CN101291586A - 用于细胞植入的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于通过细胞植入进行组织工程的方法，其包括在缺损的位置原位使用支架，其中只有在将支架插入组织缺损的位置之后才将治疗性细胞原位固定入支架，从而不仅将细胞固定至支架，而且还将支架固定至组织缺损。本发明还提供了适合用于进行本发明的方法的部分的试剂盒。

Description

用于细胞植入的方法
发明领域
本发明涉及将活细胞植入活哺乳动物的组织缺损以促进组织缺损的修复。
发明背景
使用细胞移植进行的组织工程方法是已知的，例如可包括例如开放性关节手术(例如，开放性膝盖手术)和在关节手术的情况下，使患者经历长期相对残疾的状态以恢复健康来获得最佳结果。此类方法花费昂贵并且需要多种医疗方法例如康复和物理治疗。
使用不同形式的支架技术的方法(其中将支架(具有或不具有在支架中培养的细胞)插入缺损)在进行只由关节镜检查指导的细胞植入操作中遇到了困难。
关节镜自体细胞植入(Arthroscopic Autologous CellImplantation)(称为使用小型手术干预的AACI或ACI)是治疗软骨或骨缺损的手术操作，其中在将支架插入缺损的同时，通过使用针例如“钝圆的”针或导管将细胞悬浮液或细胞混合物与前体固定剂施入所述缺损。通过关节镜显现和指导该植入操作。
WO 2004/110512公开了用于在哺乳动物中治疗软骨或骨缺损的内窥镜法，其包括鉴定缺损的位置和将软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞和成骨细胞施入软骨或骨的缺损。将细胞和可固化的支持材料例如可溶性凝血酶和血纤蛋白原或胶原混合物一起使用。可设想，对于凸关节或凹关节中的手术，可将多孔膜置于缺损的位置，但在血纤蛋白/细胞混合物在原位凝固后取出。WO 2004/110512中描述的方法使得能够通过关节镜修复组织，即无需开放性关节手术(例如，开放性膝盖手术)。
然而，WO 2004/110512中描述的方法不提供，特别是在患者在充分修复/再生已发生之前使手术部位受压力过度的情况下，不提供完全的或十分强健的缺损修复。
支架是其中可整合细胞的多孔结构。它们通常由生物相容性、可生物降解的材料制成并且被加到组织中以在形成功能组织的过程中指导细胞的组织、生长和分化。使用的材料可以是天然的或合成的来源。
之前提交的丹麦优先权申请PA200600337(以Coloplast的名义)提供了用于本发明的部分的方法和试剂盒的优选支架材料。支架材料和用于产生支架材料的方法不是本发明的部分。
本发明提供了用于通过细胞移植进行组织工程的方法，其包括将固体支架整合入缺损位置，和相伴地使用细胞和固定剂前体(例如WO2004/110512中公开的‘可固化的支持’材料)。
固定剂前体至固定剂的转化导致细胞至支架和支架至缺损部位的有效附着。我们已令人吃惊地发现本发明的方法提供了相当高的组织愈合率和达到可与周围未被破坏的组织相似的程度的恢复。支架的作用不仅增加细胞迁移(例如，成软骨效应)和成活力，而且还对细胞提供强支持，从而使得能够产生结构上强壮的组织，还使得工程改造的组织或置换的组织对周围组织的更均匀整合。
附图概述
图1.组织学，对10μm冷冻切片的(A)甲苯胺蓝染色。10μm冷冻切片的(B)番红O染色。
图2.免疫组织化学，观察到为棕色至黑色斑点的(A)II型胶原。观察到的为棕色至黑色斑点的(B)聚集蛋白聚糖。
图3.基因表达。SOX9和II型胶原蛋白在水凝胶-PolyGraft系统中显示增加的表达，当将hAC用于我们的水凝胶(SCAS原理)(具有软骨细胞例如具有本发明中包括的其他类型的支架的血纤蛋白原/凝血酶组合物)时，我们也观察到了该现象。
图4.将支架置于12孔NUNC盘的底部；以一式三份重复向标记#5和#18的行中的支架加入细胞/血纤蛋白。最后两个(2)一式三份重复设置只包含磷酸缓冲盐溶液。
图5.将软骨细胞/水凝胶用于软骨缺损的底部。
图6.现已将MPEG-PLGA置入支架。
图7.目视ICRS评分。与三个其他的组相比，SCAS系统(直方图上的PLGA)评分显著更高。
图8.当不处理缺损时或用微骨折处理它们时修复组织的代表性组织学形态。如所显示的，观察到非常少的修复组织。番红O染色和甲苯胺蓝染色。
图9.当用FIB50或用SCAS系统处理缺损时，修复组织的代表性组织学形态。如所显示的，对于SCAS系统观察到高度的填充。(SCAS原理)。使用番红O染色和甲苯胺蓝染色。
图10.2周后软骨细胞迁移出置于MPEG-PLGA/水凝胶支架中的软骨外植体的迁移。
图11.4周后软骨细胞迁出置于MPEG-PLGA/水凝胶支架中的软骨外植体的迁移。
图12.本发明的方法的概述。之前鉴定了在组织(T)中具有缺损(D)的个体(1)，制备支架(S)并将其插入缺损(2)，然后同时施用细胞悬浮液和固定剂前体(CF)，向缺损中的支架原位施用用于将固定剂前体转化成固定剂(T)的合适的转化剂。
图13.在本发明的方法使用过程中显示的两个合适的部分的试剂盒的实例。在部分的第一试剂盒中(1)，用转化剂(T)浸渍第一组分支架(S)(即(ST))，在与到达组织(T)中缺损位置(D)的递送工具(X)连接的分开的容器中提供包含固定剂前体(F)的细胞悬浮液(C)(即(CF))。可将(CF)组分贮存在两个分开的容器中，通过与递送工具(X)连接的共同的连接体/混合装置(Y)结合(该实施方案未显示)。对递送装置施加压力(P)迫使(CF)流出容器，通过递送装置，然后直接到达缺损位置处的支架上。在部分的第二试剂盒(2)中，不用转化剂(T)浸渍第一组分支架(S)，然而通过施加的压力(P)将(T)与(CF)组分混合在一起，所述压力迫使(CF)和(T)流出它们各自的容器，然后进入共同的连接器/混合装置(Y)，通过递送装置(X)将(CF)和(T)的混合物共同用于之前在组织(T)中的缺损(D)处置入的支架(S)。
图14.在本发明的方法的使用过程中显示的第三合适的部分的试剂盒的实例。在显示的部分的试剂盒中，不用转化剂(T)浸渍第一组分支架(S)，在分开的容器中提供细胞悬浮液(C)、固定剂前体(F)和转化剂(X)，所述容器与到达组织(T)的缺损位置(D)的共同递送装置(X)连接。对递送装置施用的压力(P)迫使(C)、(F)和(X)流出其各自的容器，通过共同的连接器/混合装置(Y)，从而可通过递送装置(X)将(C)、(F)和(X)的混合物共同用于之前在组织(T)的缺损(D)处置入的支架(S)。
图15.显示可用于本发明的部分的试剂盒中的合适的连接装置的实例。(F)是指连接装置和固定剂前体来源/容器之间的连接，(C)是指连接装置和细胞悬浮液来源/容器(F)之间的连接，(C)可以是单个来源，(T)是指连接装置和转化剂来源/容器之间的连接。(Y)是指连接装置体，(X)是指递送装置，任选地为递送装置和连接装置之间的软管，(M)是指帮助组分(F)、(C)和(T)混合以形成(F、C和T)的连接装置的任意混合组件。
发明概述
已在本发明中令人吃惊地发现支架和固定的细胞(例如固定在凝胶或水凝胶中的细胞和支架)的使用提供了在缺损部位产生新的健康组织的高效和有力的方法，所述方法明显示能够导致非常高质量的修复，该修复更厚、更均匀并且在一些情况下与原始未被破坏的邻近组织无伤痕接缝。例如，本方法可用于有效地制备高质量的‘透明素’如关节软骨，通常为在手术后花费长时间再生长和通常导致较弱和较差修复的组织类型。在一些方面，由本发明的进行的修复被认为几乎与天然软骨的外观等同或接近天然软骨的外观。
在第一方面，本发明提供了用于通过活哺乳动物细胞的移植修复活个体哺乳动物例如人的组织中的缺损的方法，所述方法包括：
在固定剂前体转化成固定剂之前
i)共同施用
a)包含基本上不含细胞的第一组分，生物相容性支架；
b)包含基本上不含血清的哺乳动物细胞和生物可接受的固定剂前体(或前体的混合物)的混合物的第二组分，
至所述缺损位置，和
ii)通过固定剂前体转化成固定剂来将所述哺乳动物细胞固定至所述支架，和将所述支架固定至所述活哺乳动物组织。
在第二方面，本发明提供了用于上述方法的部分的试剂盒，所述试剂盒包含
a)包含基本上不含细胞的生物相容性支架的第一组分；
b)包含基本上不含哺乳动物细胞的血清和生物可接受的固定剂前体(或前体的混合物)的混合物的第二组分，
c)和任选地用于所述固定剂前体的交联剂
其中，所述第一组分和第二组分相互分离。
此处描述的涉及用于本发明的方法的组分的实施方案同样可用于本发明的部分的试剂盒。
发明详述
新方法和手段的目的是将任何耐受类型的支架，包括但不限于胶原支架、藻酸盐、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)组合物和上述支架或膜样支架的组合物用于靶例如软骨缺损、骨缺损、皮缺损肤和器官缺损或器官中局部细胞缺损。
作为第一步骤，优选通常在切割或“裁剪大小”以适合缺损后将不含细胞或固定剂(例如粘合剂/胶粘剂)的支架置于缺损的位置-合适地，可将支架塑造成特定的形状或形式以适合缺损的位置和/或新组织的希望的形状和/或形式。
在一个方面，将与培养基和血纤蛋白原混合的细胞置于之前置于缺损中的不含细胞的支架的表面，同时或之后即刻将细胞和血纤蛋白原(其施用于位于靶区域的不含细胞的支架的表面)和包含凝胶化催化剂/试剂例如凝血酶的组分加在支架的顶部。细胞和血纤蛋白原以及凝血酶通过亲水性支架被吸收。在支架内凝胶化或凝固过程在数秒钟或数分钟(例如少于5分钟，或甚至少于2分钟)内发生，从而在使支架(和在一个方面细胞)固定至缺损的同时将细胞固定至支架。
本发明的优选方面是在加入细胞之前将支架例如不含细胞或基本上不含细胞的支架置于缺损中。合适地，支架沿着被治疗的缺损形成紧密连续的适合体(fit)。支架应当优选具有表现亲水性的能力。
在另一个方面，将一种固定剂前体(例如，血纤蛋白原)中的细胞与其他固定剂前体(凝血酶)混合，同时伴随支架的插入。
在本发明的另一个方面，可以以这样的方式制备支架，即在使用之前用一种固定剂前体“浸渍”其，所述固定剂前体能够保持其活性(例如，由HumaGene Inc.，Chicago，Illinois开发的凝血酶类似物)。通常将支架切削或塑造成缺损的尺寸，然后将支架置于缺损中(例如，在关节镜指导过程中)，将与固定剂前体混合的细胞置于支架上，此时细胞/固定剂前体可包含溶液，当将该溶液加入至用其他固定剂前体(例如，凝血酶类似物)浸渍的支架时，将使已存在于支架中的固定剂前体激活，从而使其和与细胞一起加入的固定剂前体反应，导致凝胶化、凝固和粘着。
所述方法称为支架亲水性细胞吸收系统(Scaffold HydrophilicCell Absorption system)(SCAS系统)。可使用任何细胞对任何合适的靶使用SCAS系统，所述靶的范围是软骨缺损、骨关节缺损、骨缺损、牙周组织缺损、皮肤缺损以及各种“靶”器官(其中通过修复所述器官中的病症细胞将使患者受益)。例如可将覆盖需要自体皮肤移植的受损皮肤的区域的支架置于需要移植的区域，当喷雾在亲水性膜上时，例如由于膜将快速吸收包含血纤蛋白原的培养基中的细胞和同时吸收凝胶化因子(例如凝血酶)的事实，包含一种凝胶形成或凝固组分(例如，血纤蛋白原)的培养基中的细胞可与其他凝胶形成或凝固组分集中在一起，并且被吸收，从而使膜保持对损伤的皮肤区域的粘着，整个方法通常在灭菌或无菌高效空气过滤的帐篷(heap-filtered tent)(LAF-bench)或房间中进行。将优选自体来源的细胞例如成纤维细胞和/或皮肤细胞例如角质细胞或其他皮肤相关细胞固定在支架或膜中，同时当所述不含细胞的支架或膜置于其靶(例如，软骨缺损)中时，由于原位凝胶化或凝固施加到支架或膜上的不含细胞的组合物，支架或膜将附着至靶。
在一个实施方案中，在安置支架后，使用例如此处描述的部分的试剂盒将细胞悬浮液(例如悬浮在包含血纤蛋白原的培养基中)和包含凝固剂例如凝血酶的另一种溶液以及可能的其他凝固剂置于支架上，所述试剂盒可包含可在功能或结构上连接的至少两个注射器，从而释放例如一滴或更多滴包含细胞悬浮液和凝固剂混合物(例如，血纤蛋白原和凝血酶)的此类混合的组分。然后亲水性支架促进混合的细胞流体和凝固剂“吸收”入支架，从而将支架固定或附着在靶位置(缺损)例如软骨缺损中，所述支架现在充满分散在支架中的血纤蛋白中包含的细胞。因此，用细胞填充支架，同时凝固剂在支架中相互作用，从而该支架立即(例如在将混合的细胞流体和凝固剂施用入支架的数秒或数分钟内)保持在原位。
在由K.Osther和其他人(美国专利号5,759,190、5,989,269、6,120,514、6,283,980、6,379,367、6,592,598、6,592,599、6,599,300、6,599,301)提供的之前的公开内容中，在将包含细胞的支架置于靶(例如，软骨缺损)中之前，将细胞用于支架并且培养入支架进行一段时间。本发明导致提高的结果和更方便的方法，如此处所描述的。
在本发明的方法中，没有作为相同手术操作的一部分从缺损位置取出支架。优选地，不取出支架，然而通常在手术后至少1至6个月内其可在缺损位置被生物降解或溶解。因此在进行本发明的方法期间和之后，支架保留在缺损位置，然而通常在手术后至少1至6个月的时期内其可在缺损位置被生物降解或溶解。
可如WO02/061052(其在此引用作为参考)中所述制备细胞。从而可将WO02/061052中公开的细胞直接注射入置于其靶上的不含细胞的支架。
在一个实施方案中，由于同时或基本上同时对已置于靶区域的不含细胞的支架(或膜)加入细胞流体和凝胶化材料，细胞被锁入支架。从而施用入不含细胞的支架(或膜)的包含细胞的凝胶化物质与也以液体形式用于不含细胞的膜的凝胶化物质同时或基本上同时分散。在一个实施方案中，通过凝胶化材料血纤蛋白原与凝血酶的相互作用成血纤蛋白凝胶(水凝胶)，将细胞固定入支架内。然后支架自发地附着至靶区域(例如，软骨缺损)。
本发明的实施方案
优选在施用所述第二组分之前，将第一组分用于所述缺损的位置。在这样的实施方案中，认为这样是可能的，即可将第一组分用于随后使用的第二组分的分开的手术操作，例如在使用开放性手术操作中可使用第一组分，同时可通过内窥镜使用第二手术操作。然而，优选在相同的手术操作期间使用第一和第二组分。
在已施用和固定第一和第二组分后，可使哺乳动物细胞能够在整个支架中迁移和/或生长，从而产生新的活组织，在软骨修复的情况下，这可称为软骨形成作用。
在本发明的优选实施方案中，同时对所述缺损的位置施用固定剂前体转化剂。
在优选实施方案中，以所述第一组分的部分的形式使用转化剂。在该方面，可将转化剂整合入支架，例如以颗粒形式存在或化学连接或非化学连接的形式整合入其中。转化剂可用作溶剂，例如可让该溶剂在支架中干燥，和/或例如共价连接至支架聚合物，或可选择地化学地或通过辐射与聚合物交联或通过离子吸引(例如氢键或范德瓦尔斯力)结合。
在一个实施方案中，转化剂可以是交联剂和/或聚合剂。
在一个实施方案中，转化剂是蛋白质或多糖。
在一个实施方案中，将转化剂和所述生物可接受的支架一起冻干。
在优选实施方案中，固定剂以水凝胶(即能够结合水的凝胶化物质，例如通过混合固定剂前体血纤蛋白原和转化剂凝血酶形成的血纤蛋白)的形式存在。
认识到，同时优选的是固定剂前体是第二组分的部分，和认识到分开地提供转化剂(作为第一组分的部分或当对支架施用时与细胞一起提供)，在一个特定的实施方案中，可能可以将转化剂(例如凝血酶)与细胞混合，将转化剂例如血纤蛋白原与第一组分一起提供或作为第一组分的的部分例如作为冷冻干燥的支架的组分提供。在特定的实施方案中，为了本发明的目的，转化剂和固定剂前体是可互换的术语，重要的是在进行本发明的方法之前，使它们保持分开，从而允许在进行本发明的方法期间同时或基本上同时施用。
在优选的实施方案中，哺乳动物细胞与所述活哺乳动物组织/个体免疫相容。然而在使用免疫抑制药物的情况下，可使用非免疫相容细胞。
患者
活的个体哺乳动物优选是人类，通常为患者。然而本发明的方法也可用于其他哺乳动物例如马或山羊。
细胞
优选可从所述个体哺乳动物获得或衍生所述哺乳动物细胞。在WO02/061052中公开了从个体哺乳动物获得和培养细胞的此类方法。
优选以细胞悬浮液或组织外植体的形式提供哺乳动物细胞。可直接从个体哺乳动物的其他部分获取组织外植体，从而其可以以组织移植物例如皮肤移植物的形式存在。
哺乳动物细胞在来源上可以是自体的、同种的(同种异体的)或异种的。
哺乳动物细胞可来源于多能干细胞或全能(pluripotent)干细胞。
哺乳动物细胞可选自：成纤维细胞、角质细胞、软骨细胞、内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经和牙周细胞。间充质来源的细胞。
成纤维细胞和角质细胞是皮肤细胞的两种细胞类型。
软骨细胞对于例如软骨修复是特别优选的。
还可使用干细胞或其他合适的前体细胞，当所述细胞处于缺损位置时能够原位变成或产生软骨细胞。
通常，用于第二组分的细胞以足以导致靶组织或缺损的再生或修复的量(例如大约0.1x104至大约10x106个细胞/ml或0.1x106个细胞/ml至大约10x106个细胞/ml)的细胞存在。
组织缺损
同时要认识到，本发明的方法广泛用于哺乳动物身体中的许多实体组织，优选组织缺损选自：软骨缺损、骨缺损、皮肤缺损、牙周缺损。
手术方法
可作为或可在手术例如内窥镜、关节镜或微创手术或常规手术或开放性手术的方法的操作期间进行手术操作。
支架
高度优选支架是亲水性的和/或在插入缺损位置之前通过使用生物相容性湿润剂例如水凝胶来制备。
也高度优选支架对于水和/或等渗缓冲液是多孔的。
在一个实施方案中，支架基本上主要由聚合物组成或主要包含聚合物，所述聚合物的分子量例如平均分子量大于大约1kDa，例如大约1kDa至大约1百万kDa，例如25kDa至75kDa。
支架可以以选自：膜、编织或非编织的纤维、冷冻干燥的聚合物例如冷冻干燥的聚合物片、棒或管的形式存在。
在一个优选实施方案中，支架是合成的。
支架可以以选自：片、膜、塑造的形状、塞、管、球形、制备用于插入缺损位置的三维形状或植入物的形式存在。
本发明的方法可用于美容整形，例如，将支架制造/塑造成整形外科所需的形状，然后在一处于原位后就将细胞用于或固定至支架。
可通过将缺损用作模子(mound)或通过在使用缺损作为模板制备的模子中产生缺损来预先塑造支架以使之适合缺损的确切形状。
第一组分例如支架或例如在冷冻干燥过程中加入支架的组合物/化合物可包含可以例如增强细胞粘着、细胞迁移和/或组织再生的其他化合物，这些化合物可以例如选自：透明质酸(HA)、羟基磷灰石(例如以颗粒的形式存在)、生长因子例如IGF-1和胶原。
事实上，支架的孔可部分地由促进细胞粘着和/或向内生长以再生组织的组分占据，所述组分是例如选自硫酸软骨素、透明质烷、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、生长因子、血纤蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原、明胶和聚集蛋白聚糖的组分。
也涉及，在一个实施方案中第二组分可包含这样的化合物，即其可以例如增强细胞迁移和/或组织再生。
在一个有趣的实施方案中，以例如大约0.1至大约15wt％，例如0.1至10wt％，例如0.1至10wt％的比例将一定量的增强细胞迁移和/或组织再生的化合物例如透明质酸整合入支架。在一个实施方案中，该水平低于15wt％，例如低于10wt％或低于5wt％。在一个实施方案中，该水平高于0.01wt％例如高于0.1wt％或高于1wt％。
支架可由任何合适的生物可接受性材料组成或其包含所述材料，然而在优选实施方案中，支架通常包含选自：聚丙交酯(PLA)、聚己内酯(PCL)，聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(D，L-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)、MPEG-PLGA(甲氧基聚乙二醇)-聚(D，L-丙交酯-共聚-乙交酯)、聚羟酸的化合物。在这方面，支架，除了孔域和任何额外的组分例如促进细胞粘着和/或向内生长以再生组织的组分外，还可包含至少50％，例如至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的一种或更多种此处提供的聚合物，包括聚合物的混合物。
PLGA和MPEG-PLGA是特别优选的。
可通过冷冻干燥包含化合物例如上面所列的化合物来在溶液中制备支架。
优选支架具有20％至99％例如50至95％或75％至95％范围内的多孔度。
在一个实施方案中，支架包含生物聚合物，例如蛋白质或多糖。合适的生物聚合物可选自：明胶、胶原、藻酸盐、壳多糖、壳聚糖、角蛋白、蚕丝、纤维素和其衍生物以及琼脂糖。
生物学可接受的固定剂前体
在一个实施方案中，生物学可接受的固定剂前体是从生物获得的或衍生的组分例如血纤蛋白原。
血纤蛋白原可以以重组血纤蛋白原(例如，来自HumaGene Inc.，Chicago，Illinois，USA的重组人血纤蛋白原)的形式存在。
可从哺乳动物宿主细胞例如从与个体哺乳动物相同的物种获得或衍生的宿主或转基因宿主分离血纤蛋白原。
使用的合适的血纤蛋白原的浓度包括1-100mg/ml。0
在一个实施方案中，特别当固定剂前体是血纤蛋白原时，转化剂可选自：凝血酶、凝血酶类似物、重组凝血酶或重组凝血酶类似物。
使用的合适的凝血酶的浓度是0.1NIH单位至150NIH单位，和/或合适的用于聚合1-100mg/ml血纤蛋白原的凝血酶水平。
标准的NIH单位是指用于凝血酶的测量(按照Gaffney PJ，Edgell(Thromb Haemost.1995 Sep；74(3)：900-3)的美国国立卫生研究院常规使用的标准单位，相当于1.1至1.3 IU，优选1.15IU的凝血酶。
活哺乳动物组织可以例如选自：结缔组织、皮肤、软骨组织、骨、韧带和牙周组织。
在一个实施方案中，在重建外科或整形外科中进行该方法。
部分的试剂盒
适合用于上述方法的部分的试剂盒包含根据本发明的方法或此处其他地方的方法定义的第一组分和第二组分，其中，所述第一组分和所述第二组分相互分离。因此必须在进行手术操作之前，不把第一和第二组分混合。
合适地，优选还提供此处定义的转化剂，其中转化剂与所述第一和所述第二组分分离。
如此处所描述的，转化剂可以是第一组分的部分。
部分的试剂盒的结构形式可采用任何形式，所述形式使第一和第二组分以及任选地转化剂能在进行手术操作前保持分开，但在手术期间混合，以使在加入第二组分之前或与之同时或在一个实施方案中在加入第二组分之后将支架插入缺损，如此处参考本发明的方法所描述的。
优选，部分的试剂盒包含整合的供应装置，其包含下列功能上连接的装置：(i)至少一个在使用前可包含所述第二组分的容器，(ii)施压器(force applicator)，用于将所述第二组分压出所述容器和进入(iii)(混合)连接器，从而到达(iv)递送装置，其中所述递送装置适合将第二组分直接用于插入活哺乳动物组织的缺损位置的第一组分。
在一个实施方案中，整合的供应装置包含两个容器，包含所述细胞悬浮物的第一容器，和包含所述固定剂前体的第二容器，其中所述第一和第二容器通过共同的连接器连接，从而允许同时混合所述细胞悬浮物和所述固定剂前体以在通过所述递送工具递送之前制备第二组分。
如此处所解释的，也常在使用前将细胞悬浮液和固定剂前体混合，从而不必总是在整合的供应装置中具有两个用于各物质的分开的容器。
然而，整合的供应装置可包含另外的容器，所述容器装有所述转化剂，其中所述另外的容器通过共同的连接器与所述第一容器连接，和任选地通过所述共同连接体与所述第二容器连接，从而使得所述第一组分与所述转化剂在即将通过所述递送工具将转化剂递送至插入在所述组织的缺损位置的所述第一组分之前混合。这样的整合的供应装置还可包括上述涉及用于细胞悬浮液和固定剂前体的分开的容器的实施方案。
可将容器与施压器功能连接，所述施压器可以是共同的施压器装置或分开的独立的施压器。可通过例如结合或连接注射器柱塞的近端在结构上连接施压器，或可通过例如计算机协调的蠕动泵连接它们。
尽管容器可采用任何合适的形式例如管、圆筒、袋子、罐、烧杯等形式，但在一个实施方案中，至少一个容器例如第一容器、第二容器和/或所述第三容器以注射器体的形式存在，并且所述施压器以可以连接或可以不连接的各自的注射器柱塞的形式存在。
连接器通常是或包含至少一个管，所述管具有与所述一个或更多个上面提及的容器连接的近端和与所述递送装置连接的单个远端。
连接器还可包含使得第二组分和任选地所述转化剂在进入所述递送装置之前能够充分混合的混合装置。混合装置可以以例如简单螺旋桨样形状的形式存在，其可在流体的流动中产生混合涡旋，从而确保均匀的混合。混合器可以是例如通过电动机外部驱动的，或可以是利用通过螺旋桨表面的液体的流动进行旋转的无源装置。可选择地连接器可用作静态混合器。
递送装置可以以任何合适的医疗装置的形式存在，所述医疗装置用于选择的手术操作，例如此处提及的手术操作，例如递送装置可选自：导管、针头、注射器、管、压力枪和喷射装置。
同时上面统一标准的连接器和递送装置是优选的，要认识到部分的试剂盒可包含平行整合的供应装置，例如用于第二组分的供应装置和用于转化剂的供应装置。
发明的其他方面
第一组分包含或由固体支架组成。
第二组分包含细胞(哺乳动物细胞)和生物可接受的固定剂前体。通常第二组分以细胞悬浮液的形式存在。
在一个优选实施方案中，在干燥或在潮湿的条件下贮存第一组合物，但在使用前在例如盐水或等渗缓冲液或合适的缓冲系统中使其变湿。
此处所用的术语“同时施用”是指这样的施用，即该施用形成第一组分和第二组分以及合适地转化剂(其将固定剂前体转变成固定剂)的混合物，这样混合物可在固定步骤(过程)之前存在于缺损的位置。在本发明的方法中，高度优选在加入第二组分之前将支架(即第一组分)加至缺损的位置。在第一组分之前加入第二组分可导致支架与缺损之间的液体缝隙，从而导致支架不能很好地固定至缺损，以及导致支架和其中包埋的细胞不能有效地固定至缺损的高可能性。
然而，在一个实施方案中，在施用第二组分之后将第一组分(支架)置入缺损位置。在这样的实施方案中，在固定步骤之前放置支架。从而可以例如已(最近)将转化剂作为第二组分的部分施用，或可以作为第一组分的部分或在第一组分施用后不久施用转化剂。在该实施方案中，无论第二组分的施用是否在第一组分的施用之前，第二和第一组分的施用之间的时间优选不超过30分钟，例如不超过10分钟，不超过5分钟，不超过2分钟例如不超过1分钟。
可以作为第一组分(例如用支架制备的)的部分提供转化剂，或可在即将把第二组分施用至第一组分之前、期间或之后向第二组分中加入转化剂。
术语“生物相容性”是指当插入哺乳动物的身体例如患者的身体时，特别是当插入缺损的位置时不导致显著毒性或来自个体的有害免疫反应的组合物或化合物。
支架
“生物相容性支架”是指当插入哺乳动物身体例如患者身体特别是当插入缺损位置时可被耐受的固体支架。支架可作为本发明的方法/手术操作的部分而不取出，但其在一段时间内例如手术后1至6个月之间可被分生物分解(生物降解)(或重吸收)，例如当缺损已通过细胞在整个支架中迁移和生长而被合适地修复，其适当地与周围的组织连接在一起。生物分解的时间在不同的施用之间差异很大。
在一个实施方案中，(生物相容性)支架优选包含可选自：胶原、藻酸盐、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、MPEG-PLGA或PLGA的聚合物。
支架可以以多种不同的形式例如选自：多孔膜、多孔片、植入物、纤维、三维形状例如蘑菇形状、泡沫、管、编织或非纺织片、棒或这些形式的任何组合的形式存在。
合适地，支架可以是任何类型和大小以及任何厚度的支架，例如从薄膜至数毫米厚的支架。在一个实施方案中，还考虑可使用液体支架基质，即一旦在缺损中于原位置后但在加入细胞之前形成固体支架的不含细胞或基本不含细胞的支架。然而，优选支架在加入至缺损之前是固体。
支架，或第一组分在用于本发明的方法之前优选不含细胞或基本不含细胞。
用于本发明的背景中的所需类型的支架应当是这样的支架，即该支架在哺乳动物(包括人)中不充当异物，从而可以没有观察到免疫或只观察到最低限度的免疫，用于本文中的支架应当对于放置它的生物是无毒性的或没有显著害处的。优选，支架不包含任何微生物细胞或任何其他有害污染物。在将所述支架置入其靶区域后，应当能够将支架中使用的细胞例如包埋在水凝胶中的人细胞置于支架上。支架应当优选是亲水性的，这样细胞材料可被相对快速地吸收入支架。然而，在一些情况下，可通过注射细胞和水凝胶来进入支架。细胞应当耐受不具有毒性或只具有最低程度的毒性或不具有显著的可导致有害结果的毒性的支架。
在优选实施方案中，支架以可经预先切割或裁剪以适合于缺损的片的形式存在。这样的支架厚度可以是例如0.2mm至6mm。
在高度优选实施方案中，支架是亲水性的，即当置于水溶液例如生理介质、缓冲液或水中时，具有吸收至少少量水或水溶液(例如细胞悬浮组合物，例如水凝胶溶液)，例如吸收至少1％，例如至少2％，例如至少5％，例如至少10％，例如至少20％，例如至少30％，例如至少50％的支架体积的水(或等同的水溶液)的能力，特别有益的是支架可将上述量的细胞悬浮液吸收入其多孔结构，从而在插入和固定入缺损位置后在整个支架中提供相对均匀的细胞分布。
术语‘亲水性的’可与术语‘极性的’互换使用。
在当使用非极性支架的情况下，优选用促进细胞吸收的试剂例如湿润剂预处理支架。也可将湿润剂与亲水性支架一起使用以提高细胞至多孔结构的渗透。
本发明的生物相容性支架可包含或由聚酯组成。通过将亲水嵌段物整合入聚合物中，聚合物的生物相容性可得到改善，因为其提高了材料的湿润特征而且初始细胞粘着在非极性材料上被削弱。
在优选实施方案中，支架是生物可降解的，即将在一段时间内例如1至6个月内在哺乳动物身体内降解。
高度优选，支架是多孔的，例如具有至少25％、50％，例如在50-99.5％的范围内的多孔度。可通过本领域已知的任何方法例如将孔的体积与固体支架的体积相比来测量多孔度。可通过确定与和支架相同的组合物的非多孔样品比较确定的支架密度来进行该多孔度测量。可选择地可使用水银测孔仪(Mercury Intrusion Porosimetry)。
在本发明的非常有趣的实施方案中，本发明的生物相容性支架由一种或更多种聚合物组成或包含所述聚合物，所述聚合物选自：聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D/L-乳酸)(PDLLA)、聚(己内酯)(PCL)和聚(乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)和其衍生物，特别是包含各自聚合物骨架、外加增强聚合物的亲水性质的取代基或组合物，例如MPEG或PEG的衍生物。此处提供了实例，其包括高度优选的聚合物群MPEG-PLGA。
术语“基本上不含细胞的”，当用于指第一组分时，是指支架在用于本发明的方法之前不包含活哺乳动物细胞。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞的”等同于“不含细胞的”，是指支架是无菌的，并且不包含在导入患者后可存活和/或复制的活微生物或哺乳动物细胞，优选无论怎样没有活细胞。
在一个实施方案中，支架由合成的聚合物组成或包含所述聚合物。
“缺损”
此处使用的术语“缺损”是指组织的任何有害的或损伤的状况，该状况与现有的或将来的丢失、或功能障碍、残疾、不适或痛疼相关。缺损优选与正常组织的丢失例如正常组织的明显丢失相关。可设想，本发明的方法可进行预防性使用，即预防缺损的发生，或防止现存的缺损的恶化。缺损可以例如是组织中的空腔、组织中的撕裂或伤口、组织密度的丢失、异常细胞类型的发生或由于非健康或损伤的组织等的手术切除导致的。在优选实施方案中，缺损可以是损伤的关节软骨、下至和/或包括骨(骨关节炎)的关节软骨缺损、软骨和骨缺损的组合、由正常软骨或骨包围的骨中的缺损或骨结构本身的缺损或骨结构(所述骨结构需要通过加入骨细胞和支架(如SCAS系统中的支架)来重新增强)。在最优选实施方案中，缺损存在于软骨例如关节软骨或为皮肤缺损。
“组织”
此处使用的术语“组织”是指为活哺乳动物个体例如人类的部分的实体活组织。组织可以是软组织(例如，内脏器官和皮肤)或硬组织(例如骨、关节和软骨)。组织可选自：软骨例如关节软骨、骨、皮肤、牙、韧带和腱或任何其他间充质细胞组织。
“细胞”
此处也可称为“哺乳动物细胞”或“细胞”的术语“活哺乳动物细胞”是指从获自哺乳动物组织的细胞获得的或衍生的细胞，所述细胞在用于本发明的方法之前已体外保持或培养在优选合适的培养基中。在一个优选实施方案中，术语“活哺乳动物细胞”是指软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞和成骨细胞、牙周细胞或来源于皮肤的细胞和/或其组合。在优选实施方案中，从活个体哺乳动物获得或衍生细胞，即其是自体的。细胞也可以是同种的，即与它们将应用的组织相容，或可来源于多能或甚至全能干细胞例如以同种细胞的形式存在。在一个实施方案中，细胞可以是同种异体的，来自另一个相似的个体，或可以是异种的，即，来源于被治疗的生物以外的生物。同种细胞可以是分化的细胞、祖细胞或来源于多能(例如，胚胎细胞或胚胎细胞与成熟专能细胞(adult specialist cell)的组合)、全能干细胞(来源于脐带血、成年干细胞等)、工程改造的细胞(通过将分化细胞的细胞核转移入胚胎干细胞或多能干细胞(例如来源于脐带血细胞的干细胞)来交换、插入或添加来自其他细胞或基因构建体的基因产生的)。
因此在一个实施方案中，本发明的方法还包括干细胞和来源于干细胞的细胞的用途，细胞可以优选获自与被治疗的个体哺乳动物相同的物种，例如人干细胞或从其衍生的细胞
在优选实施方案中，特别是对于软骨、骨和/或皮肤的修复，细胞是间充质细胞、软骨形成细胞或来源于皮肤的细胞。
固定剂/固定剂前体
用于本发明的固定剂前体可以是任何形式的生物相容性胶粘剂或粘合剂的任何形式，包括凝胶化剂，所述固定剂前体能够被多孔支架吸收并且当转化成固定剂时，能够将支架锚定至缺损和将细胞锚定至支架以及任选地也将细胞锚定至缺损。
WO 2004/110512提供了几种称为‘支持材料’的固定剂前体-即能够在对缺损施用后凝固或固化的材料。
合适的固定剂前体可以是蛋白质例如选自：血纤蛋白原、明胶、胶原、胶原肽(I型、II型和III型)的蛋白质，
固定剂前体可以是多糖例如琼脂糖或褐藻酸酶。
合适地，固定剂可以是生物相容性医用粘合剂。
优选固定剂前体是生物相容的，且可以例如是已从人获得的或可选择地重组表达的人蛋白。人血纤蛋白原是优选的固定剂前体，例如当暴露于例如凝血酶时聚合发生。
优选固定剂是血纤蛋白。
固定剂前体可以是凝胶化试剂，当其适当地转化成固定剂形式时，在支架周围和其中形成凝胶，从而固定支架和细胞。
WO2004/110512(此处引用作为参考)提供了固定剂前体和转化剂的合适的组合的实例。合适地，固定剂前体对转化剂的比例可用于控制固定发生的速度和固定的组合物对细胞提供的支持水平。
在优选实施方案中，通过使用转化剂将固定剂前体转化成固定剂。优选在支架位于缺损位置后加入转化剂。优选在即将对支架加入第二组分之前、加入的同时或加入之后即刻向第二组分加入转化剂-即转化剂在将固定剂前体转化成固定剂(例如凝胶/水凝胶或固体)中的作用只在支架和细胞原位位于缺损位置并且通常细胞已分布在整个支架中后才发生。
在一个实施方案中，例如当固定剂前体是血纤蛋白原时，转化剂是凝血酶或凝血酶抑制剂。可向转化剂或第一或第二组分中加入因子XIII、钠、钙或镁离子以促进转化。在特定的实施方案中，可加入可促进凝血酶对血纤蛋白原的裂解作用从而使聚合发生的离子或盐例如钠、钙、镁等。可使用任何来源的凝血酶，尽管优选使用生物相容的形式-例如，可在人组织缺损的治疗中使用人重组凝血酶。可选择地可使用其他来源的凝血酶例如牛凝血酶，然而牛凝血酶可在例如人中诱导免疫反应。
当第一和第二组分原位置于缺损位置后，组分通过固定剂前体至固定剂的转化而被原位固定。尽管涉及，在一些实施方案中，不需要转化剂，但要认识到转化剂提供了确保支架和细胞的均匀和有效的固定的高度可控制和方便的方法。
可将转化剂凝血酶整合入支架，从而当向支架中加入血纤蛋白原/细胞悬浮液时将形成水凝胶。
固定可以采用以形成凝胶(即明胶)例如水凝胶的形式，所述凝胶将细胞固定入支架和将支架固定入缺损，同时允许通过合适的培养基以用于细胞迁移和培养，从而促进新组织在整个支架中生长，以修复缺损。
细胞的制备
WO02/061052(此处引用作参考)提供了制备用于本发明的细胞的合适的方法。
在使用前，通常将活哺乳动物细胞置于具有培养基的合适的悬浮液中，所述培养基可任选地包含生长激素、生长因子、粘附强度增强剂和/或生理可接受的离子例如钙和/或镁离子(参见WO2004/110512)。高度优选，细胞悬浮液不包含显著水平的血清，即基本上不含血清，例如不含自体或同种异体的血清，特别是如果血清包含可在缺损位置干扰原位形成固定剂的组分时。一个实例是血清的使用，所述血清包含凝血酶，如果将所述凝血酶加入包含血纤蛋白原的第一组分，可在安置在缺损位置之前加速固定剂的形成。在一个实施方案中，如果它们不干扰本发明的方法，那么少量血清的使用或惰性稳定血清蛋白的加入可以是可接受的。
在使用前，可将细胞悬浮液与单独的培养基保持在一起，然后与固定剂前体混合以形成第二组分。在一个实施方案中，可在对支架施用固定剂前体之前、施用的同时或甚至之后即刻将细胞悬浮液与固定剂前体混合-即可原位形成第二组分。然而，优选在对缺损位置和/或所述第一组分施用之前混合包含哺乳动物细胞和固定剂前体的第二组合物。
部分的试剂盒
图12-15提供了本发明的合适的试剂盒、其在本发明的方法中的应用(图12)和形成所示装置的部分的连接器装置的图示。
在本发明的部分的试剂盒中，包含哺乳动物细胞的第二组分适当地与容器(例如递送装置的一个室)中的固定剂前体位于一起。然而，也涉及，固定剂前体可存在于相同的或与第二容器(例如室或递送装置)功能性连接的分开的容器中，即所述第二容器与所述第一室功能性连接从而允许在即将对缺损位置施用第二组合物之前或甚至施用过程中形成第二组分。然而优选在本发明的方法之前将细胞和固定剂前体混合在一起，作为均一的第二组分。
重要的是固定剂前体在室内本身不形成固定剂(例如，形成凝胶和凝结细胞)，只在置入缺损位置处的支架后才形成固定剂。因而，优选不向第二组分中加入转化剂(当使用时)直至即将对缺损位置处的支架施用第二组分之前、期间或甚至之后。因此部分的试剂盒可包含装有所述转化剂的其他容器，所述容器可与所述第一室(任选地所述第二室)功能性连接从而允许在即将对在缺损位置的支架施用第二组分之前或甚至施用期间形成所述第二组分和所述转化剂的混合物。也涉及，可在对缺损位置共施用所述第一和第二组分后使用转化剂，然而，在一些情况下，这可导致不均匀的固定，从而导致更低的质量结果。
在一个实施方案中，本发明的部分的试剂盒包括第一组分(支架)，和双室或三室递送装置例如注射器，其中功能性连接室以允许在应用过程中混合2个/3个室的内容物。第二组件(包括细胞和固定剂前体)存在于一个室中或以细胞悬浮液的形式存在，固定剂前体存在于2个分开的室中，转化剂存在于第三室中。可以例如将室通过“Y”连接与1个单个的连接功能性连接，以使当通过对注射器柱塞施压(也可通过例如在注射器柱塞末端融合在一起来在结构或功能连接其)(例如在注射器的情况下)释放室内的内容物时，第一组分和转化剂混合。适当地，混合2个/3个室的内容物的行为导致第一组分/转化剂混合物至处于缺损位置上的支架的共同施用-例如，当通过注射器针头或导管到达缺损位置的支架时，形成了第一组分/转化剂混合物。
在其中第一组分包含转化剂的实施方案中，不必在施用之前将转化剂和第二组分混合，尽管任选地可将其与该实施方案组合。然而，通常，与该实施方案相关的部分的试剂盒包括第一组分(支架)和包含所述第二组分的容器例如递送装置。然而，如上所述，可由两个分开的室(一个装有细胞(悬浮液)，另一个装有固定剂前体(溶液))形成第二组分
用于支架的制备的优选聚合物
DK申请PA200600337公开了用于制备在本发明中用作支架的此类优选聚合物的方法。下列公开内容涉及用于制备支架的优选聚合物，包括之前已在DK申请PA200600337中公开的用于制备此类聚合物的方法。
用于本发明的方法的优选生物可降解的聚合物由聚烷基二醇残基和一个或两个聚(乳酸-共聚-乙醇酸)残基组成。
因此，在用于本发明的方法的一个方面，从下列通式表示的聚合物制备支架，或支架包含或由所述聚合物组成：
A-O-(CHR1CHR2O)n-B
其中：
A是分子量为至少4000g/mol的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基，聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基中(i)丙交酯单元和(ii)乙交酯单元中的摩尔比在80∶20至10∶90特别地70∶30至10∶90的范围内，
B是针对A定义的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基或选自氢、C1-6-烷基和羟基保护基团，
各-(CHR1CHR2O)-单元内的R1和R2中的一个选自氢和甲基，并且相同-(CHR1CHR2O)-单元内的R1和R2中的另一个是氢，
n表示聚合物链内的-(CHR1CHR2O)-单元的平均数目并且为10-1000，特别地16-250范围内的整数，
(iii)聚亚烷基二醇单元-(CHR1CHR2O)-对聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基中的(i)丙交酯单元和(ii)乙交酯单元的组合量的摩尔比为至多20∶80，
和其中共聚物的分子量为至少10,000g/mol，优选至少15,000g/mol或至少20,000g/mol。
因此，用于本发明的方法的聚合物可以是双嵌段型的或三嵌段型的。
聚合物的多孔度优选为至少50％，例如在50-99.5％的范围内。
要理解，用于本发明的方法的聚合物包含一个或两个残基A，即聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基。发现此类残基应当具有至少4000g/mol，更特别地至少5000g/mol或甚至至少8000g/mol的分子量。
聚合物的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)可在生理条件(例如体液中和组织中)下被降解。然而，由于这些残基的分子量(和此处所示的其他要求)的原因，据认为降解将非常慢以至于由聚合物制造的材料和物体可在聚合物完全降解前完成它们的使命。
表述“聚(丙交酯-共聚-乙交酯)”包括许多聚合物变体例如聚(随机-丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(内消旋丙交酯(mesolactide)-共聚-乙交酯)、聚(L-丙交酯-共聚-乙交酯)、聚(L-丙交酯-共聚-乙交酯)，PLGA中丙交酯/乙交酯的序列可以是随机的、标记的(tapered)或为嵌段物，丙交酯可以是L-丙交酯、DL-丙交酯或D-丙交酯。
优选，聚(丙交酯-共聚-乙交酯)是聚(随机-丙交酯-共聚-乙交酯)或聚(标记的-丙交酯-共聚-乙交酯)。
另一个重要特征是聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基中的(i)丙交酯单元和(ii)乙交酯单元的摩尔比应当在80∶20至10∶90特别地70∶30至10∶90的范围内的事实。
通常已观察到，对于其中聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基中的(i)丙交酯单元和(ii)乙交酯单元的摩尔比是70∶20或更少的聚合物，获得最好的结果，然而当对于具有高至80∶20的各摩尔比例的聚合物，只要(iii)聚烷基二醇单元-(CHR1CHR2O)-对聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基中的(i)丙交酯单元和(ii)乙交酯单元的组合量的摩尔比为至多8∶92，则也可观察到相当好的结果。
如上所述，B是针对A定义的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基或是选自氢、C1-6-烷基和羟基保护基团。
在一个实施方案中，B是针对A定义的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基，即聚合物是三嵌段型。
在另一个实施方案中，B选自氢、C1-6-烷基和羟基保护基团，即聚合物是双嵌段型。
最常见地(在该实施方案内)，B是C1-6-烷基，例如甲基、乙基、1-丙基，2-丙基，1-丁基、叔-丁基，1-戊基等，最优选甲基。在B是氢的情况下，即相应于末端OH基，那么通常使用羟基保护基团作为B制备聚合物。“羟基保护基团”是可在通过例如氢解、水解或其他合适的方法合成聚合物后除去而不破坏聚合物，从而在PEG-部分上留下羟基的基团，参见，例如描述现有技术方法例如由Greene，T.W.和Wuts，P.G.M.(Protecting Groups in Organic Synthesis，第3版或更后的版本)描述的方法的教科书。关于该点特别有用的实例是苄基、四氢吡喃基、甲氧甲基和苄氧羰基。为了获得其中B是氢的聚合物可除去此类羟基保护基团
各-(CHR1CHR2O)-单元内的R1和R2中的一个选自氢和甲基，并且相同-(CHR1CHR2O)-单元内的R1和R2中的另一个是氢。因此，-(CHR1CHR2O)n-残基可以是聚乙二醇、聚丙二醇或聚(乙二醇-共聚-丙二醇)。优选，-(CHR1CHR2O)n-残基是聚乙二醇，即各单元内的R1和R2都是氢。
n表示聚合物链内的-(CHR1CHR2O)-单元的平均数目并且为10-1000，特别地16-250范围内的整数。应当理解n代表聚合物分子的混合物内的-(CHR1CHR2O)-单元的平均数目。这对于本领域技术人员来说是显然的。聚亚烷基二醇残基(-(CHR1CHR2O)n-)的分子量通常在750-10,000g/mol，例如750-5,000g/mol的范围内。
-(CHR1CHR2O)n-残基在生理条件下通常不被降解，在另一方面可在体内从例如人体分泌。
(iii)聚亚烷基二醇单元-(CHR1CHR2O)-对聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基中的(i)丙交酯单元和(ii)乙交酯单元的组合量的摩尔比也起着一定的作用并且应当为至多20∶80。更常见地，比例为至多18∶82，例如至多16∶84，优选至多14∶86或至多12∶88，特别地至多10∶90，或至多8∶92。通常，比例在0.5∶99.5至18∶82的范围内，例如在1∶99至16∶84的范围内，优选在1∶99至14∶86的范围内，或在1∶99至12∶88的范围内，特别地在2∶98至10∶90的范围内，或甚至2∶98至8∶92的范围内。
据认为，共聚物的分子量不是显著相关的，只要其为至少10,000g/mol。然而，优选分子量为至少15,000g/mol。“分子量”被解释为聚合物的数量平均分子量，因为本领域技术人员将认识到聚合物分子的混合物内的聚合物分子的分子量将由分布在平均值周围的值表示，例如由高斯分布表示。更常见地，分子量在10,000-1,000,000g/mol，例如15,000-250,000g/mol或20,000-200,000g/mol的范围内。发现特别有趣的聚合物是具有至少20,000g/mol例如至少30,000g/mol的分子量的聚合物。
可如下举例说明聚合物结构(其中R选自氢、C1-6-烷基和羟基保护基；n如上定义，选择m、p和ran以使聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基的上述条件得以满足)：
Figure A20068003915600331
双嵌段型聚合物
Figure A20068003915600332
三嵌段型聚合物
对于上述聚合物结构(I)和(II)中的各结构，将意识到依赖于起始材料和反应条件，由p和m代表的丙交酯和乙交酯可随机分布。
同样，要认识到丙交酯单元可以是D/L或L或D，通常为D/L或L。
如上所述，聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基，即聚酯残基在生理环境中被水解降解，聚亚烷基二醇从例如哺乳动物身体分泌。可如实验部分中所述估量生物可降解性。
聚合物的制备(之前在DK申请PA200600337中描述的)。
原则上可按照本领域技术人员已知的下列原理制备聚合物。
原则上，可如下制备其中B不是残基A(双嵌段型聚合物)的聚合物：
Figure A20068003915600341
原则上，可如下制备其中B是残基A(三嵌段型聚合物)的聚合物：
Figure A20068003915600342
除非使用特殊的条件，丙交酯单元和乙交酯单元的分布在各聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基内是随机分布的或标记的。
用于支架的聚合物中存在的乙交酯和丙交酯单元的优选比例在大约80∶20的上限和大约10∶90的下限之间，和更优选大约60∶40至40∶60的范围内。
优选PEG-含量的上限为至多大约20摩尔％，例如至多大约15摩尔％，例如，1-15摩尔％之间，优选4-9摩尔％之间，例如大约6摩尔％。
在实验部分进一步举例说明本发明的聚合物的合成。
支架的其他方面(如DK申请PA200600337中所公开的，但也可用于其他支架的方面)
支架可以例如是生物可降解的、多孔的包含此处定义的聚合物的材料，其中多孔度为至少50％，例如在50-99％的范围内。
可通过冷冻干燥获得高度的多孔度。
聚合物的材料的孔隙空间可以不被占据以使或甚至促进细胞粘着和/或向内生长以再生组织。然而，在一个实施方案中，材料的孔至少部分被来自细胞外基质的组分占据。这样的组分可促进细胞的粘着和/或向内生长以再生组织。来自细胞外基质的组分的实例是硫酸软骨素、透明质烷、透明质酸、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、生长因子、血纤蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原和聚集蛋白聚糖。
支架还可包含单独地或与上述的一种物质一起的转化剂组分凝血酶。
可以作为非均相分散的颗粒或作为表面包衣的形式加入来自细胞外基质的组分。相对于合成的聚合物，来自细胞外基质的组分的浓度通常在0.5-15％(w/w)的范围内，优选低于10％(w/w)。此外，细胞外基质的组分的浓度相对于材料的体积优选为至多0.3％(w/v)，例如至多0.2(w/v)。
可按照已知的技术例如Antonios G.Mikos，Amy J.Thorsen，LisaA Cherwonka，Yuan Bao & Robert Langer.Preparation andcharacterization of poly(L-lactide)foams foams.Polymer 35，1068-1077(1994)中公开的技术制备多孔材料。然而，用于制备多孔材料的一个非常有用的技术是冷冻干燥。
在一个实施方案中，可按照之前在DK申请PA200600337中公开的下列方法制备支架。该方法特别适合于从PLGA和MPEG-PLGA聚合物制备支架。
(a)将此处定义的聚合物溶解在非水溶剂中以获得聚合物溶液；
(b)冷冻步骤(a)中获得的溶液以获得冷冻的聚合物溶液；和
(c)冷冻干燥步骤(b)中获得的冷冻聚合物溶液以获得生物可降解的多孔材料。
应当根据熔点选择用于本方法的非水溶剂，以使其可适合冷冻。其举例说明的实例是二噁烷(mp.12℃)和碳酸二甲酯(mp.4℃)。
在一个变体中，在步骤(a)后将聚合物溶液倾倒或浇铸入合适的模型中。这样，可能获得专门针对特定应用设计的材料的三维形状。
可在按照步骤(b)中所定义的冷冻溶液(分散体)之前，将来自细胞外基质的组分的颗粒分散在步骤(a)中获得的溶液中。
可将来自细胞外基质的组分例如溶解在合适的溶剂中，然后加入至步骤(a)中获得的溶液。通过与步骤(a)的溶剂(即用于此处定义的聚合物的溶剂)混合，很可能使来自细胞外基质的组分沉淀，从而形成分散体。
在一个方面，将步骤(c)中获得的生物可降解的、多孔材料在随后的步骤中沉浸在葡糖胺聚糖(例如透明质烷)的溶液中，然后再次冷冻干燥。
在一些可选择的实施方案中，从此处定义的聚合物制备的材料以纤维或纤维结构的形式存在，可能与来自细胞外基质的组分一起存在。可用本领域技术人员已知的技术例如通过熔体纺丝、电纺丝(electrospinning)、挤压等制备纤维或纤维材料。
具体实施方案
实施例1
以下列方式制备包含包埋在本发明的水凝胶中的人细胞的亲水性支架。
用无菌解剖刀将MPEG-PLGA支架(按照来自在下面提供参考的DK申请PA2006 00337的实施例制备的)切成直径10mm的环形。
关于用于本说明书的实施例中的凝血酶的种类，对于实施例“一般”使用牛凝血酶作为凝血酶，但所得的凝胶化可与人凝血酶相同。尽管，如此处所讨论的，应当在本发明的组合物或试剂盒中避免牛凝血酶的使用，但用于实施例的凝血酶只是用于证明凝血酶的凝胶化效应与凝血酶的来源无关。可通过将凝血酶溶解在包含0.1％BSA的无菌水中来配制该凝血酶。
关于用于本说明书的实施例中的血纤蛋白原的种类，对于实施例来说“一般”使用牛血纤蛋白原作为血纤蛋白原，但所得的凝胶化与人血纤蛋白原相同。尽管如此处所讨论的，在本发明的组合物或试剂盒中应当避免使用牛血纤蛋白原，但用于实施例的血纤蛋白原只是用于证明血纤蛋白原的凝胶化效应与血纤蛋白原的来源无关，只与其为超过90％的纯血纤蛋白原的纯度相关。通过将血纤蛋白原在37℃下溶解在DMEM/F12(Life Technologies)中来配制该血纤蛋白原，所述DMEM/F12以59μg/ml培养基的终浓度包含庆大霉素硫酸盐(Invitrogen)和以2.4μg/ml的终浓度包含两性霉素(Invitrogen)。
向494μL无菌40mM CaCl2中加入6μl保持在4℃下的上述凝血酶溶液。将该激活的凝血酶溶液(500μL)抽入结核菌素(1ml)注射器，然后保持在4℃下直至使用。
将500μl保持在温度37℃(通常在4℃和37℃之间的范围内)下的上述血纤蛋白原溶液抽入结核菌素(1ml)注射器，可加入任意量的软骨细胞以向软骨缺损内提供最终数目的细胞例如加入0.1x104至10x106个人软骨细胞/cm2，保持包含细胞的溶液在4°-37℃的温度范围内直至使用，上限最高温度为38℃。
将MPEG-PLGA支架置于准备装载由软骨细胞和血纤蛋白原/凝血酶组成的水凝胶的无菌陪替培养皿(Nunc)中。用Y连接器组合两个注射器。使用稳定的压力推动结核菌素注射器的两个注射器活塞。将250μL加在置于陪替培养皿中的PEG-PLGA支架上。在30-60秒后，水凝胶因PEG-PLGA支架的亲水性质而被吸收。吸收后，在MPEG-PLGA支架内开始凝固过程，从而将软骨细胞保留在支架内。
在凝固后，为研究软骨细胞在3周内在支架中的行为，使用25ml包含20％胎牛血清、庆大霉素59μg/ml和两性霉素2.5μg/ml以及P-抗坏血酸的DMEM/F12。将支架置于37℃下5％CO2的培养箱中。
实施例2
以下列方法制备包含包埋在本发明的水凝胶中的人细胞的亲水性支架。将来自Osteobiologics，Inc.的Trufit
Figure A20068003915600371
(用于临床前试验的称为PolyGraft
Figure A20068003915600372
BGS，Lot#X41053，只用于临床前研究)测量分成5.3x3mm，然后包装在由铝箔制成的无菌包装中。
关于用于本说明书的实施例中和本说明书中的凝血酶的种类，与上面实施例1中所述的相似，对于实施例“一般”使用牛凝血酶作为凝血酶，但所得的凝胶化可与人凝血酶相同。尽管，如此处所讨论的，应当在本发明的组合物或试剂盒中避免牛凝血酶的使用，但用于实施例的凝血酶只是用于证明凝血酶的凝胶化效应与凝血酶的来源无关。通过将凝血酶溶解在包含0.1％BSA的无菌水中来配制该凝血酶。
关于用于本说明书的实施例中的血纤蛋白原的种类，对于实施例来说“一般”使用牛血纤蛋白原作为血纤蛋白原，但所得的凝胶化与人血纤蛋白原相同。尽管如此处所讨论的，在本发明的组合物或试剂盒中应当避免使用牛血纤蛋白原，但用于实施例的血纤蛋白原只是用于证明血纤蛋白原的凝胶化效应与血纤蛋白原的来源无关，只与其为超过90％的纯血纤蛋白原的纯度相关。通过将血纤蛋白原在37℃下溶解在DMEM/F12(Life Technologies)中来制备该血纤蛋白原，所述DMEM/F12以59μg/ml培养基的终浓度包含庆大霉素硫酸盐(Invitrogen)和以2.4μg/ml的终浓度包含两性霉素(Invitrogen)。
向494μL无菌40mM CaCl2中加入6μl保持在4℃下的上述凝血酶溶液。将该激活的凝血酶溶液(500μL)抽入结核菌素(1ml)注射器，然后保持在4℃下直至使用。
将500μl保持在温度37℃(通常在4℃和37℃之间的范围内)下的上述血纤蛋白原溶液抽入结核菌素(1ml)注射器，可加入任意量的软骨细胞以向软骨缺损内提供最终数目的细胞例如加入0.1至10x106个人软骨细胞/cm2，保持包含细胞的溶液在4°-37℃的温度范围内直至使用，上限最高温度为38℃。
将Trufit
Figure A20068003915600381
置于准备装载由软骨细胞和血纤蛋白原/凝血酶组成的水凝胶的无菌陪替培养皿(Nunc)中。用Y连接器组合两个注射器。使用稳定的压力推动结核菌素注射器的两个注射器活塞。将250μL加在置于陪替培养皿中的Trufit上。在30-60秒后，水凝胶因Trufit
Figure A20068003915600383
的亲水性质而被吸收。吸收后，在Trufit内开始凝固过程，从而将软骨细胞保留在Trufit
Figure A20068003915600385
内。
在凝固后，为研究软骨细胞在3周内在Trufit
Figure A20068003915600391
中的行为，使用25ml包含20％胎牛血清、庆大霉素59μg/ml和两性霉素2.5μg/ml以及P-抗坏血酸的DMEM/F12。将Trufit置于37℃下5％CO2的培养箱中。
实施例3
将人关节软骨细胞(hAC)培养为单层细胞培养物，然后使用胰蛋白酶EDTA将其从细胞培养瓶释放出来。
将0.5x106个细胞与由软骨细胞和血纤蛋白原/凝血酶组成的水凝胶混合，然后用于陪替培养皿中的特殊Trufit(称为Poly-GraftTop Phase，来自Osteobiologics，San Antonio，Texas)。5分钟后，将“水凝胶-PolyGraft系统置于24孔板中并对小孔使用生长培养基。在37℃下在CO2培养箱中培养6(六)个样品；每周更换生长培养基大约2次；使2(二)个样品保持14天以进行“14天”时间点分析，2(二)个样品进行2个月分析，2个样品进行4个月分析。
在各时间点后，进行下列分析：
·冷冻切片后，进行组织学(甲苯胺蓝染色和番红O染色)和免疫细胞化学(抗聚集蛋白聚糖和II型胶原的单克隆抗体)
·RNA纯化，以进行随后的RT-PCR分析。分析II型胶原和软骨形成转录因子Sox9的表达。对于这些实验，对照是以单层培养在与在水凝胶-Polygraft系统中用于培养的培养基相同的生长培养基中的hAC。
·迁移测定。在各时间点后，将水凝胶-PolyGraft系统加工成外植体，在光学显微镜(LM)下观察hAC的迁移。
下面显示的结果是“ 14天时间点”。组织学显示于图1中，免疫组织化学显示于图2中，基因表达显示于图3中。
迁移测定
处理后观察到良好和快速的细胞迁移。该迁移率与正常关节软骨组织中的正常迁移相当。
尽管已在14天的时间点上发现这些数据，但通过甲苯胺蓝和番红O染色显示该水凝胶-Polygraft系统内培养的hAC能够合成少量富集在蛋白聚糖中的软骨基质。使用免疫组织化学，进一步证明该系统培养的hAC合成II型胶原和聚集蛋白聚糖：两种熟知的关节透明软骨的标记。
此外，通过RT-PCR证明II型胶原和软骨形成转录标记SOX9的基因表达。II型胶原的表达验证了通过免疫组织化学显示的蛋白质水平上的表达。
此外，基因表达分析证明，当与水凝胶-PolyGraft(PolyGraft本身也称为PolyGraft Top Phase)中的标记的相对高的mRNA水平的表达相比，在软骨细胞单层对照培养物中存在这两种标记的低得多的mRNA水平。
我们预期通过上述方法测量的信号将随培养时间的增加而强烈增加。
实施例4
在另一个实施方案中，我们使用MPEG-PLGA支架作为SCAS系统。再次用从1％至10％的不同浓度的2种不同透明质酸(HA和NZHA)产生支架，或用这些材料包被支架或用CS(硫酸软骨素(chodroritinsulfate))产生支架。将各支架无菌地切成一式三份1x1cm，然后以一式三份置于无菌的12孔平底盘中。对于特定的支架对一式三份的各份赋予代号。代号包含MPEG-PLGA的下列包衣。
使用的膜的下列代号如下：
HA＝透明质酸
MPEG-PLGA＝(甲氧基聚乙二醇-嵌段-共聚-聚(丙交酯-共聚-乙交酯)。
在本研究中MPEG-PLGA的组合物与此处描述的相同。
通过冷冻干燥产生支架。支架是具有1-3mm厚度和大约90％的多孔度的片。
代号1：PLGA 4％，1％批HA
从4w/w％二噁烷溶液”浇铸”MPEG-PLGA(Mw 2.000-30.000 Da；PLA/PGA比为50∶50)。支架包含以颗粒形式的1w/w％HA(Mw大于1百万道尔顿)。通过冷冻干燥产生支架。支架是具有1-3mm的厚度和大约90％的多孔度的片。
代号2：PLGA 4％，被包被的1.5％批HA，
从4w/w％二噁英溶液浇铸MPEG-PLGA支架。将支架冷冻干燥。然后用1.5w/w％HA溶液包被其，和进行干燥。(Mw HA＞1百万)
代号3：PLGA 4％，2％批HA，
参见代号1。唯一的不同是其包含2w/w％颗粒形式的HA。
代号4：PLGA 4％，5％批HA，
参见代号1。唯一的不同是其包含5w/w％颗粒形式的HA。
代号5：PLGA 4％，10％批HA，
参见代号1。唯一的不同是其包含10w/w％颗粒形式的HA。
代号6：PLGA 4％，1％NZHA，
参见代号1。唯一的不同是其包含1w/w％颗粒形式的HA(Mw大约700.000Da)。
代号7：PLGA 4％，2％NZHA，
参见代号1。唯一的不同是其包含2w/w％颗粒形式的HA(Mw大约700.000Da)。
代号8：PLGA 4％，5％NZHA，
参见代号1。唯一的不同是其包含5w/w％颗粒形式的HA(Mw大约700.000Da)。
代号9：PLGA 4％，10％NZHA，
参见代号1。唯一的不同是其包含10w/w％颗粒形式的HA(Mw大约700.000Da)。
代号10：PLGA 4％，
由从4w/w％的不具有添加剂的二噁烷溶液”浇铸”MPEG-PLGA(Mw2.000-30.000Da；PLA/PGA比为50∶50)制造的支架。
可用例如1％明胶、1-10％批HA制备基于明胶的支架。使用1w/w％的包含1w/w％HA(Mw 1百万)的明胶溶液常规地制造该支架。将支架与EDC交联。
使用包含16％胎牛血清和庆大霉素以及两性霉素的DMEM/F12在细胞培养瓶中将使用外植方法(在WO 02/061052下公开的PCT/DK02/00065专利申请中描述的)获得的人软骨细胞培养物扩增至16x106个人软骨细胞。将软骨细胞在包含50mg/ml牛血纤蛋白原F8630(产品名称CAS号(product description CAS Number)：9001-32-5(在使用前5至60分钟内在37℃下将血纤蛋白原溶解在培养基中))的无血清DMEM/F12中重悬浮达到4x106个细胞/ml(2x105个细胞/50μl)的浓度。向各支架中加入50μl的量的细胞/血纤蛋白原溶液(除了板中具有代号1和2的两排小孔和代号3的上部小孔外，所述小孔偶然接受197μl细胞/血纤蛋白原；立即除去过量的细胞/血纤蛋白原溶液)。
让细胞/血纤蛋白原溶液浸透入不同的受试支架。当施用溶液时，一些支架在数秒钟内显示迅速的吸收。其他支架只显示较低程度的吸收，甚至在2至3分钟后，50μl在这些支架的顶部形成液滴。
作为组分的其他部分，向各个1x1cm支架中加入50μl凝血酶溶液。凝血酶(产品编号T6634，产品名称9002-04-4)来自牛血浆，且以100个单位/ml(相应于0.1个单位/μl)的浓度配制。向495μl40 mM CaCl2溶液中加入5μl相当于0.5个单位的量的凝血酶(相应于0.1个单位x5μl)。向各支架加入了50μl的该稀释的溶液中的凝血酶。如在图4至7的各图下所描述的在实验期观察到下列结果。
将由20万(200,000)个人软骨细胞/50μl DMEM/F12培养基(除了之前溶解在培养基中的50mg/ml牛血纤蛋白外，无任何血清)组成的五十(50)μl置于各支架的顶部。加入五十(50)μl 4℃的在40Mm氯化钙溶液中预先稀释的牛凝血酶。设置由一式三份各型支架组成。在该设置中，不同支架的代号和使用的结果示于表1。允许在室温下凝固5分钟，并估计支架上使用的总共100μl的吸收时间。5分钟后，则向各小孔加入两(2)ml DMEM/F12培养基(包含16％体积/体积的胎牛血清和抗生素例如庆大霉素和两性霉素)，注意单个支架的形状和粘着。将板在37℃下于CO2培养箱中温育。在3天的温育后，除去培养基，加入新培养基。通过开始时弄错192μl细胞/血纤蛋白原混合物获得这些所谓的“SCAS”系统或膜”，代号1至2以及上部小孔代号3。立即尽可能彻底地除去未浸透入这些小孔中的膜的多余量和过剩量。在整个实验中向其余小孔中的其余膜加入50μl的量的细胞/血纤蛋白原混合物。向各孔中加入五十(50)μl如之前所描述稀释的凝血酶溶液。在加入凝血酶后，总溶液中的一些未浸透入代号为1和2的小孔以及代号3的上部小孔，但表现出已分散入小孔(其也表现对小孔底部的附着)。
检测SCAS原理(小孔中的细胞/血纤蛋白/支架)的实例示于图4。
表1.人血纤蛋白/软骨细胞在不同“ColoPlast”支架上的应用
 支架号#   细胞/血纤蛋白对支架的浸泡时间   支架至盘孔底部的粘着   支架在盘孔底部的形成   细胞在孔内、支架外的迁移
 代号1   ＜1分钟   +++   扁平，未折叠   +++
 代号2   ＜1分钟   +++   扁平，未折叠   +++
 代号3   ＜1分钟   +++   扁平，未折叠   +++
 代号4   ＜1分钟   +++   扁平，未折叠   +++
 代号5   ＜1分钟   +++   扁平，未折叠   +++
 代号6   ＞2分钟   (+)+   扁平，未折叠   +++
 代号7   2分钟   ++   扁平，未折叠   +++
 代号8   2分钟   ++   扁平，未折叠   +++
 代号9   2分钟   ++   扁平，未折叠   (+)+
 代号10   ＜1分钟   +++   扁平，未折叠   +++
实施例5
在Foulum的研究中心的手术室内，在10只成年山羊的股骨髁中试验SCAS系统。混合血纤蛋白/“自体”软骨细胞并将其用于支架。
将SCAS系统与3个组比较：1.空缺损(对照)，2.与血纤蛋白凝胶(FIB50)混合的软骨细胞和3.微骨折(治疗关节软骨缺损的已建立的方法)。
在用于研究的成年山羊中的两个股骨髁中产生6mm的环形缺损。收集软骨组织以进行软骨细胞培养。在第二开放性手术中，将缺损随机分配至4个处理组(各组10个膝关节)。
使用SCAS系统的处理由下列步骤组成。
在手术前2小时为外科医生提供下面3个小瓶：(1)悬浮在包含16％胎牛血清和抗生素的DMEM/F12中的软骨细胞(1x106个细胞/100μl)，(2)血纤蛋白原溶液(100mg/ml DMEM/F12+抗生素)和(3)凝血酶溶液(100U/ml CaCl2)。此外给外科医生提供MPEG-PLGA支架(1cmx1cm)。
即将进行手术之前，将软骨细胞悬浮液与血纤蛋白原溶液无菌混合(1∶1v/v)，然后将软骨细胞/血纤蛋白原溶液抽入结核菌素注射器(1ml)。将凝血酶溶液抽入另一个结核菌素注射器(1ml)，然后组合两个注射器；现形成双注射器。
然后将双注射器的2个室的一半体积用于山羊膝关节中的缺损的底部(图5)。然后将MPEG-PLGA支架放入缺损，最后将双注射器的两个室中的剩余溶液施用至MPEG-PLGA支架。然后不触碰膝关节5分钟，以使MPEG-PLGA支架能够吸收软骨细胞/水凝胶。5分钟后，闭合关节。
跟踪观察动物4个月。分析：ICRS目视评分(0-12)。进行力学试验以估量再生组织的硬度。通过O，Driscoll和Pinada软骨评分进行组织学分析，确定缺损的百分数填充。
ICRS目视评分和组织学外观证明组之间存在高度显著性差异(图7至9)。使用SCAS系统进行的软骨再生显示高缺损填充和接近透明软骨的组织特征，然而在空缺损中未看到透明软骨的再生。力学试验显示在处理组之间不存在差异。
SCAS系统证明具有良好表型特征的广泛的软骨再生反应。如所预期的，在空缺损中未看到再生现象。所述方法表现为用于进行体内软骨组织工程、在缺损中产生透明质样关节软骨的非常好的技术。
实施例6
为了确定载有由血纤蛋白原/凝血酶组成的水凝胶的MPEG-PLGA是否允许软骨细胞从完整的软骨组织迁移入MPEG-PLGA/水凝胶支架，进行下列实验。
从获自正常关节软骨的软骨活检组织产生小软骨外植体(3-5)，然后将其放入MPEG-PLGA支架(1cmx1cm)内。将包含软骨外植体的支架置于小孔(12孔板)中。将50μl(包含50mg/ml牛血纤蛋白原F8630，产品名称CAS号：9001-32-5(在使用前5至60分钟内在37℃下将血纤蛋白原溶解在培养基中))的无血清DMEM/F12用于MPEG-PLGA支架，在吸收入支架后，向支架加入50μl凝血酶溶液。凝血酶(产品编号T6634，产品名称9002-04-4)来自牛血浆，并且以100个单位/ml(相应于0.1个单位/μl)的浓度配制。向495μl 40mM CaCl2溶液中加入5μl相当于0.5个单位的量的凝血酶(相应于0.1个单位x5μl)。向各支架加入50μl的在该稀释的溶液中配制的凝血酶。
5分钟后，向各孔中加入3ml生长培养基，然后培养支架3周，每隔3至4天更换培养基。
最后快速冷冻(snap-frozen)支架，然后进行冷冻切片。固定切片，然后用甲苯胺蓝染色。
按照图10和11的各图下所描述的，在实验过程中观察下列结果。
本实验证明MPEG-PLGA/水凝胶支架(SCAS)允许软骨细胞从软骨组织迁移入支架结构。这是很重要的，因为软骨细胞从人膝关节中围绕缺损的软骨迁移入支架是最佳透明质样关节软骨再生反应所必需的。
实施例7(根据DK申请PA2006 00337)-聚合物生物降解试验
可如下确定多孔材料的生物可降解性。
将大约1克的多孔材料完全浸没在培养基(于DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s培养基中配制的10％胎牛血清)中，然后在37℃下贮存28天。每周更换培养基2次，即在第3、7、10、14、17、21和24天更换培养基。在第28天，通过GCP分析多孔材料。生物降解测量为数目/相对于起始值的重量平均分子量。
试验多孔MPEG-PLGA(2-30kDa，L∶G 50∶50)，生物降解确定为大约0.5(相对于起始值的终Mn/w值)
概述
作为使PLGA更具亲水性的尝试，使MPEG或PEG与PLGA共聚合，从而产生具有低MPEG/PEG含量(＜20％MPEG/PEG)的共聚物。当检测这些聚合物和将其与普通PLGA比较时，细胞对MPEG-PLGA和PLGA-PEG-PLGA的起始粘着优于普通PLGA并且细胞的形态学和附着性更好。
这是令人吃惊的，因为根据文献已知包含PEG的聚合物抵抗蛋白质和细胞的粘着。对于我们的聚合物的改良的性能的关键似乎是聚合物中PEG含量保持较低(至多20mol-％，优选至多14mol-％)，因为具有高PEG含量的聚合物在生物学试验中产生较差的粘附和形态学。
PLA与PLGA相比具有长降解时间，我们的实验显示聚醚-PLGA的PLGA部分中更高的丙交酯含量产生更低的细胞粘着。
已知的合成的生物可降解的聚合物通常是疏水性材料，其在生物环境中具有缓慢的起始细胞粘着。我们尝试通过合成MPEG-PLGA嵌段共聚物来改变PLGA的亲水性。我们的第一个聚合物是具有50∶50(mol)的G∶L比率的1.9-30kDa MPEG-PLGA。通过冷冻干燥将这些聚合物制成薄的多孔片。在生物学测定中，起始和长期细胞粘着非常优秀，性能优于未经修饰的PLGA。这是令人惊奇的，因为文献描述了PEG至聚合物的整合使其抵抗细胞和蛋白质的粘着。我们成功的关键似乎是我们具有低PEG含量(6％)，当PEG含量更高(MPEG-PLGA 5-30kDa，14％PEG)时，当与低PEG材料和普通PLGA相比时，我们在起始和更长的时期都看到减少的细胞附着。
实施例8(根据DK申请PA200600337)-聚合物的纯化
将聚合物溶解在合适的溶剂(例如二噁烷、四氢呋喃、氯仿、丙酮)中，然后在-40至40℃的温度下，在搅拌的条件下将其在非溶剂(例如水、甲醇、乙醇、1-丙醇或2-丙醇)中沉淀。让聚合物沉积，除去溶剂，然后在40-120℃/过夜的条件下在真空干燥箱中进行干燥。
使用核磁共振分光术和GPC分析聚合物以确认其结构、分子量和纯度。
不同的MPEG-PLGA聚合物的合成的实例
  聚合物   G/L-比例   乙交酯(g)  DL-丙交酯(g)   起始物   起始物(g)  4％Sn(Oct)2(μL)   二噁烷(g)
  750-15000 50L   50∶50   2.12  2.64   MPEG 750 Da   0.238   129   5
  1100-20000 50L   50∶50   2.11  2.63   MPEG 1100 Da   0.261   98   5
  1900-30000 50L   50∶50   2.10  2.60   MPEG 1900 Da   0.298   65   5
  1900-30000 80L   20∶80   0.79  3.91   MEPEG 1900 Da   0.298   65   5
  5000-30000 50L   50∶50   1.86  2.31   MPEG 5000 Da   0.833   68   5
  15000-1900-1500050L   50∶50   2.10  2.60   PEG 1900 Da   0.298   65   5
  30000-5000-3000050L   50∶50   2.06  2.56   PEG 5000 Da   0.385   31   5
制造支架的方法
将聚合物(例如1.9-30kDa)溶解在合适的溶剂(例如二噁烷)中，达到0.5-10％(w/v)的浓度。将溶液倒入模具中，进行冷冻，然后冷冻干燥成多孔片。可通过将来自细胞外基质的组分分散在溶剂中或通过随后用来自细胞外基质的组分的分散体/溶液处理多孔片来整合该组分。
支架的检测
通过以2.5x104个细胞/cm2的浓度将原代成纤维细胞接种在支架的表面上来进行MPEG-PLGA和PLGA的不同支架的生物相容性研究。通过在第1、3和7天使用中性红对细胞染色，然后使用配置有Evolution MP冷彩色照相机(Media Cybernetics)的Leica DMIRE2倒置显微镜进行评估来进行细胞粘着、成活力和生长的评价，使用Image Pro Plus 5.1软件(Media Cybernetics)拍摄数字图像。
比较PLGA的冷冻干燥的支架的生物相容性的研究显示具有良好形态学的细胞，但只有非常低的起始量的细胞的总体附着。通过将这些支架与MPEG-PLGA 2-30kDa比较，我们看到MPEG-PLGA支架的更好的生物相容性，因为更大量的细胞由于该支架的更好的湿润能力而附着至该支架。
从试验的开始细胞生长就展示良好的形态学和对MPEG-PLGA1.9-30kDa的良好附着，从第1天至第7天看到细胞的量增加。将MPEG-PLGA的MPEG部分的大小增加至5-30kDa产生对支架表面具有极小的粘着或没有粘着的独立的圆细胞，从而产生显著减少的生物相容性，从第1天至第7天该现象变得更糟。
如果对MPEG-PLGA 2-15kDa进行试验和将其与MPEG-PLGA 2-20kDa和MPEG-PLGA 2-30kDa比较，我们可看到当PLGA部分的大小增加时，成纤维细胞的附着和成活力增加。这意味着2-30kDa具有最好的生物相容性。将大小从2-15kDa增加至2-20kDa，与从2-20kDa至2-30kDa的幅度相比，产生了对生物相容性的最大正效应。
将MPEG-PLGA 2-20kDa中的丙交酯含量从60％增加至80mol％减少了成纤维细胞的附着和成活力。当将具有60％丙交酯的MPEG-PLGA2-15kDa与具有80％丙交酯的MPEG-PLGA 2-15相比时，该效应更明显。生物相容性试验的概述：
Figure A20068003915600491
1)Alkermes MEDISORB PLGA 5050DL高I.V.
2)LA为聚合物的PLGA部分的mol％
结果是从+至+++++的主观分级，+表示低附着和低成活力，而+++++表示优异的附着和成活力。
可在成纤维细胞聚居的MPEG-PLGA支架上体外培养人角质细胞，从而形成多层和分化的重建表皮(参见图1)。重建的表皮显示与体内正常表皮相似的形态学特征。
在组织学样本上，我们发现基底细胞层(基底层)和最终覆盖的角质层的清晰证据，中间层，虽然未成熟和轻微过度增生，但与棘层、颗粒层相似。最终的成熟的缺乏应当归因于体外模型的选择而不是支架材料。
实施例9：在(MPEG-PLGA)聚乳酸支架中使用软骨细胞的软骨再生。
山羊中的体内研究。
近年来，已引入多孔支架进行临床软骨组织工程。存在许多支架材料，需要鉴定最佳支架。本研究目的在于在山羊股骨髁的全厚度软骨缺损模型中研究与软骨细胞悬浮液组合的MPEG-PLGA多孔支架的软骨再生反应。
方法
使用10只成年山羊进行研究，在Foulum，Denmark的研究中心进行研究。在两个股骨髁中产生6mm的环形缺损。收集软骨组织以进行软骨细胞培养。在第二开放性手术中，将缺损随机分配至下面2个处理组：1.空缺损(对照)2.MPEG-PLGA冷冻干燥的多孔支架中的血纤蛋白/软骨细胞溶液。跟踪观察动物4个月。分析：ICRS目视评分(0-12)。进行力学试验以估量再生组织的硬度。通过O，Driscoll和Pinada软骨评分和缺损的百分数填充进行组织学分析。
结果
ICRS和组织学评分证明组间存在高度显著性差异。软骨再生是显示高缺损填充和与透明软骨接近的组织特征的MPEG-PLGA/细胞组，然而在空缺损中未看到再生组织。力学试验显示处理组之间不存在差异。结论
MPEG-PLGA/细胞结构显示具有良好表型特征的广泛软骨再生反应。如所预期的，在空缺损中未看到再生。多孔MPEG-PLGA支架与培养软骨细胞组合一起似乎是用于进行体内软骨组织工程的良好技术。
实施例10：在血纤蛋白原凝胶支架和微骨折中使用软骨细胞进行的软骨再生。山羊中的体内研究。
引言
本软骨组织工程的临床目的是开发一致的形成透明软骨和可与关节镜技术一起使用的方法。本研究目的在于在山羊股骨髁全厚度软骨缺损模型中研究基于可注射血纤蛋白的高粘软骨细胞悬浮液的软骨再生反应。
方法
将10只成年山羊用于研究。在两个股骨髁中产生6mm的环形缺损。收集软骨组织以进行软骨细胞培养。在第二开放性手术中，将缺损随机分配至下面2个处理组：1.微骨折(通过软骨下骨的1mm穿刺)(对照)2.缺损中的血纤蛋白/软骨细胞糊。跟踪观察动物4个月。分析：ICRS目视评分(0-12)。进行力学试验以估量再生组织的硬度。通过O，Driscoll和Pinada软骨评分和缺损的百分数充填进行组织学分析。
结果
ICRS评分显示组之间相同的评分。力学试验显示处理组之间无差异。然而两个组都显著比未受损伤的软骨硬。组织学显示在两个组中存在有限的再生反应。在微骨折组中观察到软骨下骨变化具有囊。软骨评分和组织填充在两个组中相同。
结论
目视和组织学评分显示微骨折和血纤蛋白/软骨细胞刺激有限的软骨再生反应。力学试验揭示与正常软骨相比所有处理组的硬度增加，这表明软骨的薄层修复组织导致软骨下骨成为组织变硬的原因。总之，基于高粘血纤蛋白的软骨细胞悬浮液对软骨修复的刺激不比微骨折更强。这可能可以通过与其他软骨组织工程方法相比，不充足的细胞容纳和细胞支持以及由于来自动物的压力导致的注射材料的可能丢失来解释。

Claims (60)

1.用于通过移植活哺乳动物细胞来修复活个体哺乳动物例如人的组织中的缺损的方法，该方法包括：
i)在将固定剂前体转化成固定剂之前对所述缺损的位置同时施用下列物质
包含生物相容性支架的第一组分；和
包含哺乳动物细胞和生物可接受的固定剂前体的混合物的第二组分
和
ii)通过将固定剂前体转变成固定剂来将所述哺乳动物细胞固定至所述支架，和将所述支架固定至活哺乳动物组织。
2.权利要求1的方法，其中在施用所述第二组分之前，对所述缺损位置施用所述第一组分。
3.权利要求1的方法，其中在施用所述第一组分之前或同时对所述缺损的位置施用所述第二组分。
4.前面权利要求中任一项的方法，其中将包含固定剂前体的转化剂的第三组分一起施用至所述缺损的位置。
5.权利要求4的方法，其中所述转化剂用作所述第一组分的部分。
6.权利要求4或5的方法，其中将所述转化剂整合入所述生物可接受的支架。
7.权利要求4至6中任一项的方法，其中转化剂是交联剂。
8.权利要求6至7中任一项的方法，其中转化剂是蛋白质或多糖。
9.权利要求5至8中任一项的方法，其中将转化剂与所述生物可接受的支架一起冷冻干燥，或将其作为溶剂一起施用。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中固定剂以水凝胶的形式存在。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物细胞与所述活哺乳动物组织是免疫相容的。
12.权利要求11的方法，其中从所述个体哺乳动物获得或衍生所述哺乳动物细胞。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物细胞以细胞悬浮液或组织外植体的形式存在。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物是自体、同种(同种异体)或异种来源的。
15.前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物细胞来源于多能或全能干细胞。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中哺乳动物细胞选自：成纤维细胞、皮肤细胞、角质细胞、软骨细胞、内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞和牙周细胞。
17.前述权利要求中任一项的方法，其中第二组分中的细胞以足以导致靶组织或缺损再生或修复的量例如大约0.1x104至大约10x106个细胞/ml的量存在。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中组织缺损选自：软骨缺损、骨缺损、皮肤缺损和牙周缺损。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中按照手术的方法例如内窥镜、关节镜或微创手术和常规的或大多数开放性手术的方法进行所述方法或在手术期间进行所述方法。
20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物相容性支架是亲水性的和/或在插入缺损的位置之前通过使用生物相容性湿润剂来制备。
21.前述权利要求中任一项的方法，其中支架对于水和/或等渗缓冲液是多孔性的。
22.权利要求21或22的方法，其中支架主要由聚合物组成或主要包含聚合物，所述聚合物的分子量大于大约1kDa，例如在大约1kDa和大约1百万kDa之间，例如在25kDa和75kDa之间。
23.权利要求20或22的方法，其中支架以选自：膜、非编织和编织的纤维、冷冻干燥的聚合物例如冷冻干燥的聚合物片的形式存在。
24.前述权利要求中任一项的方法，其中支架是合成的。
25.前述权利要求中任一项的方法，其中将其他化合物整合入第一和/或第二组分，例如支架中，其中其他化合物选自：透明质酸(HA)、羟基磷灰石(例如以颗粒的形式存在)、生长因子例如IGF-1、胶原。
26.前述权利要求中任一项的方法，其中支架的孔可由促进细胞粘着和/或向内生长以再生组织的组分占据，所述组分是例如选自硫酸软骨素、透明质烷、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、生长因子、血纤蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原、明胶和聚集蛋白聚糖的组分。
27.权利要求25或26的方法，其中将透明质酸整合入支架。
28.权利要求25至27的方法，其中透明质酸以大约0.1至大约15wt％的比例存在于支架中。
29.前述权利要求中任一项的方法，其中支架包含选自：聚丙交酯(PLA)、聚己内酯(PCL)，聚乙醇酸交酯(PGA)、聚(D，L-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)、MPEG-PLGA(甲氧基聚乙二醇)-聚(D，L-丙交酯-共聚-乙交酯)的化合物。
30.权利要求29的方法，其中支架由PLGA或MPEG-PLGA组成或其包含所述物质。
31.权利要求30的方法，其中MPEG-PLGA是下列通式的聚合物：
A-O-(CHR1CHR2O)n-B
其中；
A是分子量为至少4000g/mol的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基，聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基中(i)丙交酯单元和(ii)乙交酯单元的摩尔比在80∶20至10∶90的范围内，
B是针对A定义的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基或选自氢、C1-6-烷基和羟基保护基团，
各-(CHR1CHR2O)-单元内的R1和R2中的一个选自氢和甲基，并且相同-(CHR1CHR2O)-单元内的R1和R2中的另一个是氢，
n表示聚合物链内的-(CHR1CHR2O)-单元的平均数目并且为10-1000范围内的整数，
(iii)聚亚烷基二醇单元-(CHR1CHR2O)-对聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基中的(i)丙交酯单元和(ii)乙交酯单元的组合量的摩尔比为至多20∶80，
和其中共聚物的分子量为至少10,000g/mol，优选至少15,000g/mol。
32.权利要求31的方法，其中各单元内的R1和R2都是氢。
33.权利要求31或32的方法，其中B是针对A定义的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)残基。
34.权利要求31或33的方法，其中B是C1-6-烷基。
35.权利要求31至34中任一项的聚合物，其中B是羟基保护基团。
36.权利要求31至35中任一项的聚合物，其中B是羟基。
37.权利要求29至36的方法，其中通过冷冻干燥包含化合物的溶液来在溶液中制备支架。
38.权利要求29至37的方法，其中支架具有50至97％范围内的多孔度。
39.前述权利要求中任一项的方法，其中生物相容性支架包含生物聚合物例如蛋白质或多糖。
40.权利要求39的方法，其中生物聚合物选自：明胶、胶原、藻酸盐、壳多糖、壳聚糖、角蛋白、蚕丝、纤维素和其衍生物以及琼脂糖。
41.前述权利要求中任一项的方法，其中生物可接受的固定剂前体是通过生物获得的或衍生的组分，例如血纤蛋白原。
42.权利要求41的方法，其中通过重组制备血纤蛋白原。
43.权利要求41或42的方法，其中从哺乳动物宿主细胞例如从与个体哺乳动物相同的物种或转基因宿主获得的或衍生的宿主细胞分离血纤蛋白原。
44.权利要求41至43中任一项的方法，其中使用的血纤蛋白原的浓度为1-100mg/ml。
45.前述权利要求中任一项的方法，其中转化剂选自：凝血酶、凝血酶类似物、重组凝血酶、重组凝血酶类似物。
46.权利要求45的方法，其中使用的凝血酶的浓度为0.1NIH单位至150NIH单位，和/或为用于聚合1-100mg/ml血纤蛋白原的凝血酶的合适水平。
47.前述权利要求中任一项的方法，其中活哺乳动物组织选自：结缔组织、皮肤、软骨组织、骨、韧带和牙周组织。
48.前述权利要求中任一项的方法，其中支架以选自：片、膜、塑造的形状、塞、管、球形、制备用于插入缺损位置的三维形状或植入物、整容植入物、重建植入物的形式存在。
49.前述权利要求中任一项的方法，其中在重建手术或整容手术中进行所述方法。
50.用于通过移植活哺乳动物细胞治疗活哺乳动物组织中的缺损的部分的试剂盒，所述试剂盒包含根据前述权利要求中任一项定义的第一组分和第二组分，其中，所述第一组分和所述第二组分是相互分离的。
51.权利要求50的部分的试剂盒，其中进一步提供前述权利要求中任一项中定义的转化剂，且其中转化剂与所述第一和所述第二组分分离。
52.权利要求50的部分的试剂盒，其中所述转化剂是所述第一组分的部分。
53.权利要求50至52任一项的部分的试剂盒，其包含整合的供应装置，所述装置包括下列功能性连接的装置：(i)至少一个在使用之前包含所述第二组分的容器，(ii)施压器，用于将所述第二组分压出所述容器并进入(iii)连接器，从而到达(iv)递送装置，其中所述递送装置适合用于直接将第二组分用于插入活性哺乳动物组织中的缺损的位置的第一组分。
54.权利要求53的部分的试剂盒，其中所述整合的供应装置包括两个容器，包含所述细胞悬浮液的第一容器，和包含所述固定剂前体的第二容器，其中所述第一和第二容器通过共同的连接器连接起来，从而允许同时混合所述细胞悬浮液和所述固定剂前体，从而在通过所述递送工具进行递送之前制备第二组分。
55.权利要求53或54的部分的试剂盒，其中所述整合的供应装置包括包含所述转化剂的另外的容器，其中所述另外的容器通过共同的连接器与所述第一容器，和任选地通过所述共同的连接器与所述第二容器连接，从而允许在通过所述递送工具将所述转化剂递送至已插入所述组织中的缺损的位置的所述第一组分之前将所述第一组分与所述转化剂混合。
56.权利要求54或55的部分的试剂盒，其中将所述第二容器和/或另外的容器与施压器功能性连接，所述施压器可以是共同的施压器装置或分开的独立的施压器。
57.权利要求53至56中任一项的部分的试剂盒，其中所述至少一个容器例如第一容器、第二容器和/或所述第三容器以注射器体的形式存在，所述施压器以各自注射器柱塞的形式存在。
58.权利要求53至57中任一项的部分的试剂盒，其中所述连接器是或包含至少一个管，所述管具有与所述一个或更多个容器连接的近端和与所述递送装置连接的单个远端。
59.权利要求58的部分的试剂盒，其中所述连接器进一步包含混合装置，从而允许在进入所述递送装置之前充分混合第二组分和任意的所述转化剂。
60.权利要求53至59中任一项的部分的试剂盒，其中所述递送装置以选自：注射器、导管、针和管、喷雾装置和压力枪的医疗装置的形式存在。
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