JP2023508917A - 生体適合性材料 - Google Patents

Abstract

本発明はポリマーおよび天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）を含む組成物を提供する。組成物は水でヒドロゲルを形成する。組成物は、化粧および治療用途のための充填剤として有用である。本発明の実施形態は、組成物またはヒドロゲルを使用して、ある特定の状態を治療する方法、およびその場でのヒドロゲルの形成を可能にする、組成物のそれぞれの成分の同時または逐次投与のための外科キットを提供する。【選択図】図１ｃ

Description

関連出願
この出願は豪国仮特許出願第２０１９９０４８１７号（２０１９年１２月１９日）および同第２０２０９０３４６２号（２０２０年９月２５日）に対する条約による優先権を主張し、それらの開示内容すべてはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は生体適合性材料に関する。生体適合性材料は、組織再生および修復において有用である。

本発明は、任意の特定の組織形成を誘導することなく、損傷した組織の自然治癒を支持する充填剤に関する。本発明を使用して、部分的または完全に組織腔または欠損に充填するか、またはそれらを覆い、必要な空間充填を最小の異物反応で提供することを目的とする。

１つの実施形態では、本発明は組織伝導性医療用充填剤に関する。１つの実施形態では、本発明のポリマーはヒドロゲルとして製剤化され得る。別の実施形態では、ヒドロゲルは熱応答性である。さらに別の実施形態では、本明細書で開示される組成物は、注射され得る、流し込まれ得るまたは噴霧され得る流動可能な形態での送達のために開発された。一実施形態では、組成物は身体内または上または近くへの投与後にヒドロゲルを形成する。

本発明は組織工学用途において有用である。これは化粧および治療用途の両方を含む。本発明は、慢性、急性または外科的に作られた欠損の治療のための皮膚用途ならびに歯科および整形外科用途において有用である。しかし、本発明はこれらの特定の使用分野に限定されないことが理解されるであろう。

従来技術についての以下の考察は、本発明を適当な技術的背景に位置付け、その利点がより完全に理解されることを可能にするために提供される。しかし、本明細書を通しての従来技術についてのいかなる考察もそのような従来技術が当該分野で広く知られている、もしくは共通する一般的な知識の一部をなしていること、または、この従来技術が当業者によって関連すると確認され、理解され、考えられることが合理的に予期され得ることを明示的または言外に認めることであるとみなされるべきでないことは理解されるべきである。

本明細書で参照される特許および刊行物の全ては、それらの全体が参照により組み込まれる。

特許文献１はポリマー、特にヒドロゲルとして有用なポリマー、および組織の修復または再建のためのヒドロゲルの使用に関する。特に特許文献１のポリマーおよびヒドロゲルは、軟骨、特に関節軟骨の修復または再建に使用され得る。ポリマーは、少なくとも水を結合させるためのモノマー、機械特性を付与するためのモノマーおよび細胞外タンパク質に結合するためのモノマーを含む。ヒドロゲルは、少なくとも水を結合させるためのモノマーおよび細胞外タンパク質に結合するためのモノマーを含む、ポリマーを含む。上記細胞外基質タンパク質の結合によるポリマーの架橋がヒドロゲルを形成する。

特許文献２は、組織再生および修復に有用な生体適合性材料を開示し、生物活性ポリマーはヒドロゲル、例えば熱応答性ヒドロゲルの形態であり得る。特許文献２の生物活性ポリマーおよび得られるヒドロゲルは、骨組織の再生に使用され得る。したがって、特許文献２は、生物活性ポリマーによって形成された治療有効量のヒドロゲルを哺乳動物に投与し、骨欠損を治療することを含む、哺乳動物において骨欠損を治療する方法を開示する。

特許文献３は、少なくとも１つの殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位を少なくとも３つのさらなるモノマー単位と共に含むポリマーであって、上記３つのさらなるモノマー単位が温度活性化、水溶性、機械強度、タンパク質／多糖結合能、およびそれらの組合せからなる群から選択される特性を引き出す、ポリマーを開示する。特に特許文献３は、水溶性モノマー単位が親水性エチレングリコール（ＯＥＧＭＡ）部分であり、機械強度を与えるモノマー単位がポリラクチド－ｃｏ－２－ヒドロキシ－エチルメチルアクリレート（ＰＬＡ／ＨＥＭＡ）であり、タンパク質反応性モノマー単位がＮ－アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）部分であり、熱硬化性モノマー単位がＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）部分である、ポリマーを開示する。殺菌性／鎮痛性／抗炎症性モノマー単位は、サリチル酸のメタクリル酸エステル誘導体（５－ＨＭＡもしくは４－ＨＭＡ、またはそれらの組合せ）を含む。

上で参照された３つ全ての出願は本出願人に譲渡される。本発明はこの背景に対して開発された。

国際公開第２０１３／０９１００１号（ＰＣＴ／ＡＵ２０１２／００１５６６） 国際公開第２０１７／０３５５８７号（ＰＣＴ／ＡＵ２０１６／０５０８１７） 国際公開第２０１７／０１５７０３号（ＰＣＴ／ＡＵ２０１６／０５０６５３）

１つの形態では、本発明は流動可能な充填剤として具現化され、身体内への（例えば注射による）または身体表面への（すなわち３０～３７℃で）投与により、充填剤は接着性ヒドロゲルを形成する。ヒドロゲルは、最小の炎症応答で、身体内で十分に忍容される。ヒドロゲルは、活動性の出血または再生性生物学的成分を含有する他の流体の存在下で再生特性を発揮するだけであるので、宿主組織伝導性であるが誘導性ではない。充填剤は細いゲージ針（例えば２１Ｇ）により注射され得る。ヒドロゲルは注射部位に接着する。充填剤は噴霧による投与のためにエアロゾル内に配合され得る。ヒドロゲルは、身体内で３Ｄ構造を層状に作る様式で、または局所的に最小侵襲様式で投与され得る。本発明の充填剤の主要な革新的態様は、最小の異物反応、宿主組織伝導性、血液との混合、注射可能性、接着特性、層状充填および最適な分解プロファイルを含む。

本発明は皮膚用途などの軟組織用途、ならびに歯科および整形外科などの硬組織用途に有用である。例えば本発明は皺の減少などの化粧用途に有用である。本発明は瘢痕治癒を促進するのに有用である。これはやけどによる瘢痕および術後瘢痕を含む。本発明は糖尿病性潰瘍などの慢性創傷の管理にも使用され得る。

本発明は歯科用途にも有用である。抜歯は、軟組織、基礎となる骨に損傷を与え、最終的に下顎骨または歯槽骨の重大な喪失につながる、本質的に外傷性の処置である。臨床的には、歯槽骨の喪失は、欠如歯の将来の補綴置換に関連して審美的および機能的合併症をもたらす。欠如歯がインプラント支持再建で置換される場合、複雑な骨移植処置が決まって必要とされる。複雑な骨移植処置を減らすまたは潜在的に排除しようとして、抜歯窩または顎堤保存技術が提案されてきた。

いくつかの技術が文献に記載されており、そのほとんどが抜歯直後の抜歯窩内に移植充填材料を入れることを含む。抜歯部位に充填するために使用されてきたいくつかの市販の製品がある。実際、現在利用可能な製品のどれも骨量を抜歯前レベルに再建することも治癒転帰の向上をもたらすこともできない。

脱灰骨同種移植片、合成生物活性ガラスおよび脱タンパクウシ骨ミネラル（異種移植片）を用いた臨床研究は、投与の６～９カ月後でさえ移植粒子が結合組織または線維性骨環境によって包囲されていることを示した。これらの知見は、治癒が移植粒子によって物理的に妨げられていることを示す。生じた手術部位は、長期の待機期間後でさえインプラント埋入のための予測不能な手術環境である。抜歯後の骨喪失に関連する問題の範囲を考慮すると、抜歯を受けている患者の骨治癒転帰を改良するための足場に対する重大な満たされていない必要性がある。

室温で注射可能であり、体温でヒドロゲルを形成する、組織の修復のための組成物が一般に必要とされている。

本発明の組成物は、任意の特定の組織形成を誘導することなく、損傷した組織の自然治癒を支持する充填剤として使用されることを意図する。本発明を使用して、組織腔に部分的または完全に充填して必要な空間充填を最小の異物反応で提供することを目的とする。本発明は、腔に接着し、血液と混合し、宿主の軟組織および硬組織修復を容易にすることができる。軟組織または硬組織などの任意の特定の組織成長を誘導するために、本発明は他の活性成分と組み合わせて使用され得る。

本発明の目的は、従来技術の欠点の少なくとも１つを克服もしくは改善すること、または有用な代替案を提供することである。

本発明の特に好ましい形態の目的は、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４を特定の濃度でおよび特定の製剤で充填材料として使用することである。充填材料は組織誘導特性を一切有しない。充填剤は他の材料、例えば、３Ｄ構造を提供する不活性材料または特定の組織の形成を誘導する活性材料と組み合わせて使用され得る。本発明は注射され得る、流し込まれ得るまたは噴霧され得る。ポリマーおよびＴＢ４の濃度を調整して、本発明の異なる形態を形成することができる。

本発明は軟組織および硬組織に使用されることを意図する。軟組織について、本発明は皮膚タイプの用途のための生物活性成分（細胞または脂肪移植片のような）に添加され、生成物は注射または噴霧され得る。硬組織または硬／軟組織用途について、本発明は３Ｄ充填剤（例えば不活性骨粒子）と共に、または活性化合物（例えば成長因子）と共に適用され、軟組織および硬組織成長の両方を促進することができる。想定される市販形態は注射剤またはパテである。

本発明は、その好ましい実施形態に関して以下に記載されるが、本発明の主旨および範囲は多くの他の形態で具現化され得ることを当業者は理解するであろう。

本発明において出願人は、チモシンベータ－４と結合させ、細胞親和性医療用充填材料を形成するためにその所有のスマートポリマー、ＰＮＰＨＯを最適化した。

本発明の第１の態様によると、ポリマーおよび天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）を含む組成物であって、上記ポリマーが、
水を結合させるための第１のモノマー、
上記ヒドロゲルに機械特性を付与するための第２のモノマー、
天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）に結合するための第３のモノマー、および
相転移挙動を付与するための第４のモノマーを含み、
上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）がチモシンベータ－４またはその機能的ホモログである、組成物が提供される。

一実施形態では、第１のモノマーは、ポリエーテル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アミノ酸）およびデキストランから選択される。

一実施形態では、上記ポリエーテルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）またはそのマクロモノマー、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンオキシド－ｃｏ－プロピレンオキシド（ＰＰＯ）、それらのｃｏ－ポリエチレンオキシドブロックまたはランダムコポリマーから選択される。

一実施形態では、第１のモノマーはオリゴ（エチレン）グリコールモノメチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ）である。

一実施形態では、第２のモノマーはメタクリレート、またはメタクリレートを含むランダムコポリマーである。

一実施形態では、第２のモノマーはヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレートポリ（乳酸）コポリマー（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）、ポリ（乳酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコリド）、ポリ（グリコリド－ｃｏ－ラクチド）またはポリ（グリコリド－ｃｏ－カプロラクトン）から選択される。

一実施形態では、第２のモノマーはヒドロキシエチルメタクリレートポリ（乳酸）（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）である。

一実施形態では、第３のモノマーは上記ＮＳＰＰに結合するための求電子性官能基を有する。

一実施形態では、第３のモノマーはＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＳＮＨＳ）、Ｎ－ヒドロキシエトキシ化スクシンイミド（ＥＮＨＳ）、およびＮ－アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）から選択される。

一実施形態では、第３のモノマーはＮ－アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）である。一実施形態では、第４のモノマーはポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）およびポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）ホモポリマーおよびコポリマーから選択される。

一実施形態では、第４のモノマーは（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）である。一実施形態では、上記ポリマーは約３～約８ｍｏｌ％の量の第１のモノマーを含む。

一実施形態では、上記ポリマーは約５～約９ｍｏｌ％の量の第２のモノマーを含む。

一実施形態では、上記ポリマーは少なくとも約７ｍｏｌ％、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９ｍｏｌ％の量の第３のモノマーを含む。

一実施形態では、上記ポリマーは、約３～約８ｍｏｌ％の量の第１のモノマー、約５～約９ｍｏｌ％の量の第２のモノマー、少なくとも約７ｍｏｌ％の量の第３のモノマー、および上記ポリマーの組成の１００％までの残部を構成する量の第４のモノマーを含む。

一実施形態では、上記ポリマーは約６０～約８５ｍｏｌ％、好ましくは約６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４または８５ｍｏｌ％の量の第４のモノマーを含む。

一実施形態では、第１のモノマーはＯＥＧＭＡであり、第２のモノマーはＨＥＭＡ－ＰＬＡであり、第３のモノマーはＮＡＳであり、第４のモノマーはＮＩＰＡＡｍであり、上記ポリマーは約３～約８ｍｏｌ％の量のＯＥＧＭＡ、約５～約９ｍｏｌ％の量のＨＥＭＡ－ＰＬＡ、約７ｍｏｌ％超の量のＮＡＳ、および約８５ｍｏｌ％までの量のＮＩＰＡＡｍを含む。

一実施形態では、上記ポリマーは約５ｍｏｌ％の量のＯＥＧＭＡ、約７ｍｏｌ％の量のＨＥＭＡ－ＰＬＡ、約７ｍｏｌ％超の量のＮＡＳ、および約８１ｍｏｌ％の量のＮＩＰＡＡｍを含む。

一実施形態では、上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）はチモシンベータ－４である。

一実施形態では、上記組成物は本質的に等モル量の上記ポリマーおよびチモシンベータ－４を含む。

腔に部分的または完全に充填する一実施形態では、上記ポリマーの濃度は上記組成物の約１００ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。

本発明の第２の態様によると、本発明の第１の態様による組成物および水を含むヒドロゲルであって、ＮＳＰＰの第３のモノマーへの結合が上記ポリマーを架橋し、これにより水がその中に含まれているヒドロゲルを形成する、ヒドロゲルが提供される。

本発明の第３の態様によると、水を本発明の第１の態様の組成物に添加することを含む、ヒドロゲルを作製する方法が提供される。

本発明の第４の態様によると、本発明の第１の態様の組成物の水溶液を上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）の水溶液と混合することを含む、ヒドロゲルを作製する方法が提供される。

一実施形態では、上記ヒドロゲルは体温で形成される。一実施形態では、上記ヒドロゲルは、注射によるまたはエアロゾルを投与することによる上記組成物およびＮＳＰＰの哺乳動物への投与後に形成される。

本発明の第５の態様によると、硬組織および軟組織の両方の修復および／または再建のためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。硬組織（石灰化組織とも呼ばれる）は、石灰化され、硬い細胞間基質を有する組織であり、ヒトの硬組織は骨、歯のエナメル質、象牙質、およびセメント質である。軟組織は、骨などの硬組織ではない身体の他の構造および臓器を結合、支持、または包囲する組織を含む。軟組織は腱、靱帯、筋膜、皮膚、線維組織、脂肪、および滑膜（これらは結合組織である）、ならびに筋肉、神経および血管（これらは結合組織ではない）を含む。

本発明の第６の態様によると、創傷治癒のためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第７の態様によると、一時的な皺の減少のためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第８の態様によると、瘢痕の基部を一時的に持ち上げ、治癒を促進するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第９の態様によると、外科的介入後の瘢痕組織における皮膚結合組織形成を支持し、治癒を促進するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１０の態様によると、熱傷後の瘢痕管理における皮膚結合組織形成を支持するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１１の態様によると、出血を伴う急性皮膚欠損における血管内方成長を支持し、治癒を促進するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１２の態様によると、外科的に生じた皮膚腔に充填するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１３の態様によると、皮膚移植手術を支持するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１４の態様によると、骨移植片代用物を物理的に送達するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１５の態様によると、補綴物を充填するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１６の態様によると、組織誘導特性を有しない充填剤として使用するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１７の態様によると、抜歯後の歯周組織を支持および修復するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１８の態様によると、歯周靭帯組織を一時的に持ち上げるおよび／または歯周靭帯組織移植を支持するためのヒドロゲルの製造における本発明の第１の態様による組成物の使用が提供される。

本発明の第１９の態様によると、組織の修復および／または再建のための医薬の製造における本発明の第２の態様によるヒドロゲルの使用が提供される。

本発明の第２０の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、組織の修復および／または再建の方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第２１の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、創傷治癒の方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第２２の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、一時的な皺の減少方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第２３の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、瘢痕の基部を一時的に持ち上げ、治癒を促進する方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第２４の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、外科的介入後の瘢痕組織における皮膚結合組織形成を支持し、治癒を促進する方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第２５の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、熱傷後の瘢痕管理における皮膚結合組織形成を支持する方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第２６の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、出血を伴う急性皮膚欠損における血管内方成長を支持し、治癒を促進する方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第２７の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、外科的に生じた皮膚腔に充填する方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第２８の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、皮膚移植手術を支持する方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第２９の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、骨移植片代用物を物理的に送達する方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３０の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、補綴物を充填する方法が提供される。一実施形態では、上記充填剤は組織誘導特性を有しない。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３１の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、抜歯後の歯周組織を支持および修復する方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３２の態様によると、哺乳動物に本発明の第１の態様による組成物を投与することを含む、歯周靭帯組織を一時的に持ち上げるおよび／または歯周靭帯組織移植を支持する方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３３の態様によると、哺乳動物に本発明の第２の態様によるヒドロゲルを投与することを含む、組織の修復および／または再建の方法が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３４の態様によると、組織の修復および／または再建に使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３５の態様によると、創傷治癒に使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３６の態様によると、一時的な皺の減少に使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３７の態様によると、瘢痕の基部を一時的に持ち上げ、治癒を促進することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３８の態様によると、外科的介入後の瘢痕組織における皮膚結合組織形成を支持し、治癒を促進することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第３９の態様によると、熱傷後の瘢痕管理における皮膚結合組織形成を支持することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第４０の態様によると、出血を伴う急性皮膚欠損における血管内方成長を支持し、治癒を促進することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第４１の態様によると、外科的に生じた皮膚腔に充填することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第４２の態様によると、皮膚移植手術を支持することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第４３の態様によると、骨移植片代用物を物理的に送達することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第４４の態様によると、補綴物を充填することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、充填剤は組織誘導特性を有しない。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第４５の態様によると、抜歯後の歯周組織を支持および修復することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第４６の態様によると、歯周靭帯組織を一時的に持ち上げるおよび／または歯周靭帯組織移植を支持することに使用するための本発明の第１の態様による組成物が提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

本発明の第４７の態様によると、組織の修復および／または再建に使用するための本発明の第２の態様によるヒドロゲルが提供される。一実施形態では、投与ステップは注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する。

投与ステップがエアロゾルを投与することによって行われる全ての態様および実施形態では、上記エアロゾルは、これらに限定されないが鼻腔、口または開放創などの身体の任意の開口部に適用され得る。

本発明の第４８の態様によると、ヒドロゲルを形成するためのキットであって、ポリマーおよび天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）を含み、上記ポリマーが、水を結合させるための第１のモノマー、上記ヒドロゲルに機械特性を付与するための第２のモノマー、天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）に結合するための第３のモノマー、および相転移挙動を付与するための第４のモノマーを含み、上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）がチモシンベータ－４またはその機能的ホモログである、キットが提供される。一実施形態では、上記キットは別個の容器に水をさらに含む。

本発明の第４９の態様によると、ヒドロゲルを形成するためのキットであって、別個の容器に、天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）、および組成物を含み、上記組成物が、水を結合させるための第１のモノマー、上記ヒドロゲルに機械特性を付与するための第２のモノマー、天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）に結合するための第３のモノマー、および相転移挙動を付与するための第４のモノマーを含み、上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）がチモシンベータ－４またはその機能的ホモログであり、ＮＳＰＰおよび第２のモノマーが架橋され、これにより、上記組成物が水と接触すると上記ヒドロゲルの形成が可能になる、キットが提供される。

一実施形態では、ＮＳＰＰおよび上記組成物の一方または両方が固体形態である。一実施形態では、上記キットは別個の容器に水をさらに含む。一実施形態では、上記キットは、上記キットの成分の逐次または同時投与のための指示書をさらに含む。一実施形態では、上記キットは、分注されると、上記組成物、ＮＳＰＰおよび水が互いに混合されるように構成されている。

一実施形態では、ＮＳＰＰおよび上記組成物は、そのようなものでの治療を必要とする患者において骨移植片代用物をその場に送達するための充填剤として使用される。上記充填剤は、ＢＧＳを決まった場所に少なくとも６週間（分解）維持し（接着したまま）、細胞内方成長のための足場（骨の骨芽細胞）を提供する。

別の実施形態では、局所投与のためのエアロゾルを形成するために、上記組成物中の上記ポリマーの濃度は約５ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬである。例えば組成物中のポリマーの濃度は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０ｍｇ／ｍＬである。したがって、上記ポリマーは非常に低い濃度でエアロゾルにより送達することができ、手術部位に接着し、その場に応じて使用することができる。

定義および命名法
本発明の記載および主張において、以下の専門用語は、下に提示される定義に従って使用される。本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載するためだけであり、限定することを意図しないことも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

文脈が明らかにそうでないことを必要としない限り、本明細書および特許請求の範囲を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、排他的または網羅的な意味ではなく包含的な意味、すなわち「含むが、限定されない」の意味で解釈されるべきである。

用語「好ましい」および「好ましくは」は、ある特定の利益をある特定の状況下で提供し得る本発明の実施形態を指す。しかし、同じまたは他の状況下で他の実施形態が好ましいこともある。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態の詳述は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図しない。

本明細書で使用される場合、例えば「１～５」などの範囲または長さの限界を定義する表現は、１～５の任意の整数、すなわち１、２、３、４および５を意味する。換言すれば、明示的に言及された２つの整数によって定義される任意の範囲は、上記限界を定義する任意の整数および上記範囲に含まれる任意の整数を含みかつ開示することを意図する。

実施例以外で、または特に示されない限り、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての例で用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。これらの例は本発明の範囲を限定することを意図しない。以下、または特に示されない限り、「％」は「重量％」を意味し、「比」は「重量比」を意味し、「部」は「重量部」を意味する。

本発明の広い範囲を規定する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体例で規定された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も、それらのそれぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含有する。

用語「室温」は約２０～約２５℃の温度を意味することを意図する。

用語「動物」はヒトおよび非ヒト、例えば哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌなどを含む。

本明細書で使用される場合、「インプラント」は、例えば外科的処置によって動物に完全にまたは部分的に設置される物品またはデバイスを指す。

本明細書で使用される場合、用語「天然または合成ペプチドまたはタンパク質」（またはＮＳＰＰ）は、（様々な他の重要な機能を行うことに加えて）構造的支持を動物細胞に提供する動物組織の細胞外部分に天然に存在するタンパク質またはペプチドを指す。この用語は、天然に存在するタンパク質およびペプチドの機能に類似の機能を有する合成で調製されたタンパク質またはペプチドも指す。例として、天然に存在するタンパク質およびペプチドは、動物の結合組織の決定的特徴である細胞外基質（またはＥＣＭ）に共通して見られるものである。ＥＣＭに共通して見られる天然に存在するタンパク質は、コラーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、およびラミニン（ならびにそれらのアイソフォーム）を含む。

本発明で採用されるＮＳＰＰは、チモシンベータ－４またはその機能的ホモログである。

本明細書は以下の略語を使用する：

本発明による例示的な組成物において、１４０ｍｇ／ｍＬのＰＮＰＨＯ（比５：８（５）：７：８１）は３０ｍｇ／ｍＬのチモシンベータ－４と共に使用され、この組成物は、本出願人の臨床試験のためにＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４（または代替的にＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＮＳＰＰもしくは「ＴＲ００１」）と標識され、この明細書の本文を通してそのように言及される。

本発明の好ましい実施形態は、ここで添付の図を参照して、例示としてのみ記載される。

模擬の生理学的条件（３７℃におけるＰＢＳ）でヒドロゲルを形成し、ゲル化時にその構造を保持する本発明の溶液（ポリマーおよびＮＳＰＰ）の巨視的画像である。 欠損部位における活動性の出血の存在にもかかわらず、即時のヒドロゲル形成を示す、活動性の出血を伴う部位へのＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４注射の巨視的画像である。 体温において創傷と接触したＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４溶液およびヒドロゲル形成を示す巨視的画像シーケンスである。 層を重ねる充填を介して３Ｄ領域を充填するために使用される接着性ヒドロゲルを形成する、血液と混合されたＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の巨視的画像である。 ７０℃におけるＤＭＦ中のＰＮＰＨＯの合成的調製を示す。 ＣＤＣｌ_３中のＰＮＰＨＯの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示し；ＤＭＦ溶媒の残渣トレースに対する約２．９～３．０ｐｐｍの共鳴がＮＡＳプロトン共鳴（ｅ）と重複し、同じデータセット（全体的ＰＮＰＨＯポリマー内のそれぞれのモノマーの相対的モル％に基づくそれぞれのピーク下の積分／面積）に基づく最初の計算は誤ったものとなる。その後の補正により、第３のモノマー（ＮＡＳ）が約７モル％を超える量で存在することが確認される。 水溶液中で４℃にて異なるモル分率のＨＥＭＡ－ＰＬＡで合成された、ラクテート数３（ａ）および６（ｂ）のコポリマーの溶解度を示す（＊、＊＊、および＊＊＊は、それぞれｐ＜０．０５、＜０．０１、および＜０．００１を表す）。 ＬＣＳＴ測定値およびＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４（ａ）とＰＮＰＨＯ（ｂ）の比較を示す。２つのＬＣＳＴ値間の違いから、２成分間の化学的相互作用の存在が確認され、同様にゲル化動的運動の加速におけるＴＢ４の物理的役割を示す。 宿主組織と一体化するＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の足場効果の調査を表す。全層皮膚創傷の形成（ａ）；皮膚移植のためのＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４およびＩｎｔｅｇｒａの使用（ｂ）；ならびにＩｎｔｅｇｒａまたはＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４で処置された異なる時間点での移植の生着（ｃ）。 ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４に対する炎症応答の判定およびＩｎｔｅｇｒａ（皮膚基質の至適基準）との直接比較；外科手術後２週間（ａ）；および４週間（ｂ）のＩｎｔｅｇｒａ処置部位のＨ＆Ｅ染色；ならびに移植後２週間（ｃ）；および４週間（ｄ）後のＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４処置部位のＨ＆Ｅ染色を示す図である。白い矢印はＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４構造を示し、黒い矢印はインプラント周囲の線維組織形成を示す。 ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４およびＩｎｔｅｇｒａの処置部位に関する、異なる時間点でのマウスにおける血管新生応答を示す。移植部位における血管形成および内方成長を、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲライブイメージャーを使用して、蛍光放射効率により決定した。移植手術後２週間および４週間で、血管新生応答を、ＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ７５０ ＥＸ ｉｎ ｖｉｖｏ血液プール蛍光撮像プローブを用いて決定した。この近赤外線蛍光巨大分子プローブは脈管構造中に存続し、血管および血管新生の撮像を可能にする。外科手術後の各時間点で、各マウスに、１００μＬのＰＢＳ中の２ｎｍｏｌのＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ７５０ＥＸを注射した。２４時間後、各マウスを蛍光放射効率に関してスキャンした（ｎ＝８）。放射効率を使用して、創傷領域における新しい血管の密度を示した。結果は、手術後２週間で、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４処置部位に対する蛍光放射効率は、Ｉｎｔｅｇｒａ処置部位に対する蛍光放射効率より有意に高い（ｐ＜０．０１）ことを示した。対照的に、手術後４週間で、血管新生シグナルは両方の処置群に関して非常に低く、血管形成が制御され、部位の治癒が終了したことを示した。 皮膚移植手術後２週間後のＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４処置部位の組織学的評価を示す。白い矢印は、注射可能な足場への線維芽細胞浸潤と共に、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４ヒドロゲルの構造内の血管内方成長を示す。図８（ｃ）および図８（ｄ）の結果は、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の構造内の血管の形成を示す。加えて、皮膚生検試料の染色は、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４ヒドロゲルの構造内の宿主線維芽細胞の明らかな浸潤を示した；図８（ｄ）を参照のこと。 手術後４週間の、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４で処置した皮膚移植部位のマッソントリクローム染色を示す。黒い矢印は、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の構造内の線維芽細胞の内方成長から沈着したコラーゲン線維を示す。ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の構造内の線維芽細胞浸潤および皮膚細胞外基質の形成をさらに確認するために、移植後４週間で、皮膚移植部位をマッソントリクロームで染色した。図９の結果は、移植手術後４週間の、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の構造内のコラーゲン線維形成を示す。この結果により、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の構造内の線維芽細胞の浸潤および宿主組織と一体化して新真皮形成を促進するその可能性が確認される。 手術後４週間の、Ｉｎｔｅｇｒａで処置した皮膚移植部位のマッソントリクローム染色を示す。ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の構造内のコラーゲン線維の形成は、検出されたＩｎｔｅｇｒａの構造内のコラーゲン線維の形成より有意に高かった。結果は、Ｉｎｔｅｇｒａの構造内のコラーゲン形成が、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４と比較して有意に少ないことを示した。 抜歯後のＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の使用、（ａ）活動性の出血を伴う抜歯部位、（ｂ）抜歯窩部位への２１Ｇ針を介したＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の注射、（ｃ）部位におけるＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の即時ゲル化ならびに（ｄ）部位におけるＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４と血液との混合を示す。 １０人の患者に対する抜歯後のＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４適用を示す。ＰＥＴ治験におけるこのデバイスの臨床使用は、抜歯窩部位へのＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の注射が１０人全ての患者に成功したことを示し、調査責任者がデバイス機能不良を報告することはなかった。 手術およびＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４を用いた処置後７日の、軟組織再生および創傷治癒を示す。ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４で処置した１０人全ての患者は、手術後１週間で第１の追跡調査訪問に戻った。患者からの疼痛または不快の報告はなかった。口腔検査（投与後１週間）中、部位における感染または炎症の徴候はなかった。加えて、創傷閉鎖および軟組織形成を調査責任者が検査した。１０人全ての患者において、創傷閉鎖が認められ、迅速な軟組織形成が検出された。 ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４処置された試料のＨ＆Ｅおよびマッソントリクローム染色を示す。 製剤Ａ）１７．５ｍｇ／ｍＬ、Ｂ）３５ｍｇ／ｍＬおよびＣ）７０ｍｇ／ｍＬに関するプルームパターンの代表的画像を示す。 ３種の製剤に関する最大および最小のプルーム被覆直径ならびに導かれた楕円率（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を示す。 ヒト経鼻モデルを使用した、製剤の沈着パターンを示す。 累積質量として示される、３７℃におけるＰＮＰＨＯおよびＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４ヒドロゲルからのシプロフロキサシンＨＣｌのｉｎ ｖｉｔｒｏ放出を示す（結果はｎ＝１±ＳＤを示す）。

本発明はこれから添付の実施例および図面を参照してより完全に記載される。しかし、以下の記載は説明のためのものにすぎず、上記の本発明の一般性に対する制限と決して解釈されるべきではないことが理解されるべきである。

これから本発明のある特定の実施形態に詳細に言及する。本発明は実施形態と共に記載されるが、その意図は本発明をこれらの実施形態に限定することではないことが理解されるであろう。一方、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、改変、および均等物を包含することを意図する。当業者は、本発明の実践に使用され得る、本明細書に記載されたものと類似のまたは同等の多くの方法および材料を認識するであろう。本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。

この明細書で開示および定義される本発明は、文章または図面から言及されたまたは明らかな個々の特徴の２つ以上の全ての代替的組合せに及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組合せの全ては、本発明の様々な代替的態様を構成する。

組織に適合させたポリマーの使用が本明細書で開示される。本発明の組成物は、好ましくは注射可能である。

１．ポリマー
用語「ポリマー」は、本明細書で使用される場合、繰り返し構造単位（モノマー）からなる大きな分子（高分子）を指す。これらの下位単位は、典型的には共有化学結合によって結合される。ポリマーは直鎖状または分岐状ポリマーであり得る。好ましくは、本発明のポリマーは、３種以上の異なるモノマーを含むコポリマーである。

したがって、１つの実施形態では、本明細書で使用される好ましいポリマーは、第１の水結合モノマー、ヒドロゲルに機械特性を付与することができる第２のモノマー、およびＮＳＰＰに結合するための官能基を有する第３のモノマーを含む。

用語「モノマー」は、本明細書で使用される場合、結合してポリマーを形成することができるが、それ自体がポリマー、またはモノマーもしくはポリマーの誘導体であってもよい構造単位を指す。この後者の種類のモノマーは、本明細書では「マクロモノマー」とも言う。

本明細書において「マクロモノマー」は、その分子が各々、モノマー分子として作用する１つの末端基を有するポリマーまたはオリゴマーであり、その結果、各ポリマーまたはオリゴマー分子は、単一のモノマー単位のみを生成物であるポリマーの鎖にもたらす。

本発明の組成物のポリマーは、水を結合させるための第１のモノマー、上記ヒドロゲルに機械特性を付与するための第２のモノマー、天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）に結合するための第３のモノマー、および相転移挙動を付与するための第４のモノマーを含む。

１．１．第１のモノマー：水結合モノマー
上述の通り、本明細書で使用される好ましいヒドロゲルの有利な特性は、ＮＳＰＰおよび好ましいポリマーの特定の成分の組合せに起因し得る。これらの好ましいポリマーの１つの特定の有利な特性は、それらの水結合能である。ヒドロゲルにおける水の存在は、損傷した組織の天然環境に似た環境（組織再生を補助する）および必要な圧縮耐性の両方をヒドロゲルに提供する。

したがって、本明細書で使用される好ましいポリマーは、ポリマーがＮＳＰＰおよび水と接触するとヒドロゲルが形成できるように、水を結合させることができるモノマーまたは単位を含んでいなければならない。加えて、このように形成されたヒドロゲルは、必要な圧縮耐性および復元性を有していなければならない。

水結合モノマーは、本発明で使用される好ましいポリマー中に、これらの要件を満たすポリマーを生成するのに十分な割合で存在する必要があることを当業者は理解するであろう。一般に、ポリマー中の水結合モノマーの割合は、水結合モノマー：機械強度モノマーのモル比で、約１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、または約１：５であり得る。実際、水結合モノマーは、ポリマーを親水性にするだけでなく、さらに顕著な水結合能をポリマーに付与する必要がある。

したがって、本発明で使用される好ましいポリマーは、約７０％～約５００％、約８０％～約４００％、約９０％～３００％、または約１００％～２００％の水結合能を有する。例えば、本明細書で使用される好ましいポリマーの水結合能は、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、約２００％、約２１０％、約２２０％、約２３０％、約２４０％、約２５０％、約２６０％、約２７０％、約２８０％、約２９０％、約３００％、約３１０％、約３２０％、約３３０％、約３４０％、約３５０％、約３６０％、約３７０％、約３８０％、約３９０％、約４００％、約４１０％、約４２０％、約４３０％、約４４０％、約４５０％、約４６０％、約４７０％、約４８０％、約４９０％、または約５００％である。

水結合モノマーの適切な例は、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのアルカリ性ポリイミド、オリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンオキシド－ｃｏ－プロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ｃｏ－ポリエチレンオキシドブロックまたはランダムコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アミノ酸）およびデキストランなどのポリマーに合成することができるモノマーを含む。ポリエーテル、とりわけオリゴ（オキシアルキレン）（例えばＯＥＧ）が特に好ましく、それはこれらが必要な水結合能を有し、合成および／または購入するのが簡単で、これらが入れられる組織から最小の免疫応答を引き起こすまたは引き起こさないという意味で不活性であるからである。

加えて、様々な親水性官能基のいずれかを使用してモノマー（したがって、このようなモノマーから形成されるポリマー）を水溶性にしてもよい。例えば、水溶性であるリン酸、硫酸、第四級アミン、ヒドロキシル、アミン、スルホン酸およびカルボン酸のような官能基をモノマーに組み込んで、それを水溶性にしてもよい。

モノマーは他の化合物と反応して「マクロモノマー」を形成することもできる。したがって、第１のモノマーは必要に応じてマクロモノマーであり得る。

マクロモノマーである好ましい第１のモノマーはオリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ）であり、これは２種の親水性モノマー：エチレングリコールおよびメタクリレートからなる親水性モノマーである。

好ましくは、ポリマーは約３～約８ｍｏｌ％、好ましくは約３、４、５、６、７または８ｍｏｌ％の量の第１のモノマーを含む。

１．２．第２のモノマー：機械特性を付与するモノマー
上述の通り、本発明と共に使用される好ましいヒドロゲルの有利な特性は、一部、ポリマーを構成する特定の成分に起因し得る。一部の実施形態では、本発明で使用される好ましいポリマーは、ヒドロゲルに追加の機械特性をもたらすことができる。

ヒドロゲルに機械特性を付与することができるモノマーは、所望の機械特性を有するヒドロゲルを生成するのに十分な割合で好ましいポリマー中に存在する必要があることを当業者は理解するであろう。一般に、ポリマー中の「機械的」モノマーの割合は、水結合モノマー：機械強度モノマーのモル比で、約１０：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、または約１：５であり得る。ヒドロゲルに機械特性（例えば圧縮耐性）を付与することができるモノマーの適切な例は、メタクリレート、例えばヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレートポリ（乳酸）コポリマー（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）、ポリエステル、例えばポリ（乳酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコリド）、ならびにそれらのランダムコポリマー（例えばポリ（グリコリド－ｃｏ－ラクチド）およびポリ（グリコリド－ｃｏ－カプロラクトン））を含む。

モノマーは他の化合物と反応して「マクロモノマー」を形成することもできる。マクロモノマーである好ましい第２のモノマーはヒドロキシエチルメタクリレートポリ（乳酸）（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）である。

好ましくは、ポリマーは約５～約９ｍｏｌ％、好ましくは約５、６、７、８または９ｍｏｌ％の量の第２のモノマーを含む。

１．３．第３のモノマー：ＮＳＰＰ結合モノマー
上述の通り、本発明で使用される好ましいヒドロゲルは、水の存在下でポリマーをＮＳＰＰと結合させることによって形成する。ポリマーをＮＳＰＰと有効に結合させるために、好ましくは、架橋能を有するモノマーまたは単位がポリマーに含まれる。

この架橋能は、ポリマーがＮＳＰＰ（下でさらに述べる）に結合することができること、およびそうすることによってＮＳＰＰを架橋し、ＮＳＰＰを含有するヒドロゲルを形成することができることを意味する。代替的に、類似の機構により、ＮＳＰＰは架橋剤として作用し、これによりポリマーを架橋してヒドロゲルを形成する。

本発明者らは、チモシンベータ－４などと結合するための官能基を有するモノマーがポリマーに備えられたポリマーの設計を利用することによって、ヒドロゲルを形成するために、例えば化学架橋またはＵＶ架橋でポリマーをさらに架橋する必要がないことを認識した。

加えて、ＮＳＰＰをポリマーに共有結合させることによって、ＮＳＰＰはヒドロゲルの網目構造中により有効に保持され、これは、一旦ヒドロゲルが修復部位に投与されると、ＮＳＰＰはその部位から容易に移動することができないことを意味する。これは修復部位でのゲルの構造的な完全性が維持され（上で言及された通りのＮＳＰＰの機械特性により）、組織の天然環境を厳密に模倣する修復部位の環境を提供することを補助することを意味する。

ＮＳＰＰに結合することができるポリマーを生成するために、ＮＳＰＰに結合することができるモノマーは、水の存在下でヒドロゲルが形成され得るように、ＮＳＰＰと架橋するのに十分な割合で本発明のポリマー中に存在する必要があることを当業者は理解するであろう。一般に、ポリマー中の「架橋」モノマーの割合は、架橋モノマー：水結合モノマーのモル比で少なくとも約１：１である。この比は、例えば約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１まで増加し得る。

ＮＳＰＰに結合することができるモノマーは一般に、例えばＮＳＰＰの求核性官能基がモノマーの求電子性官能基と反応して共有結合を形成することができるように、求電子性または求核性官能基を有する。好ましくは、ポリマーは２種より多くのＮＳＰＰ結合モノマーを含み、これにより、求電子性－求核性反応の結果、ポリマーはＮＳＰＰと結合し、架橋したポリマー生成物を形成する。このような反応を「架橋反応」と言う。

したがって、例えばＮＳＰＰがアミンなどの求核性官能基を有する場合、ポリマーはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などの求電子性官能基を有し得る。本発明で使用するのに適した他の求電子性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＳＮＨＳ）およびＮ－ヒドロキシエトキシ化スクシンイミド（ＥＮＨＳ）である。この種類のモノマーの例は、Ｎ－アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）である。一方、ＮＳＰＰが求電子性官能基を有する場合、ポリマーはアミンまたはチオールなどの求核性官能基を有し得る。

好ましくは、ポリマーは少なくとも約７ｍｏｌ％、より好ましくは少なくとも約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９ｍｏｌ％の量の第３のモノマーを含む。

１．４．第４のモノマー：相転移モノマー
別の実施形態では、好ましいポリマーは、ヒドロゲルに相転移特性を付与することができる第４のモノマーをさらに含んでもよく、これにより組成物が室温で注射可能な形態になること、および体温でゲル形成（すなわちヒドロゲル形成）できることを可能にする。さらに、これらの相転移特性は、本発明と共に使用される好ましいポリマーが、ｐＨおよび温度などの因子を変えることによって様々な特性（粘性など）を変化させることができるヒドロゲルを形成することを可能にする。

熱応答性の注射可能なヒドロゲルは、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）が体温より低くなるように設計されている。したがって、ゲル化は、単にヒドロゲルの温度を上げることによって、例えばヒドロゲルが体温に温まる（ヒドロゲルが身体内に投与されると生じる）ことによって達成され得る。ポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）およびポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）ホモポリマーおよびコポリマーを含む、様々な熱応答性の注射可能なポリマーが本発明で使用するのに適している。ＮＩＰＡＡｍ（モノマー構成要素またはポリＮＩＰＡＡｍとして）は、３２℃のＬＣＳＴを有し、体温でゲル形態になることを可能にするので特に適している。

熱応答性であるポリマーを生成するために、相転移モノマーは、温度およびｐＨの異なる条件へのヒドロゲルの曝露によって、ポリマーを含むヒドロゲルの粘度を変化させることを可能にするのに十分な割合で、本発明と共に使用されるポリマー中に存在する必要があることを当業者は理解するであろう。一般に、ポリマー中の「相転移」モノマーの割合は、相転移モノマー：水結合モノマーのモル比で少なくとも約９：１である。この比は、例えば相転移モノマー：水結合モノマーのモル比で約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、約１６：１、約１７：１、約１８：１、約１９：１、約２０：１、約２１：１、約２２：１、約２３：１、約２４：１、約２５：１、約２６：１、約２７：１、約２８：１、約２９：１、または約３０：１まで増加し得る。

本発明と共に使用される好ましいヒドロゲルのより低い温度（例えば４℃）での粘度は、ヒドロゲルが注射可能となるようなものである。次いで、温度が上がるにつれてヒドロゲルは粘性を増し、約３７℃の温度で所望の粘度を有するゲルを形成する。これは、本発明と共に使用される好ましいヒドロゲルが、冷たい温度では、例えば注射またはエアロゾルによる投与によって容易に修復部位に投与され得ることを意味する。次いでヒドロゲルは、身体内で身体の自然温度まで温められることによって、所望の強度および弾性特性を有する、より粘性の高いゲルに変換される。

好ましくは、ポリマーは、ポリマーの組成の１００％までの残部を構成する量の第４のモノマーを含む。一実施形態では、第４のモノマーのｍｏｌ％は、約８５％、好ましくは約６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４または８５ｍｏｌ％までであり得る。

１．５．他のポリマー特性
異なる種類のモノマーを結合させることによって、様々な異なる特性を有するポリマーが生成され得ることは、当業者によって理解されるであろう。加えて、特定のモノマーまたは官能基を既存のポリマーに組み込むことによって、ポリマーの特性は改変され得る。例えば、ＨＥＭＡモノマーと他のモノマー（例えばメチルメタクリレート）の共重合を使用して、膨張および機械特性などの特性を改変することができる。モノマーは他の化合物と反応して「マクロモノマー」（上で言及された）を形成することもでき、次いでこれは本発明で使用される好ましいポリマーに含まれる。例えば、ＨＥＭＡはラクチドと反応してＨＥＭＡ－ポリ乳酸ポリマー（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）を形成することができ、ＨＥＭＡ－ＰＬＡ自体は、本発明のポリマーのモノマーとして使用され得る。加えて、モノマー自体は、モノマー単位の組合せであってもよく、次いでこれらの組合せがポリマーに組み込まれる。この種類のモノマーの例は、オリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ）であり、ＯＥＧＭＡは、２種の親水性モノマー：エチレングリコールおよびメタクリレートからなる親水性モノマーである。

本発明で使用される好ましいポリマーは、１つまたは複数の部分および／または官能基でさらに修飾され得る。必要に応じて任意の部分または官能基が使用され得る。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭水化物、および／または多糖由来の非環式ポリアセタールで修飾され得る。加えて、上述の通り、親水性基をモノマー（したがってポリマー）に組み込んで、ポリマーの水結合能を高めることができる。

配列に関して、コポリマーはブロックコポリマー、グラフトコポリマー、ランダムコポリマー、ブレンド、混合物、ならびに／またはこれらおよび他のポリマーのいずれかの付加物であり得る。典型的には、本発明に従って使用されるポリマーは有機ポリマーである。好ましくは、本発明で使用されるポリマーは生体適合性である。一部の実施形態では、ポリマーは生分解性である。他の実施形態では、ポリマーは生体適合性および生分解性の両方である。

本発明で使用される好ましいポリマーは、それらの構造に他のモノマーも含み得る。例えばモノマーは、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリエステル、アクリルポリマー、およびイオン性ポリマーなどのポリマー、またはこれらのモノマーであり得る。

ポリマーが生分解性または吸収性であることが望まれる場合、生分解性結合を有する１種または複数のモノマーが使用され得る。代替としてまたは加えて、モノマー間の反応の生成物が生分解性結合になるようにモノマーが選択され得る。各手法について、得られる生分解性ポリマーが所望の期間、例えば約６時間～約６カ月で分解または吸収されるように、モノマーおよび／または結合が選択され得る。好ましくは、ポリマーが生理的条件下で分解する場合に得られる生成物が非毒性であるように、モノマーおよび／または結合が選択され得る。

生分解性結合は、化学的または酵素的加水分解性または吸収性であり得る。理解を助ける例示的で非限定的な化学的加水分解性の生分解性結合は、グリコリド、ラクチド、カプロラクトン、ジオキサノン、およびトリメチレンカーボネートのポリマー、コポリマーおよびオリゴマーを含む。理解を助ける酵素的加水分解性の生分解性結合は、メタロプロテイナーゼおよびコラゲナーゼによって開裂可能なペプチド結合を含む。追加の理解を助ける生分解性結合は、ポリ（ヒドロキシル酸）、ポリ（オルトカーボネート）、ポリ（無水物）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（カーボネート）、およびポリ（ホスホネート）のポリマーおよびコポリマーを含む。

本発明におけるラクチドの化学的加水分解は、ポリマーの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）の上昇をもたらし（ポリマーの全体的な疎水性を低下させることによって）、したがってその生体吸収能をもたらす。

１．６．好ましいポリマー
ポリマーは、好ましくは、約３～約８ｍｏｌ％、例えば約４～約６ｍｏｌ％または約４、５、６ｍｏｌ％の量の第１のモノマーを含む。

ポリマーは、好ましくは、約５～約９ｍｏｌ％、例えば約６～約８ｍｏｌ％または約６、７もしくは８ｍｏｌ％の量の第２のモノマーを含む。

ポリマーは、好ましくは、少なくとも約７ｍｏｌ％、例えば約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９ｍｏｌ％の量の第３のモノマーを含む。

ポリマーは、好ましくは、ポリマーの組成の１００％までの残部を構成する量、例えば約６０～約８１ｍｏｌ％、例えば約６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５ｍｏｌ％の第４のモノマーを含む。

本明細書に記載されるパーセンテージは、最終ポリマーの組成に関し、ポリマーを形成するときに利用される供給量に関するものではない。

１つの実施形態では、ポリマーは好ましくは、
ｉ．約３～約８ｍｏｌ％（例えば約４～約６ｍｏｌ％）の量の第１のモノマー、
ｉｉ．約５～約９ｍｏｌ％（例えば約６～約８ｍｏｌ％）の量の第２のモノマー、
ｉｉｉ．少なくとも約７ｍｏｌ％の量の第３のモノマー、および
ｉｖ．約８５ｍｏｌ％まで（例えば約８１ｍｏｌ％まで）の量の第４のモノマーを含む。

別の実施形態では、ポリマーは、好ましくは、
ｉ．約５ｍｏｌ％の量の第１のモノマー、
ｉｉ．約７ｍｏｌ％の量の第２のモノマー、
ｉｉｉ．約７ｍｏｌ％の量の第３のモノマー、および
ｉｖ．約８１ｍｏｌ％の量の第４のモノマーを含む。

１つの実施形態では、本発明で使用される好ましいポリマーは式（Ｉ）のポリマーである：

式中、
Ａは第１のモノマー（水結合モノマー）であり、
Ｂは第２のモノマー（ヒドロゲルに機械特性を付与することができるモノマー）であり、
Ｃは第３のモノマー（ＮＳＰＰに結合するための官能基を有するモノマー）であり、
Ｄは第４のモノマー（ヒドロゲルに相転移特性を付与することができるモノマー）であり、
ｍは１～２０、例えば１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２の整数であり、
ｎは１～２０、例えば１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２の整数であり、
ｐは１～２０、例えば１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２の整数であり、
ｑは１～２０、例えば１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２の整数である。

好ましくは、ｍ：ｎ：ｐ：ｑの比は約５：８（５）：７：８１である。必要な水結合能、強化能および／または架橋能が達成されるという条件で、モノマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤは任意の順序でポリマーに存在し得ることが当業者には分かるであろう。

Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、好ましくは、それぞれ第１、第２、第３および第４のモノマーの文脈において上で提供されたｍｏｌ％範囲で存在し得る。

式（Ｉ）のポリマーの例は式（Ｉａ）のポリマーである：

式中、Ａは水結合モノマーＯＥＧＭＡであり、Ｂは強化モノマーＨＥＭＡ－ＰＬＡであり、Ｃは架橋剤ＮＡＳであり、Ｄは相転移モノマーＮＩＰＡＡｍであり、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｘおよびｙは上で定義された通りである。

必要な水結合能、強化能および／または架橋能が達成されるという条件で、モノマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤは任意の順序でポリマーに存在し得ることを当業者は知っているであろう。

いくつかのモノマー、例えばＨＥＭＡ－ＰＬＡ、ポリエステル、例えばポリ（乳酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコリド）、およびそれらのランダムコポリマー（例えばポリ（グリコリド－ｃｏ－ラクチド）およびポリ（グリコリド－ｃｏ－カプロラクトン）ならびに他の生分解性および生体適合性ポリマーが、ｉｎ ｖｉｖｏでの生分解性セグメント（例えばＰＬＡ）の分解中に、本発明で使用される好ましいポリマーのＬＣＳＴを上昇させることができ、ポリマーの生体吸収につながることも発見された。これは、本発明で使用されるポリマーがｉｎ ｖｉｖｏで生分解性であるように設計され得るという追加の利点を提供する。

本発明で使用される好ましいポリマーの全体の大きさは、ポリマーに組み込まれるモノマーの種類、ヒドロゲルを形成するのに使用しようとされるＮＳＰＰの種類、およびタンパク質がポリマーに結合する条件などの因子によって異なり得る。しかし、一般に、本発明で使用される好ましいポリマーは約１～約１００ｋＤａ、約５～約６０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子であり得る。

１．７．ＰＮＰＨＯ
好ましいポリマーはＰＨＰＨＯである。ポリマーＰＮＰＨＯは、好ましくは、約３～約８ｍｏｌ％、例えば約４～約７ｍｏｌ％または約３、４、５、６、７もしくは８ｍｏｌ％の量のＯＥＧＭＡを含む。

ポリマーは、好ましくは、約５～約９ｍｏｌ％、例えば約６～約８ｍｏｌ％または約３、４、５、６、７もしくは８ｍｏｌ％の量のＨＥＭＡ－ＰＬＡを含む。ポリマーは、好ましくは、少なくとも約７ｍｏｌ％、例えば約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９ｍｏｌ％の量のＮＡＳを含む。

ポリマーは、好ましくは、ポリマーの組成の１００％までの残部を構成する量、例えば約６４～約８５ｍｏｌ％、例えば約６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５ｍｏｌ％のＮＩＰＡＡｍを含む。

本明細書に記載されるパーセンテージは、最終ポリマーの組成に関し、ポリマーを形成するときに利用される供給量に関するものではない。

１つの実施形態では、好ましくは、ポリマーは、
ｉ．約３～約８ｍｏｌ％（例えば約４～約６ｍｏｌ％）の量のＯＥＧＭＡ、
ｉｉ．約５～約９ｍｏｌ％（例えば約６～約８ｍｏｌ％）の量のＨＥＭＡ－ＰＬＡ、
ｉｉｉ．少なくとも約７ｍｏｌ％の量のＮＡＳ、および
ｉｖ．約８５ｍｏｌ％まで（例えば約８１ｍｏｌ％まで）の量のＮＩＰＡＡｍを含む。

別の実施形態では、ポリマーは、
ｉ．約５ｍｏｌ％の量のＯＥＧＭＡ、
ｉｉ．約７ｍｏｌ％の量のＨＥＭＡ－ＰＬＡ、
ｉｉｉ．約７ｍｏｌ％の量のＮＡＳ、および
ｉｖ．約８１ｍｏｌ％の量のＮＩＰＡＡｍを含む。

本出願で使用するためのポリマーＰＮＰＨＯの好ましい形態は、上に描かれた式（Ｉａ）のポリマーである。

以前に定義された式Ｉに基づいて、
ｉ．Ａはオリゴ（エチレン）グリコールモノメチルエーテルメタクリレートＯＥＧＭＡであり、
ｉｉ．Ｂはヒドロキシエチルメタクリレートポリ（乳酸）（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）であり、
ｉｉｉ．ＣはＮ－アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）であり、
ｉｖ．ＤはＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）である。

加えて、ｘは１～１０００の範囲内であり、ｙは１～１０００の範囲内であり、ｍ、ｎ、ｐ、およびｑは１～２０の範囲内である。

必要な水結合能、強化能および／または架橋能が達成されるという条件で、モノマーＡ、Ｂ、ＣおよびＤは任意の順序でポリマーに存在し得ることが当業者には分かるであろう。

１．８．ポリマーの合成
当業者は、本発明で使用される好ましいポリマーを合成する適切な方法を知っているであろう。これらは開環重合、付加重合（遊離ラジカル重合を含む）および縮合重合などの方法を含む。

好ましいポリマーＰＮＰＨＯの形成は下の実施例に記載される。

２．ヒドロゲルを形成するための組成物
本発明はまた、本発明で使用するためのヒドロゲルを形成するのに有用な好ましい組成物に関する。

本発明の組成物はポリマーおよびＮＳＰＰを含み、ポリマーは、
ｉ．第１の水結合モノマー、および
ｉｉ．機械特性を付与する第２のモノマー、
ｉｉｉ．ＮＳＰＰに結合することができる官能基を含む、ＮＳＰＰ結合モノマーである第３のモノマー、
ｉｖ．ヒドロゲルに相転移特性を付与することができる第４のモノマーを含み、
天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）はチモシンベータ－４またはその機能的ホモログであり、
ＮＳＰＰの第２のモノマーへの結合はポリマーを架橋し、これにより、組成物が水と接触するとヒドロゲルの形成が可能になる。

用語「組成物」は、本明細書で使用される場合、上で言及された成分を含有する固体または液体組成物を指す。一部の実施形態では、標的骨組織の修復および／もしくは再生を補助するための、ならびに／または生物活性化合物の標的化送達を達成する方法を提供するための薬学的に許容される賦形剤および生物活性剤（例えば薬物、ビタミン、およびミネラル）などの他の成分も本発明で使用される好ましい組成物に含まれ得る。

一般に、本発明で使用される組成物中のポリマーの量は、ヒドロゲルの形成を可能にする量である。

一部の実施形態では、組成物中のポリマーの量は、約１％ｗ／ｗ～約９０％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ～約８０％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ～約７０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約６０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約５０％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ～約４０％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗまたは約８％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗの範囲である。

一部の実施形態では、ポリマーの量は、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約１５％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約２５％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約３５％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約４５％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗ、約５５％ｗ／ｗ、約６０％ｗ／ｗ、約６５％ｗ／ｗ、約７０％ｗ／ｗ、約７５％ｗ／ｗ、約８０％ｗ／ｗまたはそれ以上である。一部の実施形態では、ポリマーの量はおよそ８５％ｗ／ｗである。

概して、組成物中のポリマー濃度が高くなるにつれてヒドロゲルの硬さが増す。

一般に、本発明の組成物中のＮＳＰＰの量は、ヒドロゲルの形成を可能にする量である。

一部の実施形態では、組成物中のＮＳＰＰの量は、約０．０１％ｗ／ｗ～約６０％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ～約５０％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ～約４０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗ、または約５％ｗ／ｗ～約１０％ｗ／ｗの範囲である。

一部の実施形態では、ＮＳＰＰのパーセントは、約１％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約６％ｗ／ｗ、約７％ｗ／ｗ、約８％ｗ／ｗ、約９％ｗ／ｗ、約１０％ｗ／ｗ、約２０％ｗ／ｗ、約３０％ｗ／ｗ、約４０％ｗ／ｗ、約５０％ｗ／ｗ、またはそれ以上である。

％ｗ／ｗは、組成物が水と接触する前の組成物の総重量に基づく。

１つの実施形態では、組成物は等モル量のポリマーおよびチモシンベータ－４またはその機能的ホモログを含む。

２．１．賦形剤および生物活性剤
薬学的に許容される賦形剤は、本発明で使用される好ましい組成物および／またはヒドロゲルに含まれてもよく、所望の特定の剤形に適したありとあらゆる溶媒、分散媒、不活性希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、造粒剤、表面活性剤、崩壊剤、等張剤、増粘もしくは乳化剤、保存剤、結合剤、滑沢剤、緩衝剤、油などを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版（２００６） Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤およびその調製のための公知の技術を開示する。任意の望ましくない生物学的効果が生じる、またはそうでなければ医薬組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することなどによって、任意の従来の賦形剤が物質またはその誘導体と相容れない場合を除いて、その使用はこの発明の範囲内であると想定される。

着色剤、コーティング剤、甘味、香味、および着香剤などの賦形剤が、製剤者の判断により組成物中に存在し得る。

本発明で使用される好ましい組成物および／またはヒドロゲルに添加され得る生物活性剤または薬物化合物は、タンパク質、グリコサミノグリカン、炭水化物、核酸、ならびに無機および有機生物活性化合物、例えば酵素、抗生物質、抗腫瘍剤、局所麻酔薬、ホルモン、血管新生剤、血管新生阻害剤、成長因子（例えばインスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および形質転換成長因子－ｂ（ＴＧＦｂ）、抗体、神経伝達物質、向精神薬、抗がん薬、化学療法薬、生殖器に影響を及ぼす薬物、遺伝子、およびオリゴヌクレオチドを含む。

賦形剤および／または生物活性剤などの成分を含有する組成物は、本明細書で開示される通りの好ましいポリマーをＮＳＰＰと化合し、得られた組成物を乾燥させ、次いでこれを１種または複数の他の成分と化合することによって生成され得る。得られた組成物は、粉末の形態または他の粒子形態であってもよく、次いで本発明に従って、これに水を添加してヒドロゲルを形成する。したがって、これらの成分を含有するヒドロゲルは、単に所望の水性溶媒を組成物に添加することによって生成され得る。

本発明で使用される好ましい組成物中に存在するポリマー、ＮＳＰＰおよび生物活性剤の量は、特定の薬物および治療される状態に必然的に依存する。当業者は、状態を治療するのに使用する適当な薬剤および量が分かるであろう。

例示的な実施形態は、脂肪移植片、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、自家移植片（すなわち生物活性移植片）を含む。このタイプの添加物の役割は、組織誘導特性を複合体に付与することである。例えば、低濃度の成長因子がＤＢＭ／自家移植片などに存在する。

さらに例示的な実施形態は、骨粒子（ヒトまたは動物由来）およびガラスビーズなどの純粋に不活性な空間充填剤を含む。このタイプの添加物の役割は、必要な３Ｄ構造を複合体に提供することである。

骨移植片代用物は、合成カルシウム／リン酸粒子、動物由来骨粒子および未処理の人骨を含むがこれらに限定されない幅広い範囲の粒子を意味することが当業者には分かるであろう。

２．２．天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）
本発明の文脈において、ＮＳＰＰは、上述の通りポリマーを架橋し、これによりポリマーがヒドロゲルを形成することを可能にするので、適切である。本発明で使用される好ましいヒドロゲルは、例えばチモシンベータ－４を式（Ｉ）のポリマーに曝露することによって形成され得る。ＮＳＰＰは、ヒドロゲルに追加の機械特性（強度および復元性など）を提供し、修復部位において天然環境を模倣する環境も提供し、これにより組織修復および再生を補助することからも重要である。

ＮＳＰＰは側鎖または他の官能基を含有することが重要であり、側鎖または他の官能基はＮＳＰＰ結合モノマーの官能基との反応を可能にするために露出され、これによりＮＳＰＰ結合モノマーを介してＮＳＰＰをポリマーに結合させる。適切な側鎖の例は、グルタミン酸またはリシル側鎖を含む。

本発明は、ＮＳＰＰのバリアント、例えば種のバリアントまたは多型バリアントの使用も想定する。本発明は、同じ活性を示すＮＳＰＰの全ての機能活性バリアントを包含することを意図する。これはＮＳＰＰのアポおよびハロ形態、翻訳後修飾形態、ならびにグリコシル化または脱グリコシル化誘導体も含む。このような機能活性断片およびバリアントは、例えば保存的アミノ酸置換を有するものを含む。

好ましくは、本発明で使用されるＮＳＰＰは、組み換え源から得られるが、天然源から抽出するか、または合成することもできる。

２．３チモシンベータ－４
好ましいＮＳＰＰはチモシンベータ－４である。チモシンベータ－４は、全ての組織および赤血球を除く全ての細胞種に見られる、高度に保存された、天然に存在する水溶性の再生性ペプチドである。それは、血液ならびに涙、唾液、脳脊髄液、および創傷液を含む他の体液にも見られる。

ヒトチモシンベータ－４は以下の配列を有する：ＳＤＫＰＤＭＡＥＩＥ ＫＦＤＫＳＫＬＫＫＴ ＥＴＱＥＫＮＰＬＰＳ ＫＥＴＩＥＱＥＫＱＡ ＧＥＳ。

チモシンベータ－４は代替的にＳｅｒ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｐｈｅ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒと書かれる。

今後の考察のために、用語チモシンベータ－４およびＴＢ４は同義的に使用され、ＴＢ４はチモシンベータ－４の簡易表記法である。

本発明の例示的な実施形態によると、チモシンベータ－４は、最も好ましくはおよそ１：１のモル比でＰＨＰＨＯと共に使用される。しかし、これは意図される用途に応じて切り替えられ得る。例示的な組成物において、１４０ｍｇ／ｍＬのＰＮＰＨＯ（比５：８（５）：７：８１）は３０ｍｇ／ｍＬのチモシンベータ－４と共に使用され、この組成物は本出願人の臨床試験のために「ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４」と標識された。

２．４チモシンベータ－４の機能的ホモログ（アイソフォーム）
代替的な好ましいＮＳＰＰはチモシンベータ－４の機能的ホモログである。上記のポリペプチドの機能的ホモログも、本明細書に記載の組成物および方法で使用するのに適している。機能的ホモログは、参照ポリペプチドとの配列類似性を有し、参照ポリペプチドの生化学的または生理的機能の１種または複数を実行するポリペプチドである。

機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであってもよく、配列類似性は収束または分岐進化事象に起因し得る。したがって、機能的ホモログは文献においてホモログ、またはオルソログ、またはパラログと表されることがある。野生型コード配列の変異体によってコードされるポリペプチドなどの天然に存在する機能的ホモログのバリアントは、それら自体が機能的ホモログであり得る。

機能的ホモログは、ポリペプチドのコード配列の部位特異的変異誘発により、または異なる天然に存在するポリペプチドのコード配列に由来するドメインを組み合わせること（「ドメインスワッピング」）によっても作られ得る。本明細書に記載の機能的ポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は、公知であり、とりわけ定向進化技術、部位特異的変異誘発技術およびランダム変異誘発技術を含み、ポリペプチドの特定の活性を増加させる、基質特異性を変える、発現レベルを変える、細胞内位置を変える、または所望の様式でポリペプチド：ポリペプチド相互作用を改変するのに有用であり得る。このような改変されたポリペプチドは機能的ホモログとみなされる。用語「機能的ホモログ」は、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用されることがある。

機能的ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列アライメントの分析によって同定され得る。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベース上での照会を行うことで、ポリペプチドのホモログを同定することができる。配列分析は、アミノ酸配列を参照配列として使用する、非冗長データベースのＢＬＡＳＴ、Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ分析を含み得る。アミノ酸配列は、一部の場合では、ヌクレオチド配列から推測される。４０％超の配列同一性を有する、データベース中のそれらのポリペプチドは、ポリペプチドとしての適切性のさらなる評価のための候補である。アミノ酸配列類似性は、ある疎水性残基が別のものを置換するまたはある極性残基が別のものを置換するなどの保存的アミノ酸置換を可能にする。必要に応じて、そのような候補の手動検査を行って、さらに評価される候補の数を狭めることができる。手動検査は、ポリペプチドに存在するドメイン、例えば保存された機能的ドメインを有すると思われるそれらの候補を選択することによって行われ得る。

保存された領域は、繰り返し配列であるか、何らかの二次構造（例えばヘリックスおよびベータシート）を形成するか、正もしくは負に帯電したドメインを確立するか、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表す、ポリペプチドの一次アミノ酸配列内で領域の位置を突き止めることによって同定することができ、例えば、ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ Ｐｆａｍ／ ａｎｄ ｐｆａｍ．ｊａｎｅｌｉａ．ｏｒｇ／で様々なタンパク質モチーフおよびドメインのコンセンサス配列を記載するＰｆａｍウェブサイトを参照されたい。Ｐｆａｍデータベースに含まれる情報は、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６：３２０～３２２頁（１９９８）；Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２８：４０５～４２０頁（１９９７）；およびＢａｔｅｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２７：２６０～２６２頁（１９９９）に記載される。保存された領域は、近縁種に由来する同じまたは関連するポリペプチドの配列をアラインすることによっても決定され得る。近縁種は、好ましくは同じ科に由来する。一部の実施形態では、２つの異なる種に由来する配列のアライメントが適切である。

典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドが、保存された領域を同定するのに有用である。関連するポリペプチドの保存された領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。一部の実施形態では、保存された領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。

３．ヒドロゲル
本発明はまた、本発明によるポリマー、ＮＳＰＰおよび水を含むヒドロゲルであって、ポリマーが、
ｉ．第１の水結合モノマー、
ｉｉ．機械特性を付与する第２のモノマー、
ｉｉｉ．ＮＳＰＰに結合することができる官能基を含む、ＮＳＰＰ結合モノマーである第３のモノマー、
ｉｖ．ヒドロゲルに相転移特性を付与することができる第４のモノマーを含み、
天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）がチモシンベータ－４またはその機能的ホモログであり、
ＮＳＰＰの第３のモノマーへの結合がポリマーを架橋し、これにより水がその中に含まれているヒドロゲルを形成する、ヒドロゲルに関する。

１つの実施形態では、ヒドロゲルは、低温での液状から体温でのゲル状へのヒドロゲルの相転移を可能にするための上記のモノマーを有するポリマーを含む。この目的に有用なモノマーの一例はＮＩＰＡＡｍである。チモシンベータ－４は、このモノマーの使用によって、温度プロファイルにより液状からゲル状に移行することができる。したがって、利点は、本発明で使用される好ましいヒドロゲルが、冷たい温度で、例えば注射またはエアロゾルによって容易に投与され得ることである。次いでヒドロゲルは、身体内で自然の体温まで温まった後、所望の強度および弾性特性を有する、より粘性の高いゲルに変換される。

上記のポリマー組成物が提供され、当業者に公知の任意の方法で水を組成物に添加することによってヒドロゲルが形成され得る。実際、本発明の１つの利点は、ヒドロゲルが形成するために、ＮＳＰＰとの接触前にポリマーを任意の方法で架橋する必要がないことである。

３．１．細胞
本発明で使用するための好ましいヒドロゲルは、標的組織の修復および／または再生を補助する細胞も含み得る。

一般に、本発明に従って使用される細胞は任意の種類の細胞である。これらの細胞は、本発明で使用される好ましいヒドロゲル内に封入または固定されたときに生存可能でなければならない。本発明の生成物は細胞の固定に有効である。例えば、ヒドロゲルの層を部位に注射／噴霧し、その後細胞を粘着性のヒドロゲルに添加し、次いでヒドロゲルの別の層で覆い、求めていた結果を達成する。したがって、封入は身体内で生じ、身体外ではない。

一部の実施形態では、ヒドロゲル内に封入され得る細胞は、哺乳動物細胞（例えばヒト細胞、霊長類細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞など）、鳥類細胞、魚類細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、およびハイブリッド細胞を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ヒドロゲル内に封入され得る例示的な細胞は、幹細胞、全能細胞、多能性細胞、および／または胚性幹細胞を含む。

一部の実施形態では、ヒドロゲル内に封入／固定され得る例示的な細胞は、初代細胞および／または任意の組織由来の細胞株を含むが、これらに限定されない。例えば、心筋細胞、筋細胞、肝細胞、角化細胞、メラニン細胞、神経細胞、星状膠細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、造血細胞（例えば単球、好中球、マクロファージなど）、エナメル芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、神経細胞、精子細胞、卵細胞、肝臓細胞、肺由来の上皮細胞、胃腸由来の上皮細胞、腸由来の上皮細胞、肝臓、皮膚由来の上皮細胞などおよび／またはそれらのハイブリッドは、本発明に従って使用される好ましいヒドロゲル内に封入され得る。

本発明に従って使用される好ましいヒドロゲル内に封入され得る例示的な哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＯＣＫ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ細胞）、ＮＳＯ細胞、ＭＣＦ－７細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４３８細胞、Ｕ８７細胞、Ａ１７２細胞、ＨＬ６０細胞、Ａ５４９細胞、ＳＰ１０細胞、ＤＯＸ細胞、ＤＧ４４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＢＣＰ－１細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＧＨ３細胞、９Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２細胞、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、およびＣ６／３６細胞を含むが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、細胞はヒドロゲル全体に均一に分布していることが望ましい。均一な分布は、より均一な環境を封入された細胞に提供するより均一な組織様ヒドロゲルを提供するのを助けることができる。一部の実施形態では、細胞は、ヒドロゲルの表面に配置される。一部の実施形態では、細胞はヒドロゲルの内部に配置される。一部の実施形態では、細胞はヒドロゲル内で層になっている。一部の実施形態では、ヒドロゲルは異なる細胞種を含有する。

一部の実施形態では、細胞生存率を最大にするために、細胞がヒドロゲル内に封入される条件は変えられる。一部の実施形態では、例えば、ポリマー濃度が低いほど細胞生存率は上昇する。一部の実施形態では、ヒドロゲルの周囲に配置された細胞は、ヒドロゲル内に完全に封入された細胞に対して低下した生存率を有する傾向がある。一部の実施形態では、細胞生存率を最大にするために、周囲環境の条件（例えばｐＨ、イオン強度、養分利用性、温度、酸素利用性、浸透圧モル濃度など）は調節されるおよび／または変えられる必要があり得る。

一部の実施形態では、細胞生存率は、細胞生存率の多くの指標の１つをモニタリングすることによって測定され得る。一部の実施形態では、細胞生存率の指標は、細胞内エステラーゼ活性、細胞膜完全性、代謝活性、遺伝子発現、およびタンパク質発現を含むが、これらに限定されない。一例に過ぎないが、細胞が蛍光発生エステラーゼ基質（例えばカルセインＡＭ）に曝露されると、エステラーゼ基質を加水分解して緑色の蛍光生成物にする細胞内エステラーゼ活性の結果、生きた細胞は緑色の蛍光を発する。別の例では、細胞が蛍光核酸染料（例えばエチジウムホモダイマー－１）に曝露されると、死んだ細胞は赤色の蛍光を発するが、これはそれらの細胞膜が損なわれると、親和性の高い核酸染料に対して透過性となるためである。

一般に、組成物中の細胞の数／量は、本発明に従って使用するための好ましいヒドロゲルの形成を可能にする量である。一部の実施形態では、ヒドロゲルを形成するのに適した細胞の量は、約０．１％ｗ／ｗ～約８０％ｗ／ｗ、約１．０％ｗ／ｗ～約５０％ｗ／ｗ、約１．０％ｗ／ｗ～約４０％ｗ／ｗ、約１．０％ｗ／ｗ～約３０％ｗ／ｗ、約１．０％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗ、約１．０％ｗ／ｗ～約１０％ｗ／ｗ、約５．０％ｗ／ｗ～約２０％ｗ／ｗ、または約５．０％ｗ／ｗ～約１０％ｗ／ｗの範囲である。一部の実施形態では、ヒドロゲルを形成するのに適した組成物中の細胞の数／量は、およそ５％ｗ／ｗである。

一部の実施形態では、ヒドロゲルを形成するのに適した、前駆体溶液中の細胞の濃度は、約１０～約１×１０^８細胞／ｍＬ、約１００～約１×１０^７細胞／ｍＬ、約１×１０^３～約１×１０^６細胞／ｍＬ、または約１×１０^４～約１×１０^５細胞／ｍＬの範囲である。一部の実施形態では、単一のヒドロゲルは、同一の細胞および／または細胞種の集団を含む。一部の実施形態では、単一のヒドロゲルは、同一でない細胞および／または細胞種の集団を含む。一部の実施形態では、単一のヒドロゲルは、少なくとも２種の異なる種類の細胞を含み得る。

一部の実施形態では、単一のヒドロゲルは、３種、４種、５種、１０種、またはそれ以上の種類の細胞を含み得る。一例に過ぎないが、一部の実施形態では、単一のヒドロゲルは胚性幹細胞のみを含み得る。一部の実施形態では、単一のヒドロゲルは、胚性幹細胞および造血幹細胞の両方を含み得る。

３．２．培地
１種または複数の細胞種または細胞株の成長を支持することができる、複合培地および／または無血清培養培地を含む様々な細胞培養培地のいずれかを使用して細胞を成長させるおよび／または維持することができる。典型的には、細胞培養培地は、緩衝剤、塩、エネルギー源、アミノ酸（例えば天然アミノ酸、非天然アミノ酸など）、ビタミン、および／または微量元素を含有する。細胞培養培地は、炭素源（例えば天然の糖、非天然の糖など）、補因子、脂質、糖、ヌクレオシド、動物由来成分、加水分解物、ホルモン、成長因子、界面活性剤、指示薬、ミネラル、特定の酵素の活性化因子、特定の酵素の活性化因子阻害剤、酵素、有機物、および／または小分子代謝産物を含むが、これらに限定されない様々な他の成分を必要に応じて含有し得る。

本発明に従って使用するのに適した細胞培養培地は、様々な供給元、例えばＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から市販されている。ある特定の実施形態では、以下の培地の１種または複数を使用して細胞を成長させる：ＲＰＭＩ－１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地、イーグル最小必須培地、Ｆ－１２Ｋ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地。

本明細書で挙げられた細胞は、本発明に従って前駆体溶液内に（したがって、最終的にはヒドロゲル中に）封入され得る、例示的で、非包括的な細胞のリストを表すことを当業者は認識するであろう。

４．用途
本発明は、任意の特定の組織形成を誘導することなく、損傷した組織の自然治癒を支持する充填剤を提供することを目的とする。本発明を使用して、最小の異物反応で、部分的または完全に組織腔に充填するか、または組織欠損を覆い、必要な空間充填を提供することを目的とする。

好ましくは、本発明の組成物は対象（例えば哺乳動物）に、注射によって、またはエアロゾルなどにより本発明を具現化する粒子を噴霧することにより投与される。

独特であることには、本発明の組成物は、欠損の形状および／または深さ／大きさに関係なく、部分的または完全に欠損に充填することができ、また、層状に添加し、必要な体積を築くことができる。本発明の組成物は、物理的に閉じ込めることを必要とすることなく部位に接着し、その場で血液と混合し、細いゲージ針により深い組織まで注射され得る。組織の隙間は、本発明の組成物で、必要に応じて異なる時間間隔で再充填され得る。

本発明は注射可能な充填剤を提供する。身体への注射後、組成物は接着性ヒドロゲルを形成する。本発明の固有の特性により、本発明の組成物は、最小の炎症応答で、身体内で十分に忍容される。生成物は、活動性の出血または再生性の生物学的成分を含有する他の流体の存在下で再生特性を発揮するだけであるので、宿主組織伝導性であるが、誘導性ではない。

本発明の組成物は、細いゲージ針により注射され得る。本発明の組成物は、注射部位に接着し、最小侵襲様式により、身体内に３Ｄ構造を層状に作る様式で注射され得る。

本出願が有用である組織の種類は、皮膚組織および歯周組織を含む。

本発明の組成物の使用は、ａ）皮膚皺の一時的な減少のために皮膚腔に充填するための注射可能な皮膚充填剤（化粧用途）、ｂ）瘢痕の基部を一時的に持ち上げ、治癒を促進するための注射可能な皮膚充填剤（治療用途）、ｃ）外科的介入後の瘢痕組織における皮膚結合組織形成を支持し、治癒を促進するための注射可能な皮膚充填剤（治療用途）、ｄ）熱傷後の瘢痕管理における皮膚結合組織形成を支持するための注射可能な皮膚充填剤（化粧／治療用途）、ｅ）出血を伴う急性皮膚欠損における血管内方成長を支持し、治癒を促進するためのすぐに使える皮膚基質（治療用途）、ｆ）外科的に生じた皮膚腔に充填するためのすぐに使える皮膚基質（治療用途）、ｇ）皮膚移植手術を支持するためのすぐに使える皮膚基質（化粧および治療用途）、ｈ）骨移植片代用物を物理的に送達するための担体系（治療用途；例えばＥｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ．、２００６年１月；３（１）：４９～５７頁を参照されたい）、ｉ）補綴物（例えばケージ）をｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで充填するための担体系（治療用途）、ｊ）組織誘導特性を有しない充填剤、ｋ）抜歯後の歯周組織を支持および修復するためのすぐに使える基質（治療用途）、ｌ）歯周靭帯組織移植を支持するためのすぐに使える基質（治療用途）、ならびにｍ）歯周靭帯組織を一時的に持ち上げるための注射可能な基質（治療用途）を含む。

本発明の好ましい実施形態の利点は以下を含む：ａ）細胞親和性、ｂ）注射可能性、ｃ）宿主組織接着性、ｄ）組織特異的誘導特性がないこと、およびｅ）身体内で十分に忍容されること（最小免疫応答）。

本発明のヒドロゲルは、好ましくは、動物の身体内への注射の結果として最小の異物反応をもたらす。

本発明のヒドロゲルは、好ましくは宿主組織伝導性である。これは、ヒドロゲルが活動性の出血または再生性生物学的成分を含有する他の流体の存在下で再生特性を発揮することを意味する。本発明のヒドロゲルは、好ましくは血液と混合可能である。

本発明の組成物は、好ましくは注射可能である。好ましくは、同じ部位への複数回の注射が可能である。本発明の組成物は、好ましくは注射による哺乳動物への投与後にその場でヒドロゲルを形成する。

本発明のヒドロゲルは、好ましくは宿主組織への良好な接着を示す。接着特性は、基礎となる組織床が徐々に築かれて、治癒を支持することを可能にする。接着特性は、最小侵襲様式での３Ｄ構造の形成も可能にする。

本発明のヒドロゲルは、好ましくは層状の充填に使用され得る。これは異なる高さを有する３Ｄ腔への充填を可能にする。

本発明のヒドロゲルは、好ましくは数日、数週間または数カ月の期間にわたりその場で分解し、健康な組織を残す。

本発明は、注射可能な足場としての安全で使用しやすい生体材料として開発された。本発明は、チモシンベータ－４とコンジュゲートした合成スマートポリマー（ＰＮＰＨＯ）からなる単一の均一分子に属する。本発明の組成物は室温で液体であり、所望の臨床位置への直接注射が可能である。本発明の組成物は、体温への曝露後に弾性ゲルを形成し、血液と混合し、その部位で血餅を安定させる。加えて、本発明の組成物の吸収速度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究に基づくと、本発明の組成物が身体に３カ月未満で吸収されると考えられる。加えて、ヒツジ骨切り術モデルならびに骨芽細胞および前骨芽細胞の細胞研究は、デバイスが血管内方成長および骨形成を支持することを確認している。

本発明の組成物が抜歯後の抜歯窩基部に注射され、血液と混合し、血餅を安定させ、血管内方成長および骨再生のための均一な足場を提供し得ることが仮定された。抜歯窩への本発明の組成物の直接投与によって、部位での創傷治癒を増強し、抜歯後の歯槽骨を保存することを目的とした。この仮定を調査するために本出願人は、抜歯を予定している１０人の参加者を含む臨床試験を行った。軟組織閉鎖（創傷治癒）、抜歯部位の外見、参加者のウェルビーイングおよび基礎となる骨の質が、この臨床試験において研究された。

本発明の組成物の用途およびこの技術のこれらの潜在的使用についての裏付けとなるデータの存在は表１にまとめられる。

５．キット
本発明で使用するための好ましいヒドロゲルの１種または複数を含む様々なキットが本明細書で開示される。例えば本発明は、ヒドロゲルおよび骨欠損を修復または再生するのに使用するための指示書を含むキットを提供する。キットは多数の異なるヒドロゲルを含み得る。

キットは、ポリマー、細胞、ＮＳＰＰ、生物活性化合物、水などを必要に応じて含み得る。キットは、いくつかの追加の成分または試薬のいずれかを任意の組合せで含み得る。様々な組合せの全ては明示的に示されていないが、各組合せは本発明の範囲に含まれる。本発明に従って提供される一部の例示的なキットは、以下の段落に記載される。

本発明のある特定の実施形態によると、キットは例えば、
ｉ．ポリマーを含む溶液、ＮＳＰＰを含む溶液、および
ｉｉ．溶液からヒドロゲルを形成するための指示書
を含み得る。

別の実施形態によると、キットは例えば、
ｉ．ポリマーおよびＮＳＰＰを含む組成物、ならびに
ｉｉ．組成物からヒドロゲルを形成するための指示書
を含み得る。

別の実施形態によると、キットは例えば、
ｉ．一方または両方が固体形態であるポリマーおよびＮＳＰＰ、必要に応じて水などの溶媒を含む組成物、ならびに
ｉｉ．組成物からヒドロゲルを形成するための指示書
を含み得る。

キットは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。例示的なキットは、エアロゾルの形態であり得るか、またはエアロゾルもしくは本発明の組成物を適用する類似の手段を形成するために組み合わせることができる成分を有する形態であり得る。

キットは典型的には、本発明で使用するための好ましいヒドロゲルの使用指示書を含む。指示書は例えば、プロトコルを含み得るか、および／またはヒドロゲルの生成、それを必要とする対象へのヒドロゲルの投与、ヒドロゲル集合体の生成などについての条件を記載し得る。キットは一般に、個々の成分および試薬の一部または全てが別々に収容され得るように１つまたは複数の器または容器を含む。キットは、個々の容器を商業的販売のために比較的厳密に閉じて入れるための手段、例えばプラスチックの箱も含むことができ、この中に指示書、発砲スチロールなどの包装材料が入れられ得る。

キットまたは「製造品」は、容器および容器上またはそれに関連付けられたラベルまたは添付文書を含み得る。適切な容器は、例えばビン、バイアル、注射器、ブリスターパックなどを含む。容器はガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、状態を治療するのに有効であるヒドロゲルまたは組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る（例えば容器は、皮下注射針によって穴をあけることが可能な栓を有する、静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、ヒドロゲルまたは組成物が最適な症状を治療するために使用されることを示す。１つの実施形態では、ラベルまたは添付文書は、使用指示書を含み、治療用組成物を使用して組織を修復または再生できることを示す。

本発明の好ましい実施形態
本発明で使用される好ましいポリマーはＰＮＰＨＯである。本発明の組成物中のＰＮＰＨＯの濃度は、好ましくは組成物の約１００～約３００ｍｇ／ｍＬである。エアロゾル形態で具現化される場合、濃度は組成物の約５ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬである。

本発明で使用される好ましいＮＳＰＰはチモシンベータ－４である。代替的に、チモシンベータ－４の機能的ホモログが使用され得る。

好ましくは、ＰＮＰＨＯはチモシンベータ－４（またはその機能的ホモログ）とコンジュゲートし、タンパク質／ペプチドセグメントおよびＰＮＰＨＯの両方が定義された役割を有する。

チモシンベータ－４（またはその機能的ホモログ）は、
ｉ．組織再生のための生物活性シグナル伝達源として働き、
ｉｉ．ヒドロゲル充填剤内およびその周りの血管の形成を促進する。

ＰＮＰＨＯポリマーは、タンパク質／ペプチドと化学的に結合し、
ｉ．このバイオポリマーの物理化学特性を組織用途に合わせて調整し、
ｉｉ．迅速な熱硬化をヒドロゲル充填剤に付与し、それを局所的に留め、
ｉｉｉ．生体吸収特性を注射可能なヒドロゲルに付与する。

これらの２種の主なセグメントの組合せは、組織再生および修復のための様々な好ましい特性を有する新しいタイプの優れた組織充填剤の形成をもたらす。ＰＮＰＨＯポリマーの利点は、全てのその成分が、生物医学用途での使用について米国ＦＤＡによって承認されていることである。

ＰＮＰＨＯポリマーは、それぞれ高い機械強度、水溶性、およびアミン基反応性を生成物に付与する、ラクチド、エチレングリコールおよびＮ－アクリロキシスクシンイミドセグメントと共に、体温でヒドロゲル形成を誘導する熱応答性画分（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）を含む。ＰＮＰＨＯポリマーの分子構造および各セグメントの役割は、実施例において下に描かれるスキームで概略的に示される。

好ましくは等モル量のＰＮＰＨＯおよびチモシンベータ－４が使用されるが、モル比は実際に遭遇する各シナリオに従って変化させてもよいことが当業者には分かるであろう。

材料
別段記載されない限り、化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。２－エチルヘキサン酸スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）_２）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）、２－ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ）およびＮ－アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）は、受け取ったそのままで使用した。オリゴ（エチレングリコール）モノメチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ、Ｍ_ｎ＝４７５）は、ジクロロメタン中のその溶液（１：１の体積比）を、使用前に中性アルミナカラムを通過させ、阻害物質を除去することにより精製した。Ｄ，Ｌ－ラクチド（ＬＡ）モノマーを、使用前に４０℃にて２４時間真空下で乾燥させた。アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）は、オーストラリアのシドニー大学化学部より厚意により寄贈された。

ＨＥＭＡ－ポリ（ラクチド）（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）マクロモノマーの合成
ＨＥＭＡ－ＰＬＡマクロモノマーを、ＨＥＭＡのヒドロキシル基を開始剤として、Ｓｎ（Ｏｃｔ）_２を触媒として用いて、ＬＡを開環重合することにより合成した（スキーム１を参照のこと）。

スキーム１．
ＨＥＭＡ－ポリ（ラクチド）（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）マクロモノマーの合成

ＬＡおよびＨＥＭＡを、３つ口フラスコ中、窒素雰囲気下で１１０℃にて１５分間混合した。その後、１ｍｌの無水トルエン中の１モル％のＳｎ（Ｏｃｔ）_２（ＨＥＭＡ供給量に対して）の混合物を、ＬＡ／ＨＥＭＡ溶液に添加した。得られた混合物を、窒素雰囲気下で、３００ｒｐｍで１１０℃にて１時間撹拌した。反応後、この混合物をテトラヒドロフランに溶解し、冷蒸留水中で１℃にて沈殿させた。形成された沈殿物を、遠心分離により３０００ｒｐｍで５分間分離した。

遠心分離サイクルを３回繰り返して、全ての未反応モノマーおよび副生成物（主に塩）を除去した。次に、沈殿物を酢酸エチルに溶解した。懸濁した固体粒子を、遠心分離を用いて６０００ｒｐｍで５分間この溶液から除去し、上清をＭｇＳＯ_４で１２時間乾燥させた。乾燥させた上清を濾過して、ＭｇＳＯ_４粒子を除去した。次に、ポリマー溶液を減圧下で６０℃にて乾燥させ、溶媒の残渣を真空下で４０℃にて２４時間さらに除去した。得られた粘稠性油状物を、さらなる使用のために冷蔵庫で保存した。

ＨＥＭＡ：ＬＡの供給比を１：１．５および１：２．５から変化させて、異なるラクテート長を有するＰＬＡ／ＨＥＭＡマクロモノマーを得た。それぞれ、ＨＥＭＡのＬＡモノマーに対する１：１．５および１：２．５のモル比を使用することにより、３および６のラクテート長を有する２種のＰＬＡ／ＨＥＭＡマクロモノマーを合成した。

^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを使用して、ＨＥＭＡとＬＡの両方からのプロトンピークを根拠に、ＰＬＡ／ＨＥＭＡマクロモノマーの合成を確認した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルから、ラクテート中のメチンに対する５．２ｐｐｍのピーク、ならびにＨＥＭＡに対する５．７ｐｐｍおよび６．０ｐｐｍのピークの合計積分値を使用して、ＰＬＡ／ＨＥＭＡマクロモノマー中の、ＬＡのＨＥＭＡに対するモル比を算出した。

ポリ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＮＡＳ－ｃｏ－（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）－ｃｏ－ＯＥＧＭＡ）（ＰＮＰＨＯ）の合成
ＰＮＰＨＯを、以下に記載される方法（１）または（２）のいずれかを使用して合成した（スキーム２を参照のこと）。

スキーム２．
ポリ（ＮＩＰＡＡｍ－ｃｏ－ＮＡＳ－ｃｏ－（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）－ｃｏ－ＯＥＧＭＡ）（ＰＮＰＨＯ）の合成

方法１
ＰＮＰＨＯを、ＡＩＢＮを開始剤として使用してフリーラジカル重合により合成した。磁気攪拌棒およびゴム製セプタムを備えるシュレンクフラスコに、ＮＩＰＡＡｍ（１２ｍｍｏｌ）、ＮＡＳ（１．０ｍｍｏｌ）、ＨＥＭＡ－ＰＬＡ（０．５７ｍｍｏｌ）、ＯＥＧＭＡ（０．５６ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（０．０７ｍｍｏｌ）および無水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を充填した。このフラスコを３サイクルの凍結－ポンプ－解凍により脱酸素化し、次に密封した後、７０℃に予熱した油浴にフラスコを浸して重合を開始した。２４時間後、反応混合物を室温まで冷却し、ジエチルエーテル中で沈殿させ、濾過し、次に真空下で乾燥させた。このポリマーをＴＨＦ／エチルエーテルで再溶解／再沈殿により２回精製し、最終的に真空下で２日間乾燥させた。

方法２
ＰＮＰＨＯを、ＡＣＶＡを開始剤として使用してフリーラジカル重合により合成した。ラクテート長（ＨＥＭＡ－ＰＬＡにおいて３および６）ならびにＨＥＭＡ－ＰＬＡのモル比（６、８、および１１モル％）ならびにＯＥＧＭＡのモル比（３、５、および８モル％）を変化させることにより、コポリマーの組成を変化させた。１つ口丸底フラスコ中で、既知の量のＮＩＰＡＡｍ、ＮＡＳ、ＨＥＭＡ－ＰＬＡ、ＯＥＧＭＡ、ＡＣＶＡ（７．０×１０^－５ｍｏｌ）を１３ｍｌの無水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミドに溶解した。次に、この系を１５分の窒素パージにより脱酸素化した。結果はまた、真空下の溶液で１０分間、窒素ガスでパージすることにより、モノマー溶液を脱酸素化することが適していることを示した。この技術により、大規模に溶液から酸素を除去する、より効率的な方法が提供される。

次に反応器を密封し、７０℃にて２４時間油浴に浸した。次に、得られたポリマー溶液を室温にて１時間冷却し、２５０ｍｌのジエチルエーテル中で沈殿させた。次に、懸濁液を濾過することにより沈殿物を収集し、真空下で６時間乾燥させた。乾燥粉末をテトラヒドロフランに溶解し、ジエチルエーテル中で沈殿させて、マクロモノマーの残渣をさらに除去した。最終的な粉末を、少なくとも４８時間真空下で乾燥させた。

ＰＮＰＨＯ組成物
ＰＮＰＨＯを、図２ａに示されるスキームに基づいて合成した。図２ｂに示されるように、^１Ｈ ＮＭＲスペクトルで各モノマーに対するプロトンピークを根拠に、ＰＮＰＨＯコポリマーの合成を確認した。ＮＩＰＡＡｍ（ａおよびｂ）、ＮＡＳ（ｅ）、ＨＥＭＡ－ＰＬＡ（ｆ、ｈ、ｋ）、ならびにＯＥＧＭＡ（ｍおよびｎ）に対する特徴的なプロトンピークを検出した。ＮＡＳプロトン共鳴（ｅ）に関して、これらはＤＭＦ溶媒の残渣トレースに対する約２．９～３．０ｐｐｍの共鳴と重複し、同じデータセット（全体的ＰＮＰＨＯポリマー内のそれぞれのモノマーの相対的モル％に基づくそれぞれのピーク下の積分／面積）に基づく最初の計算が誤ったものとなることが記述されている。その後の補正により、第３のモノマー（ＮＡＳ）が約７モル％を超える量で存在することが確認される。コポリマーの最終組成を、ＮＩＰＡＡｍ（ａ）、ＮＡＳ（ｅ／２－ｆ）、ＨＥＭＡ－ＰＬＡ（ｈ）、およびＯＥＧＭＡ（ｎ／２）に対する各モノマーからのこれらのピークの積分に基づいて算出した。本研究では、コポリマーはＰＮＰＨＯと示され、ＨＥＭＡ－ＰＬＡ（ラクテート長）のＯＥＧＭＡに対するモル比に相当する添字が追加されている。例えば、ＰＮＰＨＯ５：８（５）：７：８１は、ラクテート長５を有する８モル％のＨＥＭＡ－ＰＬＡ、および５モル％のＯＥＧＭＡを用いて合成されたコポリマーを表す。さまざまコポリマーが生成された。これらを表２に示す。表２は、それらのゲル化時間および温度に関するデータも提供する。

ＰＢＳ中のＰＮＰＨＯの溶解度
注射用製剤の開発のために、ＰＮＰＨＯのモノマー比を修正して、ＰＢＳなどの水性媒体に溶解する範囲の組成物を得た。ＮＩＰＡＡｍベースのコポリマーは、コポリマー極性基と水分子間の水素結合の形成に起因して、それらのＬＣＳＴ未満の水溶液に可溶である。本研究では、ＰＮＰＨＯの溶解度に対するラクテート長、ＨＥＭＡ－ＰＬＡおよびＯＥＧＭＡの含有量の影響を、ＰＢＳ中の異なる組成のＰＮＰＨＯの飽和濃度を測定することにより研究した。

図３の結果より、ＨＥＭＡ－ＰＬＡ骨格における３～６の範囲内のラクテート長の増加が、ＰＢＳ中のＰＮＰＨＯの溶解度に有意な影響は与えなかったことが実証される（ｐ＞０．０５）。したがって、ＰＮＰＨＯ骨格中の側鎖の疎水特性は、水性媒体中のＰＮＰＨＯの全体的溶解度に、検討された範囲内で最小限の影響をもたらした。したがって、ラクテート長を変化させることにより、水性媒体中のＰＮＰＨＯの溶解度に影響を及ぼすことなく、ゲル化挙動および機械特性などのＰＮＰＨＯの他の特徴を調整することができる。

ＰＢＳ中のＰＮＰＨＯの溶解度は、疎水性と親水性の含有物の両方を変化させることにより調整することができる。ＰＬＡセグメントは主要な疎水性骨格であり、一方、ＮＡＳとＨＥＭＡの両方のモノマーは、相対的に制限された親水特性を示す。したがって、ＯＥＧＭＡは、コポリマーの親水特性を促進するためにＰＮＰＨＯの合成に含まれた。

コポリマー中のＨＥＭＡ－ＰＬＡ（すなわち、疎水性含有物）を６モル％から８モル％および１１モル％に増加すると、ＰＢＳ中のＰＮＰＨＯの溶解度は、それぞれ３０％および５０％減少した。この溶解度低下はまた、コポリマー中の相対的に親水性のセグメントＮＩＰＡＡｍの濃度の減少にも起因した（ｐ＜０．０５）。したがって、ＰＮＰＨＯ中のＮＩＰＡＡｍ含有量の減少は、コポリマーの水和に実質的に影響を与えた。

水中のＰＮＰＨＯの溶解度は、３モル％を超える（例えば、１．５モル％）ＯＥＧＭＡを親水性セグメントとして使用した場合、劇的に増加した。この結果は、３モル％未満のＯＥＧＭＡ含有量を有するコポリマーは水性媒体に溶解しないことを示した。図３の結果は、６モル％のＰＬＡ－ＨＥＭＡを有するＰＮＰＨＯコポリマーの溶解度は、ＯＥＧＭＡ濃度を３モル％からそれぞれ５モル％および８モル％に上昇させた場合、２倍および３倍に有意に増加したことを示す。しかし、より高いモル比（すなわち、８モル％および１１モル％）の疎水性セグメントＨＥＭＡ－ＰＬＡを含有したコポリマー中では、ＯＥＧＭＡ濃度は、ＰＮＰＨＯの溶解度にほとんど影響しなかった。この挙動は、より長い鎖およびより高いＭ_Ｗを有するコポリマーの形成に起因し、これが水溶液中のコポリマーの水和および溶解性を妨害した。

１８Ｇ針を介したこれらの溶液の注射可能性に対する、水溶性ＰＮＰＨＯコポリマーの濃度の影響を判定した。ＰＢＳ中の１５０ｍｇ／ｍＬのＰＮＰＨＯ溶液が１８Ｇ針を介して注射可能であることが見い出され、この濃度のコポリマーをさらなる分析に使用した。より高濃度のポリマーを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織成長用の足場製造などの他の生物医学的用途に使用することができる。

チモシンベータ－４
スクシンイミドリンカーが、アミノ基を含有する化合物に対する高い反応性および最適化された到達性を示すため、このポリマーを、流動性ヒドロゲルの製造用に、アミノ基を有するＴＢ４に適用することができると推論することは合理的である。この仮定を確認するために、ポリマーとＴＢ４間の反応の実行可能性を検討した。ＴＢ４溶液を、リン酸緩衝食塩水中で形成した。１０００μＬのＴＢ４溶液を、１４０ｍｇのポリマーと４℃にて少なくとも２４時間完全に混合し、次にこの混合物を３７℃にてゲル化させた。

ゲル化挙動（時間および温度）
表２中の結果は、ＰＮＰＨＯ組成物を用いて製造されたヒドロゲルのゲル化時間は、２．５～５分の範囲内であることを示した。この測定は、模擬の生理学的条件（３７℃インキュベータ）中で実行され、体液および／または体表面と接触したヒドロゲルのゲル化速度は、この温度において著しく速いことに留意することが重要である。このゲル化時間は、この生成物の投与を可能とし、同時に投与された生成物のその部位からの移動を妨げるため、臨床用途に望ましい。加えて、これらのＰＮＰＨＯの製剤のゲル化温度は３７℃未満であり、それはこれらの臨床使用を可能にする。この製剤の高いゲル化温度は、臨床医がｉｎ ｖｉｖｏにおいて溶液を送達するのに非常に都合がよい。

ＰＮＰＨＯのコンジュゲーション効率
ＰＮＰＨＯのコンジュゲーション効率を試験するために、ＴＢ４合成ペプチドをモデル系として使用した。結果は、ＴＢ４が異なるＰＮＰＨＯ製剤と効率的にコンジュゲートされることを示した。この結果により、合成または天然ペプチドまたはタンパク質とコンジュゲートするＰＮＰＨＯの高い有効性が示された。２つの成分（ＴＢ４およびＰＮＰＨＯ）は、ＰＮＰＨＯのスクシンイミドエステル基およびＴＢ４のアミノ基を介して分子レベルで相互作用する。これを判定するために、ＰＮＰＨＯおよびＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を比較する。

ＰＮＰＨＯポリマーおよびコンジュゲート系（ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４）のＬＣＳＴは、ＰＮＰＨＯ、ＴＢ４の化学組成および分子構造内の親水性と疎水性の基間の比により引き起こされる。ＰＮＰＨＯおよびＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４は、加熱時に逆溶解性を示す。この熱応答性挙動は、温度がＬＣＳＴより高くなった場合、ＮＩＰＡＡｍ基および関連する側鎖、例えば、ＮＡＳ、ＰＬＡ／ＨＥＭＡ、ＯＥＧＭＡおよびＴＢ４）の、溶解コイルから崩壊小球への変化（すなわち、親水性から疎水性の状態への移行）を起こす能力から生じる（図１）。^１Ｈ－ＮＭＲは、ＮＭＲデータ取得の温度変化中のポリマーの移行を監視することにより、ＬＣＳＴの正確なプロファイルを提供する。^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを、１０℃～３０℃の範囲の温度で１℃間隔で記録する。温度が上昇し、コンジュゲート系のコイルから小球への移行時に（逆溶解性）、ＮＭＲシグナルはさまざまなピークに関して低下する。温度に対するＮＭＲピーク面積のプロットにより、ＬＣＳＴが明らかとなる。

ＰＮＰＨＯポリマーおよびＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルに基づき、コンジュゲート系のＬＣＳＴがＰＮＰＨＯポリマーのＬＣＳＴより２～４℃低いことが見い出される（図４）。ゲル化温度を定量化するために、Ｄ_２Ｏ／ｍ（ＯＥＧＭＡに関して特徴的なピーク）を使用した。ＰＮＰＨＯと比較したコンジュゲート系のゲル化温度における推移により、２つの成分間の化学的相互作用の存在が確認された。加えて、ゲル化温度の低下により、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるゲル化の動的運動が増加し、したがって投与部位における生成物の接着が促進される。

タンパク質－ＰＮＰＨＯヒドロゲルの生体吸収挙動
ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の臨床研究により、この生成物は３カ月内に身体に十分に再吸収されることが示された。インプラント術部位の組織学的評価により、インプラント術後３～４カ月でこの生成物の痕跡がないことが示された。

実行可能性研究

バッチからの試料を、９０ｍｍトリプケースソイ寒天プレート上で３７℃にてインキュベートした。バッチ出荷が実施される前に、細菌増殖が存在しないことを検証した。

このプロトコルの実行に使用された試料サイズ（複数可）を表４に示す。

実施される全ての試験用に選択された試料サイズ（複数可）を、統計学的妥当性を考慮して選択した。有意数の動物／試験物品および対照群、例えば、前臨床、概念実証試験に通常使用される３回の反復をはるかに上回る、１時間点につき１群当たり６回の反復を選択する）。

ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４試験物品は、文書化された手順およびプロセスに基づいて出願人により製造された。製品製造中に使用された全ての機器、器具および材料は、出願人のＱＭＳ内で承認されたものであった。ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４デバイスを即使用可能なシリンジ中で試験設備に供給した。各試験物品は単回使用であった。

以下の機器／器具／材料が、この試験プロトコルの実行に必要とされた。組織化学的分析、染色および可視化は、業界基準に基づいて実行された。

結果
ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４溶液は、室温（２０～２５℃）における液体から、体温（３７℃）においてゲルに移行し、模擬の生理学的条件における注射後、その構造的安定性を保持する（図１ａ）。生体ヒツジ骨切除モデルを使用して、盛んに出血している状態でのＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の注射可能性および接着性を検討した。図１ｂの結果は、この生成物は欠損部位に注射することができ、腔を充填し、血液と混合し、血餅を安定化するヒドロゲルを即時形成することを示す。部位における活動性の出血およびそれに続く血液でのヒドロゲルの希釈にもかかわらず、ヒドロゲル形成は達成された。これは、注射可能系の臨床用途に有用でありかつデバイス機能不良を防ぐため、本発明のヒドロゲル系の重要な属性である。ｉｎ ｖｉｖｏ注射における体液の存在のため、より良好な熱伝達がヒドロゲル形成の動的運動を促進する。例えば、図１ｃは、皮膚上のヒドロゲル形成がより遅いことを示す。本発明のこの特徴的な挙動を使用して、通常、コア／深部組織と比較してより低い温度を有する露出した創傷に、この生成物の層を重ねた投与を介して３Ｄ構造を形成することができる（図１ｄ）。本発明は接着物であり、血液および宿主細胞と混合して治癒を支持する。

ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４が組織再生を支持する能力は、投与時に形成される物理的足場に基づく。この基質は、その構造全体を通して細胞浸潤および血管内方成長を支持することが示唆される。この仮説を試験するために、マウス動物モデルを使用して、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４が宿主環境と一体化し、血管内方成長を支持するｉｎ ｖｉｖｏにおける可能性を調査する。加えて、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４を、陽性対照としてのＩｎｔｅｇｒａ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ皮膚基質（Ｉｎｔｅｇｒａ）と直接比較した。

動物モデルおよび外科手術
全層マウス動物モデル（ｎ＝２０）を使用し；各動物において、２つの全層皮膚欠損を外科的に生み出した；図５（ａ）を参照のこと。創傷をＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４またはＩｎｔｅｇｒａ（陽性対照）で処置し、皮膚移植を図５（ｂ）に示されるように所定位置に縫合した。次に、処置部位に通例のドレッシング、詳細にはＡｔｒａｕｍａｎおよびＩＶ ３０００を適用した。移植部位における血管形成および内方成長を、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲライブイメージャーを使用して、蛍光放射効率により決定した。欠損を、移植生着に関して、処置後８週間まで定期的に確認した。加えて、動物を異なる時間点で屠殺し；生検試料を収集して、宿主組織一体化、血管内方成長および炎症応答を定量化した。

皮膚移植生着
研究全体を通して異なる時間点で、移植皮膚の生着を調査した。成功した皮膚移植は宿主皮膚部位で損なわれておらず、一方で、失敗した部位は折れ曲がり、経時的に剥離する；図５（ｃ）を参照のこと。この調査からの結果は、手術後１週間内で、Ｉｎｔｅｇｒａで処置した４つの皮膚移植は失敗して、８０％の生着率を表すことを示した。この知見は、Ｉｎｔｅｇｒａに関しておよそ８５％の生着率を報告している以前の研究と一致している（「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｋｉｎ． Ｉ． Ｂａｓｉｃ ｄｅｓｉｇｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ」、ｎ．ｄ．；Ｖｙａｓ ＆ Ｖａｓｃｏｎｅｚ、２０１４年）。ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４で処置した全ての移植部位は、研究全体を通して生着した；ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４で処置した皮膚移植の１００％生着率。全層皮膚移植を支持するＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の有効性は、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４が、最小の炎症応答で、十分に忍容されることを示唆している。成功した皮膚移植生着により、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４が、新血管内方成長、宿主組織浸潤および細胞外基質の形成に対して再生力のある足場として作用することが示唆される。ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４のこれらの特徴を調査するために、異なる時間点での動物の生体蛍光撮像、および処置部位の組織学的評価を行った。

本発明の組成物に対する炎症応答
皮膚生検試料を、移植の２週間および４週間後に収集し、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の生物学的挙動を組織化学的に判定した。Ｉｎｔｅｇｒａの処置された部位のＨ＆Ｅ染色により、Ｉｎｔｅｇｒａ構築体に対して２週間および４週間の両方で軽度の炎症応答が示され；図６（ａ）および図６（ｂ）は、それぞれ、Ｉｎｔｅｇｒａ部位周囲に視認される多層線維組織を示す。以前の研究は、構築物に対する同様の炎症応答およびＩｎｔｅｇｒａ周囲の線維組織の形成を示した（Ｈｏｒｉ、Ｏｓａｄａ、Ｉｓａｇｏ、＆ Ｓａｋｕｒａｉ、２０１７年；Ｙ．Ｗａｎｇら、２０１５年）。

対照的に、図６（ｃ）および図６（ｄ）におけるＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４処置部位の皮膚生検試料のＨ＆Ｅ染色により、移植後２週間で、線維組織の非常に狭い層がＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４周囲に形成されたことが示される。図６（ｃ）の白い矢印はＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４ゲルの構造を示し、黒い矢印はＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４ヒドロゲル周囲の最小限の線維組織形成を特定している。炎症の増加が障害性の創傷リモデリングと相関することを認識すると、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４周囲に形成された線維組織の低減は、この材料が有効な軟組織修復に貢献していることを示唆する。

新血管化
移植部位における血管形成および内方成長を、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＸＲライブイメージャーを使用して、蛍光放射効率により決定した。移植手術後２週間および４週間で、血管新生応答を、ＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ７５０ ＥＸ ｉｎ ｖｉｖｏ血液プール蛍光撮像プローブを用いて決定した。この近赤外線蛍光巨大分子プローブは脈管構造中に存続し、血管および血管新生の撮像を可能にする。外科手術後の各時間点で、各マウスに、１００μＬのＰＢＳ中の２ｎｍｏｌのＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ７５０ＥＸを注射した。２４時間後、各マウスを蛍光放射効率に関してスキャンした（ｎ＝８）。

放射効率を使用して、創傷領域における新しい血管の密度を示した。図７の結果は、手術後２週間で、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４処置部位に対する蛍光放射効率は、Ｉｎｔｅｇｒａ処置部位に対する蛍光放射効率より有意に高い（ｐ＜０．０１）ことを示した。対照的に、手術後４週間で、血管新生シグナルは両方の処置群に関して非常に低く、血管形成が制御され、部位の治癒が終了したことを示した。４週間後の処置部位が血管新生シグナルを見せないことを示す同様の知見が、以前の研究で報告されている（Ｙｉｗｅｉ Ｗａｎｇら、２０１５年）。

本発明の組成物内の血管内方成長および細胞浸潤
皮膚移植後４週間で、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４処置部位の組織学的評価により、血管内方成長および宿主細胞浸潤を支持するＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の可能性が確認された。皮膚生検試料のＨ＆Ｅ染色を図８に示す。以前に概説したように、線維組織の薄層がＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４構造周囲に形成され、注射可能ヒドロゲルが、身体内で十分に認容されることを示す；図８（ａ）および図８（ｂ）。より重要なことには、この線維組織の薄層は、真皮中のＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４境界の指標として使用することができる。

図８（ｃ）および図８（ｄ）の結果は、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の構造内の血管の形成を示す。加えて、皮膚生検試料の染色は、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４ヒドロゲルの構造内の宿主線維芽細胞の明らかな浸潤を示した；図８（ｄ）。本発明の組成物の構造内の線維芽細胞浸潤および皮膚細胞外基質の形成をさらに確認するために、移植後４週間で、皮膚移植部位をマッソントリクロームで染色した。図９の結果は、移植手術後４週間の、本発明の組成物内のコラーゲン線維形成を示す。この結果により、本発明の組成物の構造内の線維芽細胞の浸潤および宿主組織と一体化しかつ新真皮形成を促進するその可能性が確認される。

ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の構造内のコラーゲン線維の形成は、Ｉｎｔｅｇｒａの構造内で検出されたコラーゲン線維の形成より有意に高かった。ＣＣＣの結果は、Ｉｎｔｅｇｒａの構造内のコラーゲン形成が、本発明の組成物と比較して有意に少ないことを示した。この結果はまた、文献で報告された以前の知見と一致している（Ｙｉｗｅｉ Ｗａｎｇら、２０１５年）。

この研究からの知見により、宿主組織一体化、血管内方成長、細胞浸潤および新真皮形成を支持するＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の足場効果が確認された。

技術的実行可能性：結論
ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４は、強化された動物研究の試行に成功した。強化された動物研究には、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４と至適基準の皮膚テンプレート（Ｉｎｔｅｇｒａ皮膚基質）との直接比較を伴う４０の全層皮膚移植が含まれた。研究期間中、Ｉｎｔｅｇｒａ群における８２％の成功率と比較して、本発明の組成物で処置した全ての皮膚移植が生着した（１００％生着）。加えて、本発明の組成物は、その構造内で血管網形成を迅速にし、炎症応答を最小とし、皮膚細胞の浸潤を促進して、部位において新真皮およびコラーゲン線維を形成した。これらの結果から、熱傷後の瘢痕管理における本技術の高い可能性が示される。

臨床研究－調査デバイスの説明
本発明の組成物ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４を、即使用可能な滅菌シリンジ中で供給した。本製品は、単回使用および２重小袋包装である。本発明の組成物は室温で液体であり、所望の臨床上の位置への直接の注射が可能である。体温で、本発明の組成物は白色の伸縮性足場を形成する。

デバイス組成
本発明の組成物は、注射可能な足場である。本発明の組成物の製剤には２つの主要部分；（１）合成ポリマー（ＰＮＰＨＯ）および（２）合成の非ヒトまたは動物由来のペプチド、すなわちチモシンベータ－４がある。これらの２つの部分は化学的に結合され、単一の均一分子（例えば、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４）の形成をもたらす。

このスマートポリマーは、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド－ｃｏ－（Ｎ－アクリロキシスクシンイミド）－ｃｏ－（ポリラクチド／２－ヒドロキシメタクリレート）－ｃｏ－（オリゴ（エチレングリコール）であり、ＰＮＰＨＯと表される。本発明の組成物に使用されるＰＮＰＨＯの特定の配合は、ＰＮＰＨＯ ５：８（５）：７：８１である。等モル量のＰＮＰＨＯおよびチモシンベータ－４を、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の製剤に使用する。

デバイスの意図される使用
ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４は、骨再生を促進することを意図する。詳細には、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４は、抜歯後の骨吸収を低減し、患者の健康的転帰を促進することが示される。

臨床調査計画－研究目的
主要目的は、定性的測定および分析的方法論を特定し、本発明の組成物の使用をさらに調査することであった。詳細には、歴史的な（文献）対照集団と比較した、抜歯後の本発明の組成物の存在下における治癒プロセスならびに、組織学的およびＣＴ－評価された骨再生の判定および適性である。副次的目的は、ヒトにおける本発明の組成物のｉｎ ｖｉｖｏ特徴を検討することである。

臨床調査設計－臨床治験エンドポイント
この調査の臨床治験エンドポイントは、定性的測定および分析的方法論を特定し、手術後３～４カ月までの本発明の組成物の使用をさらに調査することであった。詳細には、歴史的な（文献）対照集団と比較した、抜歯後の本発明の組成物の存在下における治癒プロセスならびに、組織学的およびＣＴ－評価された骨再生の判定および適性である。加えて、臨床治験エンドポイントは、手術後３～４カ月のヒトにおける本発明の組成物のｉｎ ｖｉｖｏ特徴を検討するように設計した。

データ品質保証
この臨床調査を、ＩＳＯ １４１５５に準拠し、ＳＳＲの内部手続要件に基づいて、出願人の認証ＩＳＯ １３４８５品質管理システム下で、設計、構成、およびモニタリングを行い、かつデータ作成、文書化、記録して報告した。

臨床調査の管理を、独立したＣＲＯ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｓｔａｒｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＳＳＲ）に外部委託した。全てのデータポイントは、治験全体を通してＳＳＲにより１００％監視された。データの品質保証および品質管理のためのモニタリング訪問を、表７に明記された間隔で実施した。

参加者集団
１０人の患者（１０）をこの研究に登録した。患者の人口統計の要約を表８に示す。

処置スケジュール
研究手順ならびに訪問および追跡調査のためのスケジュールを表９に概説する。プロトコルを、臨床調査計画（ＣＩＰ）の計画通りに実行した。参加者＃７以外の全ての参加者は計画に従い、追跡調査訪問はスケジュール通りに行われた。個人的な事情のため、参加者＃７は計画された処置を変更し、したがって、参加者＃７に関して組織構造は訪問４において収集されなかった。

追跡調査期間
研究参加者を、抜歯および本発明の組成物を用いた処置後の３カ月間（３）追跡調査した。

表１０は、個々の訪問ウィンドウと共に、意図される追跡調査訪問スケジュールを概説する。時間点ゼロ（０）は、抜歯（および処置集団に対する本発明の組成物のインプラント術）時である。

結果－対象物および調査デバイスの廃棄
１０人の患者を本発明の組成物で処置した。デバイスを全ての参加者にインプラントした。臨床調査の終了後、調査デバイスは部位に残されなかった。全ての調査デバイスを、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｓｔａｒｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＳＳＲ）臨床研究機構によるデバイス説明責任手順に基づいて調整した。

全ての知見は定性的判定であり；これらには、限定されないが、抜歯後の異なる時間点での創傷外観、患者による疼痛および不快の報告、手術後３カ月のＣＴスキャンを用いた内在する骨の放射線学的外観、インプラント設置手術中の部位の目視での外観ならびに手術後３～４カ月の処置部位の組織学的検査が含まれる。

デバイス有用性
臨床調査全体を通して、デバイス機能不良の報告はなかった。本発明の組成物は即使用可能な型式で提供され；これは、手術前の臨床医による予混合および任意の他の準備ステップの必要がない。図１１ｂは、特に、本発明の組成物が、２１Ｇ針を介して抜歯部位に容易に注射できることを示す。その後、生成物の親水性に起因し、本発明の組成物は部位において血液と混合し、ヒドロゲルを形成して血餅を安定化する。

ＰＥＴ治験におけるこのデバイスの臨床使用は、抜歯窩部位への本発明の組成物の注射が１０人全ての患者に成功したことを示し、調査責任者がデバイス機能不良を報告することはなかった。図１２の結果は、１０人全ての患者に関して、本発明の組成物の適用およびゲル化における１００％の成功率を示した。

本発明の組成物の有用性からの知見の要約を、表１１に概説する。調査責任者によると、本発明の組成物の使用により、現場で４５分までの時間短縮ができる。これは、抜歯後の本発明の組成物の使用により、例えば膜の使用および部位のマイクロ縫合のような予備的な閉鎖の必要がなくなるため、達成することができる。

デバイス安全性および創傷治癒
本発明の組成物で処置した１０人全ての患者は、手術後１週間で第１の追跡調査訪問に戻った。患者からの疼痛または不快の報告はなかった。口腔検査（投与後１週間）中、部位における感染または炎症の徴候はなかった。加えて、創傷閉鎖および軟組織形成を調査責任者が検査した。１０人全ての患者において、創傷閉鎖が認められ、迅速な軟組織形成が検出された（図１２の結果）。

抜歯および本発明の組成物を用いた処置の３カ月後、患者はインプラント設置手順を受けた。この時点で、本発明の組成物の注射部位から生検試料を収集した。独立した研究所（Ｓｏｎｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）により、試料の組織化学的分析を行った。これらの組織化学的分析からの知見を表１２に要約する。分析された全ての試料において、壊死、異物巨細胞または異物反応の証拠はなかった。これらの知見により、本発明の組成物は身体内で十分に認容され、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて生体適合性であることが示唆される。

骨再生に対する有効性の指標
手術後３カ月に、部位のＣＴ－スキャン撮像を使用して、治癒進行および部位における骨吸収の拡張を調査した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＩｍａｇｉｎｇでのＤｒ Ｔｏｍ Ｈｕａｎｇから報告された独立ＣＴ－スキャンにより、骨吸収が最小限であったことが確認された。部位のＣＴスキャン撮像に加えて、インプラント設置手順中に、生検試料を本発明の組成物注射部位から収集した。この試料を固定し、独立した組織化学的分析に送った。部位のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにマッソントリクローム染色を使用して、部位における病理学的挙動および骨再生プロセスを分析した。分析された全ての試料では、組織化学的分析により、相互接続した生存可能な骨梁、線維状骨と層板状骨、同様に活性の骨芽細胞と破骨細胞の混合物の形成が示された。全ての患者において、活発な歯周骨リモデリングが認められた。

Ｈ＆Ｅおよびマッソントリクローム染色された組織化学的標本に関する独立した研究所からの全ての報告を表１３に示す。

ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４のエアロゾル形成性能
異なる固形分含有量（１７．５ｍｇ／ｍＬ～１４０ｍｇ／ｍＬの範囲のＰＮＰＨＯ濃度）を有する各製剤に関する体積－直径分布および導出パラメータ（ｄ１０、ｄ５０、ｄ９０および％Ｖ＞１０）としての粒度分析を実行した。試験を行った製剤の濃度および温度にかかわらず、全ての製剤から生じたエアロゾル液滴は、双峰性分布を示した。一般に、第１のピーク（約５０μｍ）は、製剤の濃度減少に伴い増加する傾向があり、一方、第２のピーク（約５００～６００μｍ）は濃度につれて増加する。これは、エアロゾル液滴の大部分が１０～１００μｍ範囲であったことを示唆している。

全ての希釈製剤に対する百分位サイズは、それぞれｄ１０、ｄ５０およびｄ９０に関して２１．４±３．９μｍ、４５．６±９．４μｍおよび２３８．６±１８１．５μｍ（平均）であった。経鼻送達用に普及している中央値サイズは、３０～１２０μｍ（１）であり、したがって全ての希釈製剤は、経鼻送達用の規定内であった。重要なことに、全ての製剤は、＜１０ｕｍの直径を有する液滴を３体積％未満有し、経鼻送達に対するその適合性および下気道沈着の回避を示唆した。第９０百分位サイズは最大の変動性を示し、特により濃縮された製剤に関して、劣悪な液滴噴射を伴う潜在的な問題を示唆している。

プルーム被覆
経鼻製剤の噴霧パターンの特徴付けが、ＦＤＡにより推奨されている。試験した製剤（室温において作動）に関するプルームパターンを図１５に示す。全ての製剤は広い被覆領域を示したが、最も明白な特徴は、製剤濃度の増加に伴う、プルームの中央における沈着の欠如であった。

これらの違いにもかかわらず、Ｄ_ｍａｘおよびＤ_ｍｉｎ値（図１６）は、試料にわたり一定であり、得られた楕円率（約１）は、エアロゾル化時の噴霧対称性の指標である。全ての製剤に関する楕円率は、ＦＤＡの規定内（１．００～１．３０）である。実際に、経鼻送達のための最良の選択肢は、被覆領域と滞留時間の改善の間のトレードオフの関係であるべきである。より大きい被覆領域では、流出が起きる場合、最良の転帰は提供されなかった。

経鼻沈着パターン
ヒト経鼻モデルにおける製剤の沈着パターンを、図１７に示す。試験した両方の製剤（１７．５ｍｇ／ｍＬおよび３５ｍｇ／ｍＬ）は、沈着パターンが安定したままで、作動から１５分まで相対的に変化しなかったため、迅速な接着を示した。さらに、のどへの滴下は観察されなかった。製剤の短期間における接着性により、送達されたカーゴのより高度の滞留時間および生物学的利用能が示され得る。両方の製剤とも、鼻－脳送達にとって重要である嗅覚領域（鼻領域の上部）に到達することができた。

ＰＮＰＨＯベースのヒドロゲルからの薬物のｉｎ ｖｉｔｒｏ放出
シプロフロキサシンＨＣｌをモデル薬物として使用して、ＰＮＰＨＯベースのヒドロゲルが小親水性薬物の放出を制御し、投与後の薬物突発放出を防ぐ可能性を調査する。ゲル化プロセス中のポリマー鎖中の疎水性ドメインの集合により、基質から水が追い出される。ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４から浸出するシプロフロキサシンＨＣｌの量を判定するために、スナップウェル装置を使用してヒドロゲルを判定した。簡潔に言えば、シプロフロキサシンＨＣｌ粉末を、ＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４溶液に溶解した（２０ｍｇ／ｍＬ）。その後、２００μＬのＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４／シプロフロキサシンＨＣｌ製剤を、スナップウェルの先端チャンバーに入れ、３７℃にて３０分間、スナップウェルが平面上にある間にヒドロゲルを形成させて、膜を介したポリマー損失を回避した。次に、ヒドロゲルの最上部の液体上清層を収集した。

ゲルからの経時的な薬物放出をさらに分析するために、２ｍｌのＰＢＳを各スナップウェルの側底部区画に添加してから、プレートを３７℃にて一定の軌道振盪下（６０ｒｐｍ）でインキュベートした。２４時間の所定の時間点で、試料を側底部の媒体から取り出し（２００μＬ）、毎回、等量の新しい事前に加温したＰＢＳと置き換えた。全ての試料を、認証済み高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、シドニー ＮＳＷ、オーストラリア）を使用して、シプロフロキサシンＨＣｌに関して定量化した。

ＨＰＬＣを介したシプロフロキサシンＨＣｌの定量化
シプロフロキサシンＨＣｌの定量化を、ＬＣ２０ＡＴポンプ、ＳＩＬ２０ＡＨＴオートサンプラーおよびＳＰＤ－２０Ａ ＵＶ－ＶＩＳ検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、シドニー ＮＳＷ、オーストラリア）からなるＨＰＬＣシステムを使用して決定した。試料定量化を、逆相Ｌｕｎａ Ｃ－１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＵＳＡ）１５０×４．６ｍｍおよび３μｍの粒度を使用して実施した。測定を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）：アセトニトリル（７５：２５ ｖ／ｖ）からなる移動相、０．７ｍＬ／分の流速、２７５ｎｍの検出波長および１００μＬの注入体積を使用して実行した。アセトニトリル：水（５０：５０ ｖ／ｖ）のニードル洗浄において標準溶液を毎日新しく調製し、０．０５～１００μｇ／ｍＬの濃度内で、回帰値＞０．９９９で、直線性を確認した。

ゲル化プロセス中（３０分）、生理学的条件下で、ＰＮＰＨＯヒドロゲルからのシプロフロキサシンＨＣｌの初期の放出を評価した。平均２．７±１．４μｇおよび２８．９±１７．９μｇ（ｎ＝３）（図１８；ｔ＝０）のシプロフロキサシンＨＣｌが、それぞれＰＮＰＨＯおよびＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４の液体先端層内に放出されたことが見い出された。ヒドロゲルからの試験薬物の初期の放出は、負荷量と比較して無視できること、すなわち、負荷量は２０ｍｇ／ｍＬ、ＰＮＰＨＯおよびＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４からの放出量はそれぞれ２．７±１．４μｇおよび２８．９±１７．９μｇであることに留意することが重要である。

投与時のヒドロゲルからの相対的に低いシプロフロキサシン放出のパーセンテージにより、薬物送達用途に対する本発明の高い可能性が示される。３７℃におけるヒドロゲルからのシプロフロキサシンＨＣｌの経時的な放出は、図１８で各製剤における累積質量として表される。２４時間後、それぞれＰＮＰＨＯおよびＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４から、１３７．４±３２．４μｇ（８９．５±１５．８％）および１３３．７±４２μｇ（６５．３±１０．５％）が放出され、２種のヒドロゲル間で、放出されたシプロフロキサシンＨＣｌ量の間に有意差はなかった。これらの結果により、ＰＮＰＨＯベースのヒドロゲルからの薬物の持続放出性および制御放出性のプロファイルが確認された。

有害事象の要約
臨床治験全体を通して報告された医療用デバイスの有害事象はなかった。この治験で報告された唯一の有害事象は、参加者番号７の処置計画に関するものであり；番号７の参加者が、処置計画を変更して骨組織構造を除外することを選択したため、この参加者に関して組織構造は訪問４において収集されなかった。

デバイス有用性に関する結論
本発明の組成物を、困難を伴うことなく、１０人全ての患者に投与した。デバイス（シリンジ）機能不良は、本研究において報告されなかった。使用前に、デバイスの調製および／または混合をする必要はなかった。本発明の組成物は、抜歯窩部位への注射時に、白色ヒドロゲルを即時形成する。生成物は血液と混合し、抜歯部位に接着した。生成物は部位に接着し、部位で予備的に閉鎖してデバイスを含有する必要がなかった。

デバイス安全性
デバイス関連の有害事象、または重篤有害事象は、本研究では報告されなかった。１０人（１０）全ての患者は、抜歯後７日で、第１の追跡調査訪問に戻り、患者から炎症、感染、疼痛または不快の報告はなかった。９人（９）の患者は、インプラント設置手術を受け、その間に組織化学的分析のために元の組織を収集した。部位のＨ＆Ｅ染色により、この生成物は身体内で十分に認容され、部位において異常性または異物巨細胞の徴候はなかったことが示された。部位において壊死または壊死組織は認められなかった。加えて、抜歯部位および本発明の組成物の処置部位のＣＴスキャンにより、部位において骨様異常性はないことが示された。

デバイス有効性
抜歯および本発明の組成物を用いた処置の７日後に、全ての患者に関して創傷閉鎖が認められた。細胞レベル、骨芽細胞および破骨細胞の活性、活発な骨リモデリングが認められた。生存可能な骨および骨リモデリングが処置部位に認められ、デバイスの骨誘導特性を示した。この生成物は骨形成を誘起せず、仮説通り、宿主組織に対する他の表現型の影響を及ぼさなかった。

リスクおよび利益の判定
デバイスの潜在的な利益を慎重に考慮すると、このデバイスが許容されるかどうかを決定するために、デバイスの潜在的な利益および確認される残存リスクを、個々のおよび集合的な基準で評価した。

明らかとなった証拠は、骨に固定された補綴物が、咀嚼、発話および全般的な健康結果を含む生活の質の尺度を改善することを示唆している。しかし、経済的な障壁および口腔外科医へのアクセスが、インプラント固着される補綴物の広範な使用に対する制限と認識されている。臨床的見地から、抜歯後の骨の損失を最小限にすることが、骨に固定された補綴物の利用を簡素化し、したがって改善するために不可欠である。

抜歯後の骨体積の損失は、臨床医にとって管理するのが困難であり、特に非都会の社会経済的に不利である地域において、患者および健康システムに経済的負担を課す。歯科におけるこの問題および困難さの程度は、患者の２人のうち１人が、インプラント設置の成功のために、骨体積を増加させるための二次的な移植手順を必要とするという事実により強調される。本発明の組成物は、抜歯後に隆線骨体積を保存することができる材料を使用することが容易である。歯科医は、インプラント設置手順の容易な使用および予測性を高く評価する。本発明の組成物の使用により、抜歯後の創傷治癒が促進され、骨治癒が加速されて、二次的な増強的手順の必要を潜在的に防ぐことができるため、患者は利益を受ける。

新しい抜歯窩における本発明の組成物の適用は、臨床現場で使用するのが簡便で容易であった。他の全ての骨代用物と異なり、本発明の組成物は、液体として抜歯窩に送達され、その部位に伸縮性基質を形成する。パイロットＰＥＴ治験の主要目的は、本発明の組成物の安全性、有用性および骨誘導性を調査することであった。放射線撮像および組織化学的分析を含む、有効性の目安となるものを収集した。要約すると、治験が作動していない間は、ＰＥＴがデバイスの安全性および有用性を確認し；デバイス機能不良は認められず、デバイス関連の有害事象は検出されなかった。

意図された使用、意図された使用者、合理的に予見可能な誤用、本発明の組成物のデバイスファミリーが有し得る効果的な使用を考慮し、一般的に認識される当該分野の状況を考慮すると、リスク管理プロセスにより、潜在的なデバイス利益が残存リスクを上回ることが確認されたと結論付けることができる。

本発明の組成物の臨床関連性
本発明の組成物は、組織欠損／腔を充填するための安全で容易に使用できる生体材料として開発されてきた。本発明の組成物は、チモシンベータ－４と架橋した合成「スマート」ポリマー（ＰＮＰＨＯ）で構成される単一の均一分子である。本発明の組成物は室温で液体であり、所望の臨床上の位置への直接の注射が可能である。本発明の組成物は、体温に曝された時に伸縮性ゲルを形成し、血液と混合し、部位において血餅を安定化する。１０人の患者（１０）に、本発明の組成物を投与した。本発明の組成物の使用時に、デバイス機能不良またはデバイス関連の有害事象は報告されずまたは認められなかった。投与後１週間で、創傷治癒が認められた。

手術後３カ月に、病理学的異常、例えば、炎症、感染または巨細胞は、投与部位に検出されなかった。加えて、活発な骨リモデリング、同様に骨芽細胞および破骨細胞の活性が、本発明の組成物で処置した部位に検出され、デバイスの骨誘導特性が確認された。これらの知見により、この生成物は、例えば、部位における軟組織および硬組織の修復のような表現型の影響を誘起しなかったため、軟組織および硬組織の両方における創傷治癒に関する本発明の組成物の高い可能性が示された。しかし、本発明の組成物の骨誘起特性を増加させることにより、さらなる健康上の利益が達成可能であると考えられる。

臨床研究の要約
パイロット治験は、１０人の患者における抜歯後の抜歯窩保存のための、本発明のＰＮＰＨＯ－ｃｏ－ＴＢ４足場の使用を含んだ。全ての患者において、出願人のデバイスは投与に成功し；膜の使用または抜歯部位におけるマイクロ縫合の必要はなかった。このため、調査責任者は現場で時間短縮が可能となる。追跡調査訪問では、抜歯後７日で創傷閉鎖が認められ、いずれの患者にも感染または炎症の徴候はなかった。本発明の組成物の使用後３カ月に、組織化学的分析用に、部位から組織生検試料を収集し；その結果により、生成物が十分に再吸収され、部位には病理学的異常の徴候はないことが示された。加えて、活発な骨リモデリングも部位において認められた。

本発明は、特定の実施例を参照して記載されているが、本発明が多くの他の形態で実施され得ることが当業者には理解されるであろう。

出願人は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのエアロゾル形成研究およびベンチトップの薬物放出試験の実施における、Ｄｒ Ｈｕｉ ＯｎｇおよびＤｒ Ｄｉｎａ Ｓｉｌｖａの貢献に感謝する。

Claims (46)

1. ポリマーおよび天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）を含む組成物であって、上記ポリマーが、
   水を結合させるための第１のモノマー、
   上記ヒドロゲルに機械特性を付与するための第２のモノマー、
   天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）に結合するための第３のモノマー、および
   相転移挙動を付与するための第４のモノマーを含み、
   上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）がチモシンベータ－４またはその機能的ホモログである、組成物。
2. 第１のモノマーがポリエーテル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アミノ酸）およびデキストランから選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 上記ポリエーテルがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンオキシド－ｃｏ－プロピレンオキシド（ＰＰＯ）、それらのｃｏ－ポリエチレンオキシドブロックまたはランダムコポリマーから選択される、請求項２に記載の組成物。
4. 第１のモノマーがオリゴ（エチレン）グリコールモノメチルエーテルメタクリレート（ＯＥＧＭＡ）である、請求項２に記載の組成物。
5. 第２のモノマーがメタクリレート、またはメタクリレートを含むランダムコポリマーである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 第２のモノマーがヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレートポリ（乳酸）コポリマー（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）、ポリ（乳酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコリド）、ポリ（グリコリド－ｃｏ－ラクチド）またはポリ（グリコリド－ｃｏ－カプロラクトン）から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 第２のモノマーがヒドロキシエチルメタクリレートポリ（乳酸）（ＨＥＭＡ－ＰＬＡ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 第３のモノマーが上記ＮＳＰＰに結合するための求電子性官能基を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 第３のモノマーがＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＳＮＨＳ）、Ｎ－ヒドロキシエトキシ化スクシンイミド（ＥＮＨＳ）、およびＮ－アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 第３のモノマーがＮ－アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 第４のモノマーがポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）およびポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）ホモポリマーおよびコポリマーから選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 第４のモノマーが（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 上記ポリマーが第１のモノマーを約３～約８ｍｏｌ％、好ましくは約５ｍｏｌ％の量で含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 上記ポリマーが第２のモノマーを約５～約９ｍｏｌ％、好ましくは約７ｍｏｌ％の量で含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 上記ポリマーが第３のモノマーを少なくとも約７ｍｏｌ％の量で含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 上記ポリマーが、
    約３～約８ｍｏｌ％の量の第１のモノマー、
    約５～約９ｍｏｌ％の量の第２のモノマー、
    少なくとも約７ｍｏｌ％の量の第３のモノマー、および
    上記ポリマーの組成の１００％までの残部を構成する量の第４のモノマーを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
17. 上記ポリマーが第４のモノマーを約６０～約８５ｍｏｌ％の量で含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 第１のモノマーがＯＥＧＭＡであり、
    第２のモノマーがＨＥＭＡ－ＰＬＡであり、
    第３のモノマーがＮＡＳであり、
    第４のモノマーがＮＩＰＡＡｍであり、
    上記ポリマーが、
    約３～約８ｍｏｌ％の量のＯＥＧＭＡ、
    約５～約９ｍｏｌ％の量のＨＥＭＡ－ＰＬＡ、
    約７ｍｏｌ％超の量のＮＡＳ、および
    約８５ｍｏｌ％までの量のＮＩＰＡＡｍを含む、請求項１に記載の組成物。
19. 上記ポリマーが、
    約５ｍｏｌ％の量のＯＥＧＭＡ、
    約７ｍｏｌ％の量のＨＥＭＡ－ＰＬＡ、
    約７ｍｏｌ％超の量のＮＡＳ、および
    約８１ｍｏｌ％までの量のＮＩＰＡＡｍを含む、請求項１８に記載の組成物。
20. 上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）がチモシンベータ－４である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
21. 等モル量の上記ポリマーおよびチモシンベータ－４を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
22. 上記ポリマーの濃度が上記組成物の約１００ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
23. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物および水を含むヒドロゲルであって、ＮＳＰＰの第３のモノマーへの結合が上記ポリマーを架橋し、これにより上記水がその中に含まれているヒドロゲルを形成する、ヒドロゲル。
24. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物に水を添加することを含む、ヒドロゲルを作製する方法。
25. 請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物の水溶液を上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）の水溶液と混合することを含む、ヒドロゲルを作製する方法。
26. 上記ヒドロゲルが体温で形成される、請求項２５に記載の方法。
27. 上記ヒドロゲルが、注射による上記組成物およびＮＳＰＰの哺乳動物への投与後に形成される、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
28. 硬もしくは軟身体組織の修復および／もしくは再建；創傷治癒；一時的な皺の減少；瘢痕の基部を一時的に持ち上げ、治癒を促進すること；外科的介入後の瘢痕組織における皮膚結合組織形成を支持し、治癒を促進すること；熱傷後の瘢痕管理において皮膚結合組織形成を支持すること；出血を伴う急性皮膚欠損において血管内方成長を支持し、治癒を促進すること；外科的に生じた皮膚腔の充填；皮膚移植手術の支持；骨移植片代用物の物理的送達；補綴物の充填；組織誘導特性を有しない充填剤としての使用；抜歯後の歯周組織の支持および修復；または歯周靭帯組織を一時的に持ち上げるおよび／もしくは歯周靭帯組織移植を支持することのためのヒドロゲルの製造における、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
29. 組織の修復および／または再建のための医薬の製造における、請求項２３に記載のヒドロゲルの使用。
30. 哺乳動物に請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、硬もしくは軟身体組織の修復および／もしくは再建；創傷治癒；一時的な皺の減少；瘢痕の基部を一時的に持ち上げ、治癒を促進すること；外科的介入後の瘢痕組織における皮膚結合組織形成を支持し、治癒を促進すること；熱傷後の瘢痕管理において皮膚結合組織形成を支持すること；出血を伴う急性皮膚欠損において血管内方成長を支持し、治癒を促進すること；外科的に生じた皮膚腔の充填；皮膚移植手術の支持；骨移植片代用物の物理的送達；補綴物の充填；組織誘導特性を有しない充填剤としての使用；抜歯後の歯周組織の支持および修復；または歯周靭帯組織を一時的に持ち上げるおよび／もしくは歯周靭帯組織移植を支持することための方法。
31. 哺乳動物に請求項２３に記載のヒドロゲルを投与することを含む、組織の修復および／または再建の方法。
32. 投与ステップが注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより上記哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
33. 組織の修復および／もしくは再建；創傷治癒；一時的な皺の減少；瘢痕の基部を一時的に持ち上げ、治癒を促進すること；外科的介入後の瘢痕組織における皮膚結合組織形成を支持し、治癒を促進すること；熱傷後の瘢痕管理において皮膚結合組織形成を支持すること；出血を伴う急性皮膚欠損において血管内方成長を支持し、治癒を促進すること；外科的に生じた皮膚腔の充填；皮膚移植手術の支持；骨移植片代用物の物理的送達；補綴物の充填；組織誘導特性を有しない充填剤としての使用；抜歯後の歯周組織の支持および修復；または歯周靭帯組織を一時的に持ち上げるおよび／もしくは歯周靭帯組織移植を支持することに使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
34. 上記充填剤が組織誘導特性を有しない、請求項３３に記載の使用のための組成物。
35. 抜歯後の歯周組織の支持および修復に使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
36. 歯周靭帯組織を一時的に持ち上げるおよび／もしくは歯周靭帯組織移植を支持することに使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
37. 組織の修復および／または再建に使用するための、請求項２３に記載のヒドロゲル。
38. 投与ステップが注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
39. 投与ステップが注射によってまたはエアロゾルを投与することによって行われ、これにより哺乳動物の体温でヒドロゲルを形成する、請求項３７に記載の使用のためのヒドロゲル。
40. ヒドロゲルを形成するためのキットであって、
    ポリマーおよび天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）を含み、
    上記ポリマーが、
    水を結合させるための第１のモノマー、
    上記ヒドロゲルに機械特性を付与するための第２のモノマー、
    天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）に結合するための第３のモノマー、および
    相転移挙動を付与するための第４のモノマーを含み、
    上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）がチモシンベータ－４またはその機能的ホモログである、キット。
41. 別個の容器に水をさらに含む、請求項４０に記載のキット。
42. ヒドロゲルを形成するためのキットであって、別個の容器に、
    天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）、および
    組成物を含み、
    上記組成物が、
    水を結合させるための第１のモノマー、
    上記ヒドロゲルに機械特性を付与するための第２のモノマー、
    天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）に結合するための第３のモノマー、および
    相転移挙動を付与するための第４のモノマーを含み、
    上記天然または合成ペプチドまたはタンパク質（ＮＳＰＰ）がチモシンベータ－４またはその機能的ホモログであり、
    ＮＳＰＰおよび第２のモノマーが架橋され、これにより、上記組成物が水と接触すると上記ヒドロゲルの形成が可能になる、キット。
43. ＮＳＰＰおよび上記組成物の一方または両方が固体形態である、請求項４２に記載のキット。
44. 別個の容器に水をさらに含む、請求項４２または請求項４３に記載のキット。
45. 上記キットの成分の逐次または同時投与についての指示書をさらに含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載のキット。
46. 分注されると、上記組成物、ＮＳＰＰおよび水が互いに混合されるように構成されている、請求項４２～４５のいずれか一項に記載のキット。

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