KR101718669B1

KR101718669B1 - 연골결손 치료용 조성물 및 인공연골 제조방법

Info

Publication number: KR101718669B1
Application number: KR1020160172696A
Authority: KR
Inventors: 민병현; 최병현; 오현주; 박소라; 김영직
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2017-03-21
Also published as: KR20160148499A

Abstract

본 발명은 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질(extracellular matrix)를 유효성분으로 포함하고, 젤 형태(gel type)인 인공연골 및 상기 인공연골을 유효성분으로 함유하는 연골결손 치료용 조성물에 대한 것으로, 특히 본 발명에서 개시하는 인공연골조직은 인위적인 지지체를 사용하지 않고도 직경 5mm 이상의 큰 크기의 3차원 조직을 제작할 수 있으며, 성숙한 연골조직의 표현형을 가지면서도 물리적 특성이 딱딱하지 않고 유연성과 탄성을 가지고 있기 때문에 연골결손의 크기와 모양에 관계없이 쉽게 이식이 가능하며 숙주조직과의 결합력이 우수하여 연골재생 효능이 뛰어난 장점을 가지고 있다.

Description

연골결손 치료용 조성물 및 인공연골 제조방법{Composition for treatment of cartilage damage and method for preparation of artificial cartilage}

본 발명은 사람 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질(extracellular matrix)을 유효성분으로 포함하고, 젤 형태(gel type)인 인공연골 및 상기 인공연골을 유효성분으로 함유하는 연골결손 치료용 조성물에 관한 것이다.

연골은 단일세포인 연골세포와 세포외기질만으로 이루어진 조직이다. 연골조직은 혈관과 신경이 없어 손상을 받으면 치유되기 어렵다는 단점이 있다. 또한 연골세포는 단단한 세포외기질로 둘러 싸여 있기 때문에 한번 손상 받거나 퇴화되면 재생되기 어려운 문제점을 가지고 있다.

손상된 연골조직을 치료하기 위해 정형외과에서 다양한 임상학적 수술 방법이 시행되고 있다. 대표적인 방법으로는 골수자극술(Bone marrow stimulation)과 골연골조직이식술(Osteochondral graft)이 있다. 골수자극술은 손상된 연골의 하골(subchondral bone)을 노출시켜, 골수로부터 유도된 줄기세포를 포함하는 혈병(blood clot)으로 연골손상을 메우는 방법으로 비교적 수술이 간편하다는 장점이 있지만 수술 후 초자연골이 아닌 섬유연골로 재생이 된다는 단점이 있다. 골연골조직이식술은 환자 자신의 연골조직에서 체중을 덜 받는 부위의 골-연골 결합조직을 채취한 다음 이를 연골손상 부위에 이식치료 하는 방법으로 손상부위가 클 경우 사용할 수 없는 단점이 있다.

이러한 수술치료 기술의 단점을 극복하기 위해 외부에서 치료세포를 공급하는 세포치료제가 많이 연구되고 있다. 가장 먼저 제품화된 기술은 자가연골세포이식술(Autologous Chondrocytes Implantation, ACI)로서 환자 자신의 연골조직에서 체중을 덜 받는 건강한 부위를 조금 떼어내어 연골세포를 분리하고 체외 배양한 후 손상 부위에 다시 주입하는 기법인데, 많은 비용과 두 번의 수술로 인한 번거로움과 건강한 부위의 연골이 손상을 입는 단점 때문에 현재 많이 사용되지 않고 있다. 최근에는 제대혈 유래 중간엽줄기세포를 배양하여 손상된 연골부위에 이식치료 하는 기술이 제품화되었다. 제대혈 외에도 골수 또는 지방조직에서 중간엽줄기세포를 분리 배양하여 연골손상을 치료하는 기술이 활발히 연구되고 있으나, 주입된 중간엽줄기세포의 연골세포 분화 및 연골조직 형성 효율이 낮아 높은 치료 효과를 기대하기는 어려운 상황이다. 결론적으로, 연골세포 또는 줄기세포를 연골손상 부위에 주입하는 세포치료제는 세포가 조직에 부착되기 전에 흩어져 유실되기 쉽고 자발적인 연골조직 형성 능력이 낮아 손상된 연골조직의 재생효과가 높지 않다.

연골재생을 위한 세포치료제의 단점을 극복하고자 다양한 형태의 생체소재(biomaterials)를 지지체(scaffolds)로 이용하여 세포를 전달하는 기술이 사용되고 있으며, 나아가 체외(in vitro)에서 3차원 구조의 인공연골조직(Tissue engineered cartilage)을 제작하는 기술이 개발되고 있다. 현재 사용되는 지지체는 스폰지, 겔, 섬유 및 미세구슬(microbead) 등 다양한 형태를 가지고 있으며, 주로 천연 또는 합성 생체소재를 이용하여 제조된다. 하지만 지지체를 이용하여 치료세포를 연골손상에 단순 전달하거나 체외에서 인공연골조직을 제작하여 이식치료 하는 경우 연골재생의 효율이 낮아 실제 임상 치료에 사용하기 어렵다는 문제점이 있다. 이러한 문제는 여러 가지 원인에서 발생하는데, 많은 경우 지지체에 대한 세포 부착 효율이 낮고, 이식된 지지체가 체내에서 분해되는 과정에서 세포 독성을 유발하는 문제가 있으며, 지지체의 기능성이 낮아 연골분화가 잘 일어나지 않기 때문이다. 특히, 수화젤(hydrogel) 형태의 지지체는 산소와 영양분의 공급이 원활하지 못하여 세포의 생존율과 연골분화가 떨어지는 단점이 있고, 막(membrane)형 지지체는 3차원의 연골조직을 형성하지 못하며, 3차원 스폰지(sponge) 또는 메쉬(mesh) 형태의 지지체를 사용하는 경우 제작된 인공연골이 원래 조직(host tissue)와의 결합력이 낮아 연골재생 잘 안 되는 단점이 있다. 뿐만 아니라, 지지체를 이용한 제품의 상용화를 위해서는 별도의 생산공정이 필요하며 공정에 대한 인허가 등 시간과 비용이 많이 드는 문제점이 있다.

반면 현재 지지체를 사용하지 않고 인공연골조직을 제작하는 기술도 개발되고 있다. 예를 들어, 세포를 높은 농도로 배양접시에 접종 한 후 외부자극(bioreactor)을 주어 인공연골을 만드는 방법, 우태아혈청 및 성장인자를 배양배지에 첨가하여 세포의 증식과 분화능을 높여 만드는 방법 및 여러 세포를 원심분리를 이용하여 펠릿 형태로 제작하는 방법 등이 보고되어 있다. 하지만 이러한 기술들은 대부분 두께가 수십 micrometer (um) 정도인 얇은 막(membrane) 형태 또는 직경 1 mm 정도의 작은 펠릿 형태의 조직만 제작이 가능하며, 실제 연골손상에 대한 이식치료제로 사용 가능한 수준의 큰 연골조직을 제작하기 어렵다는 단점이 있다.

결론적으로, 사람의 연골세포는 동물 유래 연골세포에 비해 증식능력과 분화능력이 낮아서 지지체 없이 직경 5 mm 이상의 큰 크기의 3차원 연골조직을 제작하기 어렵다. 또한, 수화젤(hydrogel)의 경우 체외에서 금방 굳기 때문에 세포를 단순 전달하여 주입하는 용도로만 사용 가능하며, 3차원 지지체를 사용하여 제작된 인공연골조직은 체외에서 물성이 딱딱하게 (rigid) 변하기 때문에 손상된 연골조직에 이식할 경우 주변조직과의 결합 (integration)이 잘 되지 않는 단점이 있다. 따라서, 사람의 연골세포 또는 줄기세포를 사용하여 인위적인 지지체를 사용하지 않고 연골손상 환자의 이식 치료에 사용 가능한 수준의 우수한 성질과 큰 크기를 동시에 가지는 인공연골조직을 제작하는 기술은 지금까지 보고된 바가 없다.

대한민국 특허공개공보 제10-2011-0134137호 (2011.12.14)

본 발명의 목적은 사람 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질(extracellular matrix)를 유효성분으로 포함하고, 젤 형태(gel type)인 인공연골 및 상기 인공연골을 유효성분으로 함유하는 연골결손 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 사람 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질(extracellular matrix)을 유효성분으로 함유하고, 압축강도 0.1 내지 30kPa의 젤 형태(gel type)인 것을 특징으로 하는 인공연골을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인공연골을 유효성분으로 함유하는 연골결손 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 사람 태아연골조직에서 연골전구세포를 분리하여 배양하는 단계를 포함하는 인공연골 제조방법을 제공한다.

본 발명은 연골결손 치료용 조성물 및 인공연골 제조방법에 대한 것으로, 특히 본 발명에서 개시하는 인공연골조직은 인위적인 지지체를 사용하지 않고도 직경 5mm 이상의 큰 크기의 3차원 조직을 제작할 수 있으며, 성숙한 연골조직의 표현형을 가지면서도 오랜기간 동안 물리적 특성이 딱딱하지 않고 유연성과 탄성을 유지하기 때문에 연골결손의 크기와 모양에 관계없이 쉽게 이식이 가능하며 숙주조직과의 결합력이 우수하여 연골재생 효능이 뛰어난 장점을 가지고 있다. 이러한 연골은 성숙된 실제 연골에 비해 강도는 낮지만 체내(in vivo)에 이식 시 성숙(maturation)을 통해서 실제 연골과 유사한 강도를 가질 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 제작된 인공연골조직의 외관 사진을 나타낸다. 1 눈금은 1 mm를 나타낸다.
도 2는 인공연골조직을 체외에서 1주, 2주, 3주 동안 배양하여 제작한 다음 조직절편을 만들어서 사프라닌-O(Safranin-O) 염색 및 헤마톡실린 & 에오신(Hematoxylin & Eosin) 염색한 사진을 나타낸다.
도 3은 체외에서 1주, 2주, 3주 동안 배양하여 제작한 인공연골조직의 글리코산아미노글리칸(GAG)의 양을 측정한 결과를 나타낸다. 별표(*)는 통계학적 유의성을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따라 제작된 인공연골조직의 연골 성분 함량을 나타낸다. (수분함유량, cell, GAG, collagen)
도 5는 제작한 인공연골을 체외에서 2주 동안 배양한 후 점착성을 시험한 결과로써 수술 후 폐기되는 성인 연골조직을 이용하여 전층연골손상(chondral defect) 모델과 부분층연골손상(partial defect) 모델을 제작하였다.
도 6은 제작한 인공연골조직의 도포성 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 배지조성에 따른 인공연골조직의 형성정도를 확인한 결과이다. 배지 1: 연골분화배지, 배지 2: 우태아혈청을 포함한 분화배지. 연골분화배지에서는 전반적으로 연골형성, 우태아혈청을 포함한 분화배지에서는 인공연골조직의 표면에만 연골의 성분인 GAG가 남아있고 가운데 부분은 세포가 죽는 것을 확인할 수 있다.
도 8은 사람 영아연골세포와 사람 태아연골조직 유래 연골전구세포를 이용한 인공연골조직 제작 후 in vitro에서 배양한 인공연골조직과 누드마우스 피하에 이식 후 결과, 정상연골조직 결과를 비교하여 강도 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 사람 영아연골세포와 사람 태아연골조직 유래 연골전구세포를 이용하여 인공연골조직을 제작하여 단백당의 양을 육안으로 확인하기 위한 염색으로 조직학적 염색(Safranin O)을 시행하였다. 인공연골형성 정도를 비교하기 위한 염색으로 사람 영아연골세포 인공연골조직의 경우 조직 바깥쪽에만 단백당이 발현되지만, 사람 태아연골전구세포 인공연골조직의 경우 조직 전반적으로 단백당이 고르게 분포되어 있는 것을 확인하였다.
도 10은 형광발현인자 PKH-26을 인공연골조직에 표지하여 손상된 연골부위에 이식하여 일주일 후 형광발현정도와 부착을 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명에 따라 제작된 인공연골조직을 토끼 무릎 연골손상 모델에 이식하여 6주 후 연골손상의 재생에 대한 조직학적 분석 결과를 나타낸다.

본 발명은 사람 태아연골조직 유래 연골전구세포를 이용하여 세포와 세포가 분비한 세포외기질 만으로 구성된 3차원의 인공연골조직에 대한 것이다. 특히 본 발명에서 개시하는 인공연골조직은 인위적인 지지체를 사용하지 않고도 직경 5mm 이상의 큰 크기의 3차원 조직을 제작할 수 있으며, 성숙한 연골조직의 표현형을 가지면서도 물리적 특성이 딱딱하지 않고 유연성과 탄성을 가지고 있기 때문에 연골결손의 크기와 모양에 관계없이 쉽게 이식이 가능하며 숙주조직과의 결합력이 우수하여 연골재생 효능이 뛰어난 장점을 가지고 있다.

본 발명은 사람 태아연골조직 유래 세포 및 태아연골조직 유래 세포외기질(extracellular matrix)을 유효성분으로 함유하고, 압축강도 0.1 내지 30 kPa의 젤 형태(gel type)인 것을 특징으로 하는 인공연골을 제공한다. 상세하게는, 상기 태아연골조직유래 세포는 연골전구세포일 수 있다.

바람직하게는, 상기 젤 형태가 25 내지 37℃에서 24시간 이상, 더욱 바람직하게는 24시간 이상 1년 이하 동안 유지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 인공연골은 직경 1　mm 내지 15 mm이며, 높이 1 mm 내지 15 mm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 인공연골조직 구조물은 인위적인 지지체를 사용하지 않고도 직경 5mm 이상의 큰 크기의 3차원 조직을 제작할 수 있으며, 성숙한 연골조직의 표현형을 가지면서도 물리적 특성이 딱딱하지 않고 유연성과 탄성을 가지고 있기 때문에 연골결손의 크기와 모양에 관계없이 쉽게 이식이 가능하며 숙주조직과의 결합력이 우수하여 연골재생 효능이 뛰어나다.

본 명세서에서 “연골결손”은 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해된 연골 손상을 말한다. 이러한 연골손상으로 인한 질환에는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 연골결손 치료용 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 관절내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드(scaffold)와 함께 이식될 수도 있으며, 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 투여하는 세포수를 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 사람 태아연골조직에서 연골전구세포를 분리하여 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 연골전구세포로부터 세포외기질과 결합된 세포막을 수득하는 단계; (3) 상기 수득된 세포막을 연골분화배지에서 원심분리하여 세포 펠릿을 얻는 단계; 및 (4) 상기 얻은 세포 펠릿을 상기 연골분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인공연골 제조방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 연골분화배지는 1% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic), 1.0 mg/mL 인슐린(insulin), 0.55 mg/mL 인간 트랜스페린(human transferrin), 0.5 mg/mL 소듐 셀레나이트(sodium selenite), 50 ㎍/mL 아스코르빈산(Ascorbic acid), 1.25 mg/mL 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 40 ㎍/mL 프롤린(proline) 및 10 ng/ml TGF-β가 함유된 둘베코 개량 이글 배지-고농도 글루코스(Dulbecco's Modified Egle Medium-High Glucose; DMEM-HG)일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 인공연골은 직경 1　mm 내지 15 mm이며, 높이 1 mm 내지 15 mm이고, 젤 형태(gel type)로서 상기 젤 형태가 25 내지 37℃에서 24시간 이상, 더욱 바람직하게는 24시간 이상 1년 이하 동안 유지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1 > 사람 태아연골조직 유래 연골전구세포의 분리 및 배양

12~15주 된 태아의 무릎관절로부터 분리하였다. PBS(phosphated buffered saline)로 세척한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 0.2%(w/v) 콜라게나제(collagenase, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ)를 DMEM(Dulbecco's Modified Egle Medium, Gibco, Grand Island, NY)에서 4시간 배양 하였다. 연골조직이 완전히 소화되어 방출된 연골세포를 1700rpm에서 10분 동안 원심분리한 다음, 침전된 연골전구세포를 조직 배양접시(배양접시당 1X10⁶의 밀도에 150mm(dia.)X20mm(h))에 접종하였다.

< 실시예 2 > 3차원 인공연골조직의 제작

실시예 1에서 분리한 연골전구세포(chondrocytes)와 영아연골세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 50 units/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에 2x10⁵ cells로 희석한 다음 15~18일 동안 단층 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 0.05% 트립신-EDTA (Gibco)를 첨가하여 세포외기질과 결합된 세포막을 수득하였다. 수득한 세포막을 연골분화 배지 [둘베코 개량 이글 배지-고농도 글루코스(Dulbecco's Modified Egle Medium-High Glucose; DMEM-HG), 1% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic), 1.0 mg/mL 인슐린(insulin), 0.55 mg/mL 인간 트랜스페린(human transferrin), 0.5 mg/mL 소듐 셀레나이트(sodium selenite), 50 ㎍/mL 아스코르빈산(Ascorbic acid), 1.25 mg/mL 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 40 ㎍/mL 프롤린(proline), 10 ng/ml TGF-β)]가 포함된 50 ml 튜브에 넣고 250xg에서 20분 동안 원심분리하여 펠릿 형태의 구조체를 제작하였다. 제작된 세포 펠릿을 연골분화 배지가 담긴 배양접시에 넣고 37℃, 5% 이산화탄소가 있는 인큐베이터에서 2~3주 동안 배양하여 인공연골 조직을 제작하였다. 제작한 인공연골조직의 크기는 직경 6mm, 높이 3.5mm이다(도 1).

< 실시예 3 > 인공연골조직의 세포양 (DNA) 분석

상기 실시예 2에서 제조한 3차원 인공연골조직의 DNA를 측정하기 위해 각 1, 2, 3주 동안 배양한 인공연골조직을 수거하여 PBS(phosphated buffered saline)로 2회 세척하였다. 세포막을 용해시키는 Triton X-100이 포함된 1x Lysis buffer를 조직당 1mL 넣고 각각 시료의 상층액을 10㎕ 씩 96 well 플레이트에 분주하였다. 여기에 반응시약으로 0.5㎍/mL 농도의 Hoechst 33258(Sigma, D-1302, USA)을 넣어 반응시킨 후, micro plate reader(TECAN)로 450 nm 파장에서 측정하였다.

< 실시예 4 > 총 글리코스아미노글리칸(GAG) 내용물의 생화학적 분석

상기 실시예 2에서 제조한 3차원 인공연골조직의 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycan, GAG)와 교원질 (collagen) 조성물의 양을 측정하기 위해, 상기 인공연골조직을 60℃ 파파인 용액(5 mM L-시스테인, 100 mM Na₂HPO₄, 5mM EDTA, 파파인 타입 Ⅲ 125 ㎍/mL, pH 7.5)에서 24시간 동안 분해한 후, 12,000×g, 10분 동안 원심분리 하였다.

원심분리한 상층액의 글리코스아미노글리칸(GAG)양을 측정하기 위해 DMB(dimethylmethylene-blue) 비색분석법(colorimetric assay, Heide, T.R. and Gernot, J.,Histochem. Cell Biol., 112:271, 1999)을 수행하였다. ELISA Reader (BIO-TEK, Instruments, INC., 미국)를 사용하여 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 생화학적으로 분석된 전체 GAG 내용물은 천연연골조직의 GAG의 양은 62.8±5.1㎍/㎎ (건조중량) (Koji Kojima., et al. Biotech. Appl. Biochem., 39:257, 2004)이며, 각각 1주는 16.76±2.8 ㎍/㎎ (건조중량), 2주는 35.87±5.1 ㎍/㎎ (건조중량), 3주는 48.98±8.0㎍/㎎ (건조중량)로 배양할수록 천연연골조직과 유사함을 확인하였다(도 3 및 도 4).

< 실시예 5 > 기계적 특성 측정

Universal Testing Machine (Model H5K-T, H.T.E, 영국)을 사용하여 상기 실시예 3에서 제조한 인공연골조직의 기계적 압축강도를 측정하였다. 측정하기 전, 시료(n=6)의 크기와 높이를 각각 사진촬영 후 이미지 제이(image J) 프로그램을 이용하여 시료의 볼륨을 동일하게 제어하였다. 압축강도는 1 mm/min 속도로 눌렀다.

천연연골조직의 강도는 299.1±19.3 KPa인데 비해 사람 태아연골조직 유래 연골전구세포를 이용해 만든 인공연골조직은 각각 1주 5.9±1.6 KPa, 2주 4.8±2.8 KPa, 3주 7.6±0.9 KPa로 정상연골에 비해 강도가 현저히 떨어지는 것을 확인하였다. 사람 영아연골세포를 이용해 만든 인공연골조직의 경우 3주 배양했을 경우 압축강도가 33.5±4.19 KPa이며 누드마우스 피하에 이식 후 압축강도는 206.2±16.5 KPa로 정상연골과 유사한 강도를 나타내었다.

제작한 인공연골을 체외에서 2주 동안 배양한 후 점착성을 시험한 결과로써 수술 후 폐기되는 성인 연골조직을 이용하여 전층연골손상(chondral defect) 모델과 부분층연골손상(partial defect) 모델을 제작하였다. 연골손상부위 표면에 인공연골젤을 이식하여 3N, 1.3mm/min으로 측정하는 것을 부착성이라 정의하였을 때 전층연골손상의 경우 525 N/m², 부분층연골손상의 경우 332N/m² 로 나타내었다(도 5).

< 실시예 6 > 조직학적 분석

본 발명에 따른 인공연골조직을 체외(in vitro)에서 배양한 후 4% 포르말린으로 고정시킨 다음, 파라핀에 포매하여 4 ㎛ 두께로 절단한 후, 축적된 황산화된 프로테오글리칸 검출을 위해 횡단면을 사프라닌(Safranin) O와 헤마톡실린에오신(H&E)로 염색하였다. 체외(in vitro) 배양된 무지지체 인공연골 조직의 사진으로, 1, 2 및 3주(W) 동안 체외(in vitro)에서 배양하였을 때, 전체 배양기간 동안 새로운 연골조직의 실질적인 크기(size)가 커지는 것을 확인하였다(도 2). 육안적 검사를 한 결과, 조직의 성숙은 시간에 따라 개선되었다.

< 실시예 7 > 형광발현인자 PKH -26 표지한 인공연골조직의 체내 부착확인

일반적으로 사용되는 형광발현인자로 세포표면에 표지되는 빨간색 형광발현인자인 PKH-26을 세포에 부착하여 체외배양 및 체내에서 발현되는지를 확인하였다. 형광발현인자 PKH-26을 표지한 세포로 인공연골조직을 제작하여 체외 일주일 배양 후 발현정도를 확인하였다.

형광발현을 확인한 인공연골조직을 토끼의 부분연골손상 모델에 이식하였다. 이식 후 일주일 뒤 이식한 부위의 토끼무릎을 분리하여 동결절편기를 이용하여 4 ㎛ 두께로 절편 후 슬라이드를 제작하였다. 광학현미경과 형광현미경을 사용하여 부분연골손상 부위에 인공연골조직이 남아있으며 부착되어 있는지 확인할 수 있었다(도 10).

< 실시예 8 > 동물모델에 이식(토끼모델)

본 발명에 따른 인공연골조직을 토끼의 손상된 무릎에 이식하여 연골의 재생 정도를 관찰하였다. 토끼의 손상된 연골의 자연치유에 비해 제작한 인공연골조직을 이식하여 6주 후 관찰한 결과 정상연골과 유사하게 재생되는 것을 확인하였다(도 11).

Claims

사람 태아연골조직 유래 연골전구세포 및 상기 연골전구세포 유래 세포외기질(extracellular matrix)로 이루어진 인공연골로서, 상기 인공연골의 압축강도가 2.0 kPa 이상 8.5 kPa 이하의 젤 형태(gel type)이며, 직경 5　mm 내지 15 mm인 것을 특징으로 하는 인공연골.
제1항에 있어서, 상기 젤 형태가 25 내지 37℃에서 24 시간 이상 1년 이하 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 인공연골.
제1항에 있어서, 상기 인공연골은 높이 1 mm 내지 15 mm인 것을 특징으로 하는 인공연골.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인공연골을 유효성분으로 함유하는 연골결손 치료용 조성물.
(1) 사람 태아연골조직으로부터 분리된 연골전구세포를 배양하는 단계;
(2) 상기 배양된 연골전구세포로부터 세포외기질과 결합된 세포막을 수득하는 단계;
(3) 상기 수득된 세포막을 연골분화배지에서 원심분리하여 세포 펠릿을 얻는 단계; 및
(4) 상기 얻은 세포 펠릿을 상기 연골분화배지에서 배양하여 인공연골을 제조하는 단계를 포함하는 제1항에 따른 인공연골 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 연골분화배지는 1% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic), 1.0 mg/mL 인슐린(insulin), 0.55 mg/mL 인간 트랜스페린(human transferrin), 0.5 mg/mL 소듐 셀레나이트(sodium selenite), 50 ㎍/mL 아스코르빈산(Ascorbic acid), 1.25 mg/mL 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 40 ㎍/mL 프롤린(proline) 및 10 ng/ml TGF-β가 함유된 둘베코 개량 이글 배지-고농도 글루코스(Dulbecco's Modified Egle Medium-High Glucose; DMEM-HG)인 것을 특징으로 하는 인공연골 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 인공연골은 높이 1 mm 내지 15 mm이고, 젤 형태(gel type)로서 상기 젤 형태가 25 내지 37℃에서 24 시간 이상 1년 이하 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 인공연골 제조방법.