CN113301927A - 生物相容性材料 - Google Patents

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特伦斯·阿布拉姆斯
达克斯·考尔德
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Abstract

本发明提供了包含聚合物和天然或合成肽或蛋白质(NSPP)的组合物。该组合物与水形成水凝胶。该组合物可用作用于美容和治疗应用的填充物。本发明的实施方案提供了使用该组合物或水凝胶来治疗某些病症的方法，以及用于同时或顺序施用该组合物的各组分以能够原位形成水凝胶的外科手术试剂盒。

Description

生物相容性材料
相关申请
本申请要求澳大利亚临时专利申请2019904817(2019年12月19日)和2020903462(2020年9月25日)的协定优先权，其公开内容通过引用以它们各自的整体并入本文。
技术领域
本发明涉及生物相容性材料。所述生物相容性材料可用于组织再生和修复。
本发明涉及一种填充物，其支持受损组织的自然愈合而不诱导任何特定组织形成。目的是使用本发明来部分或完全填充或覆盖组织空腔或缺损，以提供所需的填充空间并且具有最小的异物反应。
在一个实施方案中，本发明涉及组织传导性(tissue conductive)医用填充物。在一个实施方案中，本发明的聚合物可以被配制成水凝胶。在另一个实施方案中，水凝胶是热响应性的。在另一个实施方案中，已经开发了本文公开的组合物以用于以可以被注射、被浇铸或被喷雾的可流动形式进行递送。在一个实施方案中，所述组合物在施用至身体内或上或附近之后形成水凝胶。
本发明可用于组织工程应用。这包括美容应用和治疗应用二者。本发明可用于皮肤应用以及牙科和骨科应用以治疗慢性、急性或外科手术造成的缺损。但是，应当理解，本发明不限于这些特定的使用领域。
背景技术
提供对现有技术的以下讨论以将本发明置于适当的技术背景下，并使本发明的优点能被更充分地理解。然而，应当理解，在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应视为明示或暗示承认这样的现有技术是本领域众所周知的或形成了本领域部分的公知常识，或该现有技术可以被本领域技术人员合理地预期为确定、理解和认为是相关的。
本文引用的所有专利和出版物均通过引用以它们的整体并入本文。
WO 2013/091001(PCT/AU2012/001566)涉及聚合物，尤其是可用作水凝胶的聚合物，并且涉及水凝胶用于组织修复或恢复的用途。特别地，WO 2013/091001的聚合物和水凝胶可用于软骨，尤其是关节软骨的修复或恢复。聚合物至少包含用于结合水的单体、用于赋予机械性能的单体和用于结合细胞外蛋白的单体。水凝胶包含至少包含用于结合水的单体和用于结合至细胞外蛋白的单体的聚合物。通过结合所述细胞外基质蛋白使聚合物交联形成水凝胶。
WO 2017/035587(PCT/AU2016/050817)公开了可用于组织再生和修复的生物相容性材料，其中生物活性聚合物可以是水凝胶(例如热响应性水凝胶)的形式。WO 2017/035587的生物活性聚合物和所得水凝胶可用于骨组织的再生。因此，WO 2017/035587公开了治疗哺乳动物中的骨缺损的方法，所述方法包括将治疗有效量的由生物活性聚合物形成的水凝胶施用于哺乳动物以治疗骨缺损。
WO 2017/015703(PCT/AU2016/050653)公开了一种聚合物，包含至少一种防腐/镇痛/抗炎单体单元联合至少三种其它单体单元，所述三种其它单体单元引起选自由以下组成的组的性质：温度活化、水溶性、机械强度、蛋白质/多糖键合能力及其组合。特别地，WO2017/015703公开了一种聚合物，其中：水溶性单体单元是亲水性乙二醇(OEGMA)部分；赋予机械强度的单体单元是聚丙交酯-共-2-羟基-乙基甲基丙烯酸酯(PLA/HEMA)；蛋白质反应性单体单元是N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)部分；并且热固性单体单元是N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)部分。防腐/镇痛/消炎单体单元包含水杨酸的甲基丙烯酸酯衍生物(5-HMA或4-HMA，或其组合)。
上面引用的所有三个申请都是本申请人的。在这种背景下开发了本发明。
在一种形式中，本发明体现为可流动的填充物，其中在施用到体内(例如通过注射)或施用到身体表面上(即在30-37℃)时，填充物形成粘性水凝胶。水凝胶在体内具有良好的耐受性，具有最小炎症反应。水凝胶是宿主组织传导性(tissue-conductive)的，但不是诱导性(inductive)的，因为其仅在活动性出血或包含再生生物组分的其它流体的存在下才显示再生特性。填充物可以通过细规格针(例如21G)注射。水凝胶粘附在注射部位。填充物可以被配制在气雾剂中以通过喷雾施用。水凝胶可以以在体内逐层产生3D结构的方式或通过微创方式局部被施用。本发明填充物的主要创新方面包括最小的异物反应、宿主组织传导性、与血液混合、可注射性、粘附特性、逐层填充和最佳降解谱。
本发明可用于软组织应用，例如皮肤应用，以及硬组织应用，例如牙科和骨科。例如，本发明可用于美容应用，例如皱纹减少。本发明可用于促进瘢痕愈合。这包括来自烧伤的瘢痕以及术后瘢痕。本发明还可用于控制慢性伤口，例如糖尿病性溃疡。
本发明也可用于牙科应用。牙齿拔除(Tooth extraction)是内在的创伤性程序，其损伤软组织、下层骨骼并最终导致颌骨或牙槽骨的显著损失。临床上，牙槽骨的损失导致与缺失牙的未来假体替换相关的美学和功能并发症。如果要用植入物支持的修复代替缺失牙，则总是需要复杂的骨移植程序。为了减少或潜在地消除复杂的骨移植程序，已经提出了牙槽或脊保留技术。
文献中已经描述了许多技术，其中大多数涉及在牙齿拔除后立即将移植填充材料放置在牙齿拔除牙槽内。有许多可用于填充拔除的可商购产品。的确，当前没有可用的产品能够将骨量恢复到拔除前的水平或导致改善的愈合结果。
对脱矿质骨同种异体移植物、合成生物活性玻璃和脱蛋白牛骨矿物质(异种移植物)进行的临床研究表明，即使在施用后6至9个月，移植颗粒仍被结缔组织或编织状骨质环境所包围。这些发现表明，愈合受到了移植颗粒的物理阻碍。即使在延长的等待时间之后，所产生的手术部位对于植入物放置也是不可预测的手术环境。考虑到与牙齿拔除后的骨损失有关的问题范围，对于改善牙齿拔除患者的骨愈合结果的支架存在显著未满足的需求。
通常需要在室温下可注射且在体温下形成水凝胶的用于组织修复的组合物。
本发明的组合物旨在用作支持受损组织的自然愈合而不诱导任何特定组织形成的填充物。目的是使用本发明部分地或完全地填充组织空腔，提供所需的填充空间并且具有最小异物反应。本发明可以粘附至空腔，与血液混合以促进宿主软组织和硬组织修复。为了诱导任何特定组织生长(例如软或硬)，本发明可以与其它活性成分组合使用。
本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代选择。
本发明的特别优选形式的目的是使用特定浓度和特定配方的PNPHO-co-TB4作为填充物材料。填充物材料不具有任何组织诱导特性。填充物可以与其它材料组合使用，例如，非活性的以提供3D结构，或活性的以诱导特定组织的形成。本发明可以被注射、被浇铸或被喷雾。可以调节聚合物和TB4的浓度以形成本发明的不同形式。
本发明旨在用于软组织和硬组织。在软组织方面，本发明被添加到用于皮肤类型应用的生物活性成分(如细胞或脂肪移植物)中；该产品可以被注射或被喷雾。对于硬组织或硬/软组织应用，本发明可以与3D填充物(例如，非活性骨颗粒)或活性化合物(例如，生长因子)一起施用以促进软组织和硬组织二者的生长。设想的商业形式是注射剂或油灰。
尽管以下将参考本发明的优选实施方案来描述本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明的精神和范围可以以许多其它形式体现。
发明内容
在本发明中，申请人优化了其专有的智能聚合物PNPHO，以与胸腺素β-4键合形成对细胞友好的医用填充物材料。
根据本发明的第一方面，提供了包含聚合物和天然或合成肽或蛋白质(NSPP)的组合物，其中所述聚合物包含：
用于结合水的第一单体；
用于赋予所述水凝胶机械性能的第二单体；
用于与天然或合成肽或蛋白质(NSPP)结合的第三单体；和
用于赋予相变行为的第四单体；
并且其中天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4或其功能同源物。
在一个实施方案中，第一单体选自：聚醚、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(氨基酸)和葡聚糖。
在一个实施方案中，聚醚选自：聚乙二醇(PEG)、低聚(乙二醇)(OEG)或其大分子单体、聚环氧乙烷(PEO)、聚环氧乙烷-共-环氧丙烷(PPO)、共聚环氧乙烷嵌段或其无规共聚物。
在一个实施方案中，第一单体是低聚(乙二醇)单甲基醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)。
在一个实施方案中，第二单体是甲基丙烯酸酯或包含甲基丙烯酸酯的无规共聚物。
在一个实施方案中，第二单体选自：甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸羟乙酯聚(乳酸)共聚物(HEMA-PLA)、聚(乳酸)、聚(己内酯)、聚(乙交酯)、聚(乙交酯-共-丙交酯)或聚(乙交酯-共-己内酯)。
在一个实施方案中，第二单体是甲基丙烯酸羟乙酯聚(乳酸)(HEMA-PLA)。
在一个实施方案中，第三单体具有用于与所述NSPP结合的亲电子官能团。
在一个实施方案中，第三单体选自：N-羟基磺基琥珀酰亚胺(SNHS)、N-羟基乙氧基化琥珀酰亚胺(ENHS)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)。
在一个实施方案中，第三单体是N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)。在一个实施方案中，第四单体选自：聚(环氧乙烷)/聚(环氧丙烷)和聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)均聚物和共聚物。
在一个实施方案中，第四单体是(N-异丙基丙烯酰胺)。在一个实施方案中，聚合物包含量为约3至约8mol％的第一单体。
在一个实施方案中，聚合物包含量为约5至约9mol％的第二单体。
在一个实施方案中，聚合物包含量为至少约7mol％，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19mol％的第三单体。
在一个实施方案中，聚合物包含：量为约3至约8mol％的第一单体，量为约5至约9mol％的第二单体，量为至少约7mol％的第三单体，和量为构成100％的所述聚合物组合物的其余部分的第四单体。
在一个实施方案中，聚合物包含量为约60至约85mol％，优选约64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85mol％的第四单体。
在一个实施方案中，第一单体是OEGMA，第二单体是HEMA-PLA，第三单体是NAS，并且第四单体是NIPAAm，并且其中聚合物包含：量为约3至约8mol％的OEGMA，量为约5至约9mol％的HEMA-PLA，量大于约7mol％的NAS，和量高至约85mol％的NIPAAm。
在一个实施方案中，聚合物包含：量为约5mol％的OEGMA，量为约7mol％的HEMA-PLA，量大于约7mol％的NAS，和量为约81mol％的NIPAAm。
在一个实施方案中，天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4。
在一个实施方案中，组合物包含基本上等摩尔量的聚合物和胸腺素β-4。
在一个部分或完全填充空腔的实施方案中，聚合物的浓度为组合物的约100mg/mL至约300mg/mL。
根据本发明的第二方面，提供了包含根据本发明的第一方面的组合物和水的水凝胶，其中NSPP与第三单体的结合使聚合物交联，从而形成其中包含水的水凝胶。
根据本发明的第三方面，提供了制备水凝胶的方法，所述方法包括向本发明的第一方面的组合物中添加水。
根据本发明的第四方面，提供了制备水凝胶的方法，所述方法包括将本发明的第一方面的组合物的水溶液与天然或合成肽或蛋白质(NSPP)的水溶液混合。
在一个实施方案中，在体温下形成水凝胶。在一个实施方案中，在将组合物和NSPP通过注射或通过施用气雾剂施用于哺乳动物之后形成水凝胶。
根据本发明的第五方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于硬组织和软组织二者的修复和/或恢复的水凝胶中的用途。硬组织(也称为钙化组织)是矿化的并且具有牢固的细胞间基质的组织；人类的硬组织是骨骼、牙釉质、牙本质和牙骨质。软组织包括连接、支撑或围绕身体其它结构和器官并且不是硬组织(例如骨骼)的组织。软组织包括腱、韧带、筋膜、皮肤、纤维组织、脂肪和滑膜(均为结缔组织)，以及肌肉、神经和血管(均不是结缔组织)。
根据本发明的第六方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于伤口愈合的水凝胶中的用途。
根据本发明的第七方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于暂时皱纹减少的水凝胶中的用途。
根据本发明的第八方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于暂时抬高瘢痕基部并促进愈合的水凝胶中的用途。
根据本发明的第九方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于在手术干预后的瘢痕组织中支持真皮结缔组织形成并促进愈合的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于在烧伤后的瘢痕处理中支持真皮结缔组织形成的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十一方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于在伴有出血的急性真皮缺损中支持血管向内生长并促进愈合的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十二方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于填充手术产生的真皮空腔的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十三方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于支持皮肤移植手术的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十四方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于物理递送骨移植替代物的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十五方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于填充假体的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十六方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用作无组织诱导特性的填充物的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十七方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于在牙齿拔除后支持和修复牙周组织的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十八方面，提供了根据本发明的第一方面的组合物在制备用于暂时抬高牙周韧带组织和/或支持牙周韧带组织移植的水凝胶中的用途。
根据本发明的第十九方面，提供了根据本发明的第二方面的水凝胶在制造用于组织修复和/或恢复的药物中的用途。
根据本发明的第二十方面，提供了组织修复和/或恢复方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第二十一方面，提供了伤口愈合的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第二十二方面，提供了暂时皱纹减少的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第二十三方面，提供了暂时抬高瘢痕基部并促进愈合的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第二十四方面，提供了在手术干预后的瘢痕组织中支持真皮结缔组织形成并促进愈合的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第二十五方面，提供了在烧伤后的瘢痕处理中支持真皮结缔组织形成的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第二十六方面，提供了在伴有出血的急性真皮缺损中支持血管向内生长并促进愈合的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第二十七方面，提供了填充手术产生的真皮空腔的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第二十八方面，提供了支持皮肤移植手术的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第二十九方面，提供了物理递送骨移植替代物的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十方面，提供了填充假体的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，填充物不具有组织诱导特性。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十一方面，提供了在牙齿拔除后支持和修复牙周组织的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十二方面，提供了暂时抬高牙周韧带组织和/或支持牙周韧带组织移植的方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十三方面，提供了组织修复和/或恢复方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据本发明的第二方面的水凝胶。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十四方面，提供了用于在组织修复和/或恢复中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十五方面，提供了用于在伤口愈合中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十六方面，提供了用于在暂时皱纹减少中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十七方面，提供了用于在暂时抬高瘢痕基部并促进愈合中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十八方面，提供了用于在手术干预后的瘢痕组织中支持真皮结缔组织形成并促进愈合中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第三十九方面，提供了用于在烧伤后的瘢痕处理中支持真皮结缔组织形成中使用的根据本发明第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第四十方面，提供了用于在伴有出血的急性真皮缺损中支持血管向内生长并促进愈合中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第四十一方面，提供了用于在填充手术产生的真皮空腔中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第四十二方面，提供了用于在支持皮肤移植手术中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第四十三方面，提供了用于在物理递送骨移植替代物中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第四十四方面，提供了用于在填充假体中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，填充物不具有组织诱导特性。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第四十五方面，提供了用于在牙齿拔除后支持和修复牙周组织中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第四十六方面，提供了用于在暂时抬高牙周韧带组织和/或支持牙周韧带组织移植中使用的根据本发明的第一方面的组合物。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
根据本发明的第四十七方面，提供了用于在组织修复和/或恢复中使用的根据本发明的第二方面的水凝胶。在一个实施方案中，施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在哺乳动物的体温下形成水凝胶。
在其中通过施用气雾剂进行施用步骤的所有方面和实施方案中，可以将气雾剂施用至身体的任何开口，例如但不限于鼻腔、口腔或开放性伤口。
根据本发明的第四十八方面，提供了用于形成水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包含：聚合物和天然或合成肽或蛋白质(NSPP)，其中所述聚合物包含：用于结合水的第一单体；用于赋予所述水凝胶机械性能的第二单体；用于与天然或合成肽或蛋白质(NSPP)结合的第三单体；和用于赋予相变行为的第四单体；并且其中天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4或其功能同源物。在一个实施方案中，试剂盒还包含在单独的容器中的水。
根据本发明的第四十九方面，提供了用于形成水凝胶的试剂盒，包含在各自容器中的：天然或合成肽或蛋白质(NSPP)；和组合物，其中所述组合物包含：用于结合水的第一单体；用于赋予所述水凝胶机械性能的第二单体；用于与天然或合成肽或蛋白质(NSPP)结合的第三单体；和用于赋予相变行为的第四单体；其中天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4或其功能同源物；并且其中NSPP与第二单体交联，从而使得当组合物与水接触时能够形成水凝胶。
在一个实施方案中，NSPP和组合物之一或两者为固体形式。在一个实施方案中，试剂盒还包含在单独的容器中的水。在一个实施方案中，试剂盒还包含用于顺序或同时施用试剂盒的各组分的说明书。在一个实施方案中，试剂盒被配置为使得在分配时将组合物、NSPP和水混合在一起。
在一个实施方案中，NSPP和组合物被用作填充物，以在需要用此治疗的患者中原位递送骨移植替代物。填充物将BGS保持在原位(粘合剂)至少6周(降解)，并且为细胞向内生长(骨成骨细胞)提供支架。
在另一个实施方案中，为了形成用于局部施用的气雾剂，组合物中聚合物的浓度为约5mg/mL至约70mg/mL。例如，组合物中的聚合物浓度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70mg/mL。因此，聚合物可以以非常低的浓度通过气雾剂递送，可以粘附至手术部位并相应地使用。
定义和术语
在描述和要求保护本发明时，将根据以下列出的定义使用以下术语。还应理解，本文所用的术语仅出于描述本发明的特定实施方案的目的，并不旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
除非上下文清楚地另外要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”等应理解为包含性含义，而不是排他性或穷举性含义；也就是说，为“包括但不限于”的含义。
术语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明实施方案。然而，在相同或另一些情况下，其它实施方案可能也是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的记载并不意味着其它实施方案不可用，并且不旨在将其它实施方案排除在本发明的范围之外。
如本文所用，定义范围或长度的极限的措词例如“1至5”是指1至5的任何整数，即1、2、3、4和5。换句话说，由明确提及的两个整数定义的任何范围旨在包括并且公开定义所述极限的任何整数以及包括在所述范围内的任何整数。
除了操作实施例中或另外说明以外，本文中使用的表达成分或反应条件的量的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。实施例无意于限制本发明的范围。在下文中或除非另外说明，“％”表示“重量％”，“比率”表示“重量比”，并且“份”表示“重量份”。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中给出的数值被尽可能精确地报道。然而，任何数值都固有地包含某些误差，这些误差必然地由它们各自的测试测量中的标准偏差引起。
术语“室温”旨在表示约20℃至约25℃的温度。
术语“动物”包括人和非人，例如哺乳动物，例如马、牛、猪、绵羊、猫、狗等。
如本文所用，“植入物”是指例如通过外科手术程序完全或部分地放置在动物体内的制品或装置。
如本文所用，术语“天然或合成肽或蛋白质”(或NSPP)是指天然存在于动物组织的细胞外部分中的蛋白质或肽，其为动物细胞提供结构支持(除了发挥各种其它重要的功能外)。该术语还指与那些天然存在的蛋白质和肽具有类似功能的合成制备的蛋白质或肽。举例来说，天然存在的蛋白质和肽是通常在细胞外基质(或ECM)中发现的那些，这是动物结缔组织的定义特征。通常在ECM中发现的天然存在的蛋白质包括胶原蛋白、纤维蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白(及其同工型)。
本发明中使用的NSPP是胸腺素β-4或其功能同源物。
说明书中使用了以下缩写：
ECM 细胞外基质
EHNS N-羟基乙氧基化琥珀酰亚胺
HEMA 甲基丙烯酸羟乙酯
LA 乳酸
NAS N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺
NIPAAm N-异丙基丙烯酰胺
NSPP 天然或合成肽或蛋白质
OEG 低聚(乙二醇)
OEGMA 低聚(乙二醇)单甲基醚甲基丙烯酸酯
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PEG 聚乙二醇
PEO 聚环氧乙烷
PLA 聚(乳酸)
PPO 聚环氧乙烷-共-环氧丙烷
PVA 聚乙烯醇
PVP 聚(乙烯吡咯烷酮)
PNPHO 聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-(N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺)-共-(聚丙交酯/甲基丙烯酸2-羟酯)-共-(低聚(乙二醇)/聚(NIPAAm-co-NAS-co-(HEMA-PLA)-co-OEGMA)
SNHS N-羟基磺基琥珀酰亚胺
TB4 胸腺素beta-4/胸腺素β-4
在根据本发明的示例性组合物中，140mg/mL PNPHO(比率5:8(5):7:81)与30mg/mL胸腺素β-4一起使用；出于申请人的临床试验目的，该组合物被标记为PNPHO-co-TB4(或替代地PNPHO-co-NSPP；或“TR001”)，并且在本说明书的整个正文中均如此引用。
附图说明
现在将参考附图仅以举例的方式描述本发明的优选实施方案，其中：
图1(a)是本发明溶液(聚合物和NSPP)的宏观图像，该溶液在模拟的生理条件(37℃的PBS)下形成水凝胶，并且在胶凝后保留其结构。
图1(b)是向具有活动性出血的部位进行PNPHO-co-TB4注射的宏观图像，显示了尽管在缺损部位存在活动性出血，但仍立即形成水凝胶。
图1(c)是宏观图像，顺序显示了在体温下与伤口接触的PNPHO-co-TB4溶液和水凝胶形成。
图1(d)是与血液混合的PNPHO-co-TB4形成胶粘水凝胶的宏观图像，该水凝胶用于通过逐层填充来填充3D区域。
图2(a)显示了在70℃下DMF中PNPHO的合成制备。
图2(b)显示了CDCl3中PNPHO的1H NMR谱；残留痕量DMF溶剂的约2.9-3.0ppm共振与NAS质子(e)的重叠，产生了基于相同数据集的原始计算错误(各个峰下的积分/面积，作为整个PNPHO聚合物中各个单体的相对mol％的基础)。随后的校正证实了第三单体(NAS)以大于约7mol％的量存在。
图3描绘了对于乳酸数为3(a)和6(b)，4℃下水性溶液中不同摩尔分数的HEMA-PLA下合成的共聚物的各个溶解度(*、**和***分别表示p<0.05、<0.01和<0.001)。
图4显示了PNPHO-co-TB4(a)和PNPHO(b)之间的LCST测量和比较。两个LCST值之间的差异证实在两种组分之间存在化学相互作用，并且显示了TB4在加速凝胶动力学中的物理作用。
图5表示对PNPHO-co-TB4与宿主组织整合的支架作用的研究。形成全层真皮伤口(a)；将PNPHO-co-TB4和Integra用于皮肤移植(b)；以及用Integra或PNPHO-co-TB4处理的移植物在不同时间点的存活率(c)。
图6显示了对PNPHO-co-TB4的炎症反应的评估以及与Integra(真皮基质金标准)的直接比较；术后两周(a)和四周(b)的Integra处理部位的H&E染色；以及移植后两周(c)和四周(d)的PNPHO-co-TB4处理部位的H&E染色。白色箭头显示PNPHO-co-TB4结构，并且黑色箭头显示植入物周围的纤维组织形成。
图7显示了小鼠中PNPHO-co-TB4和Integra处理部位在不同时间点的血管生成反应。使用IVIS Lumina XR活体成像仪(IVIS Lumina XR live imager)通过荧光辐射效率确定移植部位的血管形成和向内生长。移植手术后两(2)和四(4)周，使用AngioSense750 EX体内血池荧光成像探针(AngioSense750 EX in vivo blood pool fluorescent imagingprobe)确定血管生成反应。这种近红外荧光大分子探针在脉管系统中持续存在，并且能够对血管和血管生成进行成像。在术后的每个时间点，向每只小鼠注射在100μL PBS中的2nmol AngioSense750EX。24小时后，扫描每只小鼠的荧光辐射效率(n＝8)。辐射效率用于指示伤口区域中新血管的密度。结果表明，术后两周，PNPHO-co-TB4处理部位的荧光辐射效率显著高于Integra处理部位(p<0.01)。相反，两个处理组在术后四(4)周的血管生成信号非常低，表明血管形成受到控制，并且该部位的愈合已经完成。
图8显示了皮肤移植手术之后2周对PNPHO-co-TB4处理部位的组织学评价。白色箭头显示PNPHO-co-TB4水凝胶结构内的血管向内生长，以及成纤维细胞向可注射支架中的浸润。图8(c)和图8(d)中的结果显示了PNPHO-co-TB4结构内的血管的形成。此外，皮肤活检的染色显示PNPHO-co-TB4水凝胶结构内的宿主成纤维细胞的明显浸润；参见图8(d)。
图9显示了在术后4周用PNPHO-co-TB4处理的皮肤移植部位的Masson三色染色(Masson’s trichrome staining)。黑色箭头表示胶原纤维，其从PNPHO-co-TB4结构内的成纤维细胞向内生长沉积。为了进一步确定PNPHO-co-TB4结构内的成纤维细胞浸润和皮肤细胞外基质形成，在移植后4周对皮肤移植部位用Masson三色染色。图9中的结果显示了移植手术之后4周，PNPHO-co-TB4结构内的胶原纤维形成。该结果证实了PNPHO-co-TB4的结构内的成纤维细胞的浸润及其与宿主组织整合并促进新真皮形成的潜力。
图10显示了术后4周用Integra处理的皮肤移植部位的Masson三色染色。PNPHO-co-TB4结构内的胶原纤维形成明显高于在Integra结构内检测到的。结果显示，与PNPHO-co-TB4相比，Integra结构内的胶原蛋白形成明显减少。
图11显示了牙齿拔除之后PNPHO-co-TB4的使用，(a)具有活动性出血的拔除部位，(b)通过21G针将PNPHO-co-TB4注射到牙槽部位，(c)PNPHO-co-TB4在该部位立即胶凝和(d)该部位PNPHO-co-TB4与血液的混合物。
图12描绘了10名患者中牙齿拔除之后的PNPHO-co-TB4应用。装置在PET试验中的临床使用表明，在所有十名患者中将PNPHO-co-TB4注射到牙槽部位是成功的，并且主要研究员未报告任何装置故障。
图13显示了在手术和PNPHO-co-TB4处理之后7天的软组织再生和伤口愈合。用PNPHO-co-TB4处理的所有十名患者在术后一周返回进行了首次随访。没有任何患者的疼痛或不适的报告。在口腔检查期间(施用之后一周)，在该部位没有感染或炎症的迹象。此外，主要研究员检查了伤口闭合和软组织形成。在所有十名患者中，记录了伤口闭合并检测到加快的软组织形成。
图14显示了PNPHO-co-TB4处理的样品的H&E和Masson三色染色。
图15显示了制剂A)17.5mg/mL、B)35mg/mL和C)70mg/mL的羽状物模式(plumepattern)的代表性图像。
图16描绘了三种制剂的最大和最小羽状物覆盖范围(plume coverage)直径以及导出的椭圆率(平均值±SD，n＝3)。
图17显示了使用人鼻模型的各制剂的沉积模式。
图18显示了在37℃下盐酸环丙沙星从PNPHO和PNPHO-co-TB4水凝胶中的体外释放，以累积质量表示(结果为指示性，n＝1±SD)。
具体实施方式
现在将参考所附实施例和附图更全面地描述本发明。然而，应当理解，以下描述仅是说明性的，并且不应以任何方式视为对上述本发明的一般性的限制。
现在将详细参考本发明的某些实施方案。尽管将结合实施方案描述本发明，但是将理解，其意图不是将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可以包括在由权利要求书限定的本发明的范围内的替代、修改和等同物。本领域的技术人员将认识到可以在本发明的实践中使用的许多与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料。本发明决不限于所描述的方法和材料。
将理解的是，在本说明书中公开和定义的本发明扩展到所提到的或从文本或附图中显而易见的两个或更多个单个特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的多种替代方面。
本文公开了为组织定制的聚合物的用途。本发明的组合物优选是可注射的。
1.聚合物
如本文所用，术语“聚合物”是指由重复结构单元(单体)构成的大分子(高分子)。这些亚单位通常通过共价化学键连接。聚合物可以是线性或支化聚合物。优选地，本发明的聚合物是包含三种或更多种不同单体的共聚物。
因此，在一个实施方案中，本文使用的优选聚合物包含第一水结合单体、能够赋予水凝胶机械性能的第二单体和具有用于结合NSPP的官能团的第三单体。
如本文所用，术语“单体”是指可以被组合以形成聚合物的结构单元，但是其本身也可以是聚合物，或者单体或聚合物的衍生物。后一种类型的单体在本文中也称为“大分子单体”。
在本文中，“大分子单体”是聚合物或低聚物，其分子各自具有充当单体分子的一个端基，因此每个聚合物或低聚物分子仅对产物聚合物的链贡献单个单体单元。
本发明的组合物的聚合物包含：用于结合水的第一单体；用于赋予所述水凝胶机械性能的第二单体；用于与天然或合成肽或蛋白质(NSPP)结合的第三单体；和用于赋予相变行为的第四单体。
1.1.第一单体：水结合单体
如上所述，本文使用的优选水凝胶的有利性质可归因于NSPP与优选聚合物的特定组分的组合。这些优选聚合物的一个特别有利的性质是其水结合能力。水凝胶中水的存在既提供了类似于受损组织的天然环境的环境(其有助于组织再生)，又为水凝胶提供了所需的抗压性。
因此，本文所用的优选聚合物应包含能够结合水至具有以下能力的单体或单元：当聚合物与NSPP和水接触时能够形成水凝胶。另外，由此形成的水凝胶应具有所需的抗压性和回弹性。
本领域技术人员将理解，水结合单体需要以足以产生满足这些要求的聚合物的比例存在于本发明中使用的优选聚合物中。通常，聚合物中水结合单体的比例可以为：约10:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4或约1:5的水结合单体:机械强度单体的摩尔比。实际上，水结合单体不仅需要使聚合物具有亲水性，而且还需要使聚合物具有更大的水结合能力。
因此，本发明中使用的优选聚合物将具有约70％至约500％、约80％至约400％、约90％至300％或约100％至200％的水结合能力。例如，本文中使用的优选聚合物的水结合能力为约70％、约80％、约90％、约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、约200％、约210％、约220％、约230％、约240％、约250％、约260％、约270％、约280％、约290％、约300％、约310％、约320％、约330％、约340％、约350％、约360％、约370％、约380％、约390％、约400％、约410％、约420％、约430％、约440％、约450％、约460％、约470％、约480％、约490％或约500％。
水结合单体的合适实例包括可以合成以下聚合物的那些，例如聚醚(例如碱性聚酰亚胺，例如聚乙二醇(PEG)、低聚(乙二醇)(OEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚环氧乙烷-共-环氧丙烷(PPO)、共聚环氧乙烷嵌段或其无规共聚物、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(氨基酸)和葡聚糖。聚醚，并且更特别地低聚(氧化烯)(例如OEG)是特别优选的，因为其具有所需的水结合能力，易于合成和/或购买，并且就其在其所处的组织中引起最小的或没有免疫应答的意义上来说是惰性的。
另外，可以使用多种亲水性官能团中的任一种来使单体(以及因此由这样的单体形成的聚合物)具有水溶性。例如，可将水溶性的官能团如磷酸盐、硫酸盐、季胺、羟基、胺、磺酸盐和羧酸盐引入单体中以使其具有水溶性。
单体也可以与其它化合物反应形成“大分子单体”。因此，第一单体可以任选地是大分子单体。
作为大分子单体的优选的第一单体是低聚(乙二醇)单甲基醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)，其为由两种亲水性单体乙二醇和甲基丙烯酸酯构成的亲水性单体。
优选地，聚合物包含量为约3至约8mol％，优选约3、4、5、6、7或8mol％的第一单体。
1.2.第二单体：赋予机械性能的单体
如上所述，本发明使用的优选水凝胶的有利性能可部分归因于构成聚合物的特定组分。在一些实施方案中，本发明中使用的优选聚合物能够为水凝胶贡献额外的机械性能。
本领域技术人员将理解，能够赋予水凝胶机械性能的单体需要以足以产生具有期望机械性能的水凝胶的比例存在于优选聚合物中。通常，聚合物中“机械”单体的比例可以为：约10:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1、约1:1、约1:2、约1:3、约1:4或约1:5的水结合单体:机械强度单体的摩尔比。能够赋予水凝胶机械性能(例如抗压性)的单体的合适实例包括甲基丙烯酸酯，例如甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸羟乙酯聚(乳酸)共聚物(HEMA-PLA)，聚酯例如聚(乳酸)、聚(己内酯)、聚(乙交酯)及它们的无规共聚物(例如聚(乙交酯-共-丙交酯)和聚(乙交酯-共-己内酯))。
单体也可以与其他化合物反应形成“大分子单体”。作为大分子单体的优选的第二单体是甲基丙烯酸羟乙酯聚(乳酸)(HEMA-PLA)。
优选地，聚合物包含量为约5至约9mol％，优选地约5、6、7、8或9mol％的第二单体。
1.3.第三单体：NSPP结合单体
如上所述，本发明中使用的优选水凝胶是通过在水的存在下将聚合物与NSPP组合而形成的。为了使聚合物与NSPP有效地组合，优选在聚合物中包含具有交联能力的单体或单元。
这种交联能力意味着聚合物能够与NSPP结合(如下文进一步讨论)，并通过这样做使NSPP交联形成包含NSPP的水凝胶。或者，通过类似的机制，NSPP充当交联剂，从而使聚合物交联形成水凝胶。
通过利用聚合物设计，其中在聚合物中提供了具有与胸腺素β-4结合的官能团的单体等，发明人已经认识到聚合物不需要通过例如化学或UV交联进一步交联以形成水凝胶。
另外，通过NSPP与聚合物共价结合，将NSPP更有效地保留在水凝胶网络中，这意味着一旦将水凝胶施用于修复部位，NSPP就不能轻易地从该部位迁移走。这意味着维持了修复部位凝胶的结构完整性(由于如上所述的NSPP的机械性能)，并且有助于在修复部位提供密切模拟组织的天然环境的环境。
为了产生能够与NSPP结合的聚合物，本领域技术人员将理解，能够与NSPP结合的单体需要以足以与NSPP交联的比例存在于本发明的聚合物中，使得可以在水的存在下形成水凝胶。通常，聚合物中“交联”单体的比例为至少约1:1的交联单体:水结合单体的摩尔比。该比率可以提高至例如约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1或约10:1。
能够与NSPP结合的单体通常具有亲电子官能团或亲核官能团，使得例如NSPP上的亲核官能团可与单体上的亲电子官能团反应以形成共价键。优选地，聚合物包含超过两种NSPP结合单体，从而由于亲电子-亲核反应，聚合物与NSPP组合形成交联的聚合物产物。这样的反应称为“交联反应”。
因此，例如，如果NSPP具有亲核官能团(例如胺)，则聚合物可以具有亲电子官能团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))。适用于本发明的其它亲电子官能团是N-羟基磺基琥珀酰亚胺(SNHS)和N-羟基乙氧基化琥珀酰亚胺(ENHS)。这种类型的单体的实例是N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)。另一方面，如果NSPP具有亲电子官能团，则聚合物可以具有亲核官能团，例如胺或巯基。
优选地，聚合物包含量为至少约7mol％，更优选至少约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19mol％的第三单体。
1.4.第四单体：相变单体
在另一个实施方案中，优选聚合物可以进一步包含能够赋予水凝胶相变特性的第四单体，从而能够使得组合物在室温下为可注射形式，并且能够在体温下发生凝胶形成(即，水凝胶形成)。此外，这些相变特性允许本发明中使用的优选聚合物形成水凝胶，其多种性质(例如粘度)可以通过改变诸如pH和温度的因素来改变。
设计热响应性可注射水凝胶，使其低临界溶液温度(LCST)低于体温。因此，可以简单地通过提高水凝胶的温度来实现胶凝，例如通过使其升温至体温(当将水凝胶施用至体内时发生)。多种热响应性和可注射聚合物适用于本发明，包括聚(环氧乙烷)/聚(环氧丙烷)和聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)均聚物和共聚物。NIPAAm(作为单体组成嵌段或聚NIPAAm)特别适合，因为其LCST为32℃，使得其在体温下呈凝胶形式。
为了产生热响应性聚合物，本领域技术人员将理解，相变单体需要以这样的比例存在于本发明中使用的组合物中，其足以能够通过使水凝胶暴露于不同的温度和pH条件来改变包含聚合物的水凝胶的粘度。通常，聚合物中“相变”单体的比例为至少约9:1的相变单体:水结合单体的摩尔比。该比率可以升高至例如：约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1、约16:1、约17:1、约18:1、约19:1、约20:1、约21:1、约22:1、约23:1、约24:1、约25:1、约26:1、约27:1、约28:1、约29:1或约30:1的相变单体:水结合单体的摩尔比。
本发明使用的优选水凝胶在较低温度(例如4℃)下的粘度使得该水凝胶是可注射的。然后，随着温度升高水凝胶变得具有更高粘性，在约37℃的温度下形成具有期望粘度的凝胶。这意味着本发明使用的优选水凝胶在较低的温度下可以通过例如注射或通过气雾剂施用容易地施用至修复部位。然后，通过在体内升温至身体的自然温度，水凝胶转变为具有期望的强度和弹性的更高粘性的凝胶。
优选地，聚合物包含量为构成100％的聚合物组合物的其余部分的第四单体。在一个实施方案中，第四单体的mol％可以高至约85％，优选地为约64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85mol％。
1.5.其它聚合物性能
本领域技术人员将理解，通过组合不同类型的单体，可以产生具有一系列不同性能的聚合物。另外，通过将特定的单体或官能团引入预先存在的聚合物中，可以改变聚合物的性能。例如，HEMA单体与其它单体(例如甲基丙烯酸甲酯)的共聚可用于改变性能如溶胀性和机械性能。单体也可以与其它化合物反应形成“大分子单体”(如上所述)，其然后包含在本发明中使用的优选聚合物中。例如，HEMA可以与丙交酯反应以形成HEMA-聚乳酸聚合物(HEMA-PLA)，其本身可以用作本发明聚合物中的单体。另外，单体本身可以是单体单元的组合，其然后被引入聚合物中。这种类型的单体的一个实例是低聚(乙二醇)单甲基醚甲基丙烯酸甲酯(OEGMA)，其为由两种亲水单体乙二醇和甲基丙烯酸酯构成的亲水单体。
本发明中使用的优选聚合物可以进一步用一个或多个部分和/或官能团进行修饰。可以根据需要使用任何部分或官能团。在一些实施方案中，可以用聚乙二醇(PEG)、碳水化合物和/或衍生自多糖的无环聚缩醛对聚合物进行修饰。另外，如上所述，可以将亲水基团引入单体(并且因此聚合物)中，以增加聚合物的水结合能力。
就序列而言，共聚物可以是任何前述和其它聚合物的嵌段共聚物、接枝共聚物、无规共聚物、共混物、混合物和/或加合物。通常，根据本发明使用的聚合物是有机聚合物。优选地，本发明中使用的聚合物是生物相容的。在一些实施方案中，聚合物是可生物降解的。在另一些实施方案中，聚合物是生物相容且可生物降解的。
本发明中使用的优选聚合物在其结构中还可包含其它单体。例如，单体可以是聚合物，例如聚(乙烯醇)(PVA)、聚酯、丙烯酸聚合物和离子聚合物，或这些的单体。
如果期望聚合物是可生物降解的或可吸收的，则可以使用一种或多种具有可生物降解的链接(linkage)的单体。替代地或另外地，可以选择单体，使得它们之间的反应产物产生可生物降解的链接。对于每种方法，可以选择单体和/或链接，使得所得的可生物降解的聚合物在期望的时间段，例如约6小时至约6个月内降解或被吸收。优选地，选择单体和/或链接，使得当聚合物在生理条件下降解时所得产物是无毒的。
可生物降解的链接可以是化学或酶促可水解或可吸收的。说明性、示例性和非限制性的化学可水解的可生物降解链接包括乙交酯、丙交酯、己内酯、二噁烷酮和碳酸三亚甲基酯的聚合物、共聚物和低聚物。示例性的酶促可水解的可生物降解链接包括可被金属蛋白酶和胶原酶切割的肽键。其它示例性的可生物降解的链接包括聚(羟基酸)、聚(原碳酸酯)、聚(酸酐)、聚(内酯)、聚(氨基酸)、聚(碳酸酯)和聚(膦酸酯)的聚合物和共聚物。
本发明中丙交酯的化学水解导致聚合物的低临界溶液温度(LCST)的升高(通过降低聚合物的整体疏水性)，从而提高了其生物吸收能力。
1.6.优选聚合物
聚合物优选包含量为约3至约8mol％，例如约4至约6mol％或约4、5、6mol％的第一单体。
聚合物优选包含量为约5至约9mol％，例如约6至约8mol％或约6、7或8mol％的第二单体。
聚合物优选包含量为至少约7mol％，例如约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19mol％的第三单体。
聚合物优选包含量为构成100％的聚合物组合物的其余部分，例如约60至约81mol％，例如约64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85mol％的第四单体
本文所述的百分比涉及最终聚合物的组成，而不是形成聚合物时使用的进料量。
在一实施方案中，聚合物优选包含：
i.量为约3至约8mol％(例如约4至约6mol％)的第一单体；
ii.量为约5至约9mol％(例如约6至约8mol％)的第二单体；
iii.量为至少约7mol％的第三单体；和
iv.量高至约85mol％(例如高至约81mol％)的第四单体。
在另一个实施方案中，聚合物优选包含：
i.量为约5mol％的第一单体；
ii.量为约7mol％的第二单体；
iii.量为约7mol％的第三单体；和
iv.量为约81mol％的第四单体。
在一个实施方案中，本发明中使用的优选聚合物是式(I)的聚合物：
Figure BDA0003065836290000211
其中
A是第一单体(水结合单体)；
B是第二单体(能够赋予水凝胶机械性能的单体)；
C是第三单体(具有与NSPP结合的官能团的单体)；
D是第四单体(能够赋予水凝胶相变特性的单体)；
m是1至20例如1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数；
n是1至20例如1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数；
p是1至20例如1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数；并且
q是1至20例如1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的整数。
优选地，m:n:p:q的比率为约5:8(5):7:81。本领域技术人员将意识到，单体A、B、C和D可以以任何顺序存在于聚合物中，只要实现所需的水结合、增强和/或交联能力即可。
A、B、C和D可以分别优选地以以上在第一、第二、第三和第四单体的上下文中提供的mol％范围内存在。
式(I)的聚合物的一个实例是式(Ia)的聚合物：
Figure BDA0003065836290000221
其中A是水结合单体OEGMA，B是增强单体HEMA-PLA，C是交联剂NAS，D是相变单体NIPAAm，并且m、n、p、q、x和y如上定义。
本领域技术人员将意识到，单体A、B、C和D可以以任何顺序存在于聚合物中，只要实现所需的水结合、增强和/或交联能力即可。
还发现一些单体(例如HEMA-PLA)、聚酯(例如聚(乳酸)、聚(己内酯)、聚(乙交酯)及它们的无规共聚物(例如聚(乙交酯-共-丙交酯)和聚(乙交酯-共-己内酯)和其它可生物降解的生物相容性聚合物可以在体内可生物降解链段(例如PLA)的降解过程中提高本发明中使用的优选聚合物的LCST，从而导致聚合物的生物吸收。这提供了本发明中使用的聚合物可以设计成在体内可生物降解的另一优点。
本发明中使用的优选聚合物的总体尺寸可以根据以下因素而不同，例如引入聚合物中的单体的类型，寻求用于形成水凝胶的NSPP的类型以及蛋白质与聚合物偶联的条件。然而，通常，本发明中使用的优选聚合物可以是约1至约100kDa、约5至约60kDa或约30kDa的分子。
1.7.PNPHO
优选聚合物是PHPHO。聚合物PNPHO优选包含量为约3至约8mol％，例如约4至约7mol％或约3、4、5、6、7或8mol％的OEGMA。
聚合物优选包含量为约5至约9mol％，例如约6至约8mol％或约3、4、5、6、7或8mol％的HEMA-PLA。
聚合物优选包含量为至少约7mol％，例如约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19mol％的NAS。
聚合物优选包含量为构成100％的聚合物组合物的其余部分，例如约64至约85mol％，例如约64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85mol％的NIPAAm。
本文所述的百分比涉及最终聚合物的组成，而不是形成聚合物时使用的进料量。
在一个实施方案中，优选地，聚合物包含：
i.量为约3至约8mol％(例如约4至约6mol％)的OEGMA；
ii.量为约5至约9mol％(例如约6至约8mol％)的HEMA-PLA；
iii.量为至少约7mol％的NAS；和
iv.量高至约85mol％(例如高至约81mol％)的NIPAAm。
在另一个实施方案中，聚合物包含：
i.量为约5mol％的OEGMA；
ii.量为约7mol％的HEMA-PLA；
iii.量为约7mol％的NAS；和
iv.量为约81mol％的NIPAAm。
用于本申请的聚合物PNPHO的优选形式是如上所示出的式(Ia)的聚合物。
基于先前限定的式I：
i.A是低聚(乙二醇)单甲基醚甲基丙烯酸酯OEGMA；
ii.B是甲基丙烯酸羟乙酯聚(乳酸)(HEMA-PLA)；
iii.C是N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)；并且
iv.D是N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)。
另外，x在1-1000的范围内，y在1-1000的范围内，并且m、n、p和q在1-20的范围内。
本领域技术人员将意识到，单体A、B、C和D可以以任何顺序存在于聚合物中，只要实现所需的水结合、增强和/或交联能力即可。
1.8.聚合物的合成
本领域技术人员将知道合成本发明中使用的优选聚合物的合适方法。这些包括诸如开环聚合、加成聚合(包括自由基聚合)和缩合聚合的方法。
在下面的实例中描述了优选聚合物PNPHO的形成。
2.用于形成水凝胶的组合物
本发明还涉及可用于形成用于本发明的水凝胶的优选组合物。
本发明的组合物包含聚合物和NSPP，所述聚合物包含：
i.第一水结合单体；和
ii.赋予机械性能的第二单体；
iii.作为NSPP结合单体的第三单体，包含能够与NSPP结合的官能团；
iv.能够赋予水凝胶相变特性的第四单体；
其中天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4或其功能同源物；
并且其中NSPP与第二单体的结合使聚合物交联，从而使得当组合物与水接触时能够形成水凝胶。
如本文所用，术语“组合物”是指包含上述组分的固体或液体组合物。在一些实施方案中，在本发明中使用的优选组合物中也可包含其它组分，例如药学上可接受的辅料和生物活性剂(例如，药物、维生素和矿物质)，以帮助修复和/或再生靶骨组织，和/或提供实现靶向递送生物活性化合物的方法。
通常，本发明中使用的组合物中聚合物的量是允许形成水凝胶的量。
在一些实施方案中，组合物中聚合物的量为：约1％w/w至约90％w/w、约2％w/w至约80％w/w、约4％w/w至约70％w/w、约5％w/w约60％w/w、约5％w/w至约50％w/w、约6％w/w至约40％w/w、约7％w/w至约30％w/w或约8％w/w至约20％w/w。
在一些实施方案中，聚合物的量为：约1％w/w、约2％w/w、约3％w/w、约4％w/w、约5％w/w、约6％w/w、约7％w/w、约8％w/w、约9％w/w、约10％w/w、约15％w/w、约20％w/w、约25％w/w、约30％w/w、约35％w/w、约40％w/w、约45％w/w、约50％w/w、约55％w/w、约60％w/w、约65％w/w、约70％w/w、约75％w/w、约80％w/w或更多。在一些实施方案中，聚合物的量为约85％w/w。
一般来说，随着组合物中聚合物浓度的增加，水凝胶的坚固性增加。
通常，本发明组合物中NSPP的量为允许形成水凝胶的量。
在一些实施方案中，组合物中NSPP的量为：约0.01％w/w至约60％w/w、约1％w/w至约50％w/w、约1％w/w至约40％w/w、约5％w/w至约30％w/w、约5％w/w至约20％w/w、或约5％w/w至约10％w/w。
在一些实施方案中，NSPP的百分比为约1％w/w、约2％w/w、约3％w/w、约4％w/w、约5％w/w、约6％w/w、约7％w/w、约8％w/w、约9％w/w、约10％w/w、约20％w/w、约30％w/w、约40％w/w、约50％w/w或更多。
w/w％是基于组合物与水接触之前组合物的总重量。
在一个实施方案中，该组合物包含等摩尔量的聚合物和胸腺素β-4或其功能同源物。
2.1.辅料和生物活性剂
药学上可接受的辅料可以包含在本发明中使用的优选组合物和/或水凝胶中，并且包括适合于所期望的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、惰性稀释剂或其它液体载剂、分散或混悬助剂、制粒剂、表面活性剂、崩解剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、油等。Remington(Gennaro,A.R.,Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第21版(2006)Lippincott Williams&Wilkins)公开了用于配制药物组合物的多种辅料及用于其制备的已知技术。除非任何常规辅料与某种物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望的生物学作用或以有害的方式与药物组合物的任何其它组分相互作用，否则预期其使用在本发明的范围内。
根据配方设计师的判断，组合物中可以存在诸如着色剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和加香剂的辅料。
可以添加到本发明中使用的优选组合物和/或水凝胶中的生物活性剂或药物化合物包括蛋白质、糖胺聚糖、碳水化合物、核酸以及无机和有机生物活性化合物，例如酶、抗生素、抗肿瘤剂、局部麻醉药、激素、血管生成剂、抗血管生成剂、生长因子(例如胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子b(TGFb)、抗体、神经递质、精神药物、抗癌药物、化学治疗药物、影响生殖器官的药物、基因和寡核苷酸。
包含各组分例如辅料和/或生物活性剂的组合物可以通过将本文公开的优选聚合物与NSPP组合，干燥所得的组合物，然后将其与一种或多种其它组分组合来制备。所得组合物可以为粉末或其它颗粒化形式，可以向其添加水以形成根据本发明的水凝胶。因此可以简单地通过将期望的水性溶剂添加到组合物中来制备包含这些组分的水凝胶。
存在于本发明中使用的优选组合物中的聚合物、NSPP和生物活性剂的量将必然取决于特定的药物和待治疗的病症。本领域技术人员将知道用于治疗该病状的适当的药剂和量。
示例性的实施方案包括脂肪移植物、脱矿质骨基质(DBM)、自体移植物(即，生物活性移植物)。这类添加剂的作用是赋予复合材料组织诱导性能。例如，在DBM/自体移植物等中存在低浓度的生长因子。
其它示例性实施方案包括骨颗粒(来自人或动物)以及纯惰性空间填充物，例如玻璃珠。这类添加剂的作用是为复合材料提供期望的3D结构。
本领域普通技术人员将意识到，骨移植替代物是指广泛的颗粒，包括但不限于合成钙/磷酸盐颗粒、动物来源的骨颗粒和未加工的人骨。
2.2.天然或合成肽或蛋白质(NSPP)
在本发明的上下文中，NSPP是相关的，因为如上所述，其使聚合物交联，这使得聚合物能够形成水凝胶。本发明中使用的优选水凝胶可通过例如将胸腺素β-4暴露于式(I)的聚合物而形成。NSPP也是重要的，因为其为水凝胶提供了额外的机械性能(例如强度和弹性)，并且在修复部位提供了模拟天然环境的环境，从而有助于组织修复和再生。
重要的是，NSPP包含侧链或其它官能团，这些侧链或其它官能团被暴露以能够与NSPP结合单体的官能团反应，从而使NSPP通过NSPP结合单体与聚合物结合。合适的侧链的实例包括谷氨酸或赖氨酰侧链。
本发明还预期使用NSPP的变体，例如物种变体或多态性变体。本发明旨在涵盖表现出相同活性的NSPP的所有功能活性变体。这还包括NSPP的apo和halo形式、翻译后修饰形式以及糖基化或去糖基化衍生物。这样的功能活性片段和变体包括例如具有保守氨基酸替换的那些。
优选地，用于本发明的NSPP将从重组来源获得，尽管其也可以从天然来源提取或合成。
2.3胸腺素β-4
优选的NSPP是胸腺素β-4。胸腺素β-4是高度保守的天然存在的水溶性再生肽，存在于除红细胞以外的所有组织和所有细胞类型中。其也存在于血液和其它体液中，包括眼泪、唾液、脑脊液和伤口液。
人胸腺素β-4具有以下序列：SDKPDMAEIE KFDKSKLKKT ETQEKNPLPS KETIEQEKQAGES。
胸腺素β-4可替代地写为：Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser。
为了后续讨论的目的，术语胸腺素β-4和TB4同义使用；TB4是胸腺素β-4的简写形式。
根据本发明的示例性实施方案，胸腺素β-4最优选地与PHPHO以约1:1摩尔比使用。但是，这可以根据预期应用进行切换。在示例性组合物中，将140mg/mL PNPHO(比率5:8(5):7:81)与30mg/mL胸腺素β-4一起使用；出于申请人的临床试验目的，该组合物被标记为“PNPHO-co-TB4”。
2.4胸腺素β-4的功能同源物(同工型)
另一种优选的NSPP是胸腺素β-4的功能同源物。上述多肽的功能同源物也适用于本文所述的组合物和方法。功能同源物是与参考多肽具有序列相似性并且执行参考多肽的一种或多种生化或生理功能的多肽。
功能同源物和参考多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以归因于趋同或趋异的进化事件。因此，功能同源物有时在文献中被称为同源物或直系同源物或旁系同源物。天然存在的功能同源物的变体，例如由野生型编码序列的突变体编码的多肽，本身可以是功能同源物。
功能同源物也可以通过多肽的编码序列的定点诱变或通过组合来自不同天然存在的多肽的编码序列的结构域(“结构域交换”)来产生。用于对编码本文所述的功能多肽的基因进行修饰的技术是已知的，并且尤其包括定向进化技术、定点诱变技术和随机诱变技术，并且可用于以期望方式提高多肽的特定活性、改变底物特异性、改变表达水平、改变亚细胞定位或修饰多肽:多肽相互作用。这样的经修饰的多肽被认为是功能同源物。有时将术语“功能同源物”应用于编码功能同源多肽的核酸。
功能同源物可以通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定。例如，在核苷酸或多肽序列的数据库上进行查询可以鉴定多肽的同源物。序列分析可以涉及使用氨基酸序列作为参考序列的非冗余数据库的BLAST、Reciprocal BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情况下，从核苷酸序列推导氨基酸序列。数据库中具有大于40％序列同一性的那些多肽是候选者，以用于进一步评估作为多肽的适合性。氨基酸序列相似性允许保守的氨基酸替换，例如一个疏水残基替换为另一个疏水残基，或一个极性残基替换为另一个极性残基。如果需要，可以对这些候选者进行手动检查，以缩小要进一步评估的候选者的数量。可以通过选择那些似乎具有存在于多肽中的结构域(例如，保守的功能结构域)的候选者来进行手动检查。
保守区可以通过定位多肽的一级氨基酸序列中作为重复序列、形成一些二级结构(例如，螺旋和β折叠)、建立带正电或带负电的结构域或代表蛋白质基序或结构域的区域来确定；参见，例如，Pfam网站在www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/and pfam.janelia.org/描述了用于多种蛋白质基序和结构域的共有序列。Pfam数据库中包含的信息描述在Sonnhammer等人,Nucl.Acids Res.,26:320-322(1998)；Sonnhammer等人,Proteins,28:405-420(1997)；和Bateman等人,Nucl.Acids Res.,27:260-262(1999)中。保守区也可以通过比对来自密切相关物种的相同或相关多肽的序列来确定。密切相关的物种优选地来自同一家族。在一些实施方案中，来自两个不同物种的序列的比对是足够的。
通常，表现出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴定保守区。相关多肽的保守区表现出至少45％的氨基酸序列同一性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区表现出至少92％、94％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
3.水凝胶
本发明还涉及包含根据本发明的聚合物、NSPP和水的水凝胶，其中所述聚合物包含：
i.第一水结合单体；
ii.赋予机械性能的第二单体；
iii.作为NSPP结合单体的第三单体，包含能够与NSPP结合的官能团；
iv.能够赋予水凝胶相变特性的第四单体；
其中天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4或其功能同源物；
并且其中NSPP与第三单体的结合使聚合物交联，从而形成其中包含水的水凝胶。
在一个实施方案中，水凝胶包含具有上述单体的聚合物，以使水凝胶能够从较低温度下的液态相变至体温下的凝胶态。用于该目的的单体的一个实例是NIPAAm。通过使用该单体，可以使胸腺素β-4根据温度曲线从液态转变为凝胶态。因此，优点是本发明中使用的优选的水凝胶在较低的温度下可以容易地通过例如注射或气雾剂施用。在体内升温至自然体温后，水凝胶随后转变为具有期望强度和弹性的粘性更高的凝胶。
已经提供了上述聚合物组合物，可以通过以本领域技术人员已知的任何方式向组合物中添加水来形成水凝胶。确实，本发明的一个优点是聚合物不需要在与NSPP接触之前以任何方式进行交联以形成水凝胶。
3.1.细胞
本发明中使用的优选水凝胶还可以包含细胞，以辅助修复和/或再生靶组织。
通常，根据本发明使用的细胞是任何类型的细胞。当封装或固定在本发明中使用的优选的水凝胶中时，细胞应是活的。本发明的产品能有效地固定细胞。例如，在部位注射/喷涂一层水凝胶，随后将细胞添加到粘性水凝胶中，然后用另一层水凝胶覆盖，就实现了期望的结果。这样，封装发生在体内而不是体外。
在一些实施方案中，可以封装在水凝胶内的细胞包括但不限于：哺乳动物细胞(例如，人细胞、灵长类细胞、哺乳动物细胞、啮齿动物细胞等)、禽类细胞、鱼细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞和杂交细胞。在一些实施方案中，可以封装在水凝胶内的示例性细胞包括干细胞、全能细胞、多能细胞和/或胚胎干细胞。
在一些实施方案中，可以封装/固定在水凝胶内的示例性细胞包括但不限于来自任何组织的原代细胞和/或细胞系。例如：心肌细胞、肌细胞、肝细胞、角质形成细胞、黑素细胞、神经元、星形胶质细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、造血干细胞、造血细胞(例如单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等)、成釉细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、神经元、精细胞、卵细胞、肝细胞、来自肺的上皮细胞、来自消化道的上皮细胞、来自肠、肝脏的上皮细胞、来自皮肤的上皮细胞等、和/或其杂交物可以被封装在根据本发明使用的优选的水凝胶中。
可以被封装在根据本发明使用的优选的水凝胶内的示例性哺乳动物细胞包括但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞、Madin-Darby犬肾(MOCK)细胞、幼仓鼠肾(BHK细胞)、NSO细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、U87细胞、A172细胞、HL60细胞、A549细胞、SP10细胞、DOX细胞、DG44细胞、HEK 293细胞、SHSY5Y、Jurkat细胞、BCP-1细胞、COS细胞、Vero细胞、GH3细胞、9L细胞、3T3细胞、MC3T3细胞、C3H-10T1/2细胞、NIH-3T3细胞和C6/36细胞。
在一些实施方案中，期望细胞均匀地分布在整个水凝胶中。均匀分布可以帮助提供更均匀的组织样水凝胶，从而为封装的细胞提供更均匀的环境。在一些实施方案中，细胞位于水凝胶的表面上。在一些实施方案中，细胞位于水凝胶的内部。在一些实施方案中，细胞在水凝胶内分层。在一些实施方案中，水凝胶包含不同的细胞类型。
在一些实施方案中，改变将细胞封装在水凝胶中的条件，以使细胞活力最大化。在一些实施方案中，例如，细胞活力随着较低的聚合物浓度而增加。在一些实施方案中，相对于完全封装在水凝胶内的细胞，位于水凝胶边缘的细胞倾向于具有降低的活力。在一些实施方案中，可能需要调节和/或改变周围环境的条件(例如pH、离子强度、营养物可利用性、温度、氧可利用性、摩尔渗透压浓度等)，以使细胞活力最大化。
在一些实施方案中，可以通过监测细胞活力的许多指标之一来测量细胞活力。在一些实施方案中，细胞活力的指标包括但不限于：胞内酯酶活性、质膜完整性、代谢活性、基因表达和蛋白质表达。仅举一个例子，当细胞暴露于荧光酯酶底物(例如钙黄绿素AM)时，活细胞由于将酯酶底物水解为绿色荧光产物的胞内酯酶活性而发绿色荧光。再举一个例子，当细胞暴露于荧光核酸染色剂(例如溴乙啡锭二聚体-1(ethidium homodimer-1))时，死细胞由于其质膜受损并且因此可渗透高亲和力核酸染色剂而发红色荧光。
通常，组合物中细胞的数目/量是允许形成根据本发明使用的优选水凝胶的量。在一些实施方案中，适合于形成水凝胶的细胞的量的范围在：约0.1％w/w至约80％w/w、约1.0％w/w至约50％w/w、约1.0％w/w至约40％w/w、约1.0％w/w至约30％w/w、约1.0％w/w至约20％w/w、约1.0％w/w至约10％w/w、约5.0％w/w至约20％w/w、或约5.0％w/w至约10％w/w。在一些实施方案中，适合于形成水凝胶的组合物中的细胞数目/量为约5％w/w。
在一些实施方案中，适合于形成水凝胶的前体溶液中的细胞浓度的范围在约10至约1x108个细胞/mL、约100至约1x107个细胞/mL、约1x103至约1x106个细胞/mL、或约1x104至约1x105个细胞/mL。在一些实施方案中，单个水凝胶包含相同的细胞和/或细胞类型的群体。在一些实施方案中，单个水凝胶包含不相同的细胞和/或细胞类型的群体。在一些实施方案中，单个水凝胶可包含至少两种不同类型的细胞。
在一些实施方案中，单个水凝胶可包含3、4、5、10或更多种类型的细胞。仅举一个例子，在一些实施方案中，单个水凝胶可仅包含胚胎干细胞。在一些实施方案中，单个水凝胶可包含胚胎干细胞和造血干细胞二者。
3.2.培养基
能够支持一种或多种细胞类型或细胞系生长的多种细胞培养基中的任一种(包括复杂培养基和/或无血清培养基)均可用于使细胞生长和/或维持细胞。通常，细胞培养基包含缓冲液、盐、能量源、氨基酸(例如天然氨基酸、非天然氨基酸等)、维生素和/或微量元素。细胞培养基可以任选地包含多种其它成分，包括但不限于碳源(例如，天然糖、非天然糖等)、辅因子、脂质、糖、核苷、动物来源组分、水解产物、激素、生长因子、表面活性剂、指示剂、矿物质、特定酶的活化剂、特定酶的活化剂抑制剂、酶、有机物和/或小分子代谢产物。
适合根据本发明使用的细胞培养基可从多种来源商购获得，例如ATCC(Manassas,Va.)。在某些实施方案中，使用以下一种或多种培养基使细胞生长：RPMI-1640培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基、最低必需培养基Eagle、F-12K培养基、Iscove改良的Dulbecco培养基。
本领域技术人员将认识到本文列出的细胞代表了可以被封装在根据本发明的前体溶液(并因此最终在水凝胶中)内的细胞的示例性而非全面列表。
4.应用
本发明的目的是提供支持受损组织的自然愈合而不诱导任何特定组织形成的填充物。目的是使用本发明填充组织空腔或覆盖组织缺损，以提供部分或完全的所需填充空间并且具有最小的异物反应。
优选地，本发明的组合物通过注射或经由气雾剂等通过喷雾体现本发明的颗粒而施用于受试者(例如哺乳动物)。
独特地，本发明的组合物可用于部分或完全填充缺损，而与缺损的形状和/或深度/尺寸无关，可以以逐层方式添加以建立所需的体积。本发明的组合物在不需要物理封闭的情况下粘附于部位，与血液原位混合，并且可以通过细规格针注射到深层组织中。可以根据需要以不同的时间间隔用本发明的组合物再填充组织间隙。
本发明提供了可注射的填充物。注射至身体后，组合物形成粘性水凝胶。由于本发明的固有性质，本发明的组合物在体内具有良好的耐受性，具有最小炎症反应。该产品是宿主组织传导性的，但不是诱导性的，因为其仅在活动性出血或包含再生生物组分的其它流体的存在下才显示再生特性。
本发明的组合物可通过细规格针注射。本发明的组合物粘附在注射部位，并且可以通过微创方式以在体内逐层产生3D结构的方式注射。
本申请适用的组织类型包括皮肤组织和牙周组织。
本发明的组合物的用途包括：a)可注射的真皮填充物以填充皮肤空腔以暂时减少皮肤皱纹(美容用途)；b)可注射的真皮填充物以暂时抬高瘢痕基部并促进愈合(治疗用途)；c)可注射的真皮填充物以在手术干预后的瘢痕组织中支持真皮结缔组织形成并促进愈合(治疗用途)；d)可注射的真皮填充物以在烧伤后的瘢痕处理中支持真皮结缔组织形成(美容/治疗用途)；e)即用型真皮基质以在伴有出血的急性真皮缺损中支持血管向内生长并促进愈合(治疗用途)；f)即用型真皮基质以填充手术产生的真皮空腔(治疗用途)；g)即用型真皮基质以支持皮肤移植手术(美容和治疗用途)；h)载体系统以物理递送骨移植替代物(治疗用途；参见，例如Expert Rev Med Devices.,2006Jan；3(1):49-57)；i)载体系统以离体和/或体内填充假体(例如，笼(cage))(治疗用途)；j)无组织诱导特性的填充物；k)即用型基质以在牙齿拔除后支持和修复牙周组织(治疗用途)；l)即用型基质以支持牙周韧带组织移植(治疗用途)；以及m)可注射基质以用于暂时抬高牙周韧带组织(治疗用途)。
本发明的优选实施方案的优点包括以下：a)细胞友好性；b)可注射性；c)宿主组织粘附性；d)没有组织特异性诱导特性；和e)体内良好耐受性(最小的免疫反应)。
本发明的水凝胶优选导致由于注射入动物体内而引起最小的异物反应。
本发明的水凝胶优选是宿主组织传导性的。这意味着其在活动性出血或包含再生生物组分的其它流体的存在下显示出再生特性。本发明的水凝胶优选可与血液混合。
本发明的组合物优选是可注射的。优选地，可以多次注射到同一部位。本发明的组合物在通过注射施用于哺乳动物后优选原位形成水凝胶。
本发明的水凝胶优选显示出对宿主组织的良好粘附性。粘附特性允许逐渐建立下层组织床以支持愈合。粘附特性还允许以微创方式形成3D结构。
本发明的水凝胶可优选用于逐层填充。这样能够填充具有不同高度的3D空腔。
本发明的水凝胶优选在数天、数周或数月的时间内原位降解，以留下健康的组织。
已经开发出本发明作为安全且易于使用的生物材料，以作为可注射的支架。本发明在于由与胸腺素β-4缀合的合成智能聚合物(PNPHO)构成的单一均匀分子。本发明的组合物在室温下为液体，能够直接注射至期望的临床位置。本发明的组合物在暴露于体温时形成弹性凝胶，与血液混合并稳定该部位的凝块。另外，基于体外和体内研究，本发明组合物的吸收速率被认为是，本发明组合物在不到三个月的时间内吸收到体内。此外，绵羊截骨模型以及成骨细胞和成骨前细胞的研究证实，该装置支持血管向内生长和骨骼形成。
假设可以将本发明的组合物注射到牙齿拔除后的牙槽基底中以与血液混合，稳定凝块并提供用于血管向内生长和骨骼再生的均匀支架。目的是通过将本发明的组合物直接施用至拔除牙槽中来增强该部位的伤口愈合并保留牙齿拔除后的牙槽骨。为了研究该假设，申请人进行了一项临床试验，其涉及具有按计划的牙齿拔除的十名参与者。在这项临床研究中，研究了软组织闭合(伤口愈合)、拔除部位的外观、参与者的健康状况以及下层骨骼的质量。
表1总结了本发明组合物的应用和该技术的这些潜在用途的支持数据的存在。
表1.
本发明组合物的可能应用和当前支持性的临床前结果
Figure BDA0003065836290000321
Figure BDA0003065836290000331
5.试剂盒
本文公开了多种试剂盒，其包含用于本发明的一种或多种优选水凝胶。例如，本发明提供了包含用于修复或再生骨缺损的水凝胶和说明书的试剂盒。试剂盒可包含多种不同的水凝胶。
试剂盒可任选地包含聚合物、细胞、NSPP、生物活性化合物、水等。试剂盒可包含任意组合的多种其它组分或试剂中的任一种。没有明确列出所有各种组合的所有，但是每种组合都包含在本发明的范围内。在以下段落中描述了根据本发明提供的一些示例性试剂盒。
根据本发明的某些实施方案，试剂盒可包含例如：
i.包含聚合物的溶液，包含NSPP的溶液；和
ii.由溶液形成水凝胶的说明书。
根据另一个实施方案，试剂盒可包含例如：
i.包含聚合物和NSPP的组合物；和
ii.由组合物形成水凝胶的说明书。
根据另一个实施方案，试剂盒可包含例如：
i.包含聚合物和NSPP的组合物，其中一种或两种为固体形式；任选地，溶剂，例如水或类似物；和
ii.由组合物形成水凝胶的说明书。
试剂盒可进一步包含从商业和用户角度来看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。示例性的试剂盒可以是气雾剂的形式，或具有可组合形成气雾剂的组分或用于施用本发明的组合物的类似方式。
试剂盒通常包含用于本发明的优选水凝胶的使用说明书。说明书可以例如包括用于以下的方案和/或描述用于以下的条件：产生水凝胶，向有此需要的受试者施用水凝胶，产生水凝胶集合体等。试剂盒通常包含一个或多个容器或器皿，使得各个组分和试剂中的一些或全部可分开容纳。试剂盒还可以包含用于以相对密闭的方式封闭各个容器以进行商业销售的装置，例如塑料盒，其中可以包含说明书、包装材料(例如聚苯乙烯泡沫塑料)等。
试剂盒或“制品”可包括容器以及在容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳对治疗疾病有效的水凝胶或组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页表明该水凝胶或组合物用于治疗所选疾病。在一个实施方案中，标签或包装插页包括使用说明书，并指示治疗性组合物可用于修复或再生组织。
本发明的优选实施方案
本发明中使用的优选聚合物是PNPHO。本发明组合物中PNPHO的浓度优选为组合物的约100至约300mg/mL。当以气雾剂形式体现时，组合物的浓度为约5mg/mL至约70mg/mL。
本发明中使用的优选的NSPP是胸腺素β-4。或者，可以使用胸腺素β-4的功能同源物。
优选地，PNPHO与胸腺素β-4(或其功能同源物)缀合，其中蛋白质/肽段和PNPHO二者具有限定的作用。
胸腺素β-4(或其功能同源物)：
i.作为用于组织再生的生物活性信号传导的来源；和
ii.促进水凝胶填充物内部和周围血管的形成。
PNPHO聚合物与蛋白质/肽化学键合以：
i.调节该生物聚合物用于组织应用的理化特性；
ii.快速赋予水凝胶填充物热固性，以将其局部限制；和
iii.赋予可注射的水凝胶生物吸收特性。
这两个主要链段的组合导致了具有一系列有利于组织再生和修复的特性的新型智能组织填充物的形成。PNPHO聚合物的优点是其所有组分均获得美国FDA批准用于生物医学应用。
PNPHO聚合物包含热响应级分(N-异丙基丙烯酰胺)以诱导在体温下的水凝胶形成，并与丙交酯、乙二醇和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺链段一起，以分别赋予产物高机械强度、水溶性和胺基反应性。PNPHO聚合物的分子结构和每个链段的作用在以下实施例中绘制的示意图中示意性地示出。
优选地，使用等摩尔量的PNPHO和胸腺素β-4，尽管本领域普通技术人员将理解摩尔比可以根据实践中遇到的每种情况而变化。
实施例
材料
除非另有说明，否则化学品购自Sigma-Aldrich。2-乙基己酸亚锡(Sn(Oct)2)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)原样使用。低聚(乙二醇)单甲基醚甲基丙烯酸酯(OEGMA，Mn＝475)在使用之前通过使其在二氯甲烷(体积比为1:1)中的溶液通过中性氧化铝柱以除去抑制剂进行纯化。D,L-丙交酯(LA)单体在使用之前在真空中于40℃干燥24小时。偶氮二异丁腈(AIBN)由澳大利亚悉尼大学化学学院(School of Chemistry in the Universityof Sydney,Australia)慷慨赠予。
HEMA-聚(丙交酯)(HEMA-PLA)大分子单体的合成
通过LA与作为引发剂的HEMA的羟基和作为催化剂的Sn(Oct)2的开环聚合合成HEMA-PLA大分子单体(参见方案1)。
Figure BDA0003065836290000351
方案1
HEMA-聚(丙交酯)(HEMA-PLA)大分子单体的合成
将LA和HEMA在三颈烧瓶中在氮气氛中于110℃混合15分钟。随后，将1mol％的Sn(Oct)2(相对于HEMA进料)在1ml无水甲苯中的混合物添加到LA/HEMA溶液中。将所得混合物在氮气氛中于300rpm和110℃搅拌1小时。反应后，将混合物溶解在四氢呋喃中，并在1℃的冷蒸馏水中沉淀。通过以3000rpm离心5分钟来分离形成的沉淀物。
重复离心循环3次以除去所有未反应的单体和副产物(主要是盐)。然后将沉淀物溶解在乙酸乙酯中。以6000rpm离心5分钟从溶液中除去悬浮的固体颗粒，并将上清液用MgSO4干燥12小时。将干燥的上清液过滤以除去MgSO4颗粒。然后将聚合物溶液在60℃减压干燥，并且在真空中于40℃持续24小时进一步除去溶剂残留物。将所得的粘性油储存在冰箱中以备进一步使用。
HEMA:LA的进料比在1:1.5至1:2.5之间变化，以获得具有不同乳酸长度的PLA/HEMA大分子单体。使用1:1.5和1:2.5摩尔比的HEMA和LA单体分别合成了乳酸长度为3和6的两种PLA/HEMA大分子单体。
使用具有来自HEMA和LA的质子峰证据的1H NMR谱证实了PLA/HEMA大分子单体的合成。使用乳酸中次甲基的5.2ppm峰和HEMA的5.7ppm和6.0ppm峰的总积分，从1HNMR谱计算出了PLA/HEMA大分子单体中LA与HEMA的摩尔比。
聚(NIPAAm-co-NAS-co-(HEMA-PLA)-co-OEGMA)(PNPHO)的合成
使用如下所述的方法(1)或(2)合成PNPHO(参见方案2)。
Figure BDA0003065836290000361
方案2.
聚(NIPAAm-co-NAS-co-(HEMA-PLA)-co-OEGMA)(PNPHO)的合成
方法1
使用AIBN作为引发剂通过自由基聚合合成PNPHO。在装有磁力搅拌棒和橡胶隔片的Schlenk烧瓶中装入NIPAAm(12mmol)、NAS(1.0mmol)、HEMA-PLA(0.57mmol)、OEGMA(0.56mmol)、AIBN(0.07mmol)和无水N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)。通过三次冷冻-泵-解冻循环使烧瓶脱氧，然后密封，然后将烧瓶浸入预热到70℃的油浴中以开始聚合。24小时后，将反应混合物冷却至室温，在乙醚中沉淀，过滤，然后在真空下干燥。通过用THF/乙醚再溶解/再沉淀将聚合物纯化两次，并且最后在真空下干燥2天。
方法2
使用ACVA作为引发剂通过自由基聚合合成PNPHO。通过改变乳酸长度(HEMA-PLA中为3和6)以及HEMA-PLA(6、8和11mol％)和OEGMA(3、5和8mol％)的摩尔比来改变共聚物的组成。将已知量的NIPAAm、NAS、HEMA-PLA、OEGMA、ACVA(7.0×10-5mol)溶解在圆底一颈烧瓶中的13ml无水N,N’-二甲基甲酰胺中。然后通过氮气吹扫15分钟使系统脱氧。结果还表明，通过在溶液中在真空中用氮气吹扫10分钟使单体溶液脱氧是可行的。该技术提供了一种更有效的方法来从大规模溶液中去除氧。
然后将反应器密封并浸入70℃的油浴中24小时。然后将得到的聚合物溶液在室温下冷却1小时，并且在250mL乙醚中沉淀。然后通过过滤悬浮液收集沉淀物，并在真空中干燥6小时。将干燥的粉末溶解在四氢呋喃中，并且在乙醚中沉淀，以进一步除去大分子单体的残留物。将最终粉末在真空中干燥至少48小时。
表2
PNPHO聚合物(OEGMA:PLA/HEMA(LA长度):NAS:NIPAAm的形式)
单体进料 最终组成 胶凝时间(min)
5:8(5):3.5:83 4.8:7.9(5):7:80 2.5±0.6
5:8(5):7:80 4.6:7.8(5):13.6:74 3.1±0.9
8:6(5):3.5:82 8:5.4(5):7:80 5.1±0.6
8:6(5):7:80 8:5.1(5):14:72 5.4±0.1
3:8(5):3.5:72 4.8:7.9(5):7:80 2.0±0.2
3:8(5):7:80 4.6:7.8(5):13.6:74 2.2±0.9
PNPHO组合物
根据图2(a)所示的方案合成了PNPHO。通过具有每种单体的质子峰证据的1H NMR谱确认了PNPHO共聚物的合成，如图2(b)所示。检测到NIPAAm(a和b)、NAS(e)、HEMA-PLA(f、h、k)和OEGMA(m和n)的特征性质子峰。关于NAS质子共振(e)，发现这些与残留痕量DMF溶剂的约2.9-3.0ppm的共振重叠，导致基于相同数据集的原始计算错误(各个峰下的积分/面积，作为整个PNPHO聚合物中各个单体相对mol％的基础)。随后的校正证实了第三单体(NAS)以大于约7mol％的量存在。基于NIPAAm(a)、NAS(e/2-f)、HEMA-PLA(h)和OEGMA(n/2)中每种单体的这些峰的积分，计算出共聚物的最终组成。在这项研究中，共聚物表示为PNPHO，并添加了对应于HEMA-PLA(乳酸长度)与OEGMA的摩尔比的下标。例如，PNPHO 5:8(5):7:81代表用8摩尔％的乳酸长度为5的HEMA-PLA和5摩尔％OEGMA合成的共聚物。产生了多种共聚物。这些在表2中示出。表2还提供了关于其胶凝时间和温度的数据。
PNPHO在PBS中的溶解度
改变PNPHO的单体比例，以获得一系列溶解于水性介质(例如PBS)中的组合物，以开发可注射制剂。由于共聚物极性基团与水分子之间形成氢键，因此基于NIPAAm的共聚物可溶于低于其LCST的水溶液。在这项研究中，通过测量不同组成的PNPHO在PBS中的饱和浓度研究了乳酸长度、HEMA-PLA和OEGMA含量对PNPHO的溶解度的影响。
图3中的结果表明，在HEMA-PLA骨架中在3至6范围内增加乳酸长度对PNPHO在PBS中的溶解度没有显著影响(p>0.05)。因此，在所研究的范围内，PNPHO骨架中侧链的疏水特性对PNPHO在水性介质中的总溶解度影响很小。因此，通过改变乳酸长度，可以调节PNPHO的其它特性，例如胶凝行为和机械性能，而不会影响PNPHO在水性介质中的溶解度。
可以通过改变疏水和亲水含量二者来调节PNPHO在PBS中的溶解度。PLA链段是主要的疏水骨架，而NAS和HEMA单体二者表现出相对有限的亲水性。因此，在PNPHO的合成中包含OEGMA以促进共聚物的亲水性。
将共聚物中的HEMA-PLA(即疏水含量)从6mol％增加到8mol％和11mol％分别使PNPHO在PBS中的溶解度降低30％和50％。该溶解度降低也是由于降低了共聚物中相对亲水性链段NIPAAm的浓度(p<0.05)。因此，降低PNPHO中NIPAAm的含量会大幅影响共聚物的水合。
当使用大于3mol％(例如1.5mol％)的OEGMA作为亲水链段时，PNPHO在水中的溶解度急剧增加。结果表明，OEGMA含量小于3mol％的共聚物不溶于水性介质。图3中的结果表明，当将OEGMA浓度从3mol％分别升高至5mol％和8mol％时，具有6mol％PLA-HEMA的PNPHO共聚物的溶解度显著提高了2倍和3倍。但是，在包含更高摩尔比的疏水性链段HEMA-PLA(即8mol％和11mol％)的共聚物中，OEGMA浓度对PNPHO的溶解性几乎没有影响。该行为归因于具有更长链和更高MW的共聚物的形成，这阻碍了共聚物在水溶液中的水合和溶解性。
评估了水溶性PNPHO共聚物的浓度对其溶液通过18G针的可注射性的影响。发现PBS中150mg/mL PNPHO溶液通过18G针是可注射的，并将该共聚物浓度用于进一步分析。较高浓度的聚合物可用于其它生物医学应用，例如用于体外组织生长的支架制造。
胸腺素β-4
由于琥珀酰亚胺接头表现出高反应性和对含氨基化合物的最佳可达性，因此可以合理地推测该聚合物可应用于具有氨基的TB4，以制备可流动的水凝胶。为了证实该假设，研究了聚合物与TB4之间反应的可行性。在磷酸盐缓冲盐水中形成TB4溶液。在4℃将1000μLTB4溶液与140mg聚合物充分混合至少24小时，然后使混合物在37℃下胶凝。
胶凝行为(时间和温度)
表2中的结果表明，用PNPHO组合物制备的水凝胶的胶凝时间在2.5至5分钟的范围内。重要的是要注意，该测量是在模拟生理条件(37℃培养箱)中进行的，并且在此温度下，与体液和/或体表接触的水凝胶的胶凝速度明显加快。该胶凝时间对于临床应用是有利的，因为其允许施用产品并且同时防止施用的产品从部位脱位。此外，这些PNPHO制剂的胶凝温度低于37℃，其允许临床使用。制剂的高胶凝温度非常便于临床医生在体内递送溶液。
PNPHO的缀合效率
为了测试PNPHO的缀合效率，将TB4合成肽用作模型系统。结果表明TB4与不同的PNPHO制剂有效缀合。该结果显示了PNPHO与合成或天然肽或蛋白质缀合的高效作用。两种组分(TB4和PNPHO)通过PNPHO的琥珀酰亚胺酯基团和TB4的氨基在分子水平上相互作用。为了评估这一点，比较了PNPHO和PNPHO-co-TB4的低临界溶液温度(LCST)。
PNPHO聚合物和缀合体系(PNPHO-co-TB4)的LCST受PNPHO、TB4的化学组成以及分子结构中亲水基团和疏水基团之比的驱动。PNPHO和PNPHO-co-TB4在加热时表现出相反的溶解性。这种热响应行为是由于当温度升高至高于LCST时NIPAAm基团和相关侧链(例如NAS、PLA/HEMA、OEGMA和TB4)经历从溶解的卷曲到塌缩小球的变化(即从亲水状态转变为疏水状态)的能力(图1)。由于监测了NMR数据采集的温度变化过程中聚合物的转变，因此1H-NMR提供了对LCST的准确分析。1H-NMR谱在10℃至30℃的温度范围内以1℃的间隔记录。随着温度的升高以及缀合体系从卷曲到球形的转变(反向溶解度)，各个峰的NMR信号下降。NMR峰面积对温度的图确定了LCST。
基于PNPHO聚合物和PNPHO-co-TB4的1H-NMR谱，发现缀合体系的LCST比PNPHO聚合物的低2至4℃(图4)。为了量化胶凝温度，使用D2O/m(相对于OEGMA的特征峰)。与PNPHO相比，缀合体系的胶凝温度的变化证实了这两种组分之间存在化学相互作用。另外，胶凝温度的降低增加了体内胶凝的动力学，并且因此促进了产品在施用部位的粘附。
蛋白质-PNPHO水凝胶的生物可吸收行为
PNPHO-co-TB4的临床研究表明，该产品在3个月内被身体完全吸收。植入部位的组织学评估显示，在植入之后三至四个月没有产品痕迹。
可行性研究
表3
可行性研究应用的产品配置
Figure BDA0003065836290000401
将来自该批次的样品在90mm胰蛋白酶大豆琼脂平板上于37℃孵育。在进行批量释放之前，验证没有细菌生长。
表4中显示了在执行该方案时使用的样本量。
表4.
测试方案中使用的样本量
Figure BDA0003065836290000402
Figure BDA0003065836290000411
在考虑统计的有效性的情况下选择用于待执行的所有测试所选择的样本量。选择了大量的动物/测试品和对照组，例如，每组每个时间点6个重复，远高于通常用于临床前概念验证研究的3个重复。
表5.
采用的测试方案
Figure BDA0003065836290000412
PNPHO-co-TB4测试品由申请人根据文献程序和方法制造。产品制造过程中使用的所有设备、工具和材料均已通过申请人QMS批准。PNPHO-co-TB4装置通过即用型注射器提供给测试设施。每个测试品均为一次性使用。
执行此测试方案需要以下设备/工具/材料。根据行业标准进行了组织化学分析、染色和可视化。
表6
执行测试方案所需的设备/工具/材料
Figure BDA0003065836290000413
Figure BDA0003065836290000421
结果
PNPHO-co-TB4溶液从室温(20至25℃)的液体转变为体温(37℃)的凝胶，并且在模拟生理条件下注射后保持其结构稳定性(图1(a))。活绵羊截骨模型用于检查在存在活动性出血的情况下PNPHO-co-TB4的可注射性和粘附性。图1(b)中的结果表明，产品可以注射到缺损部位，并立即形成水凝胶，该水凝胶填充空腔，与血液混合并使凝块稳定。尽管该部位存在活动性出血并随后血液稀释了水凝胶，但仍实现了水凝胶的形成。这是本发明水凝胶系统的重要属性，因为其可用于可注射系统的临床应用并防止装置故障。由于体内注射中存在体液，更好的热传递促进了水凝胶形成的动力学。例如，图1(c)显示皮肤上水凝胶的形成较慢。本发明的这种特征行为可用于通过在暴露的伤口上逐层施用产品(图1(d))来形成3D结构，暴露伤口通常具有比核心/深层组织低的温度。本发明粘附并且与血液和宿主细胞混合以支持愈合。
PNPHO-co-TB4支持组织再生的能力基于施用后形成的物理支架。暗示该基质在整个结构中支持细胞浸润和血管向内生长。为了验证该假设，使用小鼠动物模型来研究PNPHO-co-TB4与宿主环境整合并支持血管向内生长的体内潜力。此外，将PNPHO-co-TB4与作为阳性对照的整合再生真皮基质(Integra)进行直接比较。
动物模型和手术
使用全层小鼠动物模型(n＝20)；在每只动物中，通过手术产生了两(2)个全层真皮缺损；参见图5(a)。用PNPHO-co-TB4或Integra(阳性对照)处理伤口，并且将皮肤移植物缝合在适当位置，如图5(b)所示。然后将常规敷料施用于处理部位，特别是Atrauman和IV3000。使用IVIS Lumina XR活体成像仪通过荧光辐射效率确定移植部位的血管形成和向内生长。在处理后多至8周定期检查缺损的移植物存活率。此外，在不同的时间点处死动物；收集活检以量化宿主组织整合、血管向内生长和炎症反应。
皮肤移植物存活率
在整个研究中，研究了不同时间点移植皮肤的存活率。成功的皮肤移植物在宿主真皮部位保持完整，而失败的部位会褶皱并且随时间脱落；参见图5(c)。该研究的结果表明，术后1周内，使用Integra处理的4个皮肤移植失败，表明存活率为80％。这一发现与以前的研究一致，其报告了Integra的存活率为约85％(“Design of an artificialskin.I.Basic design principles,”n.d.；Vyas&Vasconez,2014)。在整个研究过程中，所有用PNPHO-co-TB4处理的移植部位存活；PNPHO-co-TB4处理的皮肤移植物的存活率为100％。PNPHO-co-TB4支持全层皮肤移植的功效表明，PNPHO-co-TB4具有良好的耐受性，具有最小的炎症反应。成功的皮肤移植物存活表明，PNPHO-co-TB4充当了用于新生血管向内生长、宿主组织浸润和细胞外基质形成的再生支架。为了研究PNPHO-co-TB4的这些特征，对动物在不同时间点进行了活体荧光成像，并对处理部位进行了组织学评估。
对本发明组合物的炎症反应
移植后两(2)和四(4)周收集皮肤活检，以通过组织化学评估PNPHO-co-TB4的生物学行为。Integra处理部位的H&E染色显示了在第2周和第4周对Integra构建体的轻微炎症反应；图6(a)和图6(b)分别通过Integra部位周围可见的多层纤维组织显示。先前的研究表明了对构建体的类似炎症反应和Integra周围纤维组织的形成(Hori,Osada,Isago,&Sakurai,2017；Y.Wang,等人,2015)。
相反，图6(c)和图6(d)中PNPHO-co-TB4处理部位的皮肤活检的H&E染色显示在移植后两周，在PNPHO-co-TB4周围形成了非常狭窄的纤维组织层。图6(c)中的白色箭头表示PNPHO-co-TB4凝胶的结构，并且黑色箭头表示PNPHO-co-TB4水凝胶周围的最少的纤维组织形成。认识到提高的炎症与受损的伤口重塑相关，PNPHO-co-TB4周围形成的纤维组织减少表明该材料有助于有效的软组织修复。
新血管形成
使用IVIS Lumina XR活体成像仪通过荧光辐射效率确定移植部位的血管形成和向内生长。移植手术之后两(2)和四(4)周，使用AngioSense750 EX体内血池荧光成像探针确定血管生成反应。这种近红外荧光大分子探针在脉管系统中持续存在，并且能够对血管和血管生成进行成像。在术后的每个时间点，向每只小鼠注射在100μL PBS中的2nmolAngioSense750EX。24小时后，扫描每只小鼠的荧光辐射效率(n＝8)。
辐射效率用于指示伤口区域中的新血管的密度。图7的结果表明，术后两周，PNPHO-co-TB4处理部位的荧光辐射效率显著高于Integra处理部位(p<0.01)。相反，两个处理组在术后四(4)周的血管生成信号非常低，表明血管形成受到控制并且该部位的愈合已经完成。在先前的研究中报告了类似的发现，表明四周之后处理部位未显示血管生成信号(Yiwei Wang等人,2015)。
本发明组合物内的血管向内生长和细胞浸润
皮肤移植后四(4)周对PNPHO-co-TB4处理部位的组织学评估证实了PNPHO-co-TB4支持血管向内生长和宿主细胞浸润的潜力。皮肤活检的H&E染色如图8所示。如先前所述，在PNPHO-co-TB4结构周围形成了纤维组织薄层，表明可注射的水凝胶在体内具有良好的耐受性；图8(a)和图8(b)。更重要的是，该纤维组织薄层可用作真皮中PNPHO-co-TB4边界的指示。
图8(c)和图8(d)中的结果显示了PNPHO-co-TB4结构内血管的形成。此外，皮肤活检的染色显示了PNPHO-co-TB4水凝胶结构内宿主成纤维细胞明显浸润；图8(d)。为了进一步确认本发明组合物结构内的成纤维细胞浸润和皮肤细胞外基质的形成，用Masson三色在移植之后4周对皮肤移植部位进行染色。图9中的结果显示了移植手术之后4周在本发明组合物中的胶原纤维形成。该结果证实了在本发明组合物的结构内的成纤维细胞浸润及其与宿主组织整合并促进新真皮形成的潜力。
PNPHO-co-TB4结构内胶原纤维的形成明显高于Integra结构内检测到的。CCC中的结果显示，与本发明的组合物相比，在Integra的结构内胶原蛋白形成明显减少。该结果也与文献中报道的先前发现一致(Yiwei Wang等人,2015)。
这项研究的结果证实了PNPHO-co-TB4支持宿主组织整合、血管向内生长、细胞浸润和新真皮形成的支架作用。
技术可行性：结论
PNPHO-co-TB4已在一项权威的动物研究中成功进行了试验。这项权威的动物研究涉及40个全层皮肤移植物，并直接比较了PNPHO-co-TB4和金标准真皮模板(IntegraDermal Matrix)。在研究期间，与Integra组中82％的成功率相比，所有使用本发明组合物处理的皮肤移植物均存活(100％存活率)。另外，本发明组合物加速了血管网络形成，使炎症反应最小化，促进了其结构内的皮肤细胞渗透，并且在该部位形成了新真皮和胶原纤维。这些结果表明该技术在烧伤后瘢痕处理中具有很高的潜力。
临床研究–研究装置说明
在即用型无菌注射器中提供本发明组合物PNPHO-co-TB4。该产品为一次性使用和双重装袋。本发明组合物在室温为液体，能够直接注射至期望的临床位置。在体温下，本发明的组合物形成白色弹性支架。
装置组合物
本发明组合物是可注射支架。本发明组合物的配方中有两个主要部分：(1)合成聚合物(PNPHO)和(2)合成的非人或动物来源肽，即胸腺素β-4。这两个部分化学键合导致形成单个均匀分子(例如，PNPHO-co-TB4)。
智能聚合物为聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-(N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺)-共-(聚丙交酯/甲基丙烯酸2-羟酯)-共-(低聚(乙二醇)，表示为PNPHO。在本发明组合物中使用的PNPHO的具体配方为PNPHO 5:8(5):7:81。在PNPHO-co-TB4的配方中使用等摩尔量的PNPHO和胸腺素β-4。
装置预期用途
PNPHO-co-TB4旨在促进骨骼再生。具体地，PNPHO-co-TB4旨在减少牙齿拔除后的骨吸收，从而增强患者的健康结果。
临床研究计划–研究目的
主要目的是确定定性措施和分析方法，以进一步研究本发明组合物的用途。具体地，与历史(文献)对照群体相比，牙齿拔除后在本发明组合物的存在下对愈合过程以及组织学和CT评价的骨再生的评估和鉴定。次要目的是检查本发明组合物在人体中的体内特性。
临床研究设计–临床试验终点
该研究的临床试验终点是确定定性措施和分析方法学，以进一步研究本发明组合物的用途长至术后3-4个月。具体地，与历史(文献)对照群体相比，牙齿拔除后在本发明组合物的存在下对愈合过程以及组织学和CT评价的骨再生的评估和鉴定。另外，设计临床试验终点以在术后3-4个月检查本发明组合物在人中的体内特征。
数据质量保证
按照根据SSR内部程序要求的ISO 14155，并且在申请人的ISO 13485质量管理体系认证下，设计、构建和监测临床研究，并且生成、文献记录、记录和报告了数据。
临床研究的管理外包给了独立的CRO，即Southern Start Research(SSR)。在整个试验过程中，所有数据点均由SSR进行100％监测。以表7中指定的时间间隔对数据质量保证和质量控制进行监测访视。
表7.
监测访视计划
Figure BDA0003065836290000461
参与者群体
十(10)名患者参与了本项研究。表8中示出了患者人口统计的概述。
表8.
PET临床研究中参与者的人口统计的概述
参与者的数目 N＝10
男性参与者的数目 M＝10
女性参与者的数目 F＝0
具有吸烟史的参与者的数目 S＝2
手术时的最小年龄 Min-年龄＝28
手术时的最大年龄 Max-年龄＝73
参与者的中值年龄 Med-年龄＝51
参与者的平均年龄 Ave-年龄＝53
治疗计划
表9概述了访视和随访的研究程序和计划。方案按临床研究计划(CIP)中的计划执行。除了参与者#7以外，所有参与者都遵循计划并且按计划进行了随访。由于个人情况，参与者更改了他的计划的治疗，并且因此在第4次访视中未为该参与者收集组织学。
随访期
对研究参与者在牙齿拔除和利用本发明的组合物治疗之后随访三(3)个月。
表9.
研究程序和数据收集访视
Figure BDA0003065836290000471
*登记和访视1(术前基线)可能在同一访视期间发生(完成知情同意程序之后)。
#作为护理标准的一部分，对从植入部位取出的组织进行组织学检查，以准备与访视4吻合的牙齿植入程序。
@此次访视将进行对初始CT扫描的转诊，并且在访视1之前执行该程序。CT结果将记录在访视1的CRF中。
@@此次访视将进行对第二次CT扫描的转诊，并且在访视4之前的两周内执行该程序。CT结果将记录在访视4的CRF中。
表10概述了预期的随访计划以及相应的访视窗口。时间点零(0)是牙齿拔除的时间(以及对于治疗群体植入本发明组合)。
表10.
研究随访窗口
访视 窗口开始 目标 窗口结束
访视1和2 - - -
访视3 6天 7天 10天
访视4 2个月 3个月 4个月
结果–受试者和研究装置的处置
用本发明的组合物治疗了十名患者。在所有参与者中植入了装置。完成临床研究后，没有研究装置留在原位。由Southern Start Research(SSR)临床研究组织根据装置问责程序对所有研究装置进行了核对。
所有发现均为定性评估；这些包括但不限于拔除后不同时间点的伤口外观，患者对疼痛和不适的报告，术后三个月用CT扫描显示的下方骨骼的放射学外观，植入物放置手术期间部位的视觉外观以及术后三至四个月治疗部位的组织学检查。
装置可用性
在整个临床研究中没有装置故障的报告。本发明的组合物以即用型形式提供；这消除了临床医生在手术前进行预混合和任何其它准备步骤的需要。特别地，图11(b)显示可以通过21G针容易地将本发明组合物注射到拔除部位。随后，由于产品的亲水性质，本发明的组合物在该部位与血液混合并形成水凝胶以使凝块稳定。
该装置在PET试验中的临床使用表明，对于所有10位患者，注入牙槽部位的本发明的组合物都是成功的，并且主要研究员未报告任何装置故障。图12中的结果表明，对于所有10名患者，本发明组合物的施用和胶凝成功率为100％。
表11.
本发明组合物在PET试验中对10名患者的可用性
患者# 注射/施用 胶凝 粘附 膜 封闭
001-001 成功 立即 成功 未使用 未封闭
001-002 成功 立即 成功 未使用 未封闭
001-003 成功 立即 成功 未使用 未封闭
001-004 成功 立即 成功 未使用 未封闭
001-005 成功 立即 成功 未使用 未封闭
001-006 成功 立即 成功 未使用 未封闭
001-007 成功 立即 成功 未使用 未封闭
001-008 成功 立即 成功 未使用 未封闭
001-009 成功 立即 成功 未使用 未封闭
001-010 成功 立即 成功 未使用 未封闭
表11中概述了来自本发明组合物的可用性的发现概述。根据主要研究员，使用本发明的组合物可以在程序中节省多至45分钟。这可以实现，因为拔除后使用本发明的组合物消除了对主要封闭(例如膜的使用和部位的微缝合)的需要。
表12.
基于部位的视觉观察和组织化学分析的本发明组合物在牙齿拔除后的安全性
Figure BDA0003065836290000481
Figure BDA0003065836290000491
1在CT扫描结果中鉴定为正常表示没有炎症、感染、坏死、肥大性骨生长、肥大性纤维化
装置安全性和伤口愈合
用本发明的组合物治疗的所有十名患者在术后一周后返回进行首次随访。没有任何患者出现疼痛或不适的报告。在口腔检查期间(施用后一周)，在部位没有感染或炎症的迹象。此外，主要研究员检查了伤口闭合和软组织形成。在所有十名患者中，记录了伤口闭合并检测到加快的软组织形成(结果见图12)。
牙齿拔除并且用本发明的组合物治疗之后三个月，患者接受了植入物放置程序。此时，从本发明组合物的注射部位收集活检。通过独立实验室(Sonic Clinical TrialsPty Ltd)对样品进行组织化学分析。这些组织化学分析的结果总结在表12中。在分析的所有样品中，没有坏死、异物型巨细胞或异物反应的证据。这些发现表明本发明的组合物在体内具有良好的耐受性并且在体内具有生物相容性。
骨再生功效的指征
术后三个月，将该部位的CT扫描成像用于研究该部位的愈合进展和骨吸收的延长。来自Envision Medical Imaging的Tom Huang博士的独立CT扫描报告证实骨吸收最小化。除了该部位的CT扫描成像外，在植入物放置程序中，还从本发明组合物注射部位收集了活检。将样品固定并送去进行独立的组织化学分析。使用该部位的苏木精和曙红(H&E)和Masson三色染色对部位的病理行为和骨再生过程进行了分析。在所有分析的样品中，组织化学分析显示了形成了相互连接的活性骨小梁，是编织骨和层状骨以及活性成骨细胞和破骨细胞的混合物。在所有患者中，均注意到活跃的牙周骨重塑。
表13列出了来自独立实验室的H&E和Mason三色染色的组织化学标本的所有报告。
表13.
来自用本发明化合物测试的部位的H&E和Mason三色染色的发现概述
Figure BDA0003065836290000501
Figure BDA0003065836290000511
PNPHO-co-TB4的气雾剂形成能力
对具有不同固体含量(PNPHO浓度在17.5mg/mL至140mg/mL之间)的每种制剂进行粒径分析，作为体积直径分布和导出参数(d10、d50、d90和％V>10)。无论制剂的浓度和测试温度如何，从所有制剂产生的气雾剂液滴均呈现双峰分布。通常，第一个峰(～50μm)趋于随着制剂浓度的降低而增加，而第二个峰(～500-600μm)随浓度而增加。这表明大多数气雾剂液滴在10-100μm范围内。
对于d10、d50和d90，所有稀释制剂的百分数尺寸分别为21.4±3.9μm、45.6±9.4μm和238.6±181.5μm(平均值)。用于鼻腔递送的普遍中值尺寸在30至120μm之间(1)，因此所有稀释制剂均在用于鼻腔递送的规格内。重要的是，所有制剂具有小于3％体积的直径小于10um的液滴，表明其适合鼻腔递送并避免了下气道沉积。第90个百分位数的尺寸显示出最大的可变性，暗示了粗糙液滴排放的潜在问题，尤其是对于更浓缩的制剂。
羽状物覆盖范围
FDA推荐了鼻用制剂的喷雾模式的特征。图15中显示了受试制剂(在室温下启动)的羽状物模式。所有制剂显示出较宽的覆盖面积，但最明显的特征是随着制剂浓度的增加羽状物中央没有沉积。
尽管存在这些差异，但样品的Dmax和Dmin值(图16)是恒定的，并且获得的椭圆率(～1)指示了气雾化后的喷雾对称性。所有制剂的椭圆率在FDA规格(1.00-1.30)内。实践中，用于鼻腔递送的最佳选择应该是在覆盖面积和改善的停留时间之间进行权衡。如果发生瘤(runoff)，则较高的覆盖面积将无法提供最佳结果。
鼻腔沉积模式
制剂在人鼻模型上的沉积模式如图17所示。两种受试制剂(17.5mg/mL和35mg/mL)显示出快速的粘附，因为沉积模式在从启动到多至15分钟保持稳定且相对不变。此外，未观察到滴入喉咙。制剂在短时间的粘附可能表明所递送货物的更高停留时间和生物利用度。两种制剂也都能够到达嗅觉区域(鼻区域的上部)，这对于从鼻到脑的递送很重要。
药物从基于PNPHO的水凝胶的体外释放
使用盐酸环丙沙星作为模型药物来研究基于PNPHO的水凝胶在施用后控制小的亲水性药物释放并防止药物突然释放的潜力。在胶凝过程中聚合物链中疏水结构域的组装导致水从基质中排出。为了评估从PNPHO-co-TB4中渗出的盐酸环丙沙星的量，使用Snapwell装置评估了水凝胶。简单地说，将盐酸环丙沙星粉末溶解(20mg/mL)在PNPHO-co-TB4溶液中。随后，将200μL PNPHO-co-TB4/盐酸环丙沙星制剂放入snapwell的顶端隔室中并允许形成水凝胶，同时将snapwell在37℃静置在平坦的表面上30分钟，以避免聚合物通过膜损失。接下来，收集水凝胶的顶部液体上清液层。
为了进一步分析随时间从凝胶中释放的药物，将2mL PBS添加到每个snapwell的基底外侧隔室中，然后将板在恒定轨道摇动(60rpm)下于37℃孵育。在24小时中的预定时间点，从基底外侧培养基中取出样品(200μL)，并且每次更换为等量的新鲜预热PBS。使用经过验证的高效液相色谱方法(HPLC,Shimadzu,Sydney NSW,Australia)对所有样品中的盐酸环丙沙星进行定量。
通过HPLC定量盐酸环丙沙星
使用由LC20AT泵、SIL20AHT自动进样器和SPD-20AUV-VIS检测器(Shimadzu,Sydney NSW,Australia)组成的HPLC系统确定盐酸环丙沙星的定量。使用反相Luna C-18柱(Phenomenex,Torrance,USA)150x 4.6mm和3μm粒度进行样品定量。使用由磷酸盐缓冲液(pH 7.2):乙腈(75:25v/v)组成的流动相进行测量，流速0.7mL/min，检测波长275nm和进样量100μL。每天用乙腈:水(50:50v/v)在针洗涤中新鲜制备标准溶液，并且在0.05-100μg/mL的浓度内确认线性，回归值>0.999。
评估生理条件下在胶凝过程(30分钟)期间盐酸环丙沙星从PNPHO水凝胶中的初始释放。发现平均2.7±1.4μg和28.9±17.9μg(n＝3)(图18；t＝0)的盐酸环氧氟沙星分别释放到PNPHO和PNPHO-co-TB4的液体顶端层中。重要的是要注意，与负载量相比，受试药物从水凝胶的初始释放微不足道，即负载20mg/mL，并且从PNPHO和PNPHO-co-TB4分别释放2.7±1.4μg和28.9±17.9μg。
施用后从水凝胶释放的相对较低百分比的环丙沙星显示出本发明在药物递送应用中的高潜力。在图18中，每种制剂在37℃随时间从水凝胶中的盐酸环丙沙星释放表示为累积质量。从两种水凝胶释放的盐酸环丙沙星的量之间无显著差异，24小时后从PNPHO和PNPHO-co-TB4分别释放137.4±32.4μg(89.5±15.8％)和133.7±42μg(65.3±10.5％)。这些结果证实了该药物从基于PNPHO的水凝胶中持续且受控的释放特点。
不良事件概述
整个临床试验中均未报告医疗装置不良事件。在该试验中报告的唯一不良事件与7号参与者的治疗计划有关；在访视4中未收集该参与者的组织学信息，因为该参与者被选择改变其治疗计划，其不包括骨组织学。
关于装置可用性的结论
本发明组合物被毫无困难地施用于所有十名患者。研究中未报告装置(注射器)故障。在使用之前不需要制备和/或混合装置。本发明的组合物在注射到牙槽部位后立即形成白色水凝胶。该产品与血液混合并粘附在拔除部位。产品粘附在该部位，并且无需初始封闭该部位以容纳装置。
装置安全性
研究中未报告装置相关的不良事件或严重不良事件。所有十(10)名患者在牙齿拔除后7天返回进行首次随访，九(9)名接受了植入物放置手术的患者没有报告炎症、感染、疼痛或不适，在植入物放置手术过程中收集天然组织用于组织化学分析。该部位的H&E染色表明，产品在体内具有良好的耐受性，并且在该部位没有异常或异物型巨细胞的迹象。在该部位未发现坏死或坏死组织。另外，拔除部位和本发明的组合物治疗部位的CT扫描显示在该部位没有骨异常。
装置功效
在牙齿拔除并且用本发明的组合物治疗之后7天，对所有患者发现了伤口闭合。注意到细胞水平的成骨和破骨活性、活跃的骨重塑。在治疗部位发现了活性骨和骨重塑，显示了该装置的骨传导特性。如所假设的，该产品没有诱导骨形成，并且对宿主组织没有任何其它表型作用。
风险和益处的评估
已经基于个体或集体评估了装置的潜在益处和鉴定的残留风险，以确定在权衡装置的潜在益处时其是否可接受。
越来越多的证据表明，骨锚定假体改善了生存质量测量，包括咀嚼、言语和总体健康状况。然而，经济障碍和与口腔外科医师的接触被认为是植入式固定假体广泛使用的限制。从临床的角度来看，使牙齿拔除后的骨损失最小化对于简化和因此改善对骨锚定假体的可及性是必要的。
对于临床医生而言，牙齿拔除后的骨量损失很难解决，并且给患者和卫生系统带来了财务负担，尤其是在农村和社会经济不利的地区。每2名患者中就有1名需要二次移植手术以增加骨量而用于成功移植物放置的事实凸显了在牙科领域该问题和挑战的程度。本发明组合物是易于使用的材料，其可以在牙齿拔除后保持脊骨体积。牙医赞赏植入物放置程序的易于使用和可预测性。患者将会受益，因为使用本发明的组合物促进了牙齿拔除后伤口的愈合，加速了骨骼的愈合，并可潜在地阻止对二次增强手术的需求。
将本发明的组合物施用于新拔除牙槽是简单的并且易于在临床实践中使用。与所有其它骨替代物不同，本发明的组合物以液体递送至牙槽并在该部位形成弹性基质。该先导PET试验的主要目的是研究本发明组合物的安全性、可用性和骨传导性。收集包括放射成像和组织化学分析在内的疗效指标。总而言之，尽管试验并不权威，但PET证实了装置的安全性和可用性；未发现设备故障，并且没有检测到设备相关不良事件。
考虑到预期用途，预期使用者，合理可预见的误用，本发明的组合物装置系列可能具有的影响使用，并考虑到公认的最新技术水平，可以推断风险管理过程已确认潜在装置益处超过残留风险。
本发明组合物的临床相关性
已经将本发明组合物开发为安全且易于使用的生物材料以填充组织缺损/空腔。本发明组合物是包含与胸腺素β-4交联的合成“智能”聚合物(PNPHO)的单一均匀分子。本发明组合物在室温为液体，能够直接注射至期望的临床位置。本发明组合物在暴露于体温时形成弹性凝胶，与血液混合并使该部位的凝块稳定。向十(10)名患者施用了本发明组合物。在使用本发明组合物时，没有报告或记录任何装置故障或装置相关的不良事件。施用之后一周发现伤口愈合。
术后三个月，在施用部位未检测到病理异常，例如炎症、感染或巨细胞。另外，在用本发明组合物处理的部位检测到活跃的骨重塑以及成骨和破骨活性，证实了装置的骨传导性质。这些发现表明本发明组合物在软组织和硬组织二者中均具有用于伤口愈合的高潜力，因为产品在该部位不诱导任何表型作用，例如软组织和硬组织修复。但是，认为通过提高本发明组合物的骨诱导性能可以实现进一步的健康益处。
临床研究总结
这项先导试验涉及在十名患者中在牙齿拔除后使用本发明PNPHO-co-TB4支架进行牙槽保护。在所有患者中，申请人的装置均成功施用；无需在拔除部位使用膜或微缝合。这使得主要研究员能够节省程序中时间。在随访中，拔除后7天发现伤口闭合，并且在任何患者中没有感染或炎症的迹象。使用本发明组合物三个月后，从该部位收集组织活检用于组织化学分析；结果表明，产品被完全吸收，并且在该部位没有病理异常的迹象。此外，在该部位还发现了活性骨重塑。
尽管已经参考具体实例描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明可以以许多其它形式体现。
申请人感谢Hui Ong博士和Dina Silva博士在进行体外气雾剂形成研究和台式药物释放测试中所做出的贡献。

Claims (46)

1.一种组合物，包含聚合物和天然或合成肽或蛋白质(NSPP)，其中所述聚合物包含：
用于结合水的第一单体；
用于赋予所述水凝胶机械性能的第二单体；
用于与天然或合成肽或蛋白质(NSPP)结合的第三单体；和
用于赋予相变行为的第四单体；
并且其中所述天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4或其功能同源物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一单体选自：聚醚、聚乙烯醇(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(氨基酸)和葡聚糖。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述聚醚选自：聚乙二醇(PEG)、低聚(乙二醇)(OEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚环氧乙烷-共-环氧丙烷(PPO)、共聚环氧乙烷嵌段或其无规共聚物。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中所述第一单体是低聚(乙二醇)单甲基醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二单体是甲基丙烯酸酯或包含甲基丙烯酸酯的无规共聚物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二单体选自：甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸羟乙酯聚(乳酸)共聚物(HEMA-PLA)、聚(乳酸)、聚(己内酯)、聚(乙交酯)、聚(乙交酯-共-丙交酯)或聚(乙交酯-共-己内酯)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二单体是甲基丙烯酸羟乙酯聚(乳酸)(HEMA-PLA)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第三单体具有用于与所述NSPP结合的亲电子官能团。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第三单体选自：N-羟基磺基琥珀酰亚胺(SNHS)、N-羟基乙氧基化琥珀酰亚胺(ENHS)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第三单体是N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第四单体选自：聚(环氧乙烷)/聚(环氧丙烷)和聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)均聚物和共聚物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第四单体是(N-异丙基丙烯酰胺)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚合物包含量为约3至约8mol％，优选约5mol％的所述第一单体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚合物包含量为约5至约9mol％，优选约7mol％的所述第二单体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚合物包含量为至少约7mol％的所述第三单体。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚合物包含：
量为约3至约8mol％的所述第一单体，
量为约5至约9mol％的所述第二单体，
量为至少约7mol％的所述第三单体，和
量为构成100％的所述聚合物组合物的其余部分的所述第四单体。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚合物包含量为约60至约85mol％的所述第四单体。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中：
所述第一单体是OEGMA，
所述第二单体是HEMA-PLA，
所述第三单体是NAS，并且
所述第四单体是NIPAAm，
并且其中所述聚合物包含：
量为约3至约8mol％的OEGMA，
量为约5至约9mol％的HEMA-PLA，
量大于约7mol％的NAS，和
量高至约85mol％的NIPAAm。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述聚合物包含：
量为约5mol％的OEGMA，
量为约7mol％的HEMA-PLA，
量大于约7mol％的NAS，和
量高至约81mol％的NIPAAm。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，包含等摩尔量的所述聚合物和胸腺素β-4。
22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述聚合物的浓度为所述组合物的约100mg/mL至约300mg/mL。
23.一种水凝胶，包含根据权利要求1至22中任一项所述的组合物和水，其中所述NSPP与所述第三单体的结合使所述聚合物交联，从而形成其中包含水的水凝胶。
24.一种制备水凝胶的方法，所述方法包括向权利要求1至22中任一项所述的组合物添加水。
25.一种制备水凝胶的方法，所述方法包括将权利要求1至22中任一项所述的组合物的水溶液与所述天然或合成肽或蛋白质(NSPP)的水溶液混合。
26.根据权利要求25所述的方法，其中在体温下形成所述水凝胶。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中在将所述组合物和所述NSPP通过注射施用于哺乳动物之后形成所述水凝胶。
28.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物在制备水凝胶中的用途，所述水凝胶用于：硬或软身体组织的修复和/或恢复；伤口愈合；暂时皱纹减少；暂时抬高瘢痕基部并促进愈合；在手术干预后的瘢痕组织中支持真皮结缔组织形成并促进愈合；在烧伤后的瘢痕处理中支持真皮结缔组织形成；在伴有出血的急性真皮缺损中支持血管向内生长并促进愈合；填充手术产生的真皮空腔；支持皮肤移植手术；物理递送骨移植替代物；填充假体；用作无组织诱导特性的填充物；在牙齿拔除后支持和修复牙周组织；或暂时抬高牙周韧带组织和/或支持牙周韧带组织移植。
29.根据权利要求23所述的水凝胶在制造用于组织修复和/或恢复的药物中的用途。
30.一种用于以下的方法：硬或软身体组织的修复和/或恢复；伤口愈合；暂时皱纹减少；暂时抬高瘢痕基部并促进愈合；在手术干预后的瘢痕组织中支持真皮结缔组织形成并促进愈合；在烧伤后的瘢痕处理中支持真皮结缔组织形成；在伴有出血的急性真皮缺损中支持血管向内生长并促进愈合；填充手术产生的真皮空腔；支持皮肤移植手术；物理递送骨移植替代物；填充假体；用作无组织诱导特性的填充物；在牙齿拔除后支持和修复牙周组织；或暂时抬高牙周韧带组织和/或支持牙周韧带组织移植，所述方法包括向哺乳动物施用根据权利要求1至22中任一项所述的组合物。
31.一种组织修复和/或恢复方法，所述方法包括向哺乳动物施用根据权利要求23所述的水凝胶。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的方法，其中所述施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在所述哺乳动物的体温下形成水凝胶。
33.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，用于在以下中使用：组织修复和/或恢复；伤口愈合；暂时皱纹减少；暂时抬高瘢痕基部并促进愈合；在手术干预后的瘢痕组织中支持真皮结缔组织形成并促进愈合；在烧伤后的瘢痕处理中支持真皮结缔组织形成；在伴有出血的急性真皮缺损中支持血管向内生长并促进愈合；填充手术产生的真皮空腔；支持皮肤移植手术；物理递送骨移植替代物；填充假体；用作无组织诱导特性的填充物；在牙齿拔除后支持和修复牙周组织；或暂时抬高牙周韧带组织和/或支持牙周韧带组织移植。
34.根据权利要求33使用的所述组合物，其中所述填充物不具有组织诱导特性。
35.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，用于在牙齿拔除后支持和修复牙周组织中使用。
36.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，用于在暂时抬高牙周韧带组织和/或支持牙周韧带组织移植中使用。
37.根据权利要求23所述的水凝胶，用于在组织修复和/或恢复中使用。
38.根据权利要求33至37中任一项使用的所述组合物，其中所述施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在所述哺乳动物的体温下形成水凝胶。
39.根据权利要求37使用的所述水凝胶，其中所述施用步骤通过注射或通过施用气雾剂来进行，从而在所述哺乳动物的体温下形成水凝胶。
40.一种用于形成水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包含：
聚合物和天然或合成肽或蛋白质(NSPP)，
其中所述聚合物包含：
用于结合水的第一单体；
用于赋予所述水凝胶机械性能的第二单体；
用于与天然或合成肽或蛋白质(NSPP)结合的第三单体；和
用于赋予相变行为的第四单体；
并且其中所述天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4或其功能同源物。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，还包含在单独的容器中的水。
42.一种用于形成水凝胶的试剂盒，包含在各自容器中的：
天然或合成肽或蛋白质(NSPP)；和
组合物，
其中所述组合物包含：
用于结合水的第一单体；
用于赋予所述水凝胶机械性能的第二单体；
用于与天然或合成肽或蛋白质(NSPP)结合的第三单体；和
用于赋予相变行为的第四单体；
其中所述天然或合成肽或蛋白质(NSPP)是胸腺素β-4或其功能同源物；
并且其中所述NSPP与所述第二单体交联，从而使得当所述组合物与水接触时能够形成所述水凝胶。
43.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述NSPP和所述组合物之一或两者为固体形式。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的试剂盒，还包含在单独的容器中的水。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的试剂盒，还包含用于顺序或同时施用所述试剂盒的各组分的说明书。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的试剂盒，被配置为使得在分配时将所述组合物、所述NSPP和水混合在一起。
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