KR102586164B1

KR102586164B1 - 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102586164B1
Application number: KR1020200036318A
Authority: KR
Inventors: 민병현
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2023-10-10
Also published as: KR20200115293A

Abstract

본 발명은 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 줄기세포 및 줄기세포 유래 세포외기질을 이용하여 젤 형상 또는 시트 형상의 조직 유합용 조성물을 제조하였으며, 상기 조성물은 생체 조직에 우수한 접착성 및 결합력을 가지며, 이식 후 연골, 뼈, 각막, 성장판 등으로 분화가 가능한 것을 확인한 바, 손상 조직 또는 장기 재생 치료를 위한 접착제 및 분화제로 사용하여 궁극적으로 조직 유합제로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 및 이의 제조방법{Composition for tissue integration possessing tissue adhesive and differentiation property, and manufacturing method thereof}

본 발명은 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

1998년 미국 FDA에서 피브린 실란트(fibrin sealant)가 허가되면서, 매년 새로운 조직 접착제들이 끊임없이 개발되고 있다. 이러한 조직 접착제는 종래 외과적 또는 내과적 수술에서 사용되고 있는 봉합술, 클립술, 뜸술과 같은 기술을 대체할 수 있는 소재로 각광 받고 있다.

봉합술 등과 같은 종래 외과적 기술은 강한 신장력(strong tensile strength)을 가지지만 환자의 고통 유발 및 시술 후 제거 등의 단점을 가지며, 반면, 조직 접착제는 빠른 접착 시간, 간편한 사용, 시술 후 제거 불필요 등의 장점을 가지고 있으나 낮은 접착성 및 신장력과 수분이 존재하는 경우 접착성이 현저히 떨어지는 한계가 있었다. 이에, 상기와 같은 조직 접착제의 한계점을 극복하기 위한 연구가 지속되고 있다.

의료용 조직 접착제는 조직에 직접 접촉하므로 생체 적합성이 요구되며, 통상적으로 생체 내에서 사용되기 때문에 접착제가 체액과 혈액 중으로 흘러 들어가는 경우를 대비하여 보다 엄격한 조건으로 인체에 독성과 위해성이 없어야 하고 생분해성 소재여야 한다.

현재 상용화 및/또는 실용화되고 있는 조직 접착제는 크게 시아노아크릴레이트 접착제, 피브린 접착제, 젤라틴 접착제, 폴리우레탄계 접착제 등이 있다. 시아노아크릴레이트 접착제는 최근 고기능성 및 고성능을 갖는 순간 접착제 연구에 각광 받고 있다. 상기 시아노아크릴레이트 계열 조직 접착제는 단일물질로 짧은 시간에 실온에서 개시제 없이 수분에 의해서 경화되고 외관이 투명하며 접착 강도가 큰 장점이 있으나, 충격에 약하고 내열성이 떨어진다는 단점이 있다. 또한, 독성이 심해서 현재는 거의 사용되고 있지 않으며, 미국을 제외한 다른 국가에서 부분적으로 사용되고 있고 일부에서는 조직 독성과 취약성 때문에 사용이 제한되고 있다.

피브린 접착제는 접착 부위에 존재하는 수분에 영향 없이 빠르게 접착이 가능하고 혈소판과 응고 장해가 없으며 생체 적합성이 우수한 장점을 가지고 있다. 그러나, 접착력이 약하고 생분해속도가 빠르며 혈액 감염의 위험이 있다는 단점이 있다.

또한, 젤라틴 접착제는 조직 접착성은 높으나 가교제로 사용되는 포르말린이나 글루타알데하이드가 생체 내의 단백질과도 가교 반응을 일으켜 조직 독성을 일으킨다는 단점이 있으며, 폴리우레탄계 접착제는 생체 조직 표면의 물을 흡수하여 조직과의 밀착성을 높이고 물과 반응하여 수분 이내에 경화되며 생분해되는 장점을 가지고 있으나, 합성원료인 방향족 디아이소시아네이트가 생체 독성을 가진다는 단점이 있다.

한편 현재까지 개발된 접착제는 조직과 조직 사이 혹은 조직과 이식물 사이의 유합에 거의 기여를 하지 못하고 있다. 즉, 접착제에 의해 조직이 영구적으로 유하되지 않기 때문에 접착제의 생분해 이후에는 두 조직 혹은 이식물은 다시 떨어지게 된다. 이런 단점을 극복하기 위해, 외부에서 치료 세포를 공급하는 세포 치료제가 연구되고 있다. 즉, 조직과 조직 사이 혹은 조직과 이식물 사이에 세포를 주입함으로써 이식된 세포가 세포외기질을 분비하여 접착 물질을 부착하려는 시도이다. 그러나, 세포 치료제는 접착성이 전혀 없어 세포가 조직을 생성하는 동안 별도의 접착제 혹은 물질이 필요하다.

이상과 같이 조직 접착제는 두 조직 사이의 접착력이 필요하며, 아울러 두 조직을 영구히 부착하기 위해 목표로 하는 부착 조직의 세포로 분화하여 궁극적으로 세포외기질을 분비할 수 있는 세포 치료제의 기능을 하는 것이 이상적이다. 이와 같은 세포 탑재 조직 접착제는 신체의 많은 조직 손상의 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 근육의 파열, 인대의 손상, 뼈 부착, 연골 재생 등이 이에 해당된다. 따라서 조직 접착과 분화 세포를 탑재한 조직 접착제의 개발은 이식 치료에 있어서 획기적 진보를 가져올 것으로 전망된다.

대한민국 등록특허 제10-0775958호 (2007.11.06 등록)

본 발명의 목적은 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합제(tissue adhesive product; TAP) 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 및 줄기세포 유래 세포외기질을 유효성분으로 포함하는 조직 유합용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물로 둘 이상의 조직을 부착시켜 제조되는 이식용 조직을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 태아 연골조직으로부터 줄기세포를 분리하여 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 줄기세포 및 이의 세포외기질을 포함하는 세포막을 수득하는 단계; (c) 상기 수득된 세포막을 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 수득된 세포 펠렛을 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 조직 유합용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서는 줄기세포 및 줄기세포 유래 세포외기질을 이용하여 젤 형상 또는 시트 형상의 조직 유합용 조성물을 제조하였으며, 상기 조성물은 생체 조직에 우수한 접착성 및 결합력을 가지며, 이식 후 연골, 뼈, 각막, 성장판 등으로 분화가 가능한 것을 확인한 바, 손상 조직 또는 장기 재생 치료를 위한 접착제 및 분화제로 사용하여 궁극적으로 조직 유합제로 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 연골 조직 유합제 조성물(TAP)의 접착 강도를 확인한 결과이다.
도 2는 연골손상 모델에 형광발현인자 PKH-26이 표지된 TAP를 이식한 후 손상 부위에 부착 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 1주, 2주, 3주 배양되어 제조된 TAP의 사프라닌 O 염색 및 헤마톡실린&에오신 염색 결과이다.
도 4는 연골손상 모델에 TAP를 이식한 후 조직학적 분석을 통해 이식 후 연골손상의 재생을 확인한 결과이다.
도 5는 태아 연골조직 유래 줄기세포를 이용하여 각막세포로의 분화를 확인한 결과이다.
도 6은 TAP를 이용하여 시트 형태의 각막세포로의 분화를 확인한 결과이다.
도 7은 성장판 손상 모델 제작 및 TAP 이식 방법을 도시하여 나타낸 것이다.
도 8은 성장판 손상 모델에서 TAP에 의한 연골 조직 및 성장판 조직으로의 분화를 확인한 결과이다.
도 9는 성장판 손상 모델에서 TAP에 의한 콜라겐 및 당단백 형성을 확인한 결과이다.
도 10은 성장판 손상 모델에서 TAP에 의한 길이 성장 및 각변형 개선 효과를 확인한 결과이다.
도 11 내지 13은 성장판 손상 모델에서 TAP에 의한 연골조직의 형성을 확인한 결과이다.
도 14는 TAP에 의한 요추 추간판 재생을 확인한 결과이다.
도 15는 태아 연골 유래 줄기세포 시트의 배양 7일 후 세포 분화를 확인한 Gross image 이미지 결과이다.
도 16은 태아 연골 유래 줄기세포 시트의 배양 7일 후 근원세포로의 분화를 확인하기 위해 Myf5 및 MyoD의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯팅 분석 결과이다.
도 17은 태아 연골 유래 줄기세포 시트의 배양 7일 후 근원세포로의 분화를 확인하기 위해 면역세포화학(immunocytochemistry; ICC)을 수행하여 Myf5 및 MyoD의 발현을 확인한 결과이다.

본 발명은 줄기세포 및 줄기세포 유래 세포외기질을 유효성분으로 포함하는 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어 “줄기세포”는 태아 연골조직으로부터 분리된 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게 콜라게나제 등을 이용하여 연골조직을 완전히 소화시킨 후 분리된 연골 전구세포(fetal cartilage derived progenitor cell; FCPC)이다.

본 발명에서 사용된 용어 “줄기세포 유래 세포외기질(Extracellular Matrix)”은 태아 연골조직 유래 줄기세포로부터 세포에 의해 합성되고 세포 외로 분비, 축적된 분자로 구성되어 있는 생체 고분자의 집합체로 교원질, 탄력소 등의 섬유성 단백질, 글리코사미노글리칸 등의 복합 단백질, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 단백질 등을 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 “연골”은 초자연골(hyaline cartilage), 섬유연골 (fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)을 포함하며 특별히 제한되지 않는다. 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골 (meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 및 척추 연골 등 연골 부위에 제한 없이 포함한다.

상기 조성물은 각막, 상피, 성장판, 골, 연골, 인대, 근육 또는 피부 조직으로 분화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 조성물은 젤 형상 또는 시트 형상으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명에서 사용된 용어 “젤(gel)”은 젤리와 유사한 물질로서 부드럽고 약한 범위로부터 강하고 거친 범위까지의 물성을 가지며, 정상상태에서 흐름을 나타내지 않는 고체(solid)를 의미하며, 젤의 대부분 중량은 액체(liquid)이나 3차원 네트워크 구조로 인해 전체적으로는 고체와 같이 행동한다.

상기 조성물은 25 내지 40℃에서 20 내지 30시간 동안 유지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 사용된 용어 “이식(transplantation)”은 일반적으로 공여자의 세포, 조직 또는 장기 등을 수혜자의 손상 조직 또는 장기에 옮기는 과정을 의미하며, 본 발명에 있어서는 조직 유합용 조성물의 조직 결함, 손상, 결손 부위로의 적용을 의미한다. 이식은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어 외과적 수술로 수행될 수 있고, 환부에 직접 주사할 수 있다.

상기 (b) 단계의 세포막 수득은 세포의 분리 단계 없이 바닥에 부착된 세포와 함께 세포외기질을 모두 포함하여 수득하는 것일 수 있다.

상기 (d) 단계의 배양 기간에 따라 조성물의 압축강도, 부착력 및 도포성이 조절될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “도포성(퍼짐성)”은 물성 중 퍼지는 성질을 말하며, 환부 등에 바를 때 덩어리가 되지 않고 매끄럽게 전면에 퍼지는 성질을 말한다. 본 발명에 있어서 퍼짐성은 시료를 1 mm/분 속도로 1초 동한 5 N의 힘을 수직으로 시료에 주었을 때 시료의 단위 무게 당 퍼지는 정도를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 “부착성”은 물질에 다른 물질이 붙는 성질을 말하며, 환부 등에 바를 때 물질이 떨어지지 않고 붙어 있는 성질을 말한다. 본 발명에 있어서 부착성은 직경 5 mm의 지그와 환부에 물질을 접촉하여 부착시킨 후 1.3 mm/분의 속도로 끌어당기면서 지그와 환부에 부착된 물질이 떨어져 분리될 때까지의 저항력을 말한다.

또한, 본 발명은 줄기세포 및 줄기세포 유래 세포외기질을 유효성분으로 포함하는, 조직 접착 특성을 갖는 조직 유합용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 사용된 용어 “재생”은 일반적으로 생물체에는 몸의 일부 또는 그 기능을 상실하였을 때, 그 부분의 조직이나 기관을 다시 만들어 원래 상태로 복구시키거나 그 기능을 회복하려는 작용을 일컫는다. 이러한 재생능력은 체계가 간단하고 계통적으로 진화의 정도가 낮은 것일수록 강하다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 사람 태아 연골조직 유래 줄기세포의 분리 및 배양

12~15주된 태아(출처: 아주대학교병원 윤리위원회에서 승인한 IRB NO. AJIRB-CRO-07-139)의 무릎 관절로부터 연골조직 유래 줄기세포를 분리하였다. 간략하게, 무릎 관절로부터 분리된 연골조직을 인산완충식염수(phosphated buffered saline; PBS)로 세척한 후, 0.2%(w/v) 콜라게나제(collagenase, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ)가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Egle Medium, Gibco, Grand Island, NY) 배지를 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 연골조직이 완전히 소화되어 방출된 연골조직 유래 줄기세포를 1700 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 연골조직 유래 줄기세포(fetal cartilage derived progenitor cell; FCPC)를 수득하였으며, 조직 배양접시[150 mm(dia.) X 20 mm(h)]에 1 X 10⁶ 세포 밀도로 접종하였다.

실시예 2: 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 조직 유합용 조성물 제조(TAP)

상기 실시예 1에서 수득한 연골 줄기세포를 2 X 10⁵ 세포 밀도로 희석한 후, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 50 units/mL 페니실린 및 50 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 15~18일 동안 단층 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 0.05% 트립신-EDTA(Gibco)를 첨가하여 세포외기질과 결합된 세포막을 수득하였다. 세포 및 세포외기질이 결합된 세포막의 수득은 0.05% 트립신-EDTA 처리 후 세포들을 파이펫으로 분리하지 않고 세포 및 세포외기질을 포함하는 세포막 전체를 한 번에 수득하였다.

수득한 세포 및 세포외기질을 포함하는 세포막은 연골 분화배지[1% 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic), 1.0 mg/mL 인슐린(insulin), 0.55 mg/mL 인간 트랜스페린(human transferrin), 0.5 mg/mL 소듐 셀레나이트(sodium selenite), 50㎍/mL 아스코르빈산(Ascorbic acid), 1.25 mg/mL 우혈청알부민(bovine serum albumin; BSA), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 40 ㎍/mL 프롤린(proline) 및 10 ng/ml TGF-β가 첨가된 DMEM-HG]가 포함된 50 ml 튜브에 넣고 250 xg에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛 형태의 구조체를 제조하였다.

제조된 세포 펠렛을 배양접시에 넣고, 상기 조성과 동일한 연골 분화배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1주, 2주 및 3주 동안 배양하며 조직 유합용 조성물을 제조하였다.

실시예 3: 조직 유합용 조성물의 접착 강도 측정

상기 실시예 2에서 TAP의 접착 강도를 확인하기 위해 Universal Testing Machine (Model H5K-T, H.T.E, 영국)을 사용하여 피브린 접착제와 접착력을 비교하였다.

인공관절 수술 후 폐기되는 환자의 연골조직을 동의서와 함께 기증받았다. 환자의 연골조직 표면에 6 mm biopsy punch를 이용하여 연골손상 모델을 제작하고 제조된 TAP를 삽입하였다. 그 다음 직경 5 mm의 지그가 삽입된 TAP에 접촉하여 부착시킨 후 1.3 mm/분의 속도로 끌어당기면서 지그가 TAP와 분리될 때까지의 저항력을 측정하였다.

그 결과, 도 1을 참조하여 보면, 본 발명의 TAP의 접착 강도는 초기에 2.52 kPa로 피브린 접착제보다 약했으나, 3주 후 조직으로 분화가 진행되면서 34.47 kPa로 피브린 접착제 보다 월등히 우수한 접착 강도를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 4: 형광발현인자 PKH-26을 표지한 TAP의 체내 부착 확인

세포 표면에 표지되는 형광발현인자인 PKH-26을 TAP에 부착하여 체외 배양 및 체내에서 발현되는지 여부를 확인하였다. 형광발현인자 PKH-26을 표지한 TAP를 제작하여 in vitro에서 일주일 동안 배양 후 형광이 잘 발현되는 것을 확인한 다음, 토끼의 부분 연골손상 모델에 이식하였다. 이식 후 일주일 뒤, 이식 부위의 무릎을 분리하고 동결 절편기를 이용하여 4 ㎛ 두께로 절편 후 슬라이드를 제작하였다.

광학현미경 및 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과, 도 2와 같이, 부분 연골 손상 부위에 TAP가 남아있으며, 형광발현인자가 부착되어 있는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 TAP가 환부에 도포되어 부착될 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: 연골 조직으로의 분화 확인

상기 실시예 2의 세포 펠렛으로부터 TAP 제조 과정에서 1주가 지날 때마다, 4% 포르말린으로 고정시킨 다음, 파라핀에 포매하여 4 ㎛ 두께로 절단하고, 축적된 황산화된 프로테오글리칸 검출을 위해 횡단면을 사프라닌(Safranin) O와 헤마톡실린&에오신(H&E)으로 염색하였다.

그 결과, 도 3과 같이, 1주에서 3주로 시간이 지남에 따라 헤마톡실린&에오신 염색에서는 세포 간격이 넓어지며 세포 모양이 연골세포와 유사해지는 것을 확인하였으며, 사프라닌 O 염색에서는 3주에서 단백당의 양이 증가하고 연골에서 볼 수 있는 라쿠나(lacuna)가 형성되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 TAP를 토끼의 부분 연골손상 모델에 이식한 후, 이식 부위의 무릎을 분리하고 동결 절편기를 이용하여 4 ㎛ 두께로 절편 후 슬라이드를 제작한 후, 사프라닌 O 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 4와 같이, 이식 4주 후 공여자(donor) 연골과 수혜자(host) 연골 경계부와 연골과 뼈의 경계를 보면, 대조군에 비해 연골과 연골, 연골과 뼈의 병합(integration)이 우수한 것을 확인하였으며, 이식 8주 후에는 연골과 연골, 연골과 뼈의 병합이 거의 완전하게 이루어져 손상 부위가 거의 확인되지 않을 정도로 정상 조직과 유사하게 연골이 회복되는 것을 확인하였다.

실시예 6: 각막 상피 세포로의 분화 확인

6-1. 각막 상피 세포 분화

태아 연골 줄기세포(3 X 10⁵ 세포/cm²)는 2% KnockOut^TM Serum Replacement (KnockOut^TM SR, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 10 ng/ml 각질세포 성장인자(KGF, Wako Pure Chemical, Japan), 10 ng/ml 간세포 성장인자(HGF, Wako Pure Chemical, Japan), 20 ng/ml 상피 성장인자(EGF, Wako Pure Chemical, Japan), 0.5 μg/ml 하이드로코르티손(Sigma-Aldrich, St.Louis, USA), 5 μM 레티노산(Sigma-Aldrich, St.Louis, USA)이 포함된 저 글루코즈 DMEM 배지(HyClone, Logan, UT, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였으며, 배지는 2일마다 교체하였다.

6-2. 면역세포화학

세포는 4% 파라포름 알데히드로 20분간 고정시키고, 0.1% Triton X-100과 15분, 5% BSA와 1시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 1차 항체[anti-PAX6, anti-BCRP/ABCG2, anti-p63, anti-CK3/12(1:200 희석, Abcam, Cambridge, UK)]와 함께 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, PBS로 세척하고 2차 항체[goat anti-mouse IgG H & L 및 goat anti-rabbit IgG H & L(1:1000 희석, Alexa Fluor® 488, Abcam, Cambridge, UK)]와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 세포를 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 염색하여 핵을 시각화 하였으며, 형광 현미경(Mi8, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 세포를 관찰하였다.

6-3. FACS

세포(계대 5)는 각막 상피 줄기세포 마커와 각막 상피 분화 마커를 이용하여 분석하였다. 세포를 1차 항체[anti-CD34-FITC(BD Biosciences, San Jose, CA, USA), anti-CD105(BD Biosciences, San Jose, CA, USA), anti-PAX6, anti-BCRP/ABCG2, anti-p63, anti-CK3/12(1:500 희석, Abcam, Cambridge, UK)]와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBS로 세척하고 2차 항체[goat anti-mouse IgG H & L 및 goat anti-rabbit IgG H & L(1:1000 희석, Alexa Fluor® 488, Abcam, Cambridge, UK)]와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 염색된 세포는 유세포 분석법(Becton Dickinson FACSavantage)으로 분석하였다.

6-4. 웨스턴 블랏

세포를 수집한 후, 프로테아제 억제제(Rockland Immunochemicals, Pennsylvania, USA)가 첨가된 RIPA 완충액을 이용하여 4℃에서 30분 동안 반응시켜 세포를 용해하였다. 세포 용해물을 4℃, 12,000 g에서 15분간 원심분리한 후, 단백질을 정량하였다. 20 μg의 단백질을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였으며, PVDF 막으로 이동시켰다. 이후, 상기 PVDF 막을 1차 항체[actin(1:1000)(GeneTex Inc., California, USA), anti-PAX6, anti-BCRP/ABCG2, anti-p63 및 antiCK3(1:200, Abcam , Cambridge, UK)]와 함께 상온에서 2시간 동안 반응시키고, 비특이적 결합을 방지하기 위해, skim milk로 블로킹하였다. 이후, 2차 항체[HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG 및 goat anti-mouse IgG(1:1000, GeneTex Inc., California, USA)]와 함께 1시간 동안 반응시킨 후, 화학 발광 키트(ECL 키트, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 밴드를 시각화 하였으며, Chemiluminescence 시스템(Fusion SL2, VILBER LOURMAT, France)과 Image J(NIH, USA)를 사용하여 이미지 분석을 수행하였다.

6-5. 조직학적 및 면역조직화학

시료를 4% 포름알데히드(Duksan Chemical, Korea)로 고정시킨 후, 파라핀 왁스(Merck, Darmstadt, Germany)에 포매하였다. 4 mm 두께의 슬라이드 절편을 제작한 후, 헤마톡실린&에오신으로 염색하여 in vivo에서 태아 연골 줄기세포 시트와 세포 형태를 확인하였다.

CK3와 Human nucleus의 면역조직화학 분석을 위해, 3% 과산화수소(덕산 화학, 한국)가 첨가된 메탄올로 10분간 반응시킨 후 펩신 용액(Golden Bridge International, Inc., Mukilteo, WA, USA)과 10분간 반응시켰다. 1% BSA가 첨가된 PBS로 블로킹 후, 1차 항체[anti-CK3(1:100, Abcam, Cambridge, UK), anti-human nucleus(1:100, Millipore, Massachusetts, USA)]와 함께 상온에서 1시간 30분 반응시킨 후, 2차 항체(biotinylated-anti mouse IgG(SPlink HRP Detection Kit; Golden Bridge International, Inc., Mukilteo, WA, USA)와 30분 반응시킨 다음 HRP-conjugated streptavidin 용액과 30분 동안 반응시켰다. 마지막으로 마운팅(mounting)하기 전, 3,3'-diaminobenzidine(DAB) 용액(Golden Bridge International, Inc., Mukilteo, WA, USA)과 반응시킨 다음 Mayer's hematoxylin (YD Diagnostics, Seoul, Korea)으로 대조 염색하였다.

그 결과, 도 5A와 같이, 분화 배지에서 배양된 태아 연골 줄기세포의 형태학을 SV40 각막 상피세포와 비교하였다. SV40 각막 상피세포는 Cnt-Pr 배지에서 배양하였다. 그 결과, 두 세포간에 형태학적 차이는 관찰되지 않았으며, 태아 연골 줄기세포의 형태학이 각막 상피세포와 유사한 것을 확인하였다.

도 5B와 같이, 각막 상피 줄기세포 마커(ABCG2, p63) 및 각막 상피 분화 마커(PAX6, CK3/12)를 이용하여 분화 배지에서 배양된 태아 연골 줄기세포와 SV40 각막 상피세포를 비교한 결과, SV40 각막 상피세포에서 ABCG2, p63, PAX6 및 CK3/12가 발현되는 것을 확인하였으며, 일반 배지에서 배양된 태아 연골 줄기세포에서는 PAX6 및 CK3/12가 발현되지 않고, ABCG2 및 p63이 낮게 발현되었으나, 분화 배지에서 배양된 태아 연골 줄기세포의 경우, ABCG2, p63, PAX6 및 CK3/12가 모두 높게 발현되는 것을 확인함으로써, 태아 연골 줄기세포에서 각막 상피 줄기세포 마커 및 각막 상피 분화 마커의 발현이 유도되는 것을 확인하였다.

도 5C 및 도 5D와 같이, 줄기세포 마커(CD34, CD105), 각막 상피 줄기세포 마커(ABCG2, p63) 및 각막 상피 분화 마커(PAX6, CK3/12)를 이용하여 분화 배지에서 배양된 태아 연골 줄기세포와 SV40 각막 상피세포를 비교한 결과, 분화 배지에서 배양된 태아 연골 줄기세포에서 SV40 각막 상피세포와 유사하게 각막 상피 줄기세포 마커 및 각막 상피 분화 마커의 발현이 유도되는 것을 확인하였다.

실시예 7: 화학적 화상을 입은 각막 상피 동물모델

7-1. 태아 연골 줄기세포 시트(sheet) 제조

태아 연골 줄기세포는 트립신 처리법(4 ~ 5 계대)을 통해 계대 배양하였다. 비부착성 세포는 2~3회 신선한 배지로 교환하여 세척하였다. 이후, 태아 연골 줄기세포(2 X 10⁵ 세포/cm²)는 100 U/ml 페니실린 G 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(HyClone), 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS, Gibco BRL, NY, USA), 50 μg/ml 아스코르베이트-2 포스페이트, 100 nM 덱사메타손, 40 μg/ml 프롤린, 1.25 mg/ml 우혈청알부민, 100 μg/ml 소듐 피루베이트(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)가 포함된 고 글루코즈 DMEM 배지를 포함하는 시트-배지에서 배양하였으며, 태아 연골 줄기세포가 배양 접시에서 떨어질때까지 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3-4일 동안 배양하였다.

7-2. 화학적 화상을 입은 각막 상피 동물모델

동물실험은 아주대학교 동물실험 윤리위원회의 승인을 받은 후 실험을 수행하였다. 각막 윤부 줄기세포 결핍증(limbal stem cell deficiency; LSCD)을 각 토끼(18마리)의 오른쪽 눈에 유발시켰다. 케타민과 졸레틸 혼합물을 토끼 근육 내 주사하여 마취시킨 후, 직경 8 mm의 여과지를 1 M NaOH로 포화시키고 30초 동안 각막 윤부에 놓고, 식염수로 1분 동안 세척하였으며 이를 3회 반복하였다. 태아 연골 줄기세포 시트 및 PKH26 표지된 태아 연골 줄기세포 시트를 집게로 각막에 위치시키고, 상부, 하부, 좌측 및 우측에서 6-0 검은 실크 봉합사로 봉합하였다

그 결과, 도 6B와 같이, 오른쪽 눈에 화학적 화상을 입힌 토끼 동물모델에서 태아 연골 줄기세포 시트의 효과를 분석한 결과, 정상군에서는 0일과 7일째에 정상 각막 상피가 관찰되었고(A, D), 대조군에서는 0일 및 7일째에 손상된 각막 상피가 관찰된(B, E) 반면, 태아 연골 줄기세포 시트를 처리한 경우, 0일 및 7일째에 각막 상피가 관찰된 바(C, F), 태아 연골 줄기세포 시트에 의해 손상된 각막 상피가 치료되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 6C와 같이, 이식 후 7일째 태아 연골 줄기세포의 시트 위치 및 생존 능력을 분석한 결과, 손상 부위에서 PKH26으로 표지된 태아 연골 줄기세포 시트가 관찰되었으며(A), 손상 부위에서 태아 연골 줄기세포 시트가 생존해 있는 것을 확인하였다(B).

도 6D와 같이, 이식 7일째에 각막 상피 분화 마커인 CK3를 이용하여 치유 능력을 분석한 결과, 태아 연골 줄기세포 시트를 처리하였을 때 손상 부위에 위치하여 각막 손상에 대한 치유 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 8: 성장판 조직으로의 분화 확인

도 7과 같이, 토끼의 성장판 부분을 2 mm 펀치로 2회 비스듬히 뚫은 후, 본 발명의 TAP를 이식하였으며, 이후 이식 부위를 분리하고 동결 절편기를 이용하여 4 ㎛ 두께로 절편 후 슬라이드를 제작하였다. 음성대조군은 성장판만 손상시켰고, 양성대조군으로는 현재 임상에서 가장 많이 사용되고 있는 경고제(bone wax)를 사용하였다.

그 결과, 도 8과 같이, 8주 후 본 발명의 TAP를 이식한 군에서 연골이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군으로 사용된 경고제는 이식 공간을 채우는 효과는 있으나 이식재가 골 조직으로 유지되는 한계가 있으며, 골의 각변형이 일어난데 반해, 본 발명의 TAP는 연골을 형성시켜 육안으로 관찰하였을 때도 이식한 부위가 보이지 않을 만큼 정상 연골로 재생된 것을 확인하였다.

또한, 사프라닌 O와 헤마톡실린&에오신 염색을 통해 손상된 이식 부위에 음성대조군과 양성대조군에서는 골 조직이 형성되는 반면, 본 발명의 TAP를 이식한 군에서는 확연히 연골조직이 성장판 위치에 자리하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 9와 같이, 면역염색을 수행한 결과, TAP를 이식한 군에서 정상군과 유사하게 콜라겐과 당단백을 형성하는 것을 확인하였으며, 골 형성의 단계인 콜라겐 X의 경우 8주 이후에 형성되는 것을 확인한 바, 골화가 늦게 일어나거나 방지될 것으로 기대된다.

실시예 9: 성장판 내 연골 형성능 확인

토끼의 성장판 손상 모델에 본 발명의 TAP를 이식하고 성장판 내 연골에서 골화능을 확인하였다(Group 1: 음성대조군, Group 2: 양성대조군(경고제), Group 3: TAP 처리군)(왼쪽 막대: 평균 길이, 오른쪽 막대: 실시예 결과)

그 결과, 도 10과 같이, 음성대조군에서만 길이 성장에 차이가 관찰되었으며, 각변형이 가장 많이 관찰되었고, 양성대조군인 경고제를 이식한 군에서도 각변형이 관찰되었다.

또한, 도 11과 같이, 사프라닌 O과 헤마톡실린&에오신 염색을 통해 음성대조군 및 양성대조군에서 손상 부위에 골 조직이 형성되었으나, 본 발명의 TAP의 경우 연골조직으로 유지되어 있는 것을 확인하였다.

전체적으로 4주 결과에서 음성대조군 및 양성대조군과 달리 TAP를 이식한 군에서만 손상된 성장판 부위에 연골조직이 채워져 있는 것을 확인한 반면, 성장되는 부위에 hypertrophic marker가 발현됨으로써 길이 성장의 가능성을 확인할 수 있었다.

또한, 도 12와 같이, TAP를 이식한 군을 HuNA로 염색하여 이식된 조직을 확인하였으며, PCNA로 염색하여 증식세포를 확인하였다.

또한, 도 13과 같이, 이식 후 4, 14, 21, 28주에 사프라닌 O와 uCT를 수행한 결과, 4, 14, 21, 28주 결과에서 TAP를 이식한 군에서도 거의 동일한 경향성을 확인하였다. 음성대조군 및 양성대조군에서는 성장판 손상 부위에 연골조직이 발견되지 않고, u-CT 결과에서 골 조직이 형성되는 것을 확인하였으며, 특히 음성대조군의 경우 모든 주에서 각변형이 일어난 것을 확인하였다.

또한, 도 14와 같이, 조직학적 검사를 통해 요추 추간판의 재생을 비교한 결과(요추 2-3번: 정상대조군, 요추 3-4번: TAP 처리군, 요추 4-5번: 음성대조군, 요추 5-6번: TAP 처리군), 요추 3-4번과 5-6번 사이의 추간판의 섬유테 결손이 복원되는 것을 확인하였다.

실시예 10: 태아 연골 유래 줄기세포 (Fetal cartilage-derived stem cells) 시트(TAP-C)를 활용한 근육분화 효과 확인

실험실내에서 태아 연골 유래 줄기세포 시트(sheet)를 사용하여 근육 재생에 활용할 구 있는 인공 근육조직을 만들기 위해 TAP-C를 이용하여 근육분화 효과를 확인하였다.

태아 연골 유래 줄기세포(FCSC)를 6-웰 플레이트에 분주하고, 세포 시트의 밀도 및 두께에 따른 분화의 차이를 확인하기 위하여 시트 그룹은 3 × 10⁵/well 그룹과 2 × 10⁶/well 그룹으로 구성하였다. 배지는 10% FBS가 첨가된 High-glucose DMEM (Hyclone)을 사용하였다.

배양 1일 후, 배지를 Myoblast-분화 유도 배지로 교체하였다. 배지는 DMEM/nutrient mixture F-12 (Invitrogen)에 1ng/ml transforming growth factor-β1 (TGF-β1; R&D systems), non-essential amino acids (NEAA; Invitrogen), insulin-transferrin-selenium (ITS; Gibco)를 첨가하여 제조하였으며, 7일 동안 배양하여, FCSC를 근원세포 (Myoblast)로 분화시켰다.

배양 7일 후, 근원세포로의 분화 확인을 위해, 웨스턴 블롯팅 (western blotting) 및 면역세포화학(immunocytochemistry; ICC)을 수행하여 Myf5와 MyoD의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 15 내지 도 17과 같이 근육분화 초기에 주요 인자로 작용하는 Myf5 및 MyoD의 발현이 나타남에 따라, FCSC 시트가 근원세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

분리된 태아 연골조직 유래 줄기세포 및 줄기세포 유래 세포외기질을 유효성분으로 포함하는 시트 형상의 각막 조직 유합용 조성물로서, 상기 조성물은 각막 조직에 부착되면서 인접한 조직으로 분화되는 것을 특징으로 하는, 조직 접착 및 분화 특성을 갖는 각막 조직 유합용 조성물.
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(a) 분리된 태아 연골조직으로부터 줄기세포를 분리하여 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 줄기세포 및 이의 세포외기질을 포함하는 세포막을 수득하는 단계;
(c) 상기 수득된 세포막을 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 수득된 세포 펠렛을 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 제 1항에 따른 각막 조직 유합용 조성물의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 (b) 단계의 세포막 수득은 세포의 분리 단계 없이 바닥에 부착된 세포와 함께 세포외기질을 모두 포함하여 수득하는 것을 특징으로 하는 각막 조직 유합용 조성물의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 (d) 단계의 배양 기간에 따라 조성물의 압축강도, 부착력 및 도포성이 조절되는 것을 특징으로 하는 각막 조직 유합용 조성물의 제조방법.
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