KR102305478B1

KR102305478B1 - 셀룰로오스 멤브레인을 포함하는 세포 배양용 생물반응기

Info

Publication number: KR102305478B1
Application number: KR1020190086413A
Authority: KR
Inventors: 민병현; 박인수; 이설광
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2021-09-27
Also published as: KR20210009635A

Abstract

본 발명은 연골 형성 및 면역 조절 특성을 향상시킬 수 있는 셀룰로오스 멤브레인으로 제조된 세포 배양용 생물반응기에 관한 것으로, 실리콘 튜브; 및 상기 실리콘 튜브의 상, 하부에 셀룰로오스 멤브레인(membrane)을 포함하는 세포 배양용 생물반응기로 이루어져, 생체 내에서도 항상성이 유지되어 연골세포 배양이 가능하고, 연골 표현형(phenotype)을 유지시킬 수 있으며, 면역 조절 성능 또한 향상시킬 수 있어 생물반응기로 배양된 연골세포에 의한 연골 결손 치료시, 면역 거부 반응 없이 재생 치료가 이루어질 수 있는 효과가 있다.

Description

셀룰로오스 멤브레인을 포함하는 세포 배양용 생물반응기{Cell culture bioreactor containing cellulosose membrane}

본 발명은 연골 형성 및 면역 조절 특성을 향상시킬 수 있는 셀룰로오스 멤브레인으로 제조된 세포 배양용 생물반응기에 관한 것이다.

관절 연골은 손상 후 치료가 제한적이며, 혈관구조가 결여되어 있기 때문에 손상 후에 자가회복(self-repairing)에 어려움을 겪어왔다. 이에 따라 수년간 세포 기반의 자가 또는 동종 이식으로 연골 손상을 치료하는데 사용되어왔다. 자가 세포를 사용하는 방법은 연골을 얻기 위한 침입 과정이 필요하며 양이 제한되는 문제점이 있어왔다. 이에 대안은 동종 이식 세포의 사용이지만, 면역 반응이 유도되어 세포 치료의 실패로 이어질 수 있는 문제점이 있어왔다. 또한, 연골 세포는 생체 외에서 가역 분화(dedifferentiate)되어 표현형 및 세포 외 기질(extracellular matrix; ECM) 성분의 손실을 초래할 수도 있다.

이에 최근 연골 조직공학에서 원생 연골과 유사한 연골을 생산하는 연구가 진행되고 있다. 그러나 조직공학 기술을 기반으로 형성된 연골은 연골 세포를 파괴하고 조직을 변형시킬 수 있는 염증 반응으로 인해 면역 능력이 있는 동물에서 연골 재생 치료에 이용될 수 없었다.

따라서 연골세포의 배양 및 연골의 표현형 유지를 가능하게 하며, 면역 조절 성능 또한 향상시켜 연골 손상 및 결손 재생 치료시, 면역 거부 반응 없이 재생 치료가 이루어질 수 있는 고품질의 연골조직 배양을 위한 생물반응기의 개발이 필요한 실정이다.

1. 대한민국 공개특허 제10-2008-0065606호(2008.07.14.공개)

본 발명의 목적은 연골 형성 및 면역 조절 특성을 향상시킬 수 있는 세포 배양용 생물반응기를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 생물반응기를 이용한 연골세포 배양 방법 및 이러한 방법에 따른 연골세포를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 생물반응기를 통해 배양된 연골세포를 포함하는 연골 질환의 치료를 위한 세포 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실리콘 튜브; 및 상기 실리콘 튜브의 상, 하부에 셀룰로오스 멤브레인(membrane)을 포함하는 세포 배양용 생물반응기를 제공한다.

또한, 본 발명은 인간으로부터 분리된 세포를 원심분리하여 펠릿(pellet)으로 제조하는 단계; 생체 내에 생물반응기를 삽입하는 단계; 및 상기 생물반응기에 펠릿을 넣어 배양시키는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 연골세포 배양 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 따라 생물반응기 내에서 배양된 연골세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 연골세포를 포함하는 연골 질환의 치료를 위한 세포 치료용 조성물을 제공한다.

생체 적합 재료인 실리콘 튜브 및 셀룰로오스 멤브레인으로 이루어진 생물반응기는 생체 내에서 항상성을 유지시킬 수 있어 연골세포 배양이 가능하며, 연골 표현형(phenotype)을 유지시킬 수 있고, 면역 조절 성능 또한 향상시켜 고품질의 연골조직을 형성시킬 수 있는 효과가 있다.

또한, 상기 생물반응기를 통해 형성된 연골조직은 연골 손상 및 결손 치료시 면역 거부 반응 없이 재생 치료가 이루어질 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 생물반응기 제조에 이용된 셀룰로오스 멤브레인의 SEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 IV 생물반응기 시스템(A-C), 이를 이용한 토끼 생체 내의 펠릿(pellet) 배양(D-E) 및 상기 펠릿을 이용한 연골 재생 치료(F)를 나타낸 도면이다.
도 3은 IV 생물 반응기 유체 특성 및 유체 유동성 분석을 나타낸 도면이다.
도 4는 생체 외, 피하 및 IV 생물 반응기로부터 얻어진 펠릿의 육안 관찰, 크기 측정 및 세포 생존율 분석을 나타낸 도면이다.
도 5는 생체 외, 피하 및 IV 생물반응기에서 배양한 펠릿의 조직학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 6은 생체 외, 피하 및 IV 생물반응기에서 배양한 펠릿의 면역화학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 7은 생체 외, 피하 및 IV 생물반응기에서 배양한 펠릿의 석회화(Calcification) 분석을 나타낸 도면이다.
도 8은 생체 외, 피하 및 IV 생물반응기에서 배양한 펠릿 및 원생 연골에서의 DNA (A), GAG (B) 및 콜라겐 (C) 함량 분석을 나타낸 도면이다.
도 9는 생체 외, 피하 및 IV 생물반응기에서 배양한 펠릿의 면역원성(immunogenicity) 분자 분석을 나타낸 도면이다.
도 10은 생체 내 연골 회복에 대한 이소성 인공 연골의 육안 분석 (A) 및 조직학적 분석 (B)을 나타낸 도면이다.
도 11은 생체 내 연골 회복에 대한 이소성 인공 연골의 면역조직화학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 12는 생체 내 연골 회복에 대한 활막(synovium)의 조직학적 분석을 나타낸 도면이다.

이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 실리콘 튜브와 셀룰로오스 멤브레인으로 이루어진 생물반응기를 제조하였으며, 상기 생물반응기는 생체 내에서도 항상성이 유지되어 연골세포 배양이 가능하고, 연골 표현형(phenotype)을 유지시킬 수 있으며, 면역 조절 성능 또한 향상시킬 수 있어 생물반응기로 배양된 연골세포에 의한 연골 결손 치료시, 면역 거부 반응 없이 재생 치료가 이루어질 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 실리콘 튜브; 및 상기 실리콘 튜브의 상, 하부에 셀룰로오스 멤브레인(membrane)을 포함하는 세포 배양용 생물반응기를 제공한다.

이때, 상기 셀룰로오스 멤브레인의 평균 기공 크기는 50 내지 400nm인 것을 특징으로 하며, 이러한 기공 크기는 생체 내에서 대부분의 영양분은(nutrients) 통과할 수 있지만 세포는 통과할 수 없는 크기이다. 또한, 상기 셀룰로오스는 친수성 재료이며, 단백질의 비특이적 흡착이 적을뿐더러 포유류 세포도 셀룰로오스 표면에 흡착되기 쉽지 않아 기공을 막지 못하는 특징이 있다.

또한, 상기 세포는 인간 태아 연골 전구 세포(human fetal cartilage progenitor cell, hFCPC)인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 셀룰로오스 멤브레인은 셀룰로오스를 110 내지 130℃에서 54-60wt% 브롬화리튬(lithium bromide) 수용액에 용해시켜 셀룰로오스 용액을 제조하는 단계; 및 상기 셀룰로오스 용액을 냉각시키고, 물로 염을 제거하여 셀룰로오스 멤브레인을 수득하는 단계; 를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 생물반응기는 실리콘 튜브; 및 상기 실리콘 튜브의 상, 하부에 셀룰로오스 멤브레인(membrane)을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 셀룰로오스 멤브레인의 평균 기공 크기는 50 내지 400nm일 수 있으나, 바람직하게는 200nm일 수 있다.

본원의 일 실시예에 따르면, 상기 생체 내 생물반응기 환경은 연골 형성에 필요한 물질이 포함되어 있는 등 연골 재생을 위한 좋은 환경을 제공하기 때문에 연골 기질(matrix)의 합성을 촉진하고, 3주까지 연골 표현형(phenotype)을 유지시키게 할 수 있으며, 숙주(host)의 간섭으로 보호할 수 있어 면역 조절 성능 또한 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 연골세포 배양 방법에 따라 생물반응기 내에서 배양된 연골세포를 제공한다.

이때, 상기 세포 치료용 조성물은 일반적으로 널리 알려진 성장인자 또는 분화촉진 인자 등의 요소를 더 포함시킬 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 세포 치료용 조성물은 치료하고자 하는 부위에 주사기 등을 이용하여 직접 삽입되거나, 수술을 통해 삽입되거나, 또는 순환계를 통하여 삽입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 세포 치료용 조성물에 포함되어 있는 세포는 연골 질환의 치료를 위해 생체 내 이식시 피이식 조직의 손상된 세포를 대체하여 조직의 손상을 치유하거나, 피이식 조직과 네트워크를 이루어 조직을 재건하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 연골 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 또는 외상에 의한 관절 손상 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 세포 분리 및 배양

인간 태아 연골 전구 세포(human fetal cartilage progenitor cell, hFCPC)는 임신 12주에 인간 태아 연골 조직으로부터 분리하였다. 아주대학교 메디컬 센터(AJJIRB-CRO-16-139)의 기관 검토위원회(IRB)가 승인한 대로, 태아 연골 조직은 선택적 낙태 후 환자에게서 채취하였다. 채취된 연골 조직은 1% 태아 소 혈청 (FBS; HyClone)을 함유하는 고포도당 DMEM(Dulbecco 's modified Eagle Medium; HyClone, Logan, UT, USA)에서 0.1% 콜라게나제(collagenase) II형(Worthington Biochemical Corp, Freehold, NJ, USA) 포함 시켜 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 16시간 후, 세포를 분리하여 8 × 10³ cells/cm² 의 밀도로 1% 항생제 - 항균제 및 10% FBS가 포함된 DMEM에서 배양하였다. 3일 후, 부착되지 않은 세포를 제거하고 배지를 교체해주었으며, 0.05% 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA, Gibco, Gaithersburg, MD, USA) 처리에 의해 80% 빽빽하게 자랐을 때 계대배양 하였다.

< 실시예 2> 펠릿 배양

3 × 10⁵ cells/0.5㎖의 분액을 15㎖ 폴리프로필렌 튜브에서 500g, 10분의 조건으로 원심분리 하였다. 1일 후, 전형적인 연골 형성 유도제인 TGF-β를 함유하지 않은 연골 세포 배지(ITS 혼합물, 50㎍/ml 아스코르베이트-2 포스페이트(ascorbate-2 phosphate), 100nM 덱사메타손(dexamethasone), 40㎍/ml 프롤린(proline) 및 1.25mg/ml BSA이 첨가된 DMEM 배지)에서 배양하였다. 이후, 펠릿을 3일간 배양하였다.

< 실시예 3> 셀룰로오스 멤브레인 챔버 제조

셀룰로오스 멤브레인 챔버는 실리콘 튜브(21mm × 15mm × 10mm, 외경 × 내경 × 높이) (Korea Ace Scientific, Seoul)와 셀룰로오스 멤브레인으로 구성되어있다. 셀룰로오스 멤브레인의 기공 크기는 약 50-400 nm로(도 1), 경희대학교의 바이오 에너지 연구 센터로부터 제공 받았다(Cellulose 21(3) (2014) 1175-1181).

구체적으로, 상기 셀룰로오스 멤브레인은 셀룰로오스를 110 내지 130℃에서 1시간동안 54-60wt% 브롬화리튬(lithium bromide) 수용액에 용해시킨 후, 상기 셀룰로오스가 용해된 용액을 70℃로 냉각시키고, 물로 염을 제거하여 투명한 셀룰로오스 멤브레인을 수득하였으며, 상기 셀룰로오스 멤브레인은 수용액으로부터 직접 재생성 되었다.

이후, 실리콘 튜브의 양단을 셀룰로오스 멤브레인으로 밀봉하고, 7-0 블랙 실크 실을 사용하여 고정 시켰다. 이후, 121℃에서 약 20분 동안 오토클레이브(autoclave)에서 멸균하여 사용하였다.

< 실시예 4> 피하 및 IV( In vivo ) 생물반응기 환경에서의 이소성 연골( Ectopic chondrogenesis ) 형성

아주대학교 의료원 실험 동물 연구 센터의 동물 연구자를 위한 윤리위원회의 승인을 받았으며(승인번호: 2014-0068), 제도적 윤리적 사용 프로토콜(실험실 동물의 사용 및 관리를 위한 NIH 가이드)을 준수했다.

3.5kg의 뉴질랜드 흰 토끼(피하 및 IV 생물반응기 군; OrientBio, Seongnam, Korea) 24마리를 혼합 마취제(Zerotil, Rumpun)로 마취시켰다. 이후, 상기 <실시예 3>에서 제조된 셀룰로오스 멤브레인 챔버 (2 챔버/토끼)를 토끼의 뒷 피부 하부에 삽입하였다. 또한, 실험을 위해 상기 <실시예 2>에서 제조된 펠릿 (펠릿 크기 1.14 ± 0.04 mm) 총 360개를 생체 외(in vitro), 토끼 피하 및 IV 생물반응기의 세 가지 환경으로 나누어 배양하였다. 3일 후, 총 240개의 펠릿을 피하 및 셀룰로오스 멤브레인 챔버 (5개의 펠릿/챔버)에 넣었다. 이후, 토끼를 1일, 1주 및 3주 시점마다 희생시켰다. 회수된 펠릿은 분석, 육안 관찰, 펠릿 크기 측정, 세포 생존율 분석, 조직학적 분석, 면역조직화학적 분석, 생화학적, 역전사 중합 효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석 및 웨스턴 블럿 분석에 각각 사용되었다.

< 실시예 5> 연골 결손 치료

동일한 45마리의 뉴질랜드 흰 토끼를 연골 결손 치료에 사용하였다 (OrientBio). 전신 마취 하에서 측면 피부를 절개 및 근육 박리 후에 무릎이 노출되도록 하였다. 이후, 대퇴골의 활차구(trochlear geoove)에 원통형의 연골 결손 (직경 2.0 mm, 깊이 0.5 mm)을 만들었다. 그 다음, 생체 외, 자가 IV 생물반응기 및 피하에서 1주 동안 배양된 인공 연골 조직을 결손부에 이식하고 상처를 꿰매었다. 대조군에는 결손부에 아무것도 이식하지 않았다. 수술 후 모든 토끼는 표준식이 요법을 하고, 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였으며, 일정한 온도와 습도를 유지시킨 개별 케이지에 넣었다. 진통제와 항생제는 수술 후 3일 동안 투여되었다. 수술 후 4주, 8주 및 12주에 안락사 용액을 정맥 주사하여 동물을 희생시킨 후, 육안 관찰, H & E 염색, 사프라닌-O(Safranin-O) 염색 및 콜라겐 II형(COL II), 콜라겐 I형(COL I) 및 콜라겐 X(COL X)의 면역조직화학(Immunohistochemistry; IHC) 염색을 위해 결손 부위가 회복된 연골 및 활막을 얻었다.

< 실시예 6> 투과도 측정

우선적으로, 각 유체의 투명도는 시각적으로 측정되었다. 이후, 각 유체의 투과 스펙트럼을 UV-Vis 분광광도계(Jasco V-650, Japan)를 사용하여 관찰하였다. 스펙트럼 분포는 가시 파장 범위(400-800 nm)에서 측정되었다. 결과는 물로 노멀라이즈(normalize) 하였다.

< 실시예 7> 투과성 분석

셀룰로오스 멤브레인을 통한 확산을 시험하기 위해, 2개의 챔버 시스템을 사용하여 셀룰로오스 멤브레인을 통한 글루코스 확산 패턴을 확인하였다. 간략하게, 셀룰로오스 멤브레인은 2개의 특정 챔버 사이에 고정되었으며, 챔버의 한쪽면에 4500 mg/L 글루코스 DMEM을 넣고, 챔버의 다른면에 증류수(distilled water; DW)를 넣었다. 2, 4, 8, 12, 24시간 후에 아주 대학교 병원에서 DW의 글루코스 농도를 측정하였다.

< 실시예 8> IV( In vivo ) 생물 반응기의 유체 성분 분석

아주대학교 병원에서 IV 생물반응기(BIOREACTOR) 유체 내 총 단백질과 글루코스를 측정하였다. IV 생물반응기 유체 중의 히알루론산(Hyaluronan; HA) 함량은 ELISA 키트를 사용하여 제조사의 지침(R & D Systems, Minneapolis, USA)에 따라 측정되었다. IV 생물반응기 유체의 젖산(Lactic acid) 함량은 EnzyChromTM L-Lactate Assay Kit(ECLE-100)를 사용하여 제조사의 지침(BioAssay Systems, Hayward, CA, USA)에 따라 측정되었다. 실험은 3번 실시하였고, 광밀도(Optical density)를 사용하여 젖산 생성 결과를 노멀라이즈(normalize) 시켰다.

< 실시예 9> 펠릿의 육안 관찰 및 크기 측정

회수된 펠릿(n = 5/시간/군)은 모양, 색깔 및 크기면에서 관찰되었다. 또한, 이미지 J 프로그램을 사용하여 펠릿의 크기를 분석하였다.

< 실시예 10> 세포 생존율 분석

37℃, 5% CO₂ 배양기에서 혈청이 없는 DMEM 배지 200㎕ alamarBlue (Invitrogen, California, USA)의 20㎕를 이용하여 48-웰 플레이트에 펠릿(n = 5/시간/군)을 배양했다. 배양 5시간 후, 마이크로 플레이트 리더기(Infinite M200, Tecan, CH)를 사용하여 96 웰 플레이트에서 각 웰 샘플(100㎕)의 흡광도를 570 및 600nm의 파장으로 측정하였다.

< 실시예 11> 조직학 및 면역조직화학

샘플(n = 5/시간/군)을 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 24시간 동안 고정 시키고, 탈수시킨 다음 파라핀 왁스로 고정 시켰다. 이후, 각 4㎛ 두께의 절편을 준비하고, 세포 분포 및 형태를 시각화하기 위해 헤마톡실린 / 에오신(hematoxylin / eosin) 염색(하기 표 1의 Krenn 's 활막염 점수 시스템을 이용하여 활막염을 평가하였다), 황산화된 프로테오글리칸(sulfated proteoglycans)의 축적 분석을 위한 사프라닌-O / 녹색(Safranin-O / fast green) 염색(하기 표 2의 베른(Bern) 점수를 이용한 Safranin O-Fast green 염색 연골 펠릿 평가 및 하기 표 3의 O'Driscoll 점수 시스템을 이용한 연골 회복 점수를 평가하였다) 및 석회화된 펠릿 분석을 위한 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색(이미지 J 프로그램을 이용하여 석회화의 정량 분석을 수행하였다)을 수행하였다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

면역조직화학적 분석을 위해 상기와 같이 준비된 시료의 절편을 3% 과산화수소(H₂O₂)로 10분간 처리한 후, 10분간 펩신 용액(Golden Bridge International, Inc, Mukilteo, WA, USA)과 반응시켰다. 이후, 1시간 동안 인산염완충식염수 (phosphate-buffered saline; PBS)의 1% BSA로 절편을 블로킹(blocking) 후 절편은 상온에서 1.5 시간 동안 일차 항체 (1 : 200)와 반응시켰다. 상기 사용된 일차 항체는 II형, I형 및 X형 콜라겐(모두 Abcam, Cambridge, UK로부터 구매하여 사용하였다, 표 4 참조)이다. PBS로 2회 세정하고, 절편을 30분 동안 비오티닐화된 2차 항체(biotinylated secondary antibody, 1 : 200) 및 퍼옥시다아제-결합된 스트렙타비딘(peroxidase-conjugated streptavidin) 용액으로 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 마지막으로, 절편을 3,3'-디아미노벤지딘(3,3´-diaminobenzidine; DAB) 용액과 반응시키고, Mayer's 헤마톡실린(hematoxylin, Sigma, St Louis, MO)으로 대조염색한 다음 현미경(Nikon E600, Japan) 관찰을 위해 장착하였다.

[표 4]

< 실시예 12> 생화학 분석

DNA 및 황산화된 글리코사미노글리칸(sulfated glycosaminoglycan; sGAG)의 함량 분석을 위해, 100 mM Na₂HPO₄에 5 mM EDTA 및 5 mM L-시스테인(L-cysteine)-HCl이 포함된 125 μg/ml의 파파인(papain)을 함유한 파파인 용액으로 60℃에서 24시간 동안 펠릿(n = 5/시간/군)을 완전히 반응시켰다. DNA 함량은 Picogreen 분석을 사용하여 측정되었다. 총 sGAG 함량은 Blyscan GAG 분석 키트(Biocolor, Carrickfergus, UK)를 사용하여 측정하였다. 파파인과 반응된 펠릿을 Blyscan 염료 시약과 30분간 반응시키고, 10분간 원심분리(12,000 rpm) 하였다. 침전물을 해리 시약으로 용해 시키고, 656nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 콜라겐 함량 분석을 위해 1 mg/ml 펩신(pepsin)을 함유한 0.1M HCl 용액으로 4℃에서 2일간 펠릿(n = 5/시간/군)을 완전히 반응시켰다. 콜라겐 함량은 Sircol 콜라겐 분석 키트(Biocolor)를 사용하여 측정되었다. HCl과 반응된 펠릿을 Sircol 염료 시약과 30분간 반응시키고, 10분간 원심분리(12,000 rpm) 하였다. 침전물을 얼음으로 냉각시킨 산-염 세척 시약으로 세척하고, 10분간 원심분리(12,000 rpm) 하였다. 이후, 침전물을 알칼리 시약으로 용해 시키고, 555nm에서 흡광도를 측정하였다.

< 실시예 13> 역전사 중합효소 연쇄 반응 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT- PCR )

펠릿(n = 5/시간/군)을 PBS로 씻어내고, 500㎕ TRIzol(Invitrogen, CA, USA)에서 10분 동안 용해 시켰다. 총 RNA는 제조사의 지침에 따라 추출하였다. 그 후, 총 RNA와 iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 제조사의 지침에 따라 AccuPower PCR PreMix(Bioneer, Korea)를 이용하여 인간 백혈구 항원-ABC (human leukocyte antigens-ABC; HLA-ABC), CD80, CD86 및 글리세르알데히드-6-포스페이트 탈수소 효소(glyceraldehyde-6-phosphate dehydrogenase; GAPDH)에 대해 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하였다. 프라이머의 서열 및 반응 조건은 하기 표 5에 나타냈다.

[표 5]

< 실시예 14> 웨스턴 블럿 (Western Blot) 분석

HLA-ABC, CD80, CD86 및 β-Actin에 대한 웨스턴 블럿을 수행하였다. 총 단백질을 펠릿에서 추출하고, 방사선 면역 석출 분석(Radioimmunoprecipitation assay; RIPA) 용해 완충액(Rockland, Gilbertsville, PA, USA)을 사용하여 단백질 농도를 Bradford 분석법(Bio-Rad)을 사용하여 정량화했다. 단백질 추출물을 4-20%의 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel; Bio-Rad)을 통해 전기영동 하였다. 이어서, 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride; PVDF) 멤브레인(Bio-Rad)에 옮기고, 멤브레인을 0.1% Tween-20을 함유하는 트리스-완충 식염수(Tris-buffered saline; TBS)인 TBST에서 5% 탈지분유로 블로킹(blocking) 시켰다. 멤브레인을 β-액틴(β-Actin, GeneTex, Irvine, CA, USA, 1 : 2000의 희석액), HLA-ABC, CD80 및 CD86 (1 : 2000의 희석액)에 대한 일차 항체와 함께 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다(상기 표 4 참조). 이후, 멤브레인을 37℃에서 1시간 동안 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 항-토끼(anti-rabbit) 또는 항-쥐(anti-mouse) 이차 항체(GeneTex, 1 : 2000의 희석)를 반응시켰다.

< 실시예 15> 통계분석

데이터는 GraphPad Prism 7.00 소프트웨어를 사용하여 일원 및 이원 분산 분석(ANOVA) Tukey's 다중 비교 테스트로 통계적 유의성을 분석했다. 실험은 최소 3 회 이상 반복 실험하였으며, 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시하였다. 통계적 유의성은 *p <0.05로 지정되었다.

< 실험예 1> IV( In vivo ) 생물반응기 장치

새로운 연골 재생을 위한 자가 재생 능력을 확인하기 위해 상기 <실시예 3>에 따라 셀룰로오스 멤브레인과 실리콘 튜브를 사용하여 토끼 피하에 삽입할 생체 내 생물반응기를 제조하였다(도 2A-D).

생물반응기 챔버 삽입 3일 후 챔버 내 FCPC 펠릿 배양에서 경량 혈관 네트워크로 캡슐화된 얇은 섬유 조직이 모든 챔버를 주위를 둘러싸고 있었으나, 외과적으로 제조된 피하 챔버에서만 최소의 섬유화 반응이 관찰되었다. 체액은 IV 생물반응기 챔버 내부에 가득 차있었다(도 2E). 펠릿 배양 1주 후, 이를 자가 연골 결손 부분에 이식하였다(도 2F). 결과적으로 이식된 펠릿은 원생 연골처럼 불투명하고 희끄무레하였으며, 혈관 침입은 관찰되지 않았다. 또한, 새로 형성된 조직의 모양은 이식 전과 비교하여 거의 변화가 없었음을 확인하였다.

< 실험예 2> IV 생물반응기의 유체 특성 및 유체 유동성 확인

IV 생물반응기의 유체 및 천연 활액(synovial fluid; SF)(도 3A)과 투명성(도 3B)을 나타냈다. 그 결과, IV 생물반응기 유체는 펠릿 배양 1일, 1주 및 3주 후 SF와 유사하게 재생되었다. 대조군은 셀룰로오스 멤브레인이 없는 챔버로 황갈색을 띠고, 탁한 작은 입자를 함유하고 있는 반면, IV 생물반응기 유체는 SF와 유사하게 깨끗하며, 약간 노란색을 띠고, 미립자가 없음을 확인하였다. 광 투과도 결과는 활액이 가장 높았고, 그 다음 IV 생물반응기에서 배양된 1일, 1주 및 3주 후의 순으로 나타났으며, 가장 낮은 것은 대조군으로, 800nm 에서 각각 97%, 96%, 94%, 89% 및 63%의 광투과도를 보임을 확인하였다.

또한, 펠릿 배양 전 생물반응기 유체 중의 총 단백질, 글루코스 및 히알루론산의 함량을 측정하여 토끼 SF 및 혈청과 인간 SF 및 혈청의 함량을 비교하여 하기 표 6에 나타냈다.

[표 6]

그 결과, IV 생물반응기에서의 성분이 혈청보다 활액(SF)에 더 가깝다는 것을 보여주었다.

또한, 토끼 피하에 삽입하기 전과 삽입 3주 후 IV 생물반응기에 사용된 셀룰로오스 멤브레인의 투과성을 24시간 동안 비교하였다 (도 3C). 그 결과, 시간이 경과함에 따라 오른쪽 챔버(DW)의 색상이 진해지면서 두 챔버의 색이 두 그룹에서 24 시간 후에 유사하게 변하였다. 오른쪽 챔버에서 글루코스의 농도는 두 그룹 모두에서 시간이 경과함에 따라 유사하게 증가하였다 (도 3D). 글루코스 농도는 처음 2시간에서부터 빠르게 증가하였고, 그 이후로는 상대적으로 천천히 증가하였다.

또한, 3, 6, 9, 12일에 펠릿 유무에 따른 IV 생물반응기 유체의 총 단백질, 글루코스 및 젖산 함량을 비교하였다(표 7).

[표 7]

이들 성분의 함량은 3, 6, 9, 12일에서 두 그룹 간에 유사하였으며, 각 그룹은 시간이 경과함에도 유사한 수준을 유지하였다.

상기의 결과로 IV 생물반응기 유체의 성분은 혈청보다 SF에 더 가까우며, IV 생물반응기 삽입 3주 후에도 셀룰로오스 멤브레인은 이전과 같이 투과성이 좋고, IV 생물반응기 시스템은 항상성을 유지할 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 3> 펠릿의 육안 관찰, 크기 및 세포 생존율 분석

IV 생물반응기의 효과를 FCPC 펠릿의 생장에 대하여 생체 외(in vitro) 및 피하와 비교하였다. 펠릿은 처음 3일 동안 생체 외에서 배양 한 다음 생체 외, 피하 및 IV 생물반응기에서 1일, 1주 및 3주 동안 배양하였다.

그 결과, 모든 그룹의 펠릿은 희끄무레하고, 유리질 연골처럼 원형 모양을 보였으며, 피하 조직 유착을 보이거나 붉은색의 혈액 얼룩은 나타나지 않았다 (도 4A). 또한, 육안 관찰과 크기 측정에서, 생체 외 및 IV 생물반응기 그룹에서 펠릿의 크기는 시간에 따라 유의하게 증가했지만, 피하 그룹은 3주 후에 감소함을 보였다. 3주 후 IV 생물반응기 그룹(1.762 ± 0.132 mm²)에서의 펠릿 크기는 피하 그룹(1.244 ± 0.115 mm²)에서의 펠릿보다 컸으며(p <0.05), 생체 외 그룹 (1.969 ± 0.135 mm²)과 유사하게 나타났다 (도 4B).

또한, FCPC 펠릿의 생존율에 대하여 생체 외(in vitro) 및 피하와 비교하였다. 시약은 시간 경과 시점 및 모든 그룹에서 보라색에서 분홍색으로 변함을 확인하였다(도 4C). 흡광도는 생체 외 및 IV 생물반응기 그룹에서 시간에 따라 증가했지만, 피하 그룹은 3주에 감소했다 (도 4D).

상기의 FCPC 펠릿의 육안 관찰 및 생존율 분석 결과로부터 생체 내에서 FCPC 펠릿의 성장을 유지하기 위해 IV 생물반응기는 중요한 역할을 할 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 4> 펠릿의 조직학적 분석

생체 외, 피하 및 IV 생물반응기에서 배양한 펠릿의 연골 형성을 조직학적 분석으로 추가 조사하였다(도 5A-B).

그 결과, 사프라닌-O(Safranin-O)/녹색 염색(fast green staining) 분석에서 황산화된 GAG의 축적이 시간에 따라 유의하게 증가하였고, 3주까지 생체 외 및 IV 생물반응기 그룹 사이에서 Safranin-O 염색의 강도와 영역은 유의한 차이가 발견되지 않았지만, 피하 그룹은 3주에 감소함을 확인하였다. 또한, 3주 후 베른 점수(Bern score)는 IV 생물반응기 그룹(5.8 ± 0.9)이 피하 그룹(4.0 ± 0.8) 보다 높으며(p <0.05), 생체 외 그룹(6.5 ± 1.2)과 유사함을 확인하였다. 또한, 고배율 이미지에서 (x 400), 생체 외 및 IV 생물반응기 그룹의 변성 염색 부위의 분화된 세포는 배양 과정 동안 원형 또는 긴 방추형으로 나타남을 확인하였다(도 5A-B). 이러한 형태는 배양 1주 동안 피하 그룹의 분화된 세포에서도 관찰되었지만, 세포 배양 3주에서 심하게 저하됨을 확인하였다.

< 실험예 5> 펠릿의 면역화학적 분석

Ⅱ형, Ⅰ형 및 Ⅹ형 콜라겐에 대한 면역 염색을 통해 펠릿 연골 세포의 표현형(phenotype)을 확인하였다(도 6).

그 결과, Ⅱ형 콜라겐은 생체 외 및 IV 형 생물반응기에서 시간에 따라 증가하였지만, 피하 그룹에서는 1주 보다 염색 강도 및 염색 영역 모두에서 3주 후에 약 50%에 도달하여 감소함을 확인하였다. 또한, IV 생물반응기 그룹은 3주 후에 펠릿 전체에서 Ⅱ형 콜라겐이 강하게 발현되었으며, 이는 피하 그룹 보다 강하게 나타났으나, 생체 외 그룹 보다는 약하게 나타났다. Ⅰ형과 Ⅹ형 콜라겐은 생체 외 및 IV 생물반응기 모두에서 약한 발현을 보였으나, 피하 그룹에서는 시간이 경과함에 따라 증가함을 보였다.

< 실험예 6> 펠릿의 석회화(Calcification)

연골 발생 표현형의 손실이 기질(matrix)의 석회화와 관련이 있는지 알아보기 위해 알리자린 레드(Alizarin Red) 염색을 수행하고, 이미지 J(Image J) 프로그램을 사용하여 석회화 부위의 비율을 확인하였다(도 7).

그 결과, 피하 및 IV 생물반응기 그룹에서 석회화된 광상(mineral deposits)을 나타내는 적색 염색이 1주 후에 말초 부위에서 처음 관찰되었고, 3주 후에 중심부로 퍼져 나감을 확인하였다. 생체 외 그룹은 3주 후에 말초 부위에 약한 적색을 보였다. 3주 후에 염색된 부위는 피하 그룹(9.17 ± 5.04 %)에서 IV 생물반응기 (1.43 ±0.83 %) (p <0.05)와 생체 외 그룹(0.88 ± 0.57 %) (p <0.05) 보다 더 강하고 광범위하게 나타났다.

이러한 결과로, IV 생물반응기는 연골을 형성하는 데에 기여할 수 있을 뿐만 아니라 FCPC 펠릿의 연골 형성 표현형을 유지시킬 수도 있다는 것을 확인하였다.

< 실험예 7> DNA, GAG 및 콜라겐 함량에 대한 생화학 분석

DNA, GAG 및 콜라겐의 함량은 회수된 펠릿의 화학적 분석에 의해 정량적으로 측정되었다(도 8).

그 결과, DNA 함량은 생체 외(in vitro) 및 IV 생물반응기 그룹에서 배양된 후 시간이 경과함에 따라 증가하였으나, 피하 그룹은 3주에 감소하였다 (도 8A). 3주 후에 IV 생물반응기 그룹의 DNA 함량은 피하 그룹(1.08 ± 0.08 μg / mg) 보다 높았으나 (p <0.05), 생체 외 그룹(1.56 ± 0.07 μg / mg) (p <0.05) 보다는 낮게 나타났다. 이러한 결과는 생체 외 및 IV 생물반응기 그룹에서는 시간이 경과함에 따라 세포수가 증가하지만, 피하 그룹은 감소함을 알 수 있다.

또한, GAG와 콜라겐의 함량은 DNA 함량과 비슷한 패턴을 보였다. GAG 함량은 생체 외 및 IV 생물반응기 그룹에서 배양된 후 시간이 경과함에 따라 증가하였으나, 피하 그룹은 3주에 감소하였다(도 8B). 3주 후에 GAG 함량은 IV 생물반응기 그룹(6.15 ± 0.27 μg / mg)이 피하 그룹(2.79 ± 0.35 μg / mg) (p <0.05) 보다 높았으며, 생체 외 그룹 (6.98 ± 0.26 μg / mg)(p <0.05)과는 유사하게 나타났다.

콜라겐 함량은 생체 외 및 IV 생물반응기 그룹에서 배양된 후 시간이 경과함에 따라 증가하였지만, 피하 그룹은 3주에 감소하였다(도 8C). 3주 후에 콜라겐 함량은 IV 생물반응기 그룹(50 ± 3 μg / mg)이 피하 그룹(26 ± 3 μg / mg) (p <0.05) 보다 높았으며, 생체 외 그룹(53 ± 2 μg / mg) (p <0.05 )과는 유사하게 나타났다.

이러한 생화학 분석의 결과로, IV 생물반응기는 FCPC 펠릿의 연골 형성을 유지시키는 역할을 할 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 8> 면역원성( immunogenicity ) 분자 분석

RT-PCR 분석 결과, HLA-ABC의 mRNA는 1일, 1주, 3주에서 생체 외 그룹 보다 IV 생물반응기 그룹에서 유의하게 낮은 수준으로 유지되었고, 모든 그룹에서 시간이 경과함에 따라 감소하였다(도 9A).

또한, CD80의 mRNA는 1일 및 1주에서만 낮은 수준을 보였으나, 모든 그룹에서 3주 후에 증가함을 보였다. 그러나 IV 생물반응기의 수준은 생체 외 및 피하 그룹 보다 유의하게 낮았다.

CD86의 mRNA 패턴은 CD80의 mRNA 패턴과 유사하게 나타났다. CD86의 mRNA는 1일 및 1주에 발현이 없었으나, 생체 외 및 피하 그룹에서는 3주 후에 증가하였다. 그러나 IV 생물반응기에서는 1일, 1주, 3주 시점 모두에서 발현되지 않음을 확인하였다.

단백질의 웨스턴 블럿 분석은 mRNA의 패턴과 유사한 패턴을 보였다(도 9B). 생체 외 HLA-ABC 단백질은 1일 및 1주에 증가하였으나, 3주에 감소를 보였다. 그러나 IV 생물반응기와 피하 그룹은 1일에 상대적으로 낮은 수치를 보였으며, 1주와 3주에는 발현이 없었다.

CD80의 단백질은 1일 및 1주에는 발현이 없었지만 모든 그룹에서 3주에 증가하였다. 그러나 IV 생물반응기에서는 생체 외 및 피하 그룹 보다 유의하게 낮게 나타났다.

또한, CD86의 단백질 패턴은 CD80의 단백질 패턴과 유사하게 나타났다. CD86의 단백질은 1일 및 1주에 발현이 없었으나, 생체 외 및 피하 그룹에서는 3주에 증가하였다. 그러나 IV 생물반응기에서는 1일, 1주, 3주 시점 모두에서 아무런 발현이 이루어지지 않았다.

이러한 결과로, IV 생물반응기는 FCPC 펠릿의 연골 형성 표현형을 더 잘 유지시킬 뿐만 아니라 생체 외(in vitro) 및 피하 그룹과 비교하여 더 긴 시간에서 면역원성을 감소시킬 수 있음을 알아냈다.

< 실험예 9> 생체 내 연골 회복에 대한 이소성 인공 연골의 육안 및 조직학적 분석

생체 외, 피하 및 IV 생물반응기에서 배양된 펠릿인 이소성 인공 연골을 적용하여 토끼 모델의 연골 결손을 치료하였다. 생체 내 실험을 통해 감염, 상처 벌어짐, 장애 및 사망은 발생하지 않았다.

그 결과, 새로운 조직이 서서히 형성되어 4주에서 12주까지 결손을 채울 수 있음을 확인하였다(도 10A). 대조군에서는 섬유 모양의 조직이 4주에서 12주 사이에 서서히 형성되었으나, 12주에도 결손 부분의 중심부는 여전히 오목하게 패어 있었다. 생체 외, 피하 및 IV 생물반응기 그룹에서는 반투명 조직이 4 ~ 12주에 점차적으로 결손 부분에 채워졌으나, 8주와 12주에 신연골과 원생 연골 사이의 유사성은 IV 생물반응기 그룹이 피하 및 생체 외 그룹 보다 우수하였다.

구체적으로, IV 생물반응기 그룹은 12주 후에 주위의 원생 연골과 유사한 연골 조직으로 완전히 덮여 있었다. 그러나 피하 및 생체 외 실험 그룹의 경우, 원생 연골과 신연골 사이의 차이는 분명하게 확인되었다.

또한, safranin-O 염색을 사용한 조직학적 검사 결과를 도 10B에 나타냈다. 대조군에서는 결손 부분에 섬유 모양의 조직이 형성되었고, 새로 형성된 조직과 인접한 원생 연골 사이의 차이는 4주에서 12주 사이에 명백하게 확인할 수 있었다. 신연골의 두께는 인접한 원생 연골과 유사하며, 염색 강도는 IV 생물반응기, 피하 및 생체 외 그룹에서 4 ~ 12주에 걸쳐 서서히 증가하였다. IV 생물반응기와 생체 외 실험 그룹에서 표면의 신연골은 서서히 평활해졌으며, 연골의 치밀도 및 분포도도 원생 연골과 유사해지고, 인접한 원생 연골과의 차이 없이 완전하게 되었다. 이러한 특징은 12주에 IV 생물반응기 그룹이 생체 외 그룹보다 나아짐을 확인하였으나, 피하 그룹에서는 신연골 표면이 평활해지지 않고, 염색 강도와 연골의 밀도도 낮았으며, 인접한 원생 연골과의 차이가 있었다. 또한, 상기 safranin-O 염색 검사 결과와 일치하게 4주, 6주, 12주 시점에서 IV 생물반응기, 피하 및 생체 외 실험 그룹 사이의 O'Driscoll 점수에도 통계적으로 유의한 차이가 있음을 확인하였다.

< 실험예 10> 생체 내 연골 회복에 대한 이소성 인공 연골의 면역조직화학적 분석

Ⅱ형 및 Ⅹ형 콜라겐의 IHC 염색을 수행하여 이식된 이소성 인공 연골의 표현형(phenotype)을 확인하고, 새로 형성된 조직의 조성을 평가하였다 (도 11).

도 11에서 볼 수 있듯이 IV 생물반응기와 생체 외 실험 그룹의 Ⅱ형 콜라겐 염색은 피하 및 대조군보다 강하고 균일하게 나타났으며, Ⅹ형 염색은 같은 시점에서 약하게 나타났다. 이것은 IV 생물반응기 그룹의 신연골이 유리질 연골에 가깝다는 것을 시사한다.

이러한 결과로, IV 생물반응기는 이소성 인공 연골이 생체 내 연골 회복 동안 더 좋은 연골 형성 표현형을 유지하는 데에 도움을 줄 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 11> 활막( synovium )의 조직학적 분석

피하 및 대조군에서 활막의 H & E 염색은 4주 후, 활막 세포층의 확대, 염증 세포 침윤 및 세포질의 증가를 나타냈지만 시간이 지남에 따라 점차 감소하였다 (도 12). IV 생물반응기 및 생체 외 실험 그룹의 활막은 4주, 8주, 12주의 각 시점에서 기본적으로 정상이었다. 또한, Krenn's 활막염 점수는 4주 및 8주에 IV 생물반응기 그룹과 피하 그룹간에 통계적으로 차이가 있음을 확인하였으며, 이는 12주에도 똑같이 나타났다.

이러한 결과로, IV 생물반응기는 이소성 인공 연골이 생체 내 연골 회복시 더 좋은 연골 형성 표현형을 유지시킬 뿐만 아니라 활막염을 감소시키는 데에도 도움이 된다는 것을 확인하였다.

Claims

실리콘 튜브; 및
상기 실리콘 튜브의 상, 하부에 셀룰로오스 멤브레인(membrane)을 포함하며,
상기 셀룰로오스 멤브레인은,
셀룰로오스를 110 내지 130℃에서 54-60wt% 브롬화리튬(lithium bromide) 수용액에 용해시켜 셀룰로오스 용액을 제조하는 단계; 및
상기 셀룰로오스 용액을 냉각시키고, 물로 염을 제거하여 셀룰로오스 멤브레인을 수득하는 단계;
를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 생물반응기로서,
상기 셀룰로오스 멤브레인의 평균 기공 크기는 50 내지 400nm인 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 생물반응기.
삭제
제 1항에 있어서,
세포는 인간 태아 연골 전구 세포(human fetal cartilage progenitor cell, hFCPC)인 것을 특징으로 하는, 세포 배양용 생물반응기.
삭제
인간으로부터 분리된 세포를 원심분리하여 펠릿(pellet)으로 제조하는 단계;
인간을 제외한 개체 내에 제 1항에 따른 생물반응기를 삽입하는 단계; 및
상기 생물반응기에 펠릿을 넣어 배양시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 연골세포 배양 방법으로서,
상기 생물반응기는 실리콘 튜브; 및 상기 실리콘 튜브의 상, 하부에 셀룰로오스 멤브레인(membrane)을 포함하고,
상기 셀룰로오스 멤브레인의 평균 기공 크기는 50 내지 400nm인 것을 특징으로 하는, 연골세포 배양 방법.
삭제
삭제
제 5항에 있어서,
세포는 인간 태아 연골 전구 세포(human fetal cartilage progenitor cell, hFCPC)인 것을 특징으로 하는, 연골세포 배양 방법.
삭제
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