KR101101321B1 - 상처 치유를 위한 하이드로 겔 형태의 세포전달용 비히클 및 그 제조방법 - Google Patents

상처 치유를 위한 하이드로 겔 형태의 세포전달용 비히클 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상처 치유를 위한 하이드로 겔 형태의 세포전달용 비히클 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로 , 더욱 상세하게는 수성매질에 비이온성 계면활성제 및 P 물질, 인체유래 세포 등이 분산된 하이드로겔 형태의 세포전달용 비히클 조성물, 이의 상처 치유를 위한 용도 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 하이드로겔 형태의 조성물은 상처부위에 세포 및/또는 P물질을 적절히 전달해 주며, 습윤효과 및 상처의 수축(contraction)을 막아 주는 효과 및 세포를 보호하는 효과가 있으며, 사용이 쉽고 편리하다는 장점을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 조성물을 신체 일부의 손상 시 도포 혹은 주사함으로써 조성물내의 세포가 손상부위로 전달되어 상처를 효과적으로 치유할 수 있다.

Description

상처 치유를 위한 하이드로 겔 형태의 세포전달용 비히클 및 그 제조방법{cell delivery vehicle composition having a hydrogel form for healing wounds}
본 발명은 상처 치유를 위한 하이드로 겔 형태의 세포전달용 비히클 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로 , 더욱 상세하게는 수성매질에 비이온성 계면활성제 및 P 물질, 인체유래 세포 등이 분산된 하이드로겔 형태의 세포전달용 비히클 조성물, 이의 상처 치유를 위한 용도 및 그 제조방법에 관한 것이다.
신체조직의 손상 시 조직재건에 관한 연구는 오랜 시간 동안 여러 사람들에 의해서 진행되어왔다. 약물에 의한 조직재건과, 세포를 이용한 조직재건 등이 그것이다. 하지만 이들의 약물 및 세포를 어떻게 손상된 조직에 어떠한 조성으로 어떻게 전달하느냐 하는 것도 중요한 문제 중 하나이다. 이러한 약물과 세포를 전달하는 방법으로는, 간단하게는 용액상태로 사용하기도 하고 더 나아가서 콜라겐과 같은 생체재료를 이용한 시트, 스펀지 및 부직포 형태를 이용 하거나, 피브린 점착제를 이용하기도 한다.
P 물질(substance-p)은 11개 아미노산으로 이루어진 뉴로 펩티드이며, 몇몇 의 세포 및 육아조직에서 발현되는 것으로 보고되고 있다. 몇몇의 연구에서는 각막 조직 손상에서 P 물질이 각막 재건에 도움을 주는 것으로 보고되고 있다. 이는, 단순 용액 상태로 사용한 것으로 조직 손상부위에 오래 머무르지 못하는 단점이 있다.
세포를 이용한 조직재건은 현재 몇 가지 다양한 형태로 이용되고 있다. 시트 형태는 피부, 연골, 심혈관계 등 세포를 시트(sheet) 형태로 배양하여 손상부위에 적용하는 것으로, 배양 접시에서 시트 형태로 떼어내기 때문에 효소(enzyme)에 의한 세포 손상으로 세포의 분열능력에 지장을 줄 수 있다는 단점이 지적되고 있다. 이런 문제점이 대두되면서 시술이 용이하고 이식하기 힘든 부위에도 쉽게 생착 할 수 있는 세포 현탁액(suspension) 형태가 주목받고 있다. 하지만, 세포 현탁액 또한 조직 손상부위에 머무르지 못하고 흐르는 문제가 있어, 피브린(fibrin)과 같은 생체 점착제와 같이 사용해야 한다. 따라서 세포를 손상된 조직에 생착을 방해 하지 않으면서 안정적으로 적용할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
비 이온 계면활성제는 물에 녹아도 이온화되지 않지만 습윤성이 풍부하고 자극이 적어 화장수의 가용화제, 크림의 유화제 및 클렌징크림의 세정제 등의 용도로 사용되어 왔다. 또한, 일부 비 이온 계명활성제는 의료용 부용제 등으로 사용되고 있다. 비이온 계면활성제는 세포에 대한 독성이 적고 물성이 우수함에도 불구하고, 세포의 부착 능력을 저해한다는 인식이 있어서 세포치료제의 비히클로는 사용될 수 없는 것으로 생각되어왔다.
비 이온 계면활성제의 친유기와 친수기의 정도의 차이에 따라 용해도, 습윤 력, 침투력, 유화력 및 가용화력 등의 성질이 달라질 수 있다. 이러한 특성을 이용하여 비 이온 계면활성제의 종류, 농도조절 및 적절한 생체재료를 가미함으로서 약물 및 세포의 종류와 손상된 조직의 위치에 따라서 적절한 조성을 만들기에 용이하다.
종래기술로서 중배엽 줄기세포 및/또는 P 물질를 포함하는 상처 치유용 조성물이 공개되었다 (한국 특허공개 10-2006-0037176). 그러나, 상기 특허는 단순 한 물질 혹은 두 물질을 혼합한 경우 상처부위에서 쉽게 이탈하여 그 효과를 보기 어려우며, 사용하기에도 불편하였다. 따라서, 그것들을 상처부위에 적절하게 전달(delivery)할 방법이 필요하다.
본 발명자들은 세포를 효과적으로 전달할 방법에 관해 연구하다가, 산업전반에 사용하고 있지만 세포치료 등에는 사용되지 못하던 비 이온 계면활성제를 이용하여 하이드로 겔 형태의 조성물을 제조하여 시험한 결과, 이것이 세포 전달에 적합하다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 상처를 입힌 마우스에서 P물질이 포함된 하이드로 겔이 사용이 용이하며, 하이드로 겔을 처리하지 않은 마우스에 비하여 상처치유가 빨리 이루어지는 것을 발견했고, 상처를 입힌 마우스에서 중배엽 줄기세포가 포함된 하이드로 겔이 하이드로 겔을 처리하지 않은 마우스에 비하여 상처치유가 빨리 이루어지는 것을 발견했으며, 상처를 입힌 마우스에서 피부세포가 포함된 하이드로 겔이 하이드로 겔을 처리하지 않은 마우스에 비하여 상처치유가 빨리 이루어지는 것을 발견했다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 비이온성 계면활성제를 이용한 하이드로 겔 형태의 세포 전달용 비히클 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 비이온성 계면활성제외에 P물질 또는 세포 등을 포함한 상처치료를 위한 하이드로 겔 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 조성물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 수성 매질에 비이온성 계면활성제가 분산되어 이루어진 하이드로겔 형태를 갖는 세포 전달(delivery)용 비히클 조성물을 제공한다.
일반적으로, 하이드로겔은 친수성 고분자가 공유또는 비공유 결합으로 가교되어져 만들어진 3차원 망상구조물을 말한다. 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액내 및 수성환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 본 발명에서, 하이드로겔은 수성 매질에 친수성 고분자의 일종인 비이온성 계면활성제가 분산되어 만들어진다.
본 발명에서, 세포 전달(delivery)이란 상처치유등의 목적으로 조성물내의 세포를 적용 부위인 피부등의 인체로 전달하는 것을 의미하며, 이때 상기 조성물이 세포를 담는 비히클 또는 담체로서의 역할을 한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 수성 매질(aqueous medium)은 인체에 유해하지 않으며 친수성을 갖는 비이온성 계면활성제가 분산될 수 있는 어떤 수성 매질도 가능하나, 바람직하게는 생리식염수, 인산완충용액(PBS), 및 세포배양배지로 이루러진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 전하를 띠는 부분은 없으나 하이드록시기나 에틸렌옥사이드기에 의한 물과의 수소결합에 의해 친수성을 갖게 된다. 비이온성 계면활성제로는 예를 들어 고급 알코올, 알킬페놀의 에틸렌옥사이드 부가물인 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol) 유도체, 또는 글리세린(glycerine), 펜타에리트리톨(pentaerytritol), 솔비톨(sorbitol), 설탕(saccharose) 등의 폴리하이드록시(polyhydroxy) 화합물의 부분에스테르류인 다가알콜(polyol) 유도체 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 축합형, 예컨대 지방산폴리에틸렌글리콜 축합물 (Niosol, Myrj), 지방산아마이드폴리에틸렌글리콜 축합물, 지방족알콜폴리에틸렌글리콜 축합물 (Leonil, Peregal C), 지방족아민폴리에틸렌글리콜 축합물, 지방족메르캅탄폴리에틸렌글리콜 축합물 (Nyon 218), 알킬페놀폴리에틸렌글리콜 축합물 (Igepal) 및 폴리프로필렌글리콜폴리에틸렌글리콜 축합물 (Pluronics) 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하며, 가장 바람직하게는 폴리프로필렌글리콜폴리에틸렌글리콜 축합물인 폴록사머(Poloxamer, Pluronic)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 비이온성 계면활성제의 탄화수소의 사슬길이는 5,000-20,000 분자량(MW), EO의 부가몰 수는 50-80wt%인 것이 바람직하다. 탄화수소의 사슬길이가 너무 짧으면 충분한 망상구조가 잘 형성되지 않으며 너무 길면 수성 매질에 잘 분산되지 않는다. EO의 부가몰 수가 너무 많으면 겔 형성이 안 되고 너무 적으면 친수성이 감소된다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 수성매질에 대하여 15-50%의 중량비로 혼합되어 분산되는 것을 특징으로 한다. 상기 비이온성 계면활성제의 중량비(농도)가 너무 낮으면 하이드로 겔 형성이 잘 안되고 너무 높으면 수성매질에 잘 용해되지 않는다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 하이드로겔은 상처치유를 돕는 bFGF, EGF, 및 GMCSF로 이루어진 군에서 선택된 성장인자 또는 물질-P (Substance-P)를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 성장인자 또는 물질-P는 본 발명의 조성물에서 상피세포의 이동과 섬유아세포의 증식을 촉진하는 역할을 한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 하이드로겔은 상처치유를 돕는 콜라겐(Collagen), 히알루론산(Hyaluronic acid), 글루코스아미노글리칸(Glycosaminoglycanes), 파이브로넥틴(Fibronectin) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 세포 간물질(ECM)을 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 세포 간물질은 본 발명의 조성물에서 세포의 부착 능을 증가시켜 상처치유를 촉진시키는 역할을 한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 하이드로겔은 상처치유를 돕는 카르복시메틸 셀룰로우즈(Carboxymethyl cellulose), 알긴산(Alginate), 키토산(Chitosan), 폴리 카프로락톤(Poly(e-caprolactone)), 폴리 락틱엑시드(Poly(lactic acid)), 폴 리 글리콜릭 엑시드(Poly(glycolic acid)), 히드록시아파타이트(Hydroxyapatite), 트리칼슘 포스페이트(Tricalcium phosphate) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 생체재료(Biomaterials)를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 생체재료는 본 발명의 조성물에서 하이드로 겔의 물성 향상 및 생체적합성을 향상시키는 역할을 한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 하이드로겔은 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 조성물에 포함된 세포는 인체의 적용부위에 전달되어 상처 치유등에 사용된다. 상기 세포의 예로는 피부각질세포, 섬유아세포, 색소세포, 중배엽 줄기세포, 간엽줄기세포, 조혈모세포, 골수세포, 신경세포, 상피세포 또는 이들의 혼합물 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 세포 전달은 상처 치유를 위한 것을 특징으로 한다. 본 발명에서, 상처 치유란 피부 세포의 손상으로 인한 상처를 치료나 완화하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 의하여 전달된 세포가 상처부위의 손상된 세포를 대체하거나 보충하여 상처를 치유하게 된다.
본 발명의 조성물은 하이드로겔의 형태로 제제화되어 상처 부위에 직접 도포하거나 주사기 등에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 상처 치유 등을 위해 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학 적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 질병의 중증도, 연령, 성별, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 예컨대, 성인기준으로 1회 1mg 내지 1000mg의 본 발명의 조성물을 투여할 수 있다. 세포기준으로는 예컨대 1회 3×104 내지 3×107 세포/㎏의 MSC를 투여할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는, 본 발명의 조성물이 상처부위에 세포 및/또는 P물질을 적절히 전달해 주며, 습윤효과 및 상처의 수축(contraction)을 막아 주는 효과(도 3, 5) 및 세포를 보호하는 효과(도 7)가 있음을 증명하였다. 또한 본 발명의 조성물은 사용이 쉽고 편리하다는 장점을 가지고 있다. 또한, 본 발명의 조성물에서 비 이온 계면활성제에 콜라겐과 같은 생체재료를 혼합하면 더 큰 시너지를 일으킬 수 있다는 것은 쉽게 생각할 수 있을 것이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 하이드로 겔의 조성은 세포 및/또는 P물질, 생리식염수 또는 세포 배양배지, 비 이온 계면활성제 그리고 생체재료를 혼합하여 제조될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1
50㎕의 생리식염수에 12pmole의 Substance-p 및 100㎎의 Pluronic F127 (BASF사)을 혼합하여 하이드로 겔을 제조한다. Balb/c 누드마우스 (수컷, 5주령)의 등에 지름 8mm의 상처를 만들고 준비한 하이드로 겔을 적용 한다. 대조군으로는 생리식염수를 적용하였다. 7일째에 마우스 등의 상처를 육안으로 비교하였다. 도 2는 Substance-p를 포함한 하이드로 겔 적용 7일 후 육안관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b) 육안관찰 결과 실험군의 경우 대조군에 비하여 습윤효과 및 상처의 수축 억제효과가 있었으며, 상처 치유가 촉진됨을 알 수 있다.
또한, 각각 10㎖ 생리식염수에 2g, 2.5g 및 3g의 Pluronic F127를 용해하여 20%, 25% 및 30%의 하이드로 겔을 제조하였다. 이 하이드로 겔을 레오미터(CVO, BOHLIN Instruments)를 이용하여 온도(15 -30℃)에 따른 점도 변화를 관찰하였다. 도 1은 20%, 25% 및 30%의 농도에서 Pluronic F127의 온도(15 -30℃)에 따른 점도 변화를 나타낸 결과이다. 비이온 계면활성제 농도에 따라 하이드로겔의 특성이 변화함을 알 수 있다. 온도에 따라 점도를 변화시킬 수 있는 농도가 조직재생을 위해 생체에 주입하는 경우에 더 유리하나, 생체 외부에 도포하거나 부착하는 경우에는 온도에 따른 점도 변화에 상관이 없다.
실시예 2
50㎕의 중배엽 줄기세포(MSC: mesenchymal stem cells) 배양배지(MSCGM)에 1x106 개의 중배엽 줄기세포 및 100㎎의 Pluronic F127을 혼합하여 하이드로 겔을 제조한다. Balb/c 누드마우스 (수컷, 5주령)의 등에 지름 8mm의 상처를 만들고 준비한 하이드로 겔 50㎕를 적용 한다. 대조군으로는 생리식염수를 적용하였다. 적용 후 6일째에 다시 동일한 조성의 하이드로 겔을 적용하고 초기 적용 후 14일째에 마우스 등의 상처를 육안으로 비교하고 조직학적관찰을 시행한다. 도 3은 중배엽 줄기세포를 포함한 하이드로 겔 적용 14일 후 육안관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b). 도 4는 중배엽 줄기세포를 포함한 하이드로 겔 적용 14일 후 조직학적 관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b). 육안관찰 결과 실험군의 경우 대조군에 비하여 습윤효과 및 상처의 수축 억제 효과가 있었으며, 상처치유가 촉진됨을 알 수 있다. 또한, 조직학적 관찰결과 표피층과 진피층의 형성이 실험군에서 더 잘 되었음을 알 수 있다.
실시예 3
50㎕의 피부세포 배양배지(DMEM)에 5x105 개의 피부세포(섬유아세포, 각질세포 및 색소세포) 및 100㎎의 Pluronic F127을 혼합하여 하이드로 겔을 제조한다. Balb/c 누드마우스 (수컷, 5주령)의 등에 지름 8mm의 상처를 만들고 준비한 하이드로 겔 50㎕를 적용 한다. 7일째에 마우스 등의 상처를 육안으로 비교하고 조직학적 관찰을 시행한다. 도 5는 피부세포를 포함한 하이드로 겔 적용 7일 후 육안관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b). 도 6은 피부세포를 포함한 하이드로 겔 적용 7일 후 조직학적 관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b). 육안관찰 결과 실험군의 경우 대조군에 비하여 습윤효과 및 상처의 수축 억제 효과가 있었으며, 상처치유가 촉진됨을 알 수 있다. 또한, 조직학적 관찰결과 표피층과 진피층의 형성이 실험군에서 더 잘 되었음을 알 수 있다.
실시예 4
96well plate에 2×104개의 피부세포(섬유아세포, 각질세포 및 색소세포)를 접종하고, 37℃ 인큐베이터에서 16시간 배양한다. 배지를 제거하고, 각각의 well당 하이드로 겔을 농도별로 피부세포 배양배지에 희석하여 넣고, 음성 대조군으로 100㎕ 2.5mM EDTA를 넣어 준다. 4℃에서 16시간동안 반응시키고, 제거한다. MTT 용액과 세포배양 배지를 1:9로 섞어서 37℃에서?4시간 동안 반응시키고, PBS로 세척한 후, DMSO와 에탄올을 1:1로 섞은 용액에서 20분간 교반하여 540nm에서 OD 값을 측정한다. 도 7은 하이드로 겔의 피부세포 안정성 실험결과 그래프이다. 4℃ 에서의 세포안정성은 하이드로 겔을 첨가함으로서 대조군(DMEM)보다 증가하였으며, 특히 20, 25% 첨가 시 대조군에 비하여 세포안정성이 약 1.5배 증가 하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 하이드로겔 형태의 조성물은 상처부위에 세포 및/또는 P물질을 적절히 전달해 주며, 습윤효과 및 상처의 수축(contraction)을 막아 주는 효과(도 3, 5) 및 세포를 보호하는 효과(도 7)가 있으며, 사용이 쉽고 편리하다는 장점을 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 조성물을 신체 일부의 손상 시 도포 혹은 주사함으로써 조성물내의 세포가 손상부위로 전달되어 상처를 효과적으로 치유할 수 있다.
도 1은 20%, 25% 및 30%의 농도에서 Pluronic F127의 온도(15 -30℃)에 따른 점도 변화를 나타낸 결과이다.
도 2는 Substance-p를 포함한 하이드로 겔 적용 7일 후 육안관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b).
도 3은 중배엽 줄기세포를 포함한 하이드로 겔 적용 14일 후 육안관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b).
도 4는 중배엽 줄기세포를 포함한 하이드로 겔 적용 14일 후 조직학적 관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b).
도 5는 피부세포를 포함한 하이드로 겔 적용 7일 후 육안관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b).
도 6은 피부세포를 포함한 하이드로 겔 적용 7일 후 조직학적 관찰 결과이다. 대조군 (a), 실험군(b).
도 7은 하이드로 겔의 피부세포 안정성 실험결과 그래프이다.

Claims (11)

  1. 생리식염수, 인산완충용액(PBS), 및 세포배양배지로 이루어진 군으로부터 선택된 수성 매질에 겔란트(gellant)없이 비이온성 계면활성제인 폴리프로필렌글리콜폴리에틸렌글리콜 축합물이 15~50%의 중량비로 혼합되어 분산되어 구성된 하이드로겔 형태를 갖는 세포 전달(delivery)용 비히클 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제인 폴리프로필렌글리콜폴리에틸렌글리콜 축합물은 폴록사머(Poloxamer)인 것을 특징으로 하는 세포 전달용 비히클 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 상처치유를 돕는 염기성섬유아세포성장인자(bFGF: basic Fibroblast Growth Factor), 표피성장인자(EGF: Epidermal Growth Factor), 및 과립구대식세포집락자극이자(GMCSF: Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor)로 이루어진 군에서 선택된 성장인자 또는 물질-P (Substance-P)를 더 포함하는 것을 특징으로 세포 전달용 비히클 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 상처치유를 돕는 콜라겐(Collagen), 히알루론산(Hyaluronic acid), 글루코스아미노글리칸(Glycosaminoglycanes), 파이브로넥틴(Fibronectin) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 세포 간물질(ECM)을 더 포함하는 것을 특징으로 세포 전달용 비히클 조성물.
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서, 상기 하이드로겔은 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 전달용 비히클 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 피부각질세포, 섬유아세포, 색소세포, 중배엽 줄기세포, 간엽줄기세포, 조혈모세포, 골수세포, 신경세포, 상피세포 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 세포 전달용 비히클 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 세포 전달은 상처 치유를 위한 것을 특징으로 하는 세포 전달용 비히클 조성물.
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CN2009801434363A CN102307596A (zh) 2008-11-03 2009-11-03 伤口愈合用水凝胶细胞传送载体及其制备方法
US13/127,165 US20110256089A1 (en) 2008-11-03 2009-11-03 Hydrogel Type Cell Delivery Vehicle for Wound Healing, and Preparation Method Thereof
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015105249A1 (ko) 2014-01-10 2015-07-16 (주)안트로젠 피부 재생 또는 상처 치유를 위한 중간엽 줄기세포-하이드로겔-생분해성또는중간엽 줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체 조성물
WO2018097527A1 (ko) * 2016-11-25 2018-05-31 아주대학교산학협력단 액상 플라즈마를 포함하는 피부미백 또는 상처치료용 조성물
KR20180059341A (ko) * 2016-11-25 2018-06-04 아주대학교산학협력단 액상 플라즈마를 포함하는 상처 치료용 조성물
WO2019099860A3 (en) * 2017-11-17 2019-06-27 Medline Industries, Inc. Wound treatment containing collagen and a gelatin-reducing agent, and method for promoting wound healing
US11246885B2 (en) 2017-08-31 2022-02-15 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Keloid prevention or treatment method using liquid phase plasma
US11510853B2 (en) 2017-09-18 2022-11-29 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Composition for skin soothing containing liquid-phase plasma
US11759407B2 (en) 2016-11-25 2023-09-19 Ajou Univ. Industry-Academic Cooperation Found. Composition for skin whitening or wound treatment, containing liquid plasma

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8202701B2 (en) 2004-10-08 2012-06-19 Georgia Tech Research Corporation Microencapsulation of cells in hydrogels using electrostatic potentials
KR101240133B1 (ko) * 2011-01-27 2013-03-11 서울대학교산학협력단 히알루론산과 알지네이트를 포함하는 상호관입고분자망목 구조의 세포전달용 지지체의 제조방법
EP3013377B1 (en) * 2013-06-27 2020-08-05 Regentis Biomaterials Ltd. Compositions comprising a polymer-protein conjugate and an environmentally-responsive polymer and uses thereof
CN103550830A (zh) * 2013-10-15 2014-02-05 北京大学 一种海藻酸-透明质酸原位组织工程细胞支架及其制备方法
CL2013003066A1 (es) 2013-10-22 2014-07-25 Univ Chile Composicion para tratamiento de heridas porque comprende matriz soporte y células troncalesmesenquiámicas de gelatina de wharton; metodo para tratar heridas que comprende aplicar dicha composicion
CN104888669A (zh) * 2014-03-05 2015-09-09 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种彩色水凝胶及其制备方法
CN105622961B (zh) * 2016-03-15 2018-02-23 东华大学 一种自愈性多糖水凝胶的制备方法
KR101825041B1 (ko) * 2016-04-07 2018-02-02 주식회사 바이오솔루션 물질 p를 포함하는 상처치유용 약학 조성물
CN105968390A (zh) * 2016-07-11 2016-09-28 武汉大学 一种壳聚糖基自愈合凝胶及其制备方法
KR102168094B1 (ko) 2018-10-02 2020-10-20 한국과학기술연구원 하이드로겔 조성물 및 그를 포함하는 바이오 잉크 조성물
CN111249520A (zh) * 2020-01-17 2020-06-09 中山大学孙逸仙纪念医院 一种装载小干扰rna纳米粒的复合水凝胶敷料及其制备方法
CN115389365B (zh) * 2022-10-31 2023-01-24 北京大学口腔医学院 用于评价超分子水凝胶载体的性能的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6333194B1 (en) 1999-01-19 2001-12-25 The Children's Hospital Of Philadelphia Hydrogel compositions for controlled delivery of virus vectors and methods of use thereof
US7083806B2 (en) * 2000-05-08 2006-08-01 Maelor Pharmaceuticals Limited Wound gels
KR20070076742A (ko) * 2006-01-19 2007-07-25 서울산업대학교 산학협력단 키토산 또는 히알루론산-폴리에틸렌옥사이드 및키토산-히알루론산-폴리에틸렌옥사이드를 기저로 하는하이드로젤과  이의 제조방법

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0386960A3 (en) * 1989-03-07 1991-10-23 American Cyanamid Company Pharmaceutical compositions useful as drug delivery vehicles and/or as wound dressings
US5252318A (en) * 1990-06-15 1993-10-12 Allergan, Inc. Reversible gelation compositions and methods of use
ATE250928T1 (de) * 1995-07-12 2003-10-15 Cygnus Therapeutic Systems Hydrogelpflaster
WO1997017038A1 (en) * 1995-11-09 1997-05-15 University Of Massachusetts Tissue re-surfacing with hydrogel-cell compositions
US6171610B1 (en) * 1998-04-24 2001-01-09 University Of Massachusetts Guided development and support of hydrogel-cell compositions
AU758178B2 (en) * 1998-09-04 2003-03-20 Scios Inc. Hydrogel compositions for the controlled release administration of growth factors
CA2489347A1 (en) * 2002-06-20 2003-12-31 Amnon Sintov Transdermal drug delivery system
US20040101959A1 (en) * 2002-11-21 2004-05-27 Olga Marko Treatment of tissue with undifferentiated mesenchymal cells
US20050079147A1 (en) * 2003-10-14 2005-04-14 Bernard Delaey Wound healing compositions and uses
EP2076275B1 (en) * 2006-10-06 2014-12-03 University Of Virginia Patent Foundation Compositions useful for diabetic wound healing
CN101181242A (zh) * 2007-11-22 2008-05-21 沈阳药科大学 一种作为伤口用给药系统载体的吸水性微球及制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6333194B1 (en) 1999-01-19 2001-12-25 The Children's Hospital Of Philadelphia Hydrogel compositions for controlled delivery of virus vectors and methods of use thereof
US7083806B2 (en) * 2000-05-08 2006-08-01 Maelor Pharmaceuticals Limited Wound gels
KR20070076742A (ko) * 2006-01-19 2007-07-25 서울산업대학교 산학협력단 키토산 또는 히알루론산-폴리에틸렌옥사이드 및키토산-히알루론산-폴리에틸렌옥사이드를 기저로 하는하이드로젤과  이의 제조방법

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015105249A1 (ko) 2014-01-10 2015-07-16 (주)안트로젠 피부 재생 또는 상처 치유를 위한 중간엽 줄기세포-하이드로겔-생분해성또는중간엽 줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체 조성물
WO2018097527A1 (ko) * 2016-11-25 2018-05-31 아주대학교산학협력단 액상 플라즈마를 포함하는 피부미백 또는 상처치료용 조성물
KR20180059341A (ko) * 2016-11-25 2018-06-04 아주대학교산학협력단 액상 플라즈마를 포함하는 상처 치료용 조성물
KR102006784B1 (ko) * 2016-11-25 2019-08-02 아주대학교 산학협력단 액상 플라즈마를 포함하는 상처 치료용 조성물
US11759407B2 (en) 2016-11-25 2023-09-19 Ajou Univ. Industry-Academic Cooperation Found. Composition for skin whitening or wound treatment, containing liquid plasma
US11246885B2 (en) 2017-08-31 2022-02-15 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Keloid prevention or treatment method using liquid phase plasma
US11510853B2 (en) 2017-09-18 2022-11-29 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Composition for skin soothing containing liquid-phase plasma
WO2019099860A3 (en) * 2017-11-17 2019-06-27 Medline Industries, Inc. Wound treatment containing collagen and a gelatin-reducing agent, and method for promoting wound healing
US11510969B2 (en) 2017-11-17 2022-11-29 Medline Industries, Lp Wound treatment containing collagen and a gelatin-reducing agent, and method for promoting wound healing

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KR20100049341A (ko) 2010-05-12
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