의 외상후 비-치유, 안구함몰(enophthalmos), 롬베르크병(romberg's disease), 두개공(crania burr hole) 결함, 두개골 손실 등이 포함된다. 본 발명의 조성물은 임의의 뼈에서 수술이후 치유를 보조하는 데에도 이용될 수 있다. 본 발명은 연부 조직 결함, 예를 들면, 안면 함몰(facial depression), 유방의 발육부전, 유방의 부재, 성대 결함, 연인두 기능부전(velopharyngeal incompetence), 폴랜드 증후군(Poland's syndrome) 및 소아마비 이후 위축과 궁동이, 종아리, 음경의 발육장애를 비롯한 피하 위축이나 근육 위축을 강화시키는 데에도 이용될 수 있다.
1. 세포-함유 조성물
본 발명은 예로써 계대배양된 자가조직 UMC, 임의 공급원으로부터 계대배양된 자가조직 섬유아세포 및/또는 계대배양된 자가조직 각화세포와 같은 세포를 함유하는 조성물을 제시한다. 본 발명의 조성물은 면역원성 단백질(가령, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)이 실질적으로 존재하지 않는다.
본 명세서에서 수용자에게 투여되는 조성물의 성분과 관련하여 “자가조직”은 공여자로부터 이전되어 수용자에 투여되며, 공여자와 수용자가 동일한 개체인 체내 성분(가령, 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 지질과 같은 세포 또는 생물학적 분자)을 의미한다. 본 명세서에서, “배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는” 세포는 세포가 함입된 유체가 이들 세포가 배양되는 조직 배양 배지에 포함되는 이종 또는 동종 혈청을 0.1% 미만(가령, 0.05% 미만, 0.01% 미만, 0.005% 미만, 또는 0.001% 미만)으로 함유하는 세포이다. 유사하게, “배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는” 조성물은 상기 조성물에서 세포를 둘러싸는 유체가 이들 세포가 배양되는 조직 배양 배지에 포함되는 이종 또는 동종 혈청을 0.1% 미만(가령, 0.05% 미만, 0.01% 미만, 0.005% 미만, 또는 0.001% 미만)으로 함유하는 조성물이다.
배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 세포를 수득하기 위하여, 배양된 세포는 혈청을 함유하지 않는 배지에서 확대할 수 있다. 대안으로, 세포는 혈청(가령, 0.1% 내지 20% 혈청)을 함유하는 배지에서 먼저 배양하고, 이후 혈청-없는 배지에서 배양할 수 있다. 따라서, 이들 방법에 의해, 세포 부유물에서 잠재적으로 면역원성 혈청-유래된 단백질의 존재가 예방된다.
본 발명에 사용되는 세포는 임의의 포유동물 종(가령, 인간, 비-인간 영장류, 개, 소, 말, 돼지, 양, 고양이, 토끼, 생쥐, 쥐, 기니 피그, 햄스터 또는 게르빌루스 쥐)으로부터 유래될 수 있는데, 이들 세포는 자가조직이다. 자가조직 인간 세포(가령, 자가조직 인간 UMC, 섬유아세포, 각화세포)가 특히 유용하다. 동물이 동종 번식하고 동일 기원(가령, 쥐와 생쥐와 같은 동일한 실험 계통의 동물에서처럼)이면, “자가조직”은 동일 종의 다른 개체로부터 유래됨을 의미할 수 있다. 본 발명에 사용되는 세포는 비-자가조직일 수도 있다(가령, 수용자 이외의 개체로부터, 또는 세포주로부터 수득됨).
전형적으로, 본 발명의 조성물은 개체로부터 조직 생검을 수득하고, 상기 생검으로부터 원하는 세포를 분리하고, 적절한 횟수의 계대배양으로 세포를 배양하여 원하는 양의 세포를 수득하고, 이들 세포를 부유함으로써 제조된다. 본 명세서에서 “부착성”세포는 표준 조직 배양 용기의 재료(가령, 플라스틱)에 부착하는 세포이다. 본 명세서에서 “비-부착성” 세포는 표준 조직 배양 용기의 재료(가령, 플라스틱)에 부착하지 않는 세포 및 공간과 영양이 한정되면 조직 배양 용기의 표면으로부터 이탈하는 세포이다. 이들 세포는 수거되고 적절한 조건에 놓이게 되면, 부착하고 확대될 수 있다. 따라서, 조성물은 배양으로 확대될 수 있는 임의의 세포를 함유할 수 있다. UMC와 섬유아세포는 예로써 피부 조직과 지방 조직으로부터 분리될 수 있다. UMC와 섬유아세포는 제한없이, 근막, 점막고유층, 모낭의 구근, 골수, 또는 임의 출처의 연결 조직으로부터 수득될 수도 있다. 자가조직 각화세포는 예로써 개체의 전층 생검, 머릿가죽, 모낭으로부터 수득될 수 있다. 부착성 세포와 비-부착성 세포는 차별적 단백분해, 예를 들면, 트립신처리와 농축, 또는 농도구배 정제와 Ficoll이나 Percoll를 이용한 농축에 의해 서로 실질적으로 분리될 수 있다. Ficoll이나 Percoll은 특히 Amersham Biosciences(Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA, UK)로부터 구입가능하다.
당업자에게 널리 알려져 있는 동종이식편(또는 이종이식편) 거부반응으로 인하여, 배양된 세포는 수용자와 조직적합성이어야 한다. 조직적합성은 치료되는 개체로부터 세포(가령, 말초혈 단핵 세포)를 수득하고, 이런 세포를 이용하여 개체의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 일배체형 결정함으로써 담보할 수 있다. 하지만, 이런 세포는 개체의 동일한 쌍둥이로부터, 또는 개체와 주요 조직적합성 복합체(MHC)에서 동일한 개체로부터 수득할 수도 있다. 생검 견본으로부터 분리된 세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않도록 배양할 수 있다. 이런 단계는 개체에서 원치않는 면역 반응을 활성화시키는 세포 능력을 감소시킨다.
세포 배양의 시작에 앞서, 생검은 항생제와 항진균제로 반복적으로 세척하여 후속 배양에서 오염의 가능성을 감소시킬 수 있다. 적절한 “세척 배지”는 아래 약물의 전체 또는 일부: 젠타마이신, 암포테리신 B(FUNZIZONE?), 마이코플라스마 제거제(MRA; Dianippon Pharmaceutical Company, Japan), 플라스모신(plasmocin), 타일로신(가령, Serva, Heidelberg, Germany)과 함께, 예로써 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 또는 임의의 적절한 배양 배지와 같은 조직 배양 배지를 함유할 수 있다. 젠타마이신은 1O 내지 100 ㎍/㎖(가령, 25 내지 75 ㎍/㎖, 또는 대략 5O ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 암포테리신 B는 0.5 내지 12.5 ㎍/㎖(가령, 1.0 내지 10.0 ㎍/㎖, 또는 대략 2.5 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. MRA는 0.1 내지 1.5 ㎍/㎖(가령, 0.25 내지 1.0 ㎍/㎖, 또는 대략 0.5 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 플라스모신은 1 내지 50 ㎍/㎖(가령, 10 내지 40 ㎍/㎖, 또는 대략 25 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 타일로신은 0.012 내지 1.2 ㎎/㎖(가령, 0.06 내지 0.6 ㎎/㎖, 또는 대략 0.12 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다.
세포 배양에 사용되는 성장 배지는 예로써 박테리아, 진균, 효모, 마이코플라스마에 의한 세포의 오염을 예방하는 항생제로 보충할 수 있다. 마이코플라스마 오염은 조직 배양에서 빈번하게 발생하는 문제점이다. 마이코플라스마 오염을 예방 또는 최소화하기 위하여, 타일로신과 같은 약물을 배양 성장 배지에 첨가할 수 있다. 배지는 한가지이상의 항생제/항진균제(가령, 젠타마이신, 시프로플록사신, 알라트로플록사신, 아지트로마이신, MRA, 플라스모신, 테트라사이클린)로 추가로 보충할 수 있다. 타일로신은 0.006 내지 0.6 ㎎/㎖(가령, 0.01 내지 0.1 ㎎/㎖, 또는 대략 0.06 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 젠타마이신은 0.01 내지 0.1 ㎎/㎖(가령, 0.03 내지 0.08 ㎎/㎖, 또는 대략 0.05 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 시프로플록사신은 0.002 내지 0.05 ㎎/㎖(가령, 0.005 내지 0.03 ㎎/㎖, 또는 대략 0.01 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 알라트로플록사신은 0.2 내지 5.0 ㎍/㎖(가령, 0.5 내지 3.0 ㎍/㎖, 또는 대략 1.0 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 아지트로마이신은 0.002 내지 0.05 ㎎/㎖(가령, 0.005 내지 0.03 ㎎/㎖, 또는 대략 0.01 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. MRA는 0.1 내지 1.5 ㎍/㎖(가령, 0.2 내지 1.O ㎍/㎖, 또는 대략 0.75 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 플라스모신은 1 내지 50 ㎍/㎖(가령, 10 내지 40 ㎍/㎖, 또는 대략 25 ㎍/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 테트라사이클린은 0.004 내지 0.1 ㎎/㎖(가령, 0.008 내지 0.05 ㎎/㎖, 또는 대략 0.02 ㎎/㎖) 농도로 사용될 수 있다. 이들 항생제는 전체 배양 기간 동안 또는 일부 배양 기간 동안 존재할 수 있다.
마이코플라스마 오염은 예로써 bioMerieux(Marcy I'Etiole, France)로부터 구입가능한 마이코플라스마 아가 평판과 같은 장치를 이용한 아가 배양 방법으로 분석하거나 사내(in house)에서 PCR로 제조할 수 있다. American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA) 역시 PCR “Mycoplasma Detection Kit”를 시판하고 있다. 타일로신(0.06 ㎎/㎖), 젠타마이신(0.1 ㎎/㎖), 시프로플록사신(0.01 ㎎/㎖), 알라트로플록사신(1.0 ㎍/㎖), 아지트로마이신(0.01 ㎎/㎖), 테트라사이클린(0.02 ㎎/㎖)을 함유하는 배양 배지는 마이코플라스마 오염을 예방하는데 특히 유용하다. 마이크로플라스마 오염을 예방하는데 유용한 다른 약물은 4-옥소-퀴놀린 카르복실산(OQCA)의 유도체인데, 이는 ICN Pharmaceuticals, Inc.(Costa Mesa, CA)로부터 “마이코플라스마 제거제”로서 구입가능하다. 상기 약물은 전형적으로 0.1 내지 2.5 ㎎/㎖(가령, 0.2 내지 2.0 ㎎/㎖, 또는 0.5 ㎎/㎖)로 사용된다. 항생제 혼합물, 또는 다른 약물은 시작이후 첫 2주동안 섬유아세포 배양액에 존재할 수 있다. 적절한 기간(가령, 2주)의 배양이후, 항생제-함유 배지는 전형적으로 항생제-없는 배지로 교체된다. 충분한 수의 세포가 배양액에 존재하면, 이들은 마이코플라스마, 박테리아, 진균 오염을 검사할 수 있다. 감지가능한 오염이 없는 세포만 본 발명의 방법에 사용된다.
세포는 개체에 투여하기에 앞서, 제약학적으로 수용가능한 담체를 첨가할 수 있다. 본 명세서에서 “제약학적으로 수용가능한”은 인간에게 투여되는 경우에, 세포에 유해하지 않고 생리학적으로 관용되며 알레르기 반응이나 유사한 의도하지 반응, 예를 들면 위 역류, 졸음 등을 유발하지 않는 분자와 조성물을 의미한다. 이들 조성물은 다양한 완충 내용물(가령, Tris-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH, 이온 강도의 생리학적으로 수용가능한 희석제를 함유한다.
대안으로, 즉시 투여할 필요가 없는 세포는 수거이후 최대 24-48시간동안 대략 4℃에서 얼음 위에서 배양할 수 있다. 이런 배양을 위하여, 세포는 적절한 몰삼투압농도를 보유하고 발열원과 내독소 수준이 검사된 생리 용액에 부유시킬 수 있다. 이런 용액은 전형적으로 페놀 레드 pH 지시약을 함유하지 않고, 혈청은 소 태아 혈청(FBS), 또는 다른 이종 혈청(가령, 말 혈청 또는 염소 혈청)보다는 개체의 혈청(즉, 자가조직 혈청)이다. 세포는 예로써 5% 덱스트로스를 함유하는 Krebs-Ringer 용액, 또는 임의의 다른 생리 용액에 부유시킬 수 있다. 세포는 흡출하고 배양 배지에 담아 개체에 투여할 수 있다. 세포가 부유되는 식염수 또는 배양 배지의 부피는 전형적으로 주사되는 세포의 수 및 조직 퇴행이나 결함으로 인한 손상의 정도에 연관한다.
본 발명에 사용된 세포는 UMC, 섬유아세포, 각화세포와 같은 세포형을 보관하는데 적합한 임의의 동결 배지(가령, 임의의 상업적으로 가용한 동결 배지)에서 동결할 수 있다. 대략 70%(v/v) 성장 배지, 대략 20%(v/v) 소 태아 혈청(FBS), 대략 10%(v/v) 디메틸설폭사이드(DMSO)로 구성되는 배지가 특히 유용하다. FBS는 예로써 5% 덱스트로스를 함유하는 Krebs-Ringer 용액으로 대체될 수 있고, DMSO는 예로써 글리세롤로 대체될 수도 있다. 해동된 세포를 이용하여 동일 개체에서 추후 사용 되는 추가 부유물의 제조를 위한 2차 배양을 시작함으로써 2차 시료를 수득하는 불편함을 덜 수 있다.
2. 자가조직 UMC를 함유하는 조성물
본 발명은 자가조직 UMC를 함유하는 조성물을 제시한다. 이들 조성물은 치아 결함(가령, 구강 점막의 결함, 구강 점막에 대한 외상, 또는 치주 질환), 뼈 결함과 뼈 이식, 피부의 미용적 결함(가령, 눈언저리 주름살, 튼살, 주름살, 상처 흉터, 여드름 흉터, 피하 위축)과 같은 질환을 치료하는데 유용하다. UMC는 개체(가령, 인간)로부터 획득된 생검으로부터 배양의 시작으로 수거되고 농축될 수 있다. UMC는 예로써 피부 생검 또는 지방조직이나 골수의 생검으로부터 수득할 수 있다. 피부 조직으로부터 분리된 UMC가 특히 유용한데, 그 이유는 이들이 용이하게 수득되고 확대될 수 있기 때문이다. 본 명세서에서 "UMC"는 완전히 분화된 연결 조직 세포, 예를 들면, 섬유아세포 이전의 분화 “단계”에 있는 세포를 의미한다. UMC가 모든 유형의 체세포로 분화될 수는 없기 때문에, UMC는 다능 줄기 세포와 구별된다. 섬유아세포 이외에, UMC는 지방 조직, 연골, 힘줄, 뼈 또는 근육 세포로 분화될 수 있다.
본 발명의 조성물을 생산하기 위하여, UMC 배양액은 개체의 잇몸, 머릿가죽, 이후부(post-auriculum), 구개 또는 피부의 전층(가령, 1-5 ㎜, 또는 충분한 조직이 가용한 경우에 5 ㎜ 이상) 피부 생검 시료로부터 시작될 수 있다. 진피는 표피 바로 아래에 위치하고, 전형적으로 0.5 내지 3 ㎜ 범위의 두께를 갖는다. 피부 시료는 예로써 펀치 생검 절차를 이용하여 수득할 수 있다. 피부 생검은 예로써 귀 뒤에 위치한 피부로부터 획득할 수 있다. UMC는 예로써 피부 생검을 수거하고 이로부터 배양을 시작함으로써 분리할 수 있다(참조: 실시예 1). 활발하게 성장하는 UMC의 유동(즉, 비-부착성) 콜로니는 이런 배양액에서 유동이 관찰될 수 있다. 콜로니는 세포 배양액으로부터 배양 배지의 흡출과 원심분리로 수거할 수 있고, 새로운 조직 배양 배지에 재접종함으로써 확대할 수 있다. 유동 콜로니는 배양액에서 부착성 세포가 합류성이거나 비-합류성일 때 수거될 수 있다. 유동 UMC 콜로니는 지방 조직(가령, 지방흡입술, 또는 다른 외과적 제거에 의해 수거된 지방)의 배양액으로부터 분리할 수도 있다. 조직은 작은 조각으로 절단하고 막 물질을 제거할 수 있으며, 결과의 조직은 지방 조직으로부터 UMC의 활성 셰딩(active shadding)을 유도하는 조건하에 배양될 수 있다. 활성 셰딩을 유도하는 조건의 예는 제한없이, 감소된 농도의 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 배양 배지 또는 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF)를 함유하는 배양 배지의 이용이다. 가령, 대략 0% 내지 2.5% FBS가 존재한다. 가령, 대략 2.5 내지 10 ng/㎖ aFGF가 존재한다. 대안으로, 지방 조직은 지방 소구체로부터 막의 제거이후 대략 0.1 % 내지 1 % 콜라게나제로 분리될 수 있다. 유사하게, UMC 배양액은 골수의 생검으로 시작될 수 있다(참조: Marko et al.(1995) Endocrinol. 136:4582-4588).
생검 시료로부터 UMC의 확대에 적합한 임의의 조직 배양 기술을 이용하여 이들 세포를 확대할 수 있다. 배양된 세포를 확대하는데 유용한 기술은 예로써 R.I. Freshney, Ed., Animal Cell Culture: A Practical Approach,(IRL Press, Oxford, England, 1986); R.I. Freshney, Ed., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques,(Alan R. Liss & Co., New York, 1987)에서 찾아 볼 수 있다.
세포 배양 배지는 일차 UMC 배양액의 성장에 적합한 임의의 배지일 수 있다. 배양 배지는 항생제, 항진균제 및/또는 상기한 바와 같이 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 함유할 수 있다. 배양 배지에서 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린, 또는 다른 성장 인자의 존재는 UMC가 섬유아세포로 분화하는 것을 예방할 수 있다. 배지는 혈청이 존재하지 않거나, 또는 세포의 성장을 촉진하기 위하여 인간이나 비-인간 혈청[가령, 자가조직 인간 혈청, 비-자가조직 인간 A/B 혈청, 말 혈청, 또는 소 태아 혈청(FBS)]으로 보충될 수 있다. 배지에 포함된 혈청은 전형적으로 대략 0.1% 내지 20% v/v(가령, 0.5% 내지 19%, 1% 내지 15%, 또는 5% 내지 12%) 양으로 존재한다. 특히 유용한 배지는 대략 2 mM 글루타민, 대략 10 ㎎/ℓ 소디움 피루베이트, 대략 10%(v/v) FBS, 항생제로 보충된 글루코오스 DMEM을 함유하는데(“완전 배지”), 여기서 글루코오스의 농도 범위는 대략 1,000 ㎎/ℓ 내지 4,500 ㎎/ℓ이다. UMC는 혈청-없는 배지에서 확대될 수도 있다; 이런 방식으로, UMC는 이종 또는 동종 혈청 단백질에 절대 노출되지 않고, 비-자가조직 혈청을 함유하는 배지에서 세포가 확대되는 경우에 실행되는 혈청-없는 배지에서 추가 배양을 요하지 않는다.
투여에 앞서, UMC는 활성화 화합물과 함께 배양될 수 있다. 본 명세서에서 “활성화 화합물”은 세포증식을 촉진하거나 세포 수명을 강화시킬 수 있는 화합물이다(가령, 세포 증식을 유도하는 특정 유전자의 발현을 촉진하거나, 또는 DNA 회복을 활성화시키고 세포 수명을 연장하거나 아폽토시스를 예방함으로써). UMC가 섬유아세포로 분화된 이후, 활성화 화합물은 콜라겐 생산을 촉진할 수도 있다. 활성화 화합물은 UMC를 함유하는 조성물과 함께 또는 이런 조성물과 별도로 개체에 투여될 수 있다. 세포 조성물과 강화 화합물이 개별적으로 투여되는 경우에, 상기 투여는 동시에 또는 순차적으로(임의 순서) 진행될 수 있다. 상기한 바와 같이 순차적인 경우에, 투여는 수분(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 55분) 간격, 수시간(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 18, 22, 또는 23시간) 간격, 수일(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일) 간격, 또는 수주(가령, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 그 이상) 간격으로 진행될 수 있다. 대안으로, 계대배양된 UMC의 부재하에 하나이상의 활성화 화합물의 투여는 생체내에서 UMC를 촉진하거나 분화시키는데 이용될 수 있다.
UMC(및/또는 섬유아세포와 같은 다른 세포)와 함께 투여될 수 있는 다른 화합물은 강화 화합물이다. 본 명세서에서 “강화 화합물”은 투여된 세포에는 작용하지 않지만 회복되는 조직의 구조 성분(가령, 임의 유형의 콜라겐)이거나 호스트 성분(가령, 호스트 세포 또는 세포외 기질 성분)에 작용하는 화합물이다. 따라서, 강화 화합물은 투여된 세포의 회복 효능을 강화시키는 역할을 할 수 있다. 강화 화합물은 UMC 및/또는 섬유아세포와 같은 다른 세포를 함유하는 조성물과 함께 또는 이런 조성물과 별도로 개체에 투여될 수 있고, UMC-보유 조성물이 투여된 부위에서 세포의 증식, 수명, 또는 콜라겐 생산을 강화시킬 수 있다. 세포 조성물과 활성화 화합물이 개별적으로 투여되는 경우에, 상기 투여는 동시에 또는 순차적으로(임의 순서) 진행될 수 있다. 순차적인 경우에, 투여는 수분(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 55분) 간격, 수시간(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 18, 22, 또는 23시간) 간격, 수일(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일) 간격, 또는 수주(가령, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 그 이상) 간격으로 진행될 수 있다. 대안으로, 계대배양된 UMC의 완전한 부재하에 하나이상의 강화 화합물의 투여는 생체내에서 UMC를 촉진하거나 분화시키는데 이용될 수 있다.
UMC와 함께 투여될 수 있는 활성화 화합물에는 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, C-MED 100?(Optigene-X LLC, Shrewsbury, NJ), 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 니아신, 디하이드로에피안드로스테론(DHEA), 디메틸아미노 에탄올(DMAE), α-토코페롤, 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH), 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 또는 성장 인자[가령, 인간 성장 호르몬, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린, 긴 형태의 R3 IGF-I, 변환 성장 인자-β(TGF-β)]와 같은 다른 촉진성 첨가제 등이 포함된다. 상기한 바와 같이, 이들 활성화 화합물은 UMC와 동시에 또는 UMC와 개별적으로 개체에 투여될 수 있다. 강화 화합물로서 유용한 화합물은 예로써 아미노카프로산, 에스트리올, 아세틸콜린스테라제이다. 이들 화합물중 일부는 항산화제(가령, L-리포산, C-MED 100?,, 보조효소 Q-10)이고, 다른 화합물(가령, 비타민 E, 카르복시알킬 에스테르, 카로테노이드)은 DNA 회복에 영향을 주는 것으로 생각되고, 또 다른 화합물(가령, 칼슘 트리포스페이트, 칼슘 모노포스페이트)은 골세포의 발달을 유도할 수 있다. 다른 유용한 활성인자는 전사 인자, 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제, 메틸 결합 단백질, 아세틸콜린 전구물질, 세포 막 보호인자, 분화 인자 등이다.
목적하는 활성 화합물 또는 강화 화합물이 단백질인 경우에, 개체에 투여되는 세포(가령, UMC 또는 섬유아세포)는 하나이상(가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상)의 발현 벡터(가령, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들면, 우두, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 벡터)로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염, 형질도입, 형질전환, 또는 감염될 수 있는데, 이들 각각은 하나이상(가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상)의 활성화 및/또는 강화 화합물(가령, 임의 유형의 콜라겐(I형, Ⅱ형 또는 Ⅲ형 콜라겐), 전사 인자, 텔로메라제, 또는 DNA 메틸화에 영향을 주는 인자를 인코딩하는 하나이상(가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상)의 핵산 서열을 보유한다.
세포(가령, UMC)는 개체 투여에 앞서 저에너지 레이저 광에 대한 노출에 의해 활성화될 수도 있다. 가령, 세포는 섬유아세포에 의한 콜라겐 생산을 증가시킬 수 있는 헬륨-네온 레이저 또는 갈륨-비소 레이저로 조사될 수 있다(참조: Halcin and Uitto, "Biologic Effects of Low-Energy Lasers," in Lasers in Cutaneous and Aesthetic Surgery, 1st edition(1997), Arndt and Dover, eds., Lippincott Williams & Wilkins(Philadelphia, PA), pp. 303-328). 레이저 처리는 세포 증식, 면역 조절, 상처 치료에서 세포외 기질 생산에도 영향을 줄 수 있다. 세포는 개체 투여에 앞서, 임의의 적절한 기간(가령, 수시간 내지 수주)동안 1회 이상(가령, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상) 저수준 레이저로 조사될 수 있다.
또한, 본 발명은 계대배양된 자가조직 UMC를 함유하는 조성물을 제조하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 개체로부터 UMC-보유 조직의 생검을 제공하고, 생검으로부터 자가조직 UMC를 분리하고, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 세포를 유도하는 조건하에 UMC를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. UMC가 예로써 피부 생검으로부터 유래된 부착성 섬유아세포의 배양액에서 비-부착성 세포 콜로니로서 제조되는 경우에, 이들은 배양액으로부터 계대배양하거나 비-흡착성 세포-보유 배지의 제거와 원심분리로 수거할 수 있다. UMC가 계대배양되는 경우에, 이들은 새로운 배양 배지에 재부유시키고 적절한 조직 배양 용기, 예를 들면, 조직 배양 플라스크에 분배한다. UMC가 개체에 투여되는 경우에, 이들은 적절한 용액(가령, 정상 식염수, 5% 덱스트로스를 함유하는 Krebs Ringer, 페놀 레드가 존재하지 않는 조직 배양 배지, 또는 등장성이고 포유동물이나 인간과 같은 개체에 주사하기 적합한 임의의 다른 용액)에 재부유된다. U.S. Patent No. 5,858,390에 개시된 방법을 비롯한 임의의 다른 적절한 방법을 이용하여 UMC를 분리하고 배양할 수 있다.
3. 자가조직 섬유아세포와 UMC를 함유하는 조성물
본 발명의 조성물은 UMC 이외에, 면역원성 단백질(가령, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유할 수 있다. 조성물은 배양으로 확대될 수 있는 임의의 섬유아세포를 함유할 수 있다. 피부 조직으로부터 분리된 섬유아세포가 특히 유용한데, 그 이유는 이들이 용이하게 수득되고 확대될 수 있기 때문이다. 하지만, 자가조직 섬유아세포는 섬유아세포를 보유하는 임의의 조직, 예를 들면, 개체의 잇몸, 구개 또는 피부의 생검으로부터 수득될 수 있다. 이에 더하여, 섬유아세포는 제한없이, 근막, 점막고유층, 모낭의 구근, 골수, 또는 임의 출처의 연결 조직으로부터 수득될 수도 있다. 이에 더하여, 섬유아세포는 예로써 세포 배양에 의해 UMC로부터 유래될 수 있다. 임의의 적절한 방법을 이용하여 UMC를 배양하고 분화시킬 수 있다. UMC는 예로써 산성 섬유아세포 성장 인자 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 적절한 분화-저해 인자의 부재하에 배양함으로써 섬유아세포로의 분화를 유도할 수 있다.
원하는 경우, 무균 현미경적 절개를 이용하여 각화된 조직-보유 진피와 지방세포-보유 피하 조직으로부터 생검에서 피부 조직을 분리할 수 있다. 이후, 생검 시료는 조직을 잘게 절단하는 외과용 메스 또는 가위를 이용하여 작은 조각으로 분리할 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 작은 조직 조각은 프로테아제(가령, 콜라게나제, 트립신, 키모트립신, 파파인 또는 키모파파인)로 분해시킨다. 200-1000 U/㎖의 Ⅱ형 콜라게나제로 10분 내지 24시간동안 분해가 특히 유용하지만, 임의 유형의 콜라게나제(가령, 지방 조직의 분해에 0.05% 내지 0.1% Ⅳ형 콜라게나제가 특이 유용할 수 있다)가 사용될 수 있다. 효소 분해를 이용하는 경우에, 세포는 원심분리로 수거하고 조직 배양 플라스크에 도말할 수 있다.
조직을 효소 분해하지 않는 경우에, 잘게 절단된 조직 조각은 조직 배양 플라스크의 건조 표면에 개별적으로 위치시키고 대략 2 내지 10분동안 부착되도록 방치한다. 부착된 조직 단편이 이탈하지 않도록 소량의 배지를 천천히 첨가한다. 분해된 세포의 경우에, 이들 세포는 배양 배지로 세척하여 잔류 효소를 제거하고 새로운 배지에 부유시키며 하나이상의 플라스크에 위치시킬 수 있다. 대략 48-72시간 배양이후, 플라스크는 추가의 배지를 공급할 수 있다. 배양을 시작하는데 T-25 플라스크를 이용하는 경우에, 배지의 초기 함량은 전형적으로 대략 1.5-2.0 ㎖이다. 생검 시료로부터 세포주의 확립은 대략 2-3주가 소요될 수 있는데, 이 시점에서 이들 세포는 확대를 위하여 최초 배양 용기로부터 이전될 수 있다.
초기 배양 단계동안, 조직 단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태로 유지시키는 것이 바람직하다. 이탈된 단편은 새로운 용기에 재이식될 수 있다. 이들 섬유아세포는 표준 기술에 따른 EDTA-트립신에 짧은 노출로 성장을 자극할 수 있다. 트립신에 대한 이런 노출은 배양 용기 벽에 부착된 섬유아세포가 방출되지 않도록 짧게 실시한다. 배양액이 확립되고 합류 수준에 근접한 직후에, 섬유아세포 샘플은 예로써 액체 질소에서 동결 보관을 위하여 가공할 수 있다. 추후 사용을 위하여 세포를 성공적으로 동결시키는 당분야에 공지된 다양한 방법을 비롯하여 세포를 동결하는데 임의의 적절한 방법을 이용할 수 있다. 후기보다는 초기 계대배양 섬유아세포의 동결과 보관이 바람직한데, 그 이유는 세포 배양액에서 정상적인 인간 섬유아세포의 계대배양 횟수가 제한되기 때문이다.
생검 시료로부터 피부 섬유아세포의 증식에 적합한 임의의 조직 배양 기술을 이용하여 이들 세포를 확대할 수 있다. 세포 배양 배지는 일차 섬유아세포 배양액의 성장에 적합한 임의의 배지일 수 있다. 배지는 상기한 바와 같이 인간이나 비-인간 혈청[가령, 자가조직 인간 혈청, 비-자가조직 인간 A/B 혈청, 말 혈청, 또는 소 태아 혈청(FBS)]으로 보충될 수 있다. 섬유아세포는 혈청-없는 배지에서 확대될 수도 있다; 이런 방식으로, 섬유아세포는 이종 또는 동종 혈청 단백질에 절대 노출되지 않고, 비-자가조직 혈청을 함유하는 배지에서 섬유아세포가 확대되는 경우에 실행되는 혈청-없는 배지에서 추가 배양을 요하지 않는다.
자가조직 섬유아세포는 트립신처리(trypsinization)에 의해 새로운 플라스크에 계대배양할 수 있다. 확대를 위하여, 개별 플라스크는 1:3 내지 1:5의 비율로 분할할 수 있다. 450 ㎠의 총 배양 면적(total culture area)을 보유하는 삼중 바닥 T-150 플라스크는 섬유아세포를 확대하는데 적합하다. 삼중 바닥 T-150 플라스크는 세포의 크기에 따라, 예로써 ㎠당 대략 1x106 내지 3x106 세포, 또는 대략 8x106 세포로 접종될 수 있다. 이런 플라스크는 전형적으로 6x106 내지 1x107 세포를 산출하는 능력을 갖는다. 대략 5-7일의 배양을 요하는 플라스크의 수용 능력에 도달하면, 성장 배지는 혈청-없는 배지로 교체할 수 있다. 이들 세포는 전형적으로, 적어도 4시간(가령, 하룻밤동안 또는 대략 18시간)동안 대략 30℃ 내지 37.5℃에서 배양한다. 혈청-없는 배지에서 세포의 배양은 배양 배지에 첨가된 비-자가조직 혈청(가령, FBS)로부터 유래된 단백질을 실질적으로 제거할 수 있는데, 이들 단백질은 개체에 주사되는 조성물에 존재하면 바람직하지 않은 면역 반응을 초래할 수 있다. 혈청-없는 배지는 예로써 대략 2 mM 글루타민으로 보충되고 대략 110 ㎎/ℓ소디움 피루베이트가 존재하거나 존재하지 않는 글루코오스 DMEM을 함유하는데, 여기서 글루코오스의 농도 범위는 대략 1,000 ㎎/ℓ 내지 4,500 ㎎/ℓ이다. 대략 4,500 ㎎/ℓ의 글루코오스 농도가 특히 유용하다. 혈청-없는 배지는 전술한 항생제중 한가지이상을 함유할 수도 있다.
혈청-없는 배지에서 배양의 종결 시점에서, 세포는 예로써 트립신-EDTA를 사용하여 조직 배양 플라스크로부터 제거할 수 있다. 개체 투여에 앞서, 섬유아세포는 전형적으로 혈청과 페놀 레드가 존재하지 않는 배지, 또는 식염수에서 2 내지 4회 세척한다. 세포는 원심분리와 재부유로 세척하고, 이후 적절한 생리 몰삼투압농도(osmolarity)를 보유하고 발열원과 외래 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 동등 부피의 주사가능 등장성 용액에서 주사용으로 부유시킬 수 있다. 등장성 식염수는 특히 유용한 등장성 용액이다. 수용 능력까지 성장된 5개의 삼중 바닥 T-150 플라스크는 대략 1.2 ㎖ 내지 1.4 ㎖ 부유물을 구성할 만큼 충분한 대략 3.5x107 내지 7x107 세포를 산출할 수 있다. 이후, 제약학적으로 수용가능한 담체를 계대배양된 자가조직 섬유아세포에 첨가하여 제약학적 조성물을 형성할 수 있다.
섬유아세포는 UMC에서처럼, 개체 투여에 앞서 활성화 화합물과 함께 배양될 수 있다. 적절한 활성화 화합물은 상기한 화합물을 포함한다. 이런 화합물과의 배양은 섬유아세포를 촉진하고 이들의 콜라겐 생산을 강화시킬 수 있다. 하나이상의 활성화 화합물은 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유하는 조성물과 함께 개체에 투여될 수도 있다. 대안으로, 계대배양된 섬유아세포의 부재하에 활성화 화합물을 투여하여 생체내에서 섬유아세포를 촉진할 수 있다.
게다가, UMC에서 생체내 용도로 전술된 동일한 강화 화합물 역시 UMC와 섬유아세포를 함유하는 조성물, 또는 섬유아세포 단독과 함께 사용될 수 있다.
상기한 바와 같이, 섬유아세포는 저에너지 레이저의 조사에 의해 활성화될 수 있다.
임의의 다른 적절한 방법을 이용하여 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유하는 조성물을 제조할 수도 있다(참조: U.S. Patent No. 5,858,390, 5,665,372, 5,660,850, 5,591,444, 6,342,710; International Application No. WO 99/60951).
본 발명은 계대배양된 자가조직 UMC와 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유하는 조성물을 제조하는 방법을 제시한다. 상기 방법은
(1) 개체로부터 UMC-보유 조직의 생검을 제공하고, 생검으로부터 자가조직 UMC를 분리하고, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 UMC를 유도하는 조건하에 원하는 양의 세포를 얻을 수 있을 만큼 충분한 횟수동안 UMC를 배양하고;
(2) 개체로부터 섬유아세포-보유 조직의 생검을 제공하고, 생검으로부터 자가조직 섬유아세포를 분리하고, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 섬유아세포를 유도하는 조건하에 원하는 양의 세포를 얻을 수 있을 만큼 충분한 횟수동안 섬유아세포를 배양하고;
(3) 상기 UMC와 상기 섬유아세포를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. UMC와 섬유아세포는 단일 생검 시료로부터 수득될 수 있고, 더 나아가 동시-배양될 수 있다. 따라서, 최종 혼합 단계는 필요하지 않을 수도 있다.
4. 자가조직 각화세포를 함유하는 조성물
본 발명의 조성물은 계대배양된 각화세포를 함유할 수 있다. 각화세포는 자가조직이거나 비-자가조직(가령, 다른 개체 또는 세포주로부터)일 수 있지만, 자가조직 각화세포가 특히 유용하다. 자가조직 각화세포는 예로써 피부, 잇몸, 협측 조직, 식도 조직, 외경부 조직, 모낭, 또는 결막 조직의 생검으로부터 분리될 수 있다. 자가조직 각화세포는 전형적으로 용이하게 접근가능하지만 미용적 관점에서 명백하게 드러나지 않는 부위로부터 획득된다. 비-자가조직 각화세포는 각화세포 세포주로부터 유래될 수 있다. 이런 세포는 예로써 ATCC로부터 상업적으로 구입가능하다. 본 발명에 사용되는 각화세포는 전형적으로 부유물에 담겨지고, 예로써 주사에 의해 개체에 투여될 수 있다.
본 발명은 개체에서 화상 상처와 같은 조직 결함을 회복시키거나 보강하기 위한 조성물을 제조하는 방법을 제시한다. 전형적인 치유 과정동안, 각화세포는 상처의 외부 가장자리로부터 상처의 중심부위로 성장하는데, 이는 종종 흉터를 유발한다. 각화세포의 부유물을 함유하는 조성물은 흉터를 감소시키면서 치유를 촉진하기 위하여 화상 상처에 투여(가령, 주사)될 수 있다. 각화세포 부유물은 면역원성 단백질(가령, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)이 실질적으로 존재하지 않는다.
각화세포는 예로써 피부 생검으로부터 수거할 수 있다. 전층 또는 부분층 인간 피부를 이용할 수 있다. 피부는 포피를 비롯한 임의의 신체 부분으로부터 수득될 수 있다. 전층 피부를 이용하는 경우에, 진피는 가능한 얕게 잘라낼 수 있다. 이들 피부는 항생제 및/또는 항진균제(가령, 페니실린, 스트렙토마이신, Fungizone?)를 함유하는 배지(가령, MEM)에서, 또는 상기한 항생제-함유 배지에서 1회 이상 세척할 수 있다. 이후, 이들 조직은 작은(가령, 4 ㎟) 조각으로 절단하고 트립신(가령, Ca++ 또는 Mg++가 존재하지 않는 인산염 완충액에서 0.25% 트립신)에서 배양하고 표피로부터 진피를 분리할 수 있다[Eisinger(1985) Method in Skin Research, Ed. Skerrow, pp. 193]. 트립신 처리는 적절한 기간(가령, 2 내지 18시간)동안 적절한 온도(가령, 4℃)에서 진행할 수 있다. 트립신처리이후, 표피는 미세 겸자를 이용하여 진피로부터 조심스럽게 분리할 수 있다. 진피는 폐기하거나 섬유아세포의 성장에 이용할 수 있고, 표피는 예로써 8 g/ℓ M NaCl, 0.4 g/ℓ KCl, 1 g/ℓ 덱스트로스, 0.58 g/ℓ NaHCO3, 0.5 g/ℓ 트립신, 0.2 g/ℓ 베르센(이나트륨 염)을 함유하는 용액에 부유시킬 수 있다.
모든 표피가 수거되면, 이들 표피 세포는 겸자를 이용한 물리적 티징(physical teasing)으로 서로 분리될 수 있다. 상층액에 용리된 이들 세포는 새로운 조직 배양 접시에 이전하고, 예로써 Pasteur 피펫을 이용한 활발한 피펫팅으로 분리하여 현미경하에 관찰될 수 있는 단일 세포의 부유물을 수득할 수 있다. 이후, 세포는 무균 소 태아 혈청(FBS)에 수거하고 예로써 무균 거즈 메시(sterile gauze mesh)에 여과하여 조직의 잔류 덩어리 또는 조각을 제거할 수 있다. 새로운 배지를 잔류 표피 조직에 첨가할 수 있는데, 이런 과정은 모든 조직이 완전히 분리될 때까지 반복할 수 있다. FBS에서 수거된 세포는 원심분리로 펠렛하고, 각화세포 성장 배지에 재부유시키며, 플라스틱 조직 배양 용기에서 대략 5 x 105 내지 8 x 105 세포/㎖로 접종할 수 있다. 이들 세포는 전형적으로 5% CO2와 95% 대기의 존재하에 80% 습도와 35℃ 내지 36℃에서 배양시킨다. 각화세포는 12 내지 14일후 수거가능하고, 계대배양 또는 개체 투여에 이용할 수 있다.
복제 표피 각화세포 배양액은 일차 배양액을 확립하고 계대배양을 수행하기 위하여 섬유아세포 공급층(가령, 3T3 세포층)에서 유지시키거나, 또는 동물 혈청(가령, FBS)의 존재하에 배양할 수 있다. 이들 조건하에, 각화세포는 20 내지 50회의 세포수 배가(population doubling). 세포는 예로써 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 g/㎖ 스트렙토마이신, 0.6 ㎍/㎖ Fungizone?, 0.5 ㎍/㎖ 하이드로코르티손, 200 mM L-글루타민산, 10 mM MEM-비-필수 아미노산을 함유하는 최소 필수 배지(MEM)에서 배양할 수 있다. 페니실린, 스트렙토마이신, Fungizone?,보다는, UMC와 섬유아세포 배양액에서 상기한 항생제 혼합물이 사용될 수도 있다. 표피 각화세포의 영양계 성장, 연속 증식, 분화를 뒷받침하기 위한 혈청 또는 공급층을 필요로 하지 않는 시험관내 시스템 역시 개발되었다[Peehl and Ham(1980) In Vitro 16:516-525; Tsao et al.(1982) J. Cell. Physiol. 110:219-229]. 이런 시스템은 섬유아세포 배양액으로부터 조건 배지의 이용을 포함할 수 있다.
각화세포 배양 조건은 세포 성장을 강화시키기 위하여 변형될 수 있다. 가령, 증가된 하이드로코르티손 농도(가령, 10 ㎍/㎖), 푸트레신(가령, 10-5 M), 비타민 B12(가령, 10-5 M), 또는 J-에스트라디올(가령, 3.7 x 10-6 M)을 이용하여 비조건 배지에서 각화세포 성장을 강화시킬 수 있다[참조: Peehl and Ham supra]. 각화세포 성장 배지는 표피 성장 인자 및/또는 인슐린과 같은 성분을 함유할 수도 있다. 또한, 칼슘 농도를 조정하여 각화세포 증식 속도에 영향을 줄 수 있다[Hennings et al.(1980) Cell 19:245-265].
예로써 0.05 내지 0.1 mM Ca++를 함유하는 배지에서 표피 세포 배양은 증식 속도를 증가시키는 반면, 배양 배지에서 정상적으로 발견되는 조건(가령, 1.2 mM Ca++)하에 성장은 세포의 최종 분화를 유도할 수 있다. 각화세포를 분리하고 배양하는데 임의의 적합한 다른 방법을 이용하여 본 발명의 조성물을 생산할 수 있다. 여기에는 예로써 U.S. Patent No. 4,254,226, 5,282,859, 6,029,760에 개시된 방법이 포함된다.
본 발명은 각화세포를 함유하는 조성물을 제조하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 각화세포-보유 조직의 생검을 제공하고, 상기 조직 생검으로부터 각화세포를 분리하며, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 세포를 유도하는 조건하에 원하는 양의 세포를 얻을 수 있을 만큼 충분한 횟수동안 섬유아세포를 계대배양하고, 세포의 부유를 유도하는 조건(가령, 트립신)에 상기 세포를 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
각화세포를 함유하는 조성물은 섬유아세포(가령, 계대배양된 자가조직 섬유아세포) 및/또는 UMC(가령, 계대배양된 자가조직 UMC)를 함유할 수도 있다. 섬유아세포는 분리할 수 있고, 부유물은 상기 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명의 방법은 하나이상의 조직 생검을 수득하고, 계대배양된 자가조직 각화세포와 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 부유물을 제조하며, 상기 각화세포와 상기 섬유아세포를 혼합하여 화상 상처와 같은 이상을 치료하는데 사용될 수 있는 조성물을 산출하는 단계를 포함할 수 있다. 각화세포와 섬유아세포는 단일 생검(가령, 전층 피부 생검)으로부터 수득되고 제조될 수 있다. 적절한 섬유아세포:각화세포 비율을 이용할 수 있지만, 대략 3:1(섬유아세포:각화세포) 비율이 특히 유용하다.
5. 생물분해성 무세포 기질 성분을 함유하는 조성물
계대배양된 자가조직 세포(가령, 섬유아세포가 존재하거나 존재하지 않는 UMC)를 함유하는 본 발명의 조성물은 생물분해성 무세포 기질 성분을 함유할 수도 있다. 이들 조성물은 퇴화된 조직을 회복시키기 위한 개체로의 주사 또는 이식에 적합하다. 무세포 기질 성분은 일반적으로 구조적 역할을 수행한다. 가령, 이는 조직에서 결함, 구멍, 공간 또는 공동을 메울 수 있고, 주사된 세포가 기질 또는 주변 조직에 부착되고 성장하며 새로운 조직의 성장에 기인한 구조적 인자 및 다른 인자(가령, 주화성 인자)를 생산할 수 있는 환경을 제공한다. 많은 경우에, 기질의 틈새-채움 기능은 일시적이고 이식된 세포 및/또는 호스트 세포가 상기 부위에 이동하여 새로운 조직을 형성할 때까지만 지속된다. 적절하게는, 무세포 기질은 생물분해성이다. 적절하게는, 혼합물은 생리 조건하에 용해되지 않는 고체 또는 반-고체 물질이다. 이에 더하여, 생물분해성 무세포 기질 성분 역시 계대배양된 각화세포를 함유하는 임의의 조성물에 포함될 수 있다. 이런 조성물은 퇴행된 조직을 회복하기 위한 개체 주사 또는 이식에 적합하다. 본 명세서에서 “생물분해성”은 생리학적으로 무해하고 자연 주효체(가령, 날씨, 토양 박테리아, 식물, 동물)에 의해 화학적으로 분해될 수 있는 조성물을 의미한다. 본 발명에 사용될 수 있는 기질의 예에는 자가조직과 비-자가조직 단백질을 함유하는 무세포 기질, 생물분해성 중합체를 함유하는 무세포 기질 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
비-자가조직 단백질을 함유하는 다양한 생물분해성 무세포 기질이 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 생물분해성 무세포 기질의 예에는 임의 유형의 콜라겐(가령, 소, 돼지, 인간, 또는 생물-가공된 콜라겐), 또는 예로써 글루타르알데하이드로 교차-결합된 글리코사미노글리칸(GAG)을 보유하는 임의 유형의 콜라겐을 함유하는 기질이 포함된다. 콜라겐을 함유하는 기질에는 흡수가능 콜라겐 스펀지, 콜라겐 막, 골 해면질(bone spongiosa) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 유용한 유형의 콜라겐에는 예로써 소 콜라겐(가령, Zyderm?과 Zyplast?, McGhan Medical Corporation, Santa Barbara, CA), 돼지 콜라겐, 인간 시체 콜라겐(가령, FascianTM(Fascia Biosystems, LLC, Beverly Hills, CA), Cymetra(LifeCell Corp., Branchburg, NJ), DermalogenTM(Collagenesis Corp.), 생물가공된 콜라겐(가령, FortapermTM, Organogenesis, Inc., canton, MA), 자가조직 인간 콜라겐(Autologen?,) 등이 포함된다. FascianTM이 특히 유용하다. 상기 산물은 5가지 상이한 입자 크기로 가용한데, 이들은 본 발명의 조성물과 방법에 사용될 수 있다. 0.25 ㎜ 크기의 입자가 특히 유용하다.
흡수가능 콜라겐 스펀지는 예로써 Sulzer Calcitek, Inc.(Carlsbad, CA)로부터 구입할 수 있다. CollaTape?, CollaCote?, CollaPlug?의 상표로 판매되는 이들 콜라겐 스펀지 드레싱은 소 심부 굴근(Achilles) 힘줄과 GAG로부터 추출된 교차-결합된 콜라겐으로부터 만들어진다. 이들 산물은 부드럽고 유연하며 부서지지 않고 비-발열성이다. 콜라겐 스펀지의 90% 이상은 전형적으로 개방 구멍으로 구성된다.
생물분해성 무세포 기질은 예로써 박막에 형성된 콜라겐(가령, 소 또는 돼지 I형 콜라겐)을 함유할 수 있다. 이런 한가지 막은 Sulzer Calcitek에 의해 제조되고 BioMendTM으로 시판되고 있다. 다른 막 기질은 Geistlich Sohne AG(Wolhusen, Switzerland)에 의해 Bio-Gide?로 시판되고 있고, 돼지 I형과 Ⅱ형 콜라겐으로 구성된다. Bio-Gide?은 이중층 구조를 갖는데, 한 표면은 다공성이고 세포의 내생을 가능하게 하며, 다른 표면은 밀집되고 섬유성 조직의 내생을 차단한다.
콜라겐을 함유하는 다른 적절한 기질은 COLLAGRAFT?(NeuCell, Inc., Campbell, CA), OSTEOSET? 칼슘 설페이트 알파 반-수화물 펠렛(Wright Medical Technology, Arlington, TN) 등이다.
생물분해성 무세포 기질은 과립이나 블록으로 형성된 골 해면질로부터 만들어질 수 있다. 상기 물질은 실질적으로 모든 유기 물질(가령, 단백질, 지질, 핵산, 탄수화물 및 소형 유기 분자, 예를 들면, 비타민과 비-단백질 호르몬)이 실질적으로 제거된 동물(가령, 인간, 비-인간 영장류, 소, 양, 돼지 또는 염소) 뼈로 구성된다. 이런 유형의 기질은 “무기질 기질”라고 한다. 이런 한가지 기질은 Geistlich Sohne AG에 의해 Bio-Oss? 해면질 과립과 Bio-Oss? 블록으로 시판되고 있다. Geistlich Sohne AG에서는 탈유기질 뼈를 함유하고 대략 10wt% 콜라겐 섬유를 추가로 함유하는 블록-형 기질(Bio-Oss? 콜라겐)을 또한 제조한다.
다른 유용한 생물분해성 무세포 기질은 젤라틴, 장선, 탈염된 뼈, 탈유기질 뼈, 산호 또는 수산화인회석, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 탈염된 인간 뼈로부터 만들어진 기질은 예로써 소형 블록으로 형성되고, DynaGrafto?(GenSci Regeneration Laboratories, Inc., Toronto, Ontario), Tutoplast?(Tutogen Medical, Inc., Cliton, NJ), 또는 Grafton? Demineralized Bone Matrix(Osteotech, Inc., Eatontown, NJ)로 시판되고 있다. 탈염된 뼈는 예로써 콜라겐과 혼합하여 스펀지, 블록 또는 막 형태의 기질을 생산할 수 있다. 생물분해성 기질는 무코폴리사카라이드 또는 히알루론산과 같은 글리코사미노글리칸을 함유할 수 있다. 또한, 하나이상의 단량체로부터 만들어진 합성 중합체를 사용하여 본 발명에 유용한 생물분해성 무세포 기질을 만들 수 있다. 이런 합성 중합체는 예로써 폴리(글리콜산), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산)-폴리(락트산)이다. 합성 중합체는 임의의 전술한 물질중 한가지와 혼합하여 기질을 형성할 수도 있다. 단일 기질을 형성하는 서로 다른 중합체는 개별 구획이나 층에 존재할 수 있다. 가령, W. L. Gore & Associates, Inc.(Flagstaff, AZ)에서는 다공성 생물분해성 무세포 기질(GORE RESOLUT XT Regenerative Material)을 제조한다. 상기 기질은 세포가 이동할 수 있고, 합성 생흡수가능 글리콜리드와 세포의 내생을 허용하지 않는 락티드 공중합체로 구성되는 폐쇄성 막에 부착될 수 있는 합성 생흡수가능 글리콜리드와 트리메틸렌 카보네이트 공중합체 섬유로 구성된다. 적절한 생물분해성 기질의 다른 예는 United Patent No. 5,885,829에서 발견될 수 있다.
생물분해성 무세포 기질이 선택되면, 세포(가령, 계대배양된 자가조직 섬유아세포가 존재하거나 존재하지 않는 계대배양된 자가조직 UMC)의 농축된 부유물은 기질의 표면에 균일하게 분산될 수 있다. 전형적으로, 농축 부유물은 액체 부유물을 흡수하는 기질의 능력 초과를 피하기 위하여 사용된다. 가령, GORE RESOLUT XT 기질에 적용되는 세포 부유물은 대략 94 ㎕ 내지 125 ㎕의 부피를 보유하고, 기질 ㎠당 대략 2.Ox106 내지 4.0x106 세포를 함유할 수 있다. 세포는 배지의 추가 첨가없이 기질에 부착될 수 있다. 기질과 함께 세포의 배양은 예로써 대략 37℃에서 1-2시간동안 진행될 수 있다. 전형적으로, 세포는 대략 60분 배양이후 전체 기질에 부착되고 균일하게 분산된다. 이 시점에서, 세포-적하된 기질을 보유하는 배양 용기는 추가의 성장 배지로 보충할 수 있고, 세포는 기질에서 3 내지 4일동안 배양할 수 있다. 기질 내에 공간을 실질적으로 채우기 위하여 세포가 높은 밀도로 기질에 부착되기 때문에, 3-4일 배양 기간 동안에는 증식이 거의(또는 전혀) 발생하지 않는다. 실제로, 이 기간에는 현저한 세포 증식이 바람직하지 않은데, 그 이유는 분열하는 섬유아세포가 기질을 분해하거나 부분적으로 분해하는 효소(가령, 콜라게나제)를 분비할 수 있기 때문이다.
전형적으로, 세포를 포함하는 기질은 개체에 투여되면 면역 반응을 유발할 수 있는 면역원성 단백질(가령, 비-자가조직 혈청을 함유하는 배지가 기질 접종 단계에 사용되는 경우에 배양 배지 혈청-유래된 단백질)을 실질적으로 제거하기 위하여, 예로써 혈청과 페놀 레드가 존재하지 않는 식염수 또는 배지로 세척(가령, 각 10분의 적어도 3회 세척)한다. 각 세척에 새로 만든 PBS를 사용할 수 있다. 이후, 기질은 사용에 앞서 새로운 PBS 또는 혈청-없는 배양 배지에서 배양(가령, 2시간 배양)할 수 있다. 배양이후, 계대배양된 자가조직 UMC를 함유하고 계대배양된 섬유아세포를 함유하거나 함유하지 않는 기질은 조직 퇴행이나 결함 부위에 위치시킬 수 있다.
콜라겐 스펀지 기질(예. CollaCote?)의 경우에, 대략 1.5 ㎖ 성장 배지에서 1.5x107 내지 2.Ox107 세포를 2 ㎝ x 4 ㎝ 얇은(대략 2.5 내지 3.0 ㎜ 두께) 스펀지에 접종할 수 있다. 이후, 스펀지는 배지의 추가없이 37℃에서 대략 1-2시간동안 배양하여, 거의 모든 세포가 기질 물질에 부착될 수 있도록 한다. 세포 부착이후, 성장 배지를 기질과 세포 조성물에 추가로 첨가하고, 이후 배지를 매일 변화시키면서 37℃에서 3-4일동안 배양할 수 있다. 비-자가조직 혈청을 함유하는 배지가 세포 접종 단계에 사용되면, 조성물은 이런 혈청을 함유하는 성장 배지로부터 이전하고 PBS로 반복적으로(가령, 3회 이상) 세척할 수 있다. PBS의 각 첨가이후, 기질은 PBS를 폐기하기에 앞서, 10-20분동안 배양할 수 있다. 최종 세척이후, 조성물은 개체에 직접 투여하거나, 또는 생리 용액(가령, Kreb 링거 용액)을 포함하는 바이알에 이전하고 대략 4℃에서 최대 24-48시간동안 배양할 수 있다.
막 기질(가령, BioMendTM)의 경우에, 대략 100 ㎕ 성장 배지에서 3x106 내지 8x106 세포(가령 UMC, 또는 UMC와 섬유아세포)를 15 ㎜ x 20 ㎜ 얇은(대략 0.5 내지 1.0 ㎜ 두께) 막에 접종할 수 있다. 막은 배지의 추가없이 37℃에서 대략 30-60분동안 배양하여, 거의 모든 세포가 기질 물질에 부착될 수 있도록 한다. 세포 부착이후, 성장 배지를 기질과 세포 조성물에 추가로 첨가하고, 이후 배지를 매일 변화시키면서 37℃에서 2-3일동안 배양할 수 있다. 전형적으로, 이들 세포는 높은 밀도로 기질에 첨가하여, 기질 내에서 세포에 이용가능한 공간을 실질적으로 채운다. 조성물의 세척 및 즉시 사용 또는 배양은 스펀지 기질에서 전술한 바와 동일하다.
상기한 탈유기질 기질(가령, Bio-Oss? 블록) 또는 탈염된 뼈 기질(가령, DynagraftTM 기질)과 같은 블록 기질의 경우에, 대략 100 내지 150 ㎕ 성장 배지에서 1.2x107 내지 2.0x107 세포를 1 ㎝ x 1 ㎝ x 2 ㎝ 입방 블록의 기질 물질에 접종할 수 있다. 전형적으로, 세포는 블록 표면의 한 면에 서서히 접종된다. 배지와 세포가 블록에 흡수되면, 블록의 다른 면을 유사한 방식으로 접종할 수 있다. 이런 과정은 블록의 모든 면이 접종되고 블록이 배지로 완전히 포화될 때까지 반복할 수 있다. 과도한 배지가 첨가되어 블록으로부터 배지와 세포가 누출되지 않도록 주의]한다. 이후, 조성물은 배지의 추가없이 37℃에서 대략 60-120분동안 배양하여, 거의 모든 세포가 기질 물질에 부착될 수 있도록 한다. 세포 부착이후, 성장 배지를 기질과 세포 조성물에 추가로 첨가하고, 이후 배지를 매일 변화시키면서 37℃에서 2-3일동안 배양할 수 있다. 전형적으로, 이들 세포는 높은 밀도로 기질에 첨가하여, 전술한 바와 같이 기질 내에서 세포에 이용가능한 공간을 실질적으로 채운다. 조성물의 세척 및 즉시 사용 또는 배양은 스펀지 기질에서 전술한 바와 동일하다.
계대배양된 자가조직 세포 및 소형 입자 생물분해성 기질(가령, FascianTM, CymetraTM 또는 DermalogenTM)을 함유하는 조성물은 예로써 흐름 방지 장치(luer lock)를 통하여 연결된 2개의 주사기 사이에서 이들 성분을 전후로 이동시켜 혼합함으로써 제조할 수 있다. 가령, FascianTM은 주사기(가령, 3 cc 주사기)에서 80 ㎎/주사기로 가용하다. FascianTM 입자는 소량(가령, 1.5 ㎖)의 세척 완충액(가령, 덱스트로스를 함유하는 등장성 식염수 또는 Kreb 링거 용액)을 주사기에 집어넣고, 흐름 방지 장치를 통하여 제 1 주사기를 제 2 주사기로 연결하며, 입자와 세척 용액을 두 주사기 사이에서 수회 전후로 이동시킴으로써 사용에 앞서 주사기에서 직접 세척할 수 있다. 입자를 세척 용액으로부터 분리하기 위하여, 상기 혼합물은 무균 튜브로 이전하고 FascianTM 입자를 가라앉힌다. 용액은 제거하고(가령, 흡출하거나 따라버리고), 세척 과정은 입자를 새로운 주사기로 집어넣어(가령, 18 게이지 또는 20 게이지 바늘을 통하여) 원하는 만큼 반복할 수 있다.
이들 입자는 적절히 세척한 이후, 세척에서와 동일한 과정을 이용하여 세포(가령, UMC 및 선택적으로 섬유아세포)와 혼합할 수 있다. 세포(가령, 1x107 내지 3x107 세포)는 용액(가령, 5% 덱스트로스를 함유하는 1.5 ㎖ Kreb 링거 용액)에 부유시키고 주사기에 집어넣을 수 있다. 세포를 포함하는 주사기는 흐름 방지 장치를 통하여 충전제 입자를 포함하는 주사기와 연결할 수 있고, 이들 두 성분은 주사기 사이에서 전후로 이동시켜 혼합할 수 있다. 이후, 혼합물은 T-25 조직 배양 플라스크, 조직 배양 접시 또는 튜브에 이전하여 이들 세포가 충전제 입자에 부착할 수 있도록 한다. 대안으로, 혼합물은 부착이 진행되는 동안 주사기에 유지될 수도 있지만, 이는 세포에 좀더 유해할 수 있다. 혼합물은 하룻밤동안 배양하고, 이후 의사에게 전달될 용기로 이전하거나 개체 투여용 주사기에 이전할 수 있다. 의사에게 전달되는 용기는 전달 동안 얼음에 보관할 수 있다. 이런 소형 입자 무세포 생물분해성 기질이 사용되면, 세포-보유 입자의 부유물은 조직 퇴행이나 결함 부위에 이식되기 보다는 선택적으로 주사될 수 있다.
2가지 세포형(가령, UMC와 섬유아세포)이 생물분해성 무세포 기질을 함유하는 조성물에 포함되는 경우에, 이들 세포는 기질 접종에 앞서 서로 혼합될 수 있다. 대안으로, 이들 세포는 기질에 개별적으로 접종될 수 있다. 한가지 세포형(가령, 섬유아세포)이 다른 세포형(가령, UMC) 전후에 접종되는 경우에, 2차 접종은 1차 접종 직후에 또는 1차 접종의 세포가 기질 물질에 실질적으로 부착된 이후에 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포(가령, UMC와 섬유아세포) 및 기질 성분 모두를 함유하는 조성물을 제조하는 방법을 제시한다. 전형적으로, 이들 방법은 면역원성 단백질(가령, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)이 실질적으로 존재하지 않는 계대배양된 자가조직 세포의 부유물을 제공하고, 생물분해성 무세포 기질을 제공하며, 상기 생물분해성 무세포 기질과 상기 세포 부유물을 함께 배양하여 이들 세포가 기질 내에 통합되도록 하고 조직을 회복시키거나 보강하는 조성물을 형성하는 단계를 포함한다. 이들 방법은 제 1 세포 부유물과 함께 또는 이런 부유물과 별개로, 제 2 세포(가령, 계대배양된 자가조직 섬유아세포) 부유물을 첨가하는 단계 역시 포함할 수 있다.
6. 충전제를 함유하는 조성물
본 발명의 조성물은 한가지이상의 생물분해성 무세포 주사가능 충전제(즉, 물성 개량제)와 함께 세포(가령, 계대배양된 자가조직 UMC)를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 퇴화된 조직을 회복시키기 위한 개체 주사에 적합하다. 충전제는 일반적으로 구조적 역할을 수행한다. 가령, 이는 조직에서 결함, 구멍, 공간 또는 공동을 메울 수 있고, 주사된 세포가 주변 조직에 부착되고 성장하며 새로운 조직의 성장에 기인한 구조적 인자 및 다른 인자(가령, 주화성 인자)를 생산할 수 있는 환경을 제공한다. 많은 경우에, 충전제의 틈새-채움 기능은 일시적이고 이식된 세포 및/또는 호스트 세포가 상기 부위에 이동하여 새로운 조직을 형성할 때까지만 지속된다. 적절하게는, 충전제는 생물분해성이다. 전형적으로, 충전제는 점성 용액 또는 부유물로 제공되고 사용된다. 충전제는 하나이상의 세포형(가령, UMC와 섬유아세포)과 혼합될 수 있다. 세포는 전형적으로 용적당 대략 1:1 비율로 충전제와 혼합되지만, 임의의 적절한 비율을 이용할 수도 있다.
다양한 유형의 생물분해성 무세포 주사가능 충전제를 본 발명의 조성물에 첨가할 수 있다. 충전제는 개체로부터 수득된 임의 유형의 콜라겐을 비롯한 자가조직 단백질로 구성될 수 있다. 이런 충전제의 예는 Collagenesis Corp.(Beverly, MA)에 의해 생산되는 Autologen?이다. Autologen?은 개체로부터 자가조직 피부 콜라겐 섬유의 분산액이고, 따라서 UMC 및 선택적으로 섬유아세포와 함께 개체에 재투여될 때 면역 반응을 유발하지 않는다. Autologen?을 수득하기 위하여, 개체로부터 수득된 조직(가령, 진피, 태반 또는 제대) 시료는 Collagenesis Corp.,에 발송하는데, 여기서 콜라겐-풍부한 분산액으로 가공된다. 대략 1½ 제곱 인치의 피부 조직은 1 입방 센티미터(cc)의 Autologen?을 산출할 수 있다. Autologen?의 농도는 개체 내에서 결함을 교정하거나 조직을 보강하는데 요구되는 함량에 따라 조정될 수 있다. 분산액에서 Autologen?의 농도는 예로써 적어도 25 ㎎/ℓ(가령, 적어도 30 ㎎/ℓ, 적어도 40 ㎎/ℓ, 적어도 50 ㎎/ℓ 또는 적어도 100 ㎎/ℓ)일 수 있다.
무세포 주사가능 충전제 물질은 임의 유형의 콜라겐을 비롯한 비-자가조직 단백질 역시 함유할 수 있다. 다수의 콜라겐 산물이 상업적으로 입수가능하고 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 인간 콜라겐 산물 역시 상업적으로 구입가능하다. 상업적으로 구입가능한 콜라겐에는 글루타르알데하이드와 교차-결합되고, 0.3% 리도카인-함유 인산염 완충액에 부유되는 재구성된 소 콜라겐 섬유를 보유하는 재구성된 소 콜라겐 산물, 예를 들면 Zyderm?과 Zyplast?이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 산물은 McGhan Medical Corporation(Santa Barbara, CA)에 의해 생산된다. 돼지 콜라겐 산물 역시 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에 유용한 콜라겐은 적절한 종의 조직으로부터 분리되거나, 또는 재조합 단백질로서 만들어 질 수 있다. 재조합 단백질은 자연 발생 단백질에서와 동일한 아미노산 서열을 보유하거나, 단백질의 기능을 개선하는 치환, 결실 또는 삽입이 존재하는 아미노산 서열을 보유할 수 있다.
다른 유용한 충전제의 예에는 용해된 젤라틴, 폴리글리콜산(가령, 용해된 폴리글리콜산 또는 폴리글리콜산의 입자) 또는 장선 봉합사가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 가령, 특정 젤라틴 기질 이식물은 Fibril? 상표로 판매되고 있다. 상기 충전제는 동등 부피로 (1) 0.9%(용적당) 염화나트륨 용액에 분산된 돼지 젤라틴 분말과 o-아미노카프로산의 혼합물; (2) 개체로부터 혈장 분량을 함유한다. 충전제로 유용한 다른 물질은 히알루론, 히알루론산, 레스탈린, 파를레안 등이다.
2가지 세포형(가령, UMC와 섬유아세포)이 생물분해성 무세포 충전제를 함유하는 조성물에 포함되는 경우에, 이들 세포는 충전제와의 혼합에 앞서 서로 혼합될 수 있다. 대안으로, 이들은 충전제와 순차적으로 혼합될 수 있다. 한가지 세포형(가령, 섬유아세포)이 다른 세포형(가령, UMC) 전후에 충전제와 혼합되는 경우에, 2차 혼합은 1차 혼합 직후에 또는 적절한 배양 기간이후에 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포(가령, 계대배양된 자가조직 섬유아세포가 존재하거나 존재하지 않는 계대배양된 자가조직 UMC)와 생물분해성 무세포 충전제를 함유하는 조성물을 제조하는 방법을 제시한다. 전형적으로, 이들 방법은 면역원성 단백질(가령, 배양 배지 혈청-유래된 단백질)이 실질적으로 존재하지 않는 세포(가령, 계대배양된 자가조직 UMC 및 선택적으로 섬유아세포)를 제공하고, 한가지이상의 생물분해성 무세포 충전제 물질을 제공하며, 상기 충전제를 상기 세포 부유물과 혼합시키는 단계를 포함한다. 대안으로, 2가지 세포형의 개별 부유물을 충전제와 혼합할 수도 있다.
7. UMC를 함유하고 섬유아세포가 존재하거나 존재하지 않는 조성물을 이용하는 방법
본 발명의 세포 조성물은 예로써 피부, 뼈 또는 연부 조직의 결함을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 세포 조성물은 상기한 이점으로 인하여 아텔로콜라겐(ateocollagen) 용액을 대신하여 사용될 수 있다. 본 발명으로 치료될 수 있는 조직 퇴행을 유발하는 질환, 질병 또는 결함에는 경구 점막의 결함, 경구 점막에 대한 외상(가령, 발치에 기인한 발치 구멍), 상악(maxillary)이나 하악(manibular)골과 같은 구강골(oral bone)에 대한 외상, 치주 질환, 당뇨병, 피부 궤양, 정맥혈 울체 등이 포함된다. 이에 더하여, 조직 퇴행을 유발할 수 있는 치주 질환의 예는 치주 퇴행, 치은염, 또는 구개 점막이나 잇몸 점막의 치유되지 않는 상처 등이다. 본 발명으로 치료될 수 있는 다른 결함에는 제한없이, 흉터, 주름, 눈언저리 주름살, 튼살, 파인 흉터, 비-외상 기원의 피부 함몰, 여드름 흉터 또는 여드름으로 인한 피하 위축, 외상, 기형(congenital malformation) 또는 노화 등이 포함된다. 또한, 본 발명의 조성물은 입술이나 순면 전정부(labial fold)의 형성부전과 같은 결함, 또는 척추골(spinal bone)과 장골(long bone)을 비롯하여 안와, 관골, 두개골, 구개열 골 결함을 비롯한 안면골(facial bone)과 같은 뼈의 결함을 치료하는 데에도 이용될 수 있다.
본 명세서에서 “예방”은 질환 증상의 완전한 예방, 질환 증상의 발생 지연, 또는 후속으로 발생하는 질환 증상의 심각도 감소를 의미한다. “예방”은 질환(가령, 암) 증상이 본질적으로 부재하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 “치료”는 질환 증상의 심각도에서 질환이나 질병 증상의 완전한 소멸을 의미한다.
본 발명의 조성물은 조직 결함(가령, 상기한 결함)을 치료하기 위하여 개체에 투여될 수 있다. 투여는 임의의 적절한 방법, 예를 들면, 주사, 주입 또는 이식으로 수행될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 안면 주름 치료는 아래와 같이 달성할 수 있다. 치료되는 부위는 알코올로 처리하고 잡아당겨 표면을 긴장시킨다. 주사기는 세포 부유물로 채우고, 30 게이지 이상(가령, 22 게이지, 18 게이지, 또는 12 게이지)의 주사용 바늘에 맞춘다. 상기 바늘은 가능한 피부 부위의 표면에 삽입한다; 경사 방향은 중요하지 않다. 방사선 가이던스(radiologic guidance)를 이용할 수 있다. 피내 주사는 약간의 블런치(blanch)가 관찰될 때까지 부드러운 압박으로 진행된다. 복수의 연속 주사를 수행할 수 있다.
다른 구체예에서, 주사액은 입술의 발육장애를 치료하기 위하여 입둘레 근육조직(obicularis musculature)에, 또는 깊은 피하 결함을 치료하기 위하여 피하 조직에 투여될 수 있다.
다른 구체예에서, 넓은 여드름 흉터 부위는 피부 표피박탈(dermal abrasion)로 중간이나 깊은 진피층까지 치료할 수 있다. 이후, 섬유아세포-보유 덩어리는 이런 덩어리의 섬유아세포-접종된 면이 표피박탈된 피부 표면에 병렬되도록 표피박탈된 표면에 덮여지고 도포될 수 있다. 그 다음, 도포된 덩어리는 외과적 드레싱, 예를 들면, Xeroform3, Adaptic3 또는 임의의 비폐쇄성 외과 드레싱으로 덮여진다.
UMC와 섬유아세포가 투여되는 대부분의 경우에, 이들은 단일 조성물 또는 개별 조성물로서 함께 투여된다. 하지만, UMC와 섬유아세포는 별개로 제조되고 별개로 투여될 수 있다. 이들 2가지 세포 개체군이 별개로 투여되는 경우에, 이런 투여는 동시적 또는 순차적(임의 순서)일 수 있다. 순차적인 경우에, 투여는 수분(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 55분) 간격, 수시간(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 18, 22, 또는 23시간) 간격, 수일(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일) 간격, 또는 수주(가령, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 그 이상) 간격으로 진행될 수 있다.
8. 각질세포와 섬유아세포를 함유하는 조성물을 이용하는 방법
각화세포는 표피의 주요 세포 개체군을 구성하고, 손상된 표피 조직의 회복과 재생을 달성하는데 중요한 역할을 수행한다. 본 발명은 각화세포를 함유하고 섬유아세포가 존재하거나 존재하지 않는 세포 부유물을 주사함으로써 조직 결함(가령, 화상 상처)의 강화시키는 방법을 제시한다. 상기한 바와 같이, 상처 치유는 상처의 외부 가장자리로부터 중심부위로 각화세포의 성장에 기인한 흉터를 종종 유발한다. 각화세포(가령, 계대배양된 자가조직 각화세포)를 상처의 중심 부위에 주사함으로써, 치유를 조장하고 흉터를 감소시키거나 차단할 수 있다. 각화세포와 섬유아세포 및/또는 UMC를 함유하는 조성물은 화상(가령, 작은 화상, 또는 큰 화상의 치유되지 않고 남아있는 부분)을 치료하는데 특히 유용하지만, 이들 세포 유형중 한가지만을 함유하는 조성물 역시 사용될 수 있다. 전형적으로 치료되는 화상 상처는 대략 3 내지 5 ㎝ 직경이지만, 임의의 크기 또는 면적을 가질 수 있다. 이런 유형의 치료는 화상과 같은 상처에 의해 손상된 진피를 “채우고” 재건하는 역할을 할 수 있다.
9. 장치
본 발명은 개체에서 피부 결함을 회복시키기 위한 장치를 제시한다. 이런 장치는 주사기 챔버, 주사기 챔버에 배치된 피스톤, 상기 챔버와 소통하는 구멍을 보유하는 피하 주사기를 포함한다. 상기 주사기 챔버는 세포 부유물, 예를 들면, 계대배양된 자가조직 UMC와 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 부유물 또는 본 발명에 개시된 임의의 다른 세포 조성물이나 세포 혼합물을 보유할 수 있다. 세포 부유물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다. 세포는 배양 배지(가령, 혈청-없는 배양 배지) 또는 제약학적으로 수용가능한 담체 용액(가령, 무균수 또는 생리 식염수)에 부유될 수 있다. 이들 장치는 주사기 챔버와 소통하는 구멍에 고정된 피하 주사기를 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기한 장치를 제조하는 방법을 제시한다. 상기 방법은 본 발명에 기술된 임의의 방법을 이용하여 세포 부유물을 제조하고, 이들 세포 부유물을 주사기의 주사기 챔버에 위치시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 아래의 실시예를 더욱 상세하게 기술하지만, 이들 실시예는 특허청구범위에 기술된 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
실시예 1 - 자가조직 UMC와 섬유아세포 세포의 분리
세포는 아래와 같이 정상적인 건강한 인간 지원자로부터 획득된 피부 생검으로부터 수거하고 배양의 개시로 시험관내 농축하였다. 대략 3 내지 5 ㎣의 생검은 이후부(post-auriculum) 부위로부터 획득하고, 섬유아세포 조직 배양은 4500 ㎎/ℓ D-글루코오스, 2 mM L-글루타민, 비-필수 아미노산, 10% FBS를 함유하는 DMEM을 이용하여 상기한 바와 같이 개시하였다. 부착성 섬유아세포가 2회 내지 3회 계대배양이후 완전한 합류에 도달한 이후에 비-부착성 활성 성장 세포의 콜로니가 관찰되었다. 이런 과정은 저혈청에서 배양의 개시 및 5 ng/㎖ aFGF의 존재, 또는 15 내지 30 mM의 최종 농도로 300 mM CaCl2의 첨가에 의한 혈장 덩어리에서 세포의 성장에 의해 단축될 수 있다(실시예 2 참조). 각 콜로니는 상피모양 세포와 유사한 2 내지 80개 세포를 보유하고 활발하게 분화하였다. 이들 콜로니는 유동 콜로니를 함유하는 배양 배지의 흡출과 상기 배지의 원심분리에 의해 수거하였다. 원심분리로 펠렛된 세포는 aFGF와 헤파린을 함유하는 새로운 배양 배지(4500 ㎎/ℓ D-글루코오스, 2 mM L-글루타민, 2.5% 열 불활화된 FBS, 5 ng/㎖ 재조합 인간 aFGF, 5 ㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 DMEM)에 직접 접종함으로써 새로운 조직 배양 용기에 이전되었다. 이들 세포 부유물은 새로운 조직 배양 플라스크에 첨가하고, 이후 37℃에서 배양하였다. 세포는 주 2회 사양하고, 합류 수준에 도달하면(일반적으로 1 내지 2주 이내) 계대배양하거나 차별적으로 트립신처리하였다. 조약돌-유사 세포의 콜로니가 배양 개시이후 대략 3-6주 시점에 관찰되었다. 콜로니의 분리 및 새로운 조직 배양 용기에서 배양은 세포가 부착성을 띠도록 하였다.
비-부착성 세포의 콜로니 역시 아래와 같이 인간 지방 조직으로부터 분리하였다. 조직은 작은 조각으로 절단하고, 모든 가시적 막은 제거하였다. 조직은 4500 ㎎/ℓ D-글루코오스, 2 mM L-글루타민, 2.5% 열 불활화된 FBS, 1 내지 10 ng/㎖ 재조합 인간 aFGF, 5 ㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 DMEM에 위치시켰다. 이들 조건하에, 조약돌-유사 세포가 지방 조직으로부터 활발하게 떨어져 나왔고, 연장된 기간동안 지속적으로 성장하였다. 지방 조직의 조각은 세척하고 새로운 조직 배양 용기에 위치시켰다. 대략 2주 이내에, 37℃에서 대략 5-15분동안 콜라게나제 Ⅳ 처리에 의해 조직으로부터 UMC가 분리되었다. 지방 조직으로부터 새로운 세포는 배양이 종결될 때까지 1년 이상동안 배양액에서 활발하게 성장하였다. 배양액이 완전히 성장하면, 비-부착성 세포의 클러스터가 관찰되었다. 이들 세포가 새로운 조직 배양 플라스크에 재접종되면, 동일 유형의 세포가 활발하게 성장하는 것으로 관찰되었다.
aFGF의 존재하에, 피부와 지방 조직으로부터 배양액에서 세포는 겉보기에 형태적으로 동일하였고, 조약돌-유사 형태로 상피모양 유사 세포와 외형이 닮았다. 하지만, 배양 배지로부터 aFGF의 제거이후, 대부분의 세포가 부착성 섬유아세포로 분화하였다. 조약돌-유사 비-부착성 세포 역시 Marko et al.(supra)에 의해 기술된 방법을 이용하여 골수로부터 개시된 배양액에서 관찰되었다. 이런 이유로, 진피로부터 확립된 섬유아세포 배양액 또는 지방조직이나 골수의 배양액으로부터 수거된 비-부착성 상피모양-유사 세포의 적어도 부집단(subpopulation)은 UMC이라고 결론된다.
실시예 2 - 혈장 덩어리에서 세포의 분리와 성장
본 발명에 기술된 바와 같이 분리된 세포는 혈장 덩어리 겔에서 배양한다. 이런 방법은 다양한 세포형을 분리하고 정제하는데 유용하다. 혈장 덩어리는 피브린 또는 염화칼슘을 응고제로 하여 자가조직 인간 혈장, 소 혈장, 또는 송아지 혈장을 이용하여 제조한다. 혈장 덩어리 겔은 제조하고, 미리-세척하며, 미리-배양하고, 이후 배양 플라스크로부터 직접 이전된 원하는 세포형으로 접종한다. 세포 콜로니는 덩어리 겔로부터 직접 분리한다. 대안으로, 세포는 클로닝 장치 또는 웰 평판 삽입물로 분리하는데, 이런 경우에 세포는 삽입물에 접종되고 성장 인자 전달을 위한 서포트 세포(support cell)(가령, 섬유아세포 또는 다른 원하는 세포형)가 삽입물 아래에 접종된다.
실시예 3 - 섬유아세포 부유물로 화상 상처의 치료
이마 전체에 걸쳐 6개월된 비-치유 화상 상처가 있는 1명의 환자는 페놀 레드-없는 DMEM에 담긴 대략 30 내지 40X106 섬유아세포/㎖의 부유물을 상처 부위에 직접 주사하여 치료하였다. 상처 부위는 2주 간격으로 2회 추가로 주사하였지만, 2회 주사에 의해 상처가 거의 아물었다. 상처는 최소한의 흉터만 남기고 치유되었다. 레이저 화상 상처가 있는 다른 환자들 역시 유사하게 치료되었다. 3회 주사이후, 사용하지 않은 세포는 필요한 경우에 추후 사용을 위하여 액체 질소에 보관하였다. 각화세포 및 섬유아세포를 함유하는 조성물은 섬유아세포 단독을 함유하는 조성물과 비교하여 동등하거나 이보다 더욱 효과적이었다. 게다가, UMC가 섬유아세포로 분활될 수 있다는 점에서, 이들 조성물은 섬유아세포의 투여 여부와 상관없이 섬유아세포만큼 효과적이다.
실시예 4 - 활성화 인자로 UMC 치료의 최적화
UMC 배양액에 첨가되는 활성화 화합물의 최적 농도를 결정하기 위한 시험관내 실험을 실행한다. 기질 또는 단층에 배양된 UMC는 본 발명에 개시된 다양한 농도의 활성화 화합물과 함께 배양한다. 최적 농도는 어떤 농도가 최고 수준의 세포 증식과 연관하는 지를 평가함으로써 결정한다. 대안으로, 최적 농도는 최고 수준의 콜라겐 생산을 유도하는 농도이다. 배양 배지로 분비되는 콜라겐은 면역학적 분석법, 예를 들면, 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA로 측정한다. 섬유아세포와 함께 검사된 활성화 화합물의 최적 농도는 아스코르브산의 경우에 10-5 M, 아스코르빌 팔미테이트의 경우에 10-7 M, L-리포산의 경우에 10-6-10-7이었다.
본 발명이 상세한 설명에 관련하여 구체적으로 기술되었지만, 상기 상세한 설명은 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 다른 측면, 이점, 개변은 첨부된 특허청구범위의 범위에 속한다.

Claims (62)

  1. 조직을 회복하기 위한 조성물에 있어서, 계대배양된 자가조직 UMC와 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유하고, 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 자가조직 섬유아세포는 개체의 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, UMC는 진피 조직, 지방 조직, 연결 조직, 근막, 점막고유층 또는 골수로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, UMC 또는 섬유아세포는 하나이상의 활성화 화합물로 처리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 하나이상의 활성화 화합물은 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, DHEA, DMAE, α-토코페롤, BMP, 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, NADH, 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 다른 성장 인자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, UMC 또는 섬유아세포는 저에너지 레이저 광에 노출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 생물분해성 기질을 추가로 함유하고, UMC와 섬유아세포가 상기 기질 내에서 통합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 생물분해성 무세포 기질은 UMC와 섬유아세포와의 혼합에 앞서, 아래에서 선택되는 하나이상의 물질을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물: 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선, 탈염된 뼈, 수산화인회석, 탈유기질 뼈.
  9. 제 1 항에 있어서, 생물분해성 무세포 주사가능 충전제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 생물분해성 무세포 주사가능 충전제는 UMC와의 혼합에 앞서, 아래에서 선택되는 하나이상의 물질을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물: (a) 자가조직 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액; (b) 콜라겐; (c) 용해된 젤라틴; (d) 용해된 폴리글리콜산; (e) 용해된 장선; (f) 염화나트륨 용액에 분산된 돼지 젤라틴 분말과 아미노 카프로산 및 상기 개체로부터 혈장의 분량;(g) 히알루론산.
  11. 개체에서 조직을 회복시키는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 계대배양된 자가조직 UMC를 함유하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (b) 상기 개체에서 조직 결함이나 조직 퇴행의 부위를 확인하고;
    (c) 상기 조성물을 상기 부위에 위치시켜 상기 조직 결함이나 조직 퇴행을 회복시키고,
    여기서, 상기 조직 결함이나 퇴행은 연부 조직 결함, 경구 점막의 결함, 경구 점막에 대한 외상, 치주 질환, 당뇨병, 피부 궤양, 정맥혈 울체, 피부의 미용적 결함이다.
  12. 제 11 항에 있어서, 연부 조직 결함은 안면 함몰(facial depression), 유방의 발육부전, 유방의 부재, 성대 결함, 연인두 기능부전(velopharyngeal incompetence), 폴랜드 증후군(Poland's syndrome), 음경의 발육장애, 입술의 형성부전, 피하 위축이나 근육 위축에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 구강 점막에 대한 외상은 발치에 기인한 발치 구멍(extraction socket)인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 치주 질환은 치주 퇴행, 치은염, 또는 구개 점막이나 잇몸 점막의 치유되지 않는 상처인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 미용적 결함은 주름, 파인 흉터, 비-외상 기원의 피부 함몰, 눈언저리 주름살, 튼살, 주름살, 상처 흉터, 여드름 흉터, 피하 위축에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11 항에 있어서, 조직 결함은 입술이나 구순 추벽(lip fold)의 형성부전인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 11 항에 있어서, 자가조직 MUC는 개체의 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수 또는 지방 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 11 항에 있어서, 조성물이 생물분해성 기질을 추가로 함유하고, MUC가 상기 기질 내에서 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 11 항에 있어서, 조성물은 생물분해성 무세포 충전제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 개체에서 조직 결함을 회복시키는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 계대배양된 자가조직 UMC와 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 함유하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (b) 상기 개체에서 조직 결함이나 조직 퇴행의 부위를 확인하고;
    (c) 상기 조성물을 상기 부위에 위치시켜 상기 조직 결함이나 조직 퇴행을 회복시킨다.
  21. 개체에서 조직 결함을 회복시키는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법;
    (a) (1) 계대배양된 자가조직 UMC, (2) 계대배양된 자가조직 섬유아세포, (3) 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 제약학적 조성물을 제공하고, 여기서 상기 제약학적 조성물은 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (b) 치과 또는 치주 결함, 피부의 미용적 결함, 뼈 결함에서 선택되는 조직 결함이나 조직 퇴행 부위를 상기 개체에서 확인하고;
    (c) 상기 제약학적 조성물의 치료 효과량을 상기 조직 결함이나 퇴행 부위에 인접하여 주사하고, 여기서 상기 주사는 상기 조직 결함이나 퇴행의 회복을 유도한다.
  22. 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복시키는 방법에 있어서, 제 9 항의 조성물을 개체의 퇴행 부위에 주사하여 조직을 회복시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복시키는 방법에 있어서, 제 7 항의 조성물을 개체의 퇴행 부위에 위치시켜 조직을 회복시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복시키는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 계대배양된 자가조직 UMC를 상기 개체의 조직 퇴행 부위에 주사하고, 여기서 상기 UMC는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (b) 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 상기 개체의 조직 결함이나 원하는 조직 강화 부위에 주사하고, 여기서 상기 섬유아세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (c) 생물분해성 무세포 충전제를 상기 부위에 주사한다.
  25. 조직을 회복하기 위한 세포 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 분화되지 않은 중배엽 세포(UMC)-보유 조직의 생검을 제공하여 출발 세포를 수득하고;
    (b) 상기 생검으로부터 상기 출발 세포를 분리하고;
    (c) 상기 출발 세포를 배양하고;
    (d) 상기 배양액으로부터 비-부착성 유도 세포 개체군을 수거하고, 여기서 상기 비-부착성 유도 세포는 UMC를 포함한다.
  26. 제 25 항에 있어서, 단계 (c)와 (d)를 반복하고 이전 라운드로부터 수거된 비-부착성 유도 세포의 개체군을 출발 세포로 이용하는 1회 이상의 유도체화 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 1회 이상의 추가 라운드의 유도체화는 1 내지 20회 라운드로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, UMC-보유 조직은 피부 조직, 지방 조직, 연결 조직, 근막, 점막고유층, 골수에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 산성 섬유아세포 성장 인자의 존재하에 비-부착성 세포를 배양하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복하기 위한 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 상기 개체로부터 UMC-보유 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 상기 생검으로부터 자가조직 UMC를 분리하고;
    (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 UMC가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 UMC를 배양하고;
    (d) UMC의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가조직 UMC를 노출시키고;
    (e) 상기 개체로부터 섬유아세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
    (f) 상기 생검으로부터 자가조직 섬유아세포를 분리하고;
    (g) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 섬유아세포가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 섬유아세포를 배양하고;
    (h) 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 자가조직 섬유아세포를 노출시키고;
    (i) 상기 UMC 부유물과 상기 섬유아세포 부유물을 혼합한다.
  31. 제 30 항에 있어서, UMC-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 30 항에 있어서, 자가조직 섬유아세포-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 30 항에 있어서, UMC 또는 섬유아세포는 혼합에 앞서, 하나이상의 활성화 화합물에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 하나이상의 활성화 화합물은 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, DHEA, DMAE, α-토코페롤, BMP, 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, NADH, 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 다른 성장 인자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 30 항에 있어서, UMC 또는 섬유아세포는 저에너지 레이저 광에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복하기 위한 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 계대배양된 자가조직 UMC를 제공하고;
    (b) 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 제공하고;
    (c) 생물분해성 무세포 기질을 제공하고;
    (d) 상기 자가조직 UMC, 상기 자가조직 섬유아세포, 상기 생물분해성 무세포 기질을 함께 배양하여, 상기 UMC 또는 섬유아세포를 상기 생물분해성 무세포 기질에 통합시키고,
    여기서, 상기 배양은 조직을 회복시키는 조성물을 산출하고, 상기 배양의 조건은 상기 조성물에서 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않도록 한다.
  37. 제 36 항에 있어서, 계대배양된 자가조직 UMC를 제공하는 과정은 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 상기 개체로부터 UMC-보유 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 상기 생검으로부터 자가조직 UMC를 분리하고;
    (c) 상기 UMC를 배양하고;
    (d) UMC의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 UMC를 노출시킨다.
  38. 제 37 항에 있어서, UMC-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 36 항에 있어서, 생물분해성 무세포 기질은 UMC와 섬유아세포와의 혼합에 앞서, 아래에서 선택되는 하나이상의 물질을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법: 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 젤라틴, 폴리글리콜산, 장선, 탈염된 뼈, 수산화인회석, 산호, 탈유기질 뼈.
  40. 제 36 항에 있어서, 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 제공하는 과정은 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 상기 개체로부터 섬유아세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 상기 생검으로부터 자가조직 섬유아세포를 분리하고;
    (c) 상기 섬유아세포를 배양하고;
    (d) 상기 섬유아세포를 부유시킨다.
  41. 제 40 항에 있어서, 섬유아세포-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 36 항에 있어서, UMC 또는 섬유아세포는 생물분해성 무세포 충전제와 함께 배양에 앞서, 하나이상의 활성화 화합물에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 하나이상의 활성화 화합물은 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, DHEA, DMAE, α-토코페롤, BMP, 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, NADH, 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 다른 성장 인자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 36 항에 있어서, UMC 또는 섬유아세포는 저에너지 레이저 광에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 질환, 질병 또는 결함으로 인하여 개체에서 퇴행된 조직을 회복하기 위한 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 계대배양된 자가조직 UMC를 제공하고, 상기 UMC는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (b) 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 제공하고, 상기 계대배양된 자가조직 섬유아세포는 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않고;
    (c) 생물분해성 무세포 충전제를 제공하고;
    (d) 상기 계대배양된 자가조직 UMC, 상기 계대배양된 자가조직 섬유아세포, 상기 생물분해성 무세포 충전제를 혼합한다.
  46. 제 45 항에 있어서, 계대배양된 자가조직 UMC를 제공하는 과정은 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 상기 개체로부터 UMC-보유 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 상기 생검으로부터 자가조직 UMC를 분리하고;
    (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 UMC가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 UMC를 배양하고;
    (d) UMC의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 섬유아세포를 노출시킨다.
  47. 제 46 항에 있어서, UMC-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 45 항에 있어서, 생물분해성 무세포 충전제는 UMC와 섬유아세포와의 혼합에 앞서, 아래에서 선택되는 하나이상의 물질을 보유하는 것을 특징으로 하는 방법:(a) 자가조직 콜라겐 섬유의 주사가능 분산액;(b) 콜라겐;(c) 용해된 젤라틴;(d) 용해된 폴리글리콜산;(e) 용해된 장선;(f) 염화나트륨 용액에 분산된 돼지 젤라틴 분말과 아미노 카프로산 및 상기 개체로부터 혈장의 분량;(g) 히알루론산.
  49. 제 46 항에 있어서, 계대배양된 자가조직 섬유아세포를 제공하는 과정은 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 상기 개체로부터 섬유아세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 상기 생검으로부터 자가조직 섬유아세포를 분리하고;
    (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 섬유아세포가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 섬유아세포를 배양하고;
    (d) 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 배양된 섬유아세포를 노출시킨다.
  50. 제 49 항에 있어서, 섬유아세포-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 45 항에 있어서, UMC 또는 섬유아세포는 생물분해성 무세포 충전제와의 혼합에 앞서, 하나이상의 활성화 화합물에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 하나이상의 활성화 화합물은 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, DHEA, DMAE, α-토코페롤, BMP, 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, NADH, 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 다른 성장 인자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 45 항에 있어서, UMC 또는 섬유아세포는 저에너지 레이저 광에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 개체에서 화상 상처를 회복시키는 방법에 있어서, 계대배양된 자가조직 각화세포와 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 부유물을 제공하고, 상기 부유물을 상처 부위에 주사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 계대배양된 자가조직 각화세포와 계대배양된 자가조직 섬유아세포의 부유물을 제공하는 과정은 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 상기 개체로부터 각화세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
    (b) 상기 생검으로부터 자가조직 각화세포를 분리하고;
    (c) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 각화세포가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 각화세포를 배양하고;
    (d) 각화세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 각화세포를 노출시키고;
    (e) 상기 개체로부터 섬유아세포-보유 조직의 생검을 제공하고;
    (f) 상기 생검으로부터 자가조직 섬유아세포를 분리하고;
    (g) 배양 배지 혈청-유래된 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 자가조직 섬유아세포가 생산되는 조건하에 상기 자가조직 섬유아세포를 배양하고;
    (h) 섬유아세포의 부유를 유도하는 조건에 상기 섬유아세포를 노출시키고;
    (i) 상기 부유된 각화세포와 부유된 섬유아세포를 혼합한다.
  56. 제 54 항에 있어서, 각화세포-보유 조직은 피부, 구강 점막, 잇몸, 협측 조직, 식도 조직, 외경부 조직, 결막 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 54 항에 있어서, 섬유아세포-보유 조직은 잇몸, 구개, 피부, 점막고유층, 연결 조직, 근막, 골수, 지방 조직에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 54 항에 있어서, 섬유아세포는 각화세포와의 혼합에 앞서, 하나이상의 활성화 화합물에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 하나이상의 활성화 화합물은 아스코르빌 팔미테이트, 리놀레산, 퀸산, 퀸산염, 키닉 락톤, 보조효소 Q-10, L-하이드록시산, L-리포산, 칼슘 모노포스페이트, 칼슘 트리포스페이트, 니아신, DHEA, DMAE, α-토코페롤, BMP, 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드, 글리콜산, 카르복시알킬 에스테르, 에스트리올, 아세틸-L-카르니틴, 데프레닐, 리코펜, NADH, 시스테인, 프로시스테인, 피카밀론, 빈포세틴, 레티노산, 안티네오플라스톤, 다른 성장 인자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 54 항에 있어서, 섬유아세포는 저에너지 레이저 광에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 54 항에 있어서, 부유물은 계대배양된 자가조직 UMC를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 54 항에 있어서, 상처 부위에 강화 화합물을 주사하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020057009147A 2002-11-21 2003-04-07 분화되지 않은 중배엽 세포를 이용한 조직의 치료 KR20050085079A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/301,058 US20040101959A1 (en) 2002-11-21 2002-11-21 Treatment of tissue with undifferentiated mesenchymal cells
US10/301,058 2002-11-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20050085079A true KR20050085079A (ko) 2005-08-29

Family

ID=32229887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057009147A KR20050085079A (ko) 2002-11-21 2003-04-07 분화되지 않은 중배엽 세포를 이용한 조직의 치료

Country Status (13)

Country Link
US (2) US20040101959A1 (ko)
EP (1) EP1421957A1 (ko)
JP (1) JP2006510399A (ko)
KR (1) KR20050085079A (ko)
CN (1) CN1735685A (ko)
AR (1) AR042123A1 (ko)
AU (1) AU2003221693A1 (ko)
BR (1) BR0316468A (ko)
CA (1) CA2506569A1 (ko)
CL (1) CL2003002417A1 (ko)
MX (1) MXPA05005267A (ko)
TW (1) TW200503794A (ko)
WO (1) WO2004048557A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100818636B1 (ko) * 2006-11-10 2008-04-01 재단법인서울대학교산학협력재단 중간엽줄기세포를 포함하는 인공피부 및 그의 제조방법

Families Citing this family (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004023981A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Duke University Methods and compositions for blood pool identification, drug distribution quantification and drug release verification
US7744651B2 (en) * 2002-09-18 2010-06-29 Warsaw Orthopedic, Inc Compositions and methods for treating intervertebral discs with collagen-based materials
US20040054414A1 (en) 2002-09-18 2004-03-18 Trieu Hai H. Collagen-based materials and methods for augmenting intervertebral discs
JP2006515765A (ja) 2002-11-15 2006-06-08 エスディージーアイ・ホールディングス・インコーポレーテッド 滑膜性関節を治療するためのコラーゲンベース材料および方法
US20040186471A1 (en) * 2002-12-07 2004-09-23 Sdgi Holdings, Inc. Method and apparatus for intervertebral disc expansion
FR2861734B1 (fr) 2003-04-10 2006-04-14 Corneal Ind Reticulation de polysaccharides de faible et forte masse moleculaire; preparation d'hydrogels monophasiques injectables; polysaccharides et hydrogels obtenus
FR2872431B1 (fr) * 2004-07-02 2007-07-20 Univ Rene Descartes Paris V Et Utilisation de fibroplastes gingivaux en therapie cellulaire vasculaire
US7389044B2 (en) * 2004-08-11 2008-06-17 Alcatel-Lucent Canada Inc. Method and system for providing a signature signal in an optical network in the event of loss of a client
US20060045872A1 (en) 2004-08-25 2006-03-02 Universidad Autonoma De Madrid Ciudad Universitaria de Cantoblanco Use of adipose tissue-derived stromal stem cells in treating fistula
US20060073208A1 (en) * 2004-10-01 2006-04-06 Allergan, Inc. Cosmetic neurotoxin compositions and methods
FR2890976B1 (fr) * 2005-09-20 2007-12-14 Univ La Reunion Kit pour preparer une composition comprenant des cellules adipocytaires et procede d'obtention de ladite composition
US7989205B2 (en) * 2005-10-06 2011-08-02 American Cryostem Corporation Cell culture media, kits and methods of use
JP5173199B2 (ja) * 2006-01-16 2013-03-27 株式会社アイ・ティー・オー 創傷治癒用高分子組成物
JP5538493B2 (ja) * 2006-01-16 2014-07-02 株式会社アイ・ティー・オー 生体内組織用創傷治癒用フィルム及び生体内接着用フィルム
TR200602727A2 (tr) * 2006-05-31 2007-12-24 Tun� T�Ryak� Kemal Cilt defektleri ve yaşlanması tedavisinde kullanılacak bir yöntem ve bir doku maddesi
KR100788632B1 (ko) * 2006-06-15 2007-12-26 주식회사 알앤엘바이오 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포, 섬유아세포 및지방 또는 지방세포를 함유한 피부미용 또는 성형용조성물의 제조방법
US8118779B2 (en) * 2006-06-30 2012-02-21 Warsaw Orthopedic, Inc. Collagen delivery device
US8399619B2 (en) * 2006-06-30 2013-03-19 Warsaw Orthopedic, Inc. Injectable collagen material
US20080004703A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Warsaw Orthopedic, Inc. Method of treating a patient using a collagen material
WO2008017927A2 (en) * 2006-08-10 2008-02-14 Universite Rene Descartes - Paris V Method for treating skin wounds
KR100725133B1 (ko) * 2006-12-07 2007-06-04 신준호 자가혈청과 태반추출물을 이용한 섬유아세포의 배양방법 및이를 이용한 피부재생용 조성물
US20100303770A1 (en) * 2006-12-28 2010-12-02 John Maslowski Methods for culturing dermal cells for treatment of skin injuries such as burns
WO2008129563A2 (en) * 2007-04-23 2008-10-30 Stempeutics Research Private Limited, Human mesenchymal stem cells and preparation thereof
US20100124782A1 (en) * 2007-04-28 2010-05-20 Applied Cell Biotechnologies, Inc. Composition For Repairing Defect In Skin Or Gingival Soft Tissue And Method Of Culturing Autologous Fibroblasts
BRPI0811784A2 (pt) * 2007-05-23 2011-05-10 Allergan Inc colÁgeno reticulado e uso do mesmo
US8574825B2 (en) * 2007-06-01 2013-11-05 Bacterin International, Inc. Process for demineralization of bone matrix with preservation of natural growth factors
US8318695B2 (en) * 2007-07-30 2012-11-27 Allergan, Inc. Tunably crosslinked polysaccharide compositions
WO2009018546A1 (en) * 2007-08-02 2009-02-05 Medicis Pharmaceutical Corporation Method of applying an injectable filler
US20090204101A1 (en) * 2007-08-20 2009-08-13 Wortzman Mitchell S Method of applying an injectable filler
EP2033689A1 (en) * 2007-08-22 2009-03-11 Italfarmacia S.r.l. Injectable dermatological composition for treatment of the wrinkles
JP5179124B2 (ja) * 2007-09-06 2013-04-10 矢橋工業株式会社 骨再生誘導膜、およびその製造方法
US8697044B2 (en) 2007-10-09 2014-04-15 Allergan, Inc. Crossed-linked hyaluronic acid and collagen and uses thereof
BRPI0819075A2 (pt) 2007-11-16 2014-10-07 Vicept Therapeutics Inc Método para tratar púrpura em um indivíduo e método para diminuir a púrpura em um indivíduo antes de um procedimento cirúrgico
US8394782B2 (en) * 2007-11-30 2013-03-12 Allergan, Inc. Polysaccharide gel formulation having increased longevity
US20090143348A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-04 Ahmet Tezel Polysaccharide gel compositions and methods for sustained delivery of drugs
US8394784B2 (en) * 2007-11-30 2013-03-12 Allergan, Inc. Polysaccharide gel formulation having multi-stage bioactive agent delivery
US20110097421A1 (en) * 2008-03-31 2011-04-28 Bruno Gogly Method for the Cosmetic Treatment of Skin Ageing
US20090291986A1 (en) * 2008-05-22 2009-11-26 Apostolos Pappas Composition and method of treating facial skin defect
US8357795B2 (en) 2008-08-04 2013-01-22 Allergan, Inc. Hyaluronic acid-based gels including lidocaine
EP2331153A4 (en) * 2008-08-25 2014-01-15 Laser Abrasive Technologies Llc METHOD AND DEVICE FOR REGENERATING ORAL CAVITY TISSUE
AU2009288118B2 (en) 2008-09-02 2014-12-11 Allergan, Inc. Threads of hyaluronic acid and/or derivatives thereof, methods of making thereof and uses thereof
US20100069893A1 (en) * 2008-09-17 2010-03-18 Kun Yuan Tong Technique to enhance voice with Laser beam
WO2010047793A2 (en) 2008-10-21 2010-04-29 The General Hospital Corporation Cell transplantation
KR101101321B1 (ko) * 2008-11-03 2012-01-02 주식회사 엠씨티티 상처 치유를 위한 하이드로 겔 형태의 세포전달용 비히클 및 그 제조방법
TW201103572A (en) * 2009-05-04 2011-02-01 Neostem Inc Method and composition for restoration of age-related tissue loss in the face or selected areas of the body
JP2011015865A (ja) * 2009-07-10 2011-01-27 Nagoya Institute Of Technology 骨欠損部充填材料およびその製造方法
US8853298B2 (en) 2009-07-10 2014-10-07 Nagoya Institute Of Technology Fiber wadding for filling bone defects
JP5594815B2 (ja) * 2009-09-10 2014-09-24 国立大学法人 名古屋工業大学 骨再生誘導膜およびその製造方法
WO2011059733A2 (en) * 2009-10-29 2011-05-19 The General Hospital Corporation D/B/A Massachusetts General Hospital Use of lipoic acid in cell transplantation
US9114188B2 (en) 2010-01-13 2015-08-25 Allergan, Industrie, S.A.S. Stable hydrogel compositions including additives
US20110172180A1 (en) 2010-01-13 2011-07-14 Allergan Industrie. Sas Heat stable hyaluronic acid compositions for dermatological use
US20110171286A1 (en) * 2010-01-13 2011-07-14 Allergan, Inc. Hyaluronic acid compositions for dermatological use
US20110171311A1 (en) * 2010-01-13 2011-07-14 Allergan Industrie, Sas Stable hydrogel compositions including additives
WO2011110894A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 Allergan Industrie Sas Fluid composition for improving skin conditions
PL3078388T3 (pl) * 2010-03-22 2019-08-30 Allergan, Inc. Usieciowane hydrożele do powiększania tkanek miękkich
US8529883B2 (en) 2010-05-07 2013-09-10 Fibrocell Technologies, Inc. Dosage unit formulations of autologous dermal fibroblasts
US10184110B2 (en) 2010-08-06 2019-01-22 The General Hospital Corporation System and apparatus for cell treatment
US8697057B2 (en) 2010-08-19 2014-04-15 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US9005605B2 (en) 2010-08-19 2015-04-14 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8883139B2 (en) 2010-08-19 2014-11-11 Allergan Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8889123B2 (en) 2010-08-19 2014-11-18 Allergan, Inc. Compositions and soft tissue replacement methods
US8895291B2 (en) 2010-10-08 2014-11-25 Terumo Bct, Inc. Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions
RU2013142169A (ru) * 2011-03-01 2015-04-10 Мерц Фарма ГмбХ и Ко. КГаА Композиция, содержащая активируемый пролифераторами пероксисом гамма-рецептор
US9393263B2 (en) 2011-06-03 2016-07-19 Allergan, Inc. Dermal filler compositions including antioxidants
KR102015676B1 (ko) 2011-06-03 2019-10-21 알러간, 인코포레이티드 항산화제를 포함하는 피부 충전제 조성물
US9408797B2 (en) 2011-06-03 2016-08-09 Allergan, Inc. Dermal filler compositions for fine line treatment
US20130096081A1 (en) 2011-06-03 2013-04-18 Allergan, Inc. Dermal filler compositions
JP2011207910A (ja) * 2011-07-07 2011-10-20 Oriza Yuka Kk 美容用組成物
US20130244943A1 (en) 2011-09-06 2013-09-19 Allergan, Inc. Hyaluronic acid-collagen matrices for dermal filling and volumizing applications
US9662422B2 (en) 2011-09-06 2017-05-30 Allergan, Inc. Crosslinked hyaluronic acid-collagen gels for improving tissue graft viability and soft tissue augmentation
EP3041929B1 (en) * 2013-09-05 2019-03-13 The Regents of The University of California Adipose-derived mesenchymal stem cells for oral stomatitis treatment
CN105992816B (zh) 2013-11-16 2018-04-17 泰尔茂比司特公司 生物反应器中的细胞扩增
US9694033B2 (en) 2014-01-24 2017-07-04 The Cleveland Clinic Foundation IL-9 secreting CD8+ Tc9 cells and methods of treating cancer
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
JP6830059B2 (ja) 2014-09-26 2021-02-17 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド スケジュール化された細胞フィーディング
WO2016051219A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Allergan Industrie, Sas Stable hydrogel compositions including additives
WO2016128783A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Allergan Industrie Sas Compositions and methods for improving skin appearance
EP3090764A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-09 Université Catholique De Louvain Compositions comprising mesenchymal stem cells and uses thereof
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
GB201604304D0 (en) 2016-03-14 2016-04-27 Tigenix S A U Adipose tissue-derived stromal stem cells for use in treating refractory complex perianal fistulas in crohn's disease
WO2017205667A1 (en) 2016-05-25 2017-11-30 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
CN107041894A (zh) * 2016-12-26 2017-08-15 湖南新起源医疗技术有限公司 一种用于抗衰老的干细胞嫩肤液制备方法
CN106801035A (zh) * 2017-01-24 2017-06-06 中国医学科学院基础医学研究所 一种人脂肪来源间充质干细胞的预处理方法
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
CN117247899A (zh) 2017-03-31 2023-12-19 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
EP4031167A4 (en) 2019-09-16 2023-07-19 Figene, LLC TREATMENT OF DEGENERATIVE DISC DISEASE AND STIMULATION OF PROTEOGLYCAN SYNTHESIS BY CONDITIONED MEDIUM OF FIBROBLASTS AND THEIR FORMULATIONS
CN111821512B (zh) * 2020-06-19 2022-06-14 上海大学 酶响应释药聚l-谷氨酸/壳聚糖多孔复合微载体、其制备方法及其应用
JP2023047559A (ja) * 2021-09-27 2023-04-06 国立大学法人 東京大学 細胞培養用ゲル、細胞入り細胞培養用ゲルの製造方法、細胞の製造方法、該細胞の製造方法により製造された三次元筋組織及び培養肉
US11879010B2 (en) 2021-09-30 2024-01-23 The Charlotte Mecklenburg Hospital Authority Methods and compositions for pretargeted immunotherapy

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5197985A (en) * 1990-11-16 1993-03-30 Caplan Arnold I Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells
US5733542A (en) * 1990-11-16 1998-03-31 Haynesworth; Stephen E. Enhancing bone marrow engraftment using MSCS
US5226914A (en) * 1990-11-16 1993-07-13 Caplan Arnold I Method for treating connective tissue disorders
US5486359A (en) * 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US5811094A (en) * 1990-11-16 1998-09-22 Osiris Therapeutics, Inc. Connective tissue regeneration using human mesenchymal stem cell preparations
US5591625A (en) * 1993-11-24 1997-01-07 Case Western Reserve University Transduced mesenchymal stem cells
DE69531638T2 (de) * 1994-06-06 2004-06-17 Osiris Therapeutics, Inc. Biomatrix für geweberegenaration
US5736396A (en) * 1995-01-24 1998-04-07 Case Western Reserve University Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation
US5591444A (en) * 1995-07-28 1997-01-07 Isolagen Technologies, Inc. Use of autologous dermal fibroblasts for the repair of skin and soft tissue defects
US5885829A (en) * 1996-05-28 1999-03-23 The Regents Of The University Of Michigan Engineering oral tissues
US6443974B1 (en) * 1996-07-28 2002-09-03 Biosense, Inc. Electromagnetic cardiac biostimulation
US6261549B1 (en) * 1997-07-03 2001-07-17 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
US20020016002A1 (en) * 2000-01-24 2002-02-07 Jean Toma Multipotent neural stem cells from peripheral tissues and uses thereof
US20020123143A1 (en) * 1997-08-22 2002-09-05 Jean Toma Multipotent stem cells from peripheral tissues and uses thereof
US6368636B1 (en) * 1998-03-18 2002-04-09 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
US6432710B1 (en) * 1998-05-22 2002-08-13 Isolagen Technologies, Inc. Compositions for regenerating tissue that has deteriorated, and methods for using such compositions
US6184035B1 (en) * 1998-11-18 2001-02-06 California Institute Of Technology Methods for isolation and activation of, and control of differentiation from, skeletal muscle stem or progenitor cells

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100818636B1 (ko) * 2006-11-10 2008-04-01 재단법인서울대학교산학협력재단 중간엽줄기세포를 포함하는 인공피부 및 그의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20040101959A1 (en) 2004-05-27
AR042123A1 (es) 2005-06-08
CA2506569A1 (en) 2004-06-10
AU2003221693A1 (en) 2004-06-18
CL2003002417A1 (es) 2004-08-27
WO2004048557A1 (en) 2004-06-10
TW200503794A (en) 2005-02-01
JP2006510399A (ja) 2006-03-30
MXPA05005267A (es) 2005-10-19
CN1735685A (zh) 2006-02-15
US20060182725A1 (en) 2006-08-17
BR0316468A (pt) 2005-10-11
EP1421957A1 (en) 2004-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20050085079A (ko) 분화되지 않은 중배엽 세포를 이용한 조직의 치료
Yamada et al. Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold
AU731827B2 (en) Production of cartilage tissue using cells isolated from Wharton's jelly
US6482231B1 (en) Biological material for the repair of connective tissue defects comprising mesenchymal stem cells and hyaluronic acid derivative
US7767452B2 (en) Tissue treatments with adipocyte cells
US7412978B1 (en) Augmentation and repair of vocal cord tissue defects
US20080274185A1 (en) Shape and Dimension Maintenance of Soft Tissue Grafts by Stem Cells
US20070178074A1 (en) Chondrocyte Culture Formulations
US20040013652A1 (en) Treatments with autologous fibroblast
US7186557B2 (en) Methods of producing neurons
CA2281758C (en) Repair of autologous tissue defects
JP3680067B2 (ja) 移植用軟骨細胞の製法
KR101277970B1 (ko) 연골질환 치료용 조성물, 인공연골 및 이들의 제조방법
AU2005202256B2 (en) Augmentation and repair of age-related soft tissue defects
MXPA05013486A (es) Metodos para producir neuronas.
AU2008202954A1 (en) Augmentation and repair of age-related soft tissue defects

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid