JP2022528378A

JP2022528378A - 組織接着及び分化特性を有する組織癒合用組成物及びその製造方法

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Publication number: JP2022528378A
Application number: JP2021557582A
Authority: JP
Inventors: ビョン－ヒュンミン
Original assignee: Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Current assignee: Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2022-06-10
Also published as: US20220160928A1; EP3950017A4; EP3950017A1; WO2020197337A1

Abstract

本発明は、組織接着及び分化特性を有する組織癒合用組成物及びその製造方法に関するものであって、本発明では、幹細胞及び幹細胞由来の細胞外基質を用いてゲル状またはシート状の組織癒合用組成物を製造し、組成物は、生体組織に優れた接着性及び結合力を有し、移植後、軟骨、骨、角膜、成長板などに分化が可能なことを確認したので、損傷組織または臓器再生治療のための接着剤及び分化剤として使用して究極的に組織癒合剤として有用に活用することができる。

Description

本発明は、組織接着及び分化特性を有する組織癒合用組成物及びその製造方法に関する。

１９９８年米国ＦＤＡからフィブリンシーラント（ｆｉｂｒｉｎｓｅａｌａｎｔ）が許可されて以来、毎年新たな組織接着剤が絶え間なく開発されている。このような組織接着剤は、従来の外科的または内科的手術で使われている縫合術、クリップ術、灸術のような技術を代替しうる素材として脚光を浴びている。

縫合術のような従来の外科的技術は、強い伸張力（ｓｔｒｏｎｇｔｅｎｓｉｌｅｓｔｒｅｎｇｔｈ）を有するが、患者の苦痛誘発及び施術後、除去などの短所を有し、一方、組織接着剤は、速い接着時間、簡便な使用、施術後、除去不要などの長所を有しているが、低い接着性及び伸張力と水分とが存在する場合、接着性が著しく劣る限界があった。これにより、前記のような組織接着剤の限界点を克服するための研究が持続している。

医療用組織接着剤は、組織に直接接触するので、生体適合性が要求され、通常生体内で使われるために、接着剤が体液と血液中に流入される場合を備えて、より厳格な条件で人体への毒性及び危害性を除去し、かつ生分解性素材からなる必要がある。

現在、商用化及び／または実用化されている組織接着剤は、大きくシアノアクリレート接着剤、フィブリン接着剤、ゼラチン接着剤、ポリウレタン系接着剤などがある。シアノアクリレート接着剤は、最近、高機能性及び高性能を有する瞬間接着剤の研究に脚光を浴びている。前記シアノアクリレート系組織接着剤は、単一物質であって、短時間に室温で開始剤なしに水分によって硬化され、外観が透明であり、接着強度が大きな長所があるが、衝撃に弱く、耐熱性が劣るという短所がある。また、毒性が激しくて、現在はほとんど使われておらず、米国を除いた他の国で部分的に使われており、一部では、組織毒性と脆弱性のために使用が制限されている。

フィブリン接着剤は、接着部位に存在する水分に影響なしに迅速に接着が可能であり、血小板と凝固障害がなく、生体適合性に優れるという長所を有している。しかし、接着力が弱く、生分解速度が速く、血液感染の危険があるという短所がある。

また、ゼラチン接着剤は、組織接着性は高いが、架橋剤として使われるホルマリンやグルタルアルデヒドが生体内のタンパク質とも架橋反応を起こして、組織毒性を起こすという短所があり、ポリウレタン系接着剤は、生体組織表面の水を吸収して組織との密着性を高め、水と反応して数分以内に硬化され、生分解されるという長所を有しているが、合成原料である芳香族ジイソシアネートが生体毒性を有するという短所がある。

一方、現在まで開発された接着剤は、組織と組織との間、あるいは組織と移植物との間の癒合にほとんど寄与していない。すなわち、接着剤によって組織が永久的に癒合されないために、接着剤の生分解以後には、２つの組織あるいは移植物は再び離れる。このような短所を克服するために、外部から治療細胞を供給する細胞治療剤が研究されている。すなわち、組織と組織との間、あるいは組織と移植物との間に細胞を注入することにより、移植された細胞が細胞外基質を分泌して接着物質を付着しようとする試みである。しかし、細胞治療剤は、接着性が全くなくて、細胞が組織を生成する間に別途の接着剤あるいは物質が必要である。

以上のように、組織接着剤は、２つの組織の間の接着力が必要であり、また、２つの組織を永久に付着するために、目標とする付着組織の細胞に分化して究極的に細胞外基質を分泌することができる細胞治療剤の機能を行うことが理想的である。このような細胞搭載組織接着剤は、身体の多くの組織損傷の治療のために使われる。例えば、筋肉の破裂、靭帯の損傷、骨付着、軟骨再生などがこれに該当する。したがって、組織接着と分化細胞を搭載した組織接着剤の開発は、移植治療において画期的な進歩をもたらすと見込まれる。

本発明の目的は、組織接着及び分化特性を有する組織癒合剤（ｔｉｓｓｕｅａｄｈｅｓｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔ；ＴＡＰ）組成物及びその製造方法を提供することである。

前記目的を果たすために、本発明は、幹細胞及び幹細胞由来の細胞外基質を有効成分として含む組織癒合用組成物を提供する。

また、本発明は、前記組成物で２つ以上の組織を付着させて製造される移植用組織を提供する。

また、本発明は、（ａ）胎児軟骨組織から幹細胞を分離して培養する段階；（ｂ）前記培養された幹細胞及びその細胞外基質を含む細胞膜を収得する段階；（ｃ）前記収得された細胞膜を遠心分離して細胞ペレットを収得する段階；及び（ｄ）前記収得された細胞ペレットを培地で培養する段階；を含む組織癒合用組成物の製造方法を提供する。

本発明では、幹細胞及び幹細胞由来の細胞外基質を用いてゲル状またはシート状の組織癒合用組成物を製造し、前記組成物は、生体組織に優れた接着性及び結合力を有し、移植後、軟骨、骨、角膜、成長板などに分化が可能なことを確認したので、損傷組織または臓器再生治療のための接着剤及び分化剤として使用して究極的に組織癒合剤として有用に活用することができる。

本発明の軟骨組織癒合剤組成物（ＴＡＰ）の接着強度を確認した結果である。軟骨損傷モデルに蛍光発現因子ＰＫＨ－２６が標識されたＴＡＰを移植した後、損傷部位に付着有無を確認した結果である。１週、２週、３週間培養されて製造されたＴＡＰのサフラニンＯ染色及びヘマトキシリン＆エオシン染色の結果である。軟骨損傷モデルにＴＡＰを移植した後、組織学的分析を通じて移植後、軟骨損傷の再生を確認した結果である。胎児軟骨組織由来幹細胞を用いて角膜細胞への分化を確認した結果である。ＴＡＰを用いてシート形態の角膜細胞への分化を確認した結果である。成長板損傷モデルの製作及びＴＡＰ移植方法を示した図面である。成長板損傷モデルでＴＡＰによる軟骨組織及び成長板組織への分化を確認した結果である。成長板損傷モデルでＴＡＰによるコラーゲン及び糖タンパクの形成を確認した結果である。成長板損傷モデルでＴＡＰによる長さの成長及び角変形の改善効果を確認した結果である。成長板損傷モデルでＴＡＰによる軟骨組織の形成を確認した結果である。成長板損傷モデルでＴＡＰによる軟骨組織の形成を確認した結果である。成長板損傷モデルでＴＡＰによる軟骨組織の形成を確認した結果である。ＴＡＰによる腰推椎間板の再生を確認した結果である。胎児軟骨由来幹細胞シートの培養７日後、細胞分化を確認したＧｒｏｓｓｉｍａｇｅイメージ結果である。胎児軟骨由来幹細胞シートの培養７日後、根源細胞への分化を確認するために、Ｍｙｆ５及びＭｙｏＤの発現レベルを確認したウェスタンブロッティング分析の結果である。胎児軟骨由来幹細胞シートの培養７日後、根源細胞への分化を確認するために、免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＩＣＣ）を行ってＭｙｆ５及びＭｙｏＤの発現を確認した結果である。

本発明は、幹細胞及び幹細胞由来の細胞外基質を有効成分として含む組織接着及び分化特性を有する組織癒合用組成物を提供する。

本発明で使われた用語「幹細胞」は、胎児軟骨組織から分離された幹細胞であり、望ましくは、コラゲナーゼなどを用いて軟骨組織を完全に消化させた後、分離された軟骨前駆細胞（ｆｅｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｒｉｖｅｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ；ＦＣＰＣ）である。

本発明で使われた用語「幹細胞由来の細胞外基質（ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘ）」は、胎児軟骨組織由来幹細胞から細胞によって合成され、細胞外に分泌、蓄積された分子で構成されている生体高分子の集合体であって、膠原質、弾力素などの線維性タンパク質、グリコサミノグリカンなどの複合タンパク質、フィブロネクチン、ラミニンなどの細胞付着性タンパク質などを含む。

本発明で使われた用語「軟骨」は、硝子軟骨（ｈｙａｌｉｎｅｃａｒｔｉｌａｇｅ）、線維軟骨（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ）または弾性軟骨（ｅｌａｓｔｉｃｃａｒｔｉｌａｇｅ）を含み、特に制限されない。関節軟骨（ａｒｔｉｃｕｌａｒＣａｒｔｉｌａｇｅ）、耳軟骨、鼻軟骨、ヒジ軟骨、半月状軟骨（ｍｅｎｉｓｃｕｓ）、ヒザ軟骨、肋軟骨、足首軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨及び脊椎軟骨など軟骨部位に制限なしに含む。

前記組成物は、角膜、上皮、成長板、骨、軟骨、靭帯、筋肉または皮膚組織に分化されるが、これらに制限されるものではないということを明示する。

前記組成物は、ゲル状またはシート状に製造可能であるが、これらに制限されるものではないということを明示する。

本発明で使われた用語「ゲル（ｇｅｌ）」は、ゼリーと類似した物質であって、柔らかくて弱い範囲から強くて粗い範囲までの物性を有し、定常状態で流れを表わさない固体（ｓｏｌｉｄ）を意味し、ゲルのほとんどの重量は、液体（ｌｉｑｕｉｄ）や３次元ネットワーク構造によって全体としては固体のように行動する。

前記組成物は、２５～４０℃で２０～３０時間保持されるが、これらに制限されるものではないということを明示する。

本発明で使われた用語「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」は、一般的に供与者の細胞、組織または臓器などを受容者の損傷組織または臓器に移す過程を意味し、本発明においては、組織癒合用組成物の組織欠陥、損傷、欠損部位への適用を意味する。移植は、当業者に公知の方法で行われる。例えば、外科的手術で行われ、患部に直接注射することができる。

前記（ｂ）段階の細胞膜収得は、細胞の分離段階なしに底面に付着された細胞と共に細胞外基質をいずれも含んで収得するものである。

前記（ｄ）段階の培養期間によって組成物の圧縮強度、付着力及び塗布性が調節される。

本発明で使われた用語「塗布性（拡散性）」は、物性のうち、広がる性質を言い、患部などに塗る時、塊にならず、滑らかに全面に広がる性質を言う。本発明において、拡散性は、試料を１ｍｍ／分の速度で１秒間５Ｎの力を垂直に試料に与えた時、試料の単位重量当たり広がる程度を言う。

本発明で使われた用語「付着性」は、物質に他の物質が張り付く性質を言い、患部などに塗る時、物質が落ちず、張り付いている性質を言う。本発明において、付着性は、直径５ｍｍのジグと患部とに物質を接触して付着させた後、１．３ｍｍ／分の速度で引き付けながら、ジグと患部とに付着された物質が落ちて分離される時までの抵抗力を言う。

また、本発明は、幹細胞及び幹細胞由来の細胞外基質を有効成分として含む組織接着特性を有する組織癒合用組成物を提供することができる。

本発明で使われた用語「再生」は、一般的に生物体には身体の一部またはその機能を喪失した時、その部分の組織や器官を再び作って元の状態に復元させるか、その機能を回復しようとする作用を称する。このような再生能力は、体系が簡単であり、系統的に進化の程度が低いものであるほど強い。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これらの実施例によって制限されないということは当業者にとって自明である。

実施例１：ヒト胎児軟骨組織由来幹細胞の分離及び培養

１２～１５週齢の胎児（出所：大韓民国亜洲大学病院倫理委員会で承認したＩＲＢＮＯ．ＡＪＩＲＢ－ＣＲＯ－０７－１３９）のヒザ関節から軟骨組織由来幹細胞を分離した。簡略に、ヒザ関節から分離された軟骨組織をリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で洗浄した後、０．２％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）が含有されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥｇｌｅＭｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）培地を添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で４時間培養した。軟骨組織が完全に消化されて放出された軟骨組織由来幹細胞を１７００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿された軟骨組織由来幹細胞（ｆｅｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｒｉｖｅｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌ；ＦＣＰＣ）を収得し、組織培養皿［１５０ｍｍ（ｄｉａ．）Ｘ２０ｍｍ（ｈ）］に１Ｘ１０^６細胞密度で接種した。

実施例２：組織接着及び分化特性を有する組織癒合用組成物の製造（ＴＡＰ）

前記実施例１で収得した軟骨幹細胞を２Ｘ１０^５細胞密度で希釈した後、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン及び５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地で１５～１８日間断層培養した。培養後、培地を除去し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を添加して細胞外基質と結合された細胞膜を収得した。細胞及び細胞外基質が結合された細胞膜の収得は、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ処理後、細胞をピペットで分離せず、細胞及び細胞外基質を含む細胞膜全体を一回に収得した。

収得した細胞及び細胞外基質を含む細胞膜は、軟骨分化培地［１％抗生剤－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）、１．０ｍｇ／ｍＬインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、０．５５ｍｇ／ｍＬヒトトランスフェリン（ｈｕｍａｎｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、０．５ｍｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｓｅｌｅｎｉｔｅ）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）、１．２５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）、１００ｎＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、４０μｇ／ｍＬプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）及び１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ－βが添加されたＤＭＥＭ－ＨＧ］が含まれた５０ｍｌのチューブに入れ、２５０ｘｇで２０分間遠心分離してペレット形態の構造体を製造した。

製造された細胞ペレットを培養皿に入れ、前記組成と同じ軟骨分化培地を用いて３７℃、５％ＣＯ_２培養器で１週、２週及び３週間培養し、組織癒合用組成物を製造した。

実施例３：組織癒合用組成物の接着強度の測定

前記実施例２でＴＡＰの接着強度を確認するために、ＵｎｉｖｅｒｓａｌＴｅｓｔｉｎｇＭａｃｈｉｎｅ（ＭｏｄｅｌＨ５Ｋ－Ｔ、Ｈ．Ｔ．Ｅ、イギリス）を使用してフィブリン接着剤と接着力を比較した。

人工関節手術後、廃棄される患者の軟骨組織を同意書と共に寄贈された。患者の軟骨組織表面に６ｍｍｂｉｏｐｓｙｐｕｎｃｈを用いて軟骨損傷モデルを製作し、製造されたＴＡＰを挿入した。次いで、直径５ｍｍのジグが挿入されたＴＡＰに接触して付着させた後、１．３ｍｍ／分の速度で引き付けながら、ジグがＴＡＰと分離される時までの抵抗力を測定した。

その結果、図１を参照すれば、本発明のＴＡＰの接着強度は、初期に２．５２ｋＰａでフィブリン接着剤よりも弱かったが、３週後、組織に分化が進行しながら、３４．４７ｋＰａでフィブリン接着剤よりも格段に優れた接着強度を示すことを確認した。

実施例４：蛍光発現因子ＰＫＨ－２６を標識したＴＡＰの体内付着の確認

細胞表面に標識される蛍光発現因子であるＰＫＨ－２６をＴＡＰに付着して体外培養及び体内から発現されるか否かを確認した。蛍光発現因子ＰＫＨ－２６を標識したＴＡＰを製作してｉｎｖｉｔｒｏで一週間培養後、蛍光がよく発現されることを確認した後、ウサギの部分軟骨損傷モデルに移植した。移植後、一週間後、移植部位のヒザを分離し、凍結切片機を用いて４μｍの厚さに切片した後、スライドを製作した。

光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡を用いて観察した結果、図２のように、部分軟骨損傷部位にＴＡＰが残っており、蛍光発現因子が付着されていることを確認した。前記結果から本発明のＴＡＰが患部に塗布されて付着されるということを確認した。

実施例５：軟骨組織への分化の確認

前記実施例２の細胞ペレットからＴＡＰ製造過程で１週が過ぎる度に、４％ホルマリンで固定させた後、パラフィンに包埋して４μｍの厚さに切断し、蓄積された硫酸化されたプロテオグリカンの検出のために、横断面をサフラニン（Ｓａｆｒａｎｉｎ）Ｏとヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）とで染色した。

その結果、図３のように、１週から３週に経時的にヘマトキシリン＆エオシン染色では、細胞間隔が広がり、細胞形状が軟骨細胞と類似になることを確認し、サフラニンＯ染色では、３週でタンパク糖の量が増加し、軟骨から見られるラクーナ（ｌａｃｕｎａ）が形成されることを確認した。

また、本発明のＴＡＰをウサギの部分軟骨損傷モデルに移植した後、移植部位のヒザを分離し、凍結切片機を用いて４μｍの厚さに切片した後、スライドを製作した後、サフラニンＯ染色を行った。

その結果、図４のように、移植４週後、供与者（ｄｏｎｏｒ）軟骨と受容者（ｈｏｓｔ）軟骨境界部と軟骨と骨との境界を見れば、対照群に比べて軟骨と軟骨、軟骨と骨との併合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に優れていることを確認し、移植８週後には、軟骨と軟骨、軟骨と骨との併合がほぼ完全になされて、損傷部位がほとんど確認されない程度に正常組織と同様に軟骨が回復されることを確認した。

実施例６：角膜上皮細胞への分化の確認

６－１．角膜上皮細胞分化

胎児軟骨幹細胞（３Ｘ１０^５細胞／ｃｍ^２）は、２％ＫｎｏｃｋＯｕｔ^ＴＭＳｅｒｕｍＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ^ＴＭＳＲ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、１０ｎｇ／ｍｌ角質細胞成長因子（ＫＧＦ、ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）、１０ｎｇ／ｍｌ肝細胞成長因子（ＨＧＦ、ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）、２０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ、ＷａｋｏＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｊａｐａｎ）、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）、５μＭレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）が含まれた低グルコースＤＭＥＭ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２培養器で培養し、培地は、２日ごとに取り替えた。

６－２．免疫細胞化学

細胞は、４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定させ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００と１５分、５％ＢＳＡと１時間培養した。以後、細胞を１次抗体［ａｎｔｉ－ＰＡＸ６、ａｎｔｉ－ＢＣＲＰ／ＡＢＣＧ２、ａｎｔｉ－ｐ６３、ａｎｔｉ－ＣＫ３／１２（１：２００希釈、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）］と共に常温で２時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体［ｇｏａｔａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧＨ＆Ｌ及びｇｏａｔａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧＨ＆Ｌ（１：１０００希釈、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）］と常温で１時間反応させた。以後、細胞を４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）で染色して核を視覚化し、蛍光顕微鏡（Ｍｉ８、ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて細胞を観察した。

６－３．ＦＡＣＳ

細胞（継代５）は、角膜上皮幹細胞マーカーと角膜上皮分化マーカーとを用いて分析した。細胞を１次抗体［ａｎｔｉ－ＣＤ３４－ＦＩＴＣ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－ＣＤ１０５（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－ＰＡＸ６、ａｎｔｉ－ＢＣＲＰ／ＡＢＣＧ２、ａｎｔｉ－ｐ６３、ａｎｔｉ－ＣＫ３／１２（１：５００希釈、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）］と共に常温で１時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体［ｇｏａｔａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧＨ＆Ｌ及びｇｏａｔａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧＨ＆Ｌ（１：１０００希釈、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）］と常温で１時間反応させた。染色された細胞は、流細胞分析法（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＦＡＣＳａｖａｎｔａｇｅ）で分析した。

６－４．ウェスタンブロット

細胞を収集した後、プロテアーゼ抑制剤（ＲｏｃｋｌａｎｄＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡ）が添加されたＲＩＰＡ緩衝液を用いて４℃で３０分間反応させて細胞を溶解した。細胞溶解物を４℃、１２，０００ｇで１５分間遠心分離した後、タンパク質を定量した。２０μｇのタンパク質を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＰＶＤＦ膜に移動させた。以後、前記ＰＶＤＦ膜を１次抗体［ａｃｔｉｎ（１：１０００）（ＧｅｎｅＴｅｘＩｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ａｎｔｉ－ＰＡＸ６、ａｎｔｉ－ＢＣＲＰ／ＡＢＣＧ２、ａｎｔｉ－ｐ６３及びａｎｔｉＣＫ３（１：２００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）］と共に常温で２時間反応させ、非特異的結合を防止するために、スキムミルク（ｓｋｉｍｍｉｌｋ）でブロッキングした。以後、２次抗体［ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｇｏａｔａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧ及びｇｏａｔａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ（１：１０００、ＧｅｎｅＴｅｘＩｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）］と共に１時間反応させた後、化学発光キット（ＥＣＬキット、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してバンドを視覚化し、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅシステム（ＦｕｓｉｏｎＳＬ２、ＶＩＬＢＥＲＬＯＵＲＭＡＴ、Ｆｒａｎｃｅ）とＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ、ＵＳＡ）とを使用してイメージ分析を行った。

６－５．組織学的及び免疫組織化学

試料を４％ホルムアルデヒド（ＤｕｋｓａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）で固定させた後、パラフィンワックス（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に包埋した。４ｍｍの厚さのスライド切片を製作した後、ヘマトキシリン＆エオシンで染色してｉｎｖｉｖｏで胎児軟骨幹細胞シートと細胞形態を確認した。

ＣＫ３とＨｕｍａｎｎｕｃｌｅｕｓの免疫組織化学の分析のために、３％過酸化水素（徳山化学、大韓民国）が添加されたメタノールで１０分間反応させた後、ペプシン溶液（ＧｏｌｄｅｎＢｒｉｄｇｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｋｉｌｔｅｏ、ＷＡ、ＵＳＡ）と１０分間反応させた。１％ＢＳＡが添加されたＰＢＳでブロッキング後、１次抗体［ａｎｔｉ－ＣＫ３（１：１００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎｎｕｃｌｅｕｓ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）］と共に常温で１時間３０分反応させた後、２次抗体（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ａｎｔｉｍｏｕｓｅＩｇＧ（ＳＰｌｉｎｋＨＲＰＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ；ＧｏｌｄｅｎＢｒｉｄｇｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｋｉｌｔｅｏ、ＷＡ、ＵＳＡ）と３０分反応させた後、ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ溶液と３０分間反応させた。最後に、マウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）する前、３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）溶液（ＧｏｌｄｅｎＢｒｉｄｇｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｋｉｌｔｅｏ、ＷＡ、ＵＳＡ）と反応させた後、Ｍａｙｅｒ’ｓｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（ＹＤＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で対照染色した。

その結果、図５のＡのように、分化培地から培養された胎児軟骨幹細胞の形態学をＳＶ４０角膜上皮細胞と比較した。ＳＶ４０角膜上皮細胞は、Ｃｎｔ－Ｐｒ培地で培養した。その結果、２つの細胞間に形態学的差は観察されず、胎児軟骨幹細胞の形態学が角膜上皮細胞と類似したことを確認した。

図５のＢのように、角膜上皮幹細胞マーカー（ＡＢＣＧ２、ｐ６３）及び角膜上皮分化マーカー（ＰＡＸ６、ＣＫ３／１２）を用いて分化培地から培養された胎児軟骨幹細胞とＳＶ４０角膜上皮細胞とを比較した結果、ＳＶ４０角膜上皮細胞でＡＢＣＧ２、ｐ６３、ＰＡＸ６及びＣＫ３／１２が発現されることを確認し、一般培地から培養された胎児軟骨幹細胞では、ＰＡＸ６及びＣＫ３／１２が発現されず、ＡＢＣＧ２及びｐ６３が低く発現されたが、分化培地から培養された胎児軟骨幹細胞の場合、ＡＢＣＧ２、ｐ６３、ＰＡＸ６及びＣＫ３／１２がいずれも高く発現されることを確認することにより、胎児軟骨幹細胞で角膜上皮幹細胞マーカー及び角膜上皮分化マーカーの発現が誘導されることを確認した。

図５のＣ及び図５のＤのように、幹細胞マーカー（ＣＤ３４、ＣＤ１０５）、角膜上皮幹細胞マーカー（ＡＢＣＧ２、ｐ６３）及び角膜上皮分化マーカー（ＰＡＸ６、ＣＫ３／１２）を用いて分化培地から培養された胎児軟骨幹細胞とＳＶ４０角膜上皮細胞とを比較した結果、分化培地から培養された胎児軟骨幹細胞でＳＶ４０角膜上皮細胞と同様に角膜上皮幹細胞マーカー及び角膜上皮分化マーカーの発現が誘導されることを確認した。

実施例７：化学熱傷を負った角膜上皮動物モデル

７－１．胎児軟骨幹細胞シート（ｓｈｅｅｔ）の製造

胎児軟骨幹細胞は、トリプシン処理法（４～５継代）を通じて継代培養した。非付着性細胞は、２～３回新鮮な培地に交換して洗浄した。以後、胎児軟骨幹細胞（２Ｘ１０^５細胞／ｃｍ^２）は、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＨｙＣｌｏｎｅ）、インスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＮＹ、ＵＳＡ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸－２リン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、４０μｇ／ｍｌプロリン、１．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）が含まれた高グルコースＤＭＥＭ培地を含むシート－培地で培養し、胎児軟骨幹細胞が培養皿から落ちるまで３７℃、５％ＣＯ^２培養器で３～４日間培養した。

７－２．化学熱傷を負った角膜上皮動物モデル

動物実験は、大韓民国亜洲大学動物実験倫理委員会の承認を受けた後、実験を行った。角膜輪部幹細胞欠乏症（ｌｉｍｂａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ；ＬＳＣＤ）を各ウサギ（１８匹）の右側目に誘発させた。ケタミンとゾレチル混合物とをウサギ筋肉内注射して麻酔させた後、直径８ｍｍの濾過紙を１ＭＮａＯＨで飽和させ、３０秒間角膜輪部に置き、食塩水で１分間洗浄し、それを３回繰り返した。胎児軟骨幹細胞シート及びＰＫＨ２６で標識された胎児軟骨幹細胞シートをピンセットで角膜に位置させ、上部、下部、左側及び右側で６－０黒いシルク縫合糸で縫合した

その結果、図６のＢのように、右側目に化学熱傷を負わせたウサギ動物モデルで胎児軟骨幹細胞シートの効果を分析した結果、正常群では、０日と７日目に正常角膜上皮が観察され（Ａ、Ｄ）、対照群では、０日及び７日目に損傷された角膜上皮が観察された（Ｂ、Ｅ）一方、胎児軟骨幹細胞シートを処理した場合、０日及び７日目に角膜上皮が観察されたので（Ｃ、Ｆ）、胎児軟骨幹細胞シートによって損傷された角膜上皮が治療されることを確認することができた。

また、図６のＣのように、移植後、７日目に胎児軟骨幹細胞のシート位置及び生存能力を分析した結果、損傷部位でＰＫＨ２６で標識された胎児軟骨幹細胞シートが観察され（Ａ）、損傷部位で胎児軟骨幹細胞シートが生存していることを確認した（Ｂ）。

図６のＤのように、移植７日目に角膜上皮分化マーカーであるＣＫ３を用いて治癒能力を分析した結果、胎児軟骨幹細胞シートを処理した時、損傷部位に位置して、角膜損傷に対する治癒効果を示すことを確認した。

実施例８：成長板組織への分化の確認

図７のように、ウサギの成長板部分を２ｍｍのパンチで２回斜めに穿孔した後、本発明のＴＡＰを移植し、以後、移植部位を分離し、凍結切片機を用いて４μｍの厚さに切片した後、スライドを製作した。陰性対照群は、成長板のみ損傷させ、陽性対照群としては、現在臨床で最も多く使われている硬膏剤（ｂｏｎｅｗａｘ）を使用した。

その結果、図８のように、８週後、本発明のＴＡＰを移植した群で軟骨が形成されることを確認することができた。陽性対照群として使われた硬膏剤は、移植空間を満たす効果はあるが、移植材が骨組織で保持される限界があり、骨の角変形が起こったのに反して、本発明のＴＡＰは、軟骨を形成させて肉眼で観察した時も移植した部位が見えないほど正常軟骨に再生されたことを確認した。

また、サフラニンＯとヘマトキシリン＆エオシン染色を通じて損傷された移植部位に陰性対照群と陽性対照群では、骨組織が形成される一方、本発明のＴＡＰを移植した群では、確実に軟骨組織が成長板位置に位置していることを確認することができた。

また、図９のように、免疫染色を行った結果、ＴＡＰを移植した群で正常群と同様にコラーゲンと糖タンパクとを形成することを確認し、骨形成の段階であるコラーゲンＸの場合、８週以後に形成されることを確認したので、骨化が遅く起こるか、防止されると期待される。

実施例９：成長板内軟骨形成能の確認

ウサギの成長板損傷モデルに本発明のＴＡＰを移植し、成長板内軟骨で骨化能を確認した（Ｇｒｏｕｐ１：陰性対照群、Ｇｒｏｕｐ２：陽性対照群（硬膏剤）、Ｇｒｏｕｐ３：ＴＡＰ処理群）（左側棒：平均長さ、右側棒：実施例の結果）。

その結果、図１０のように、陰性対照群のみで長さの成長に差が観察され、角変形が最も多く観察され、陽性対照群である硬膏剤を移植した群でも、角変形が観察された。

また、図１１のように、サフラニンＯとヘマトキシリン＆エオシン染色を通じて陰性対照群及び陽性対照群で損傷部位に骨組織が形成されたが、本発明のＴＡＰの場合、軟骨組織で保持されていることを確認した。

全体として４週の結果で陰性対照群及び陽性対照群とは異なって、ＴＡＰを移植した群のみで損傷された成長板部位に軟骨組織が満たされていることを確認した一方、成長される部位にｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃｍａｒｋｅｒが発現されることにより、長さの成長の可能性を確認することができた。

また、図１２のように、ＴＡＰを移植した群をＨｕＮＡで染色して移植された組織を確認し、ＰＣＮＡで染色して増殖細胞を確認した。

また、図１３のように、移植後、４、１４、２１、２８週にサフラニンＯとｕＣＴを行った結果、４、１４、２１、２８週の結果でＴＡＰを移植した群でも、ほとんど同じ傾向性を確認した。陰性対照群及び陽性対照群では、成長板損傷部位に軟骨組織が発見されず、ｕ－ＣＴ結果で骨組織が形成されることを確認し、特に、陰性対照群の場合、あらゆる週で角変形が起こったことを確認した。

また、図１４のように、組織学的検査を通じて腰推椎間板の再生を比較した結果（腰推２～３番：正常対照群、腰推３～４番：ＴＡＰ処理群、腰推４～５番：陰性対照群、腰推５～６番：ＴＡＰ処理群）、腰推３～４番と５－６番との間の椎間板の線維輪の欠損が復元されることを確認した。

実施例１０：胎児軟骨由来幹細胞（Ｆｅｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）シート（ＴＡＰ－Ｃ）を活用した筋肉分化の効果の確認

実験室内で胎児軟骨由来幹細胞シートを使用して筋肉再生に活用することができる人工筋肉組織を作るために、ＴＡＰ－Ｃを用いて筋肉分化の効果を確認した。

胎児軟骨由来幹細胞（ＦＣＳＣ）を６－ウェルプレートに分注し、細胞シートの密度及び厚さによる分化の差を確認するために、シートグループは、３×１０^５／ｗｅｌｌグループと２×１０^６／ｗｅｌｌグループとで構成した。培地は、１０％ＦＢＳが添加されたＨｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を使用した。

培養１日後、培地をＭｙｏｂｌａｓｔ－分化誘導培地に取り替えた。培地は、ＤＭＥＭ／ｎｕｔｒｉｅｎｔｍｉｘｔｕｒｅＦ－１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１ｎｇ／ｍｌｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β１（ＴＧＦ－β１；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）、ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ－ｓｅｌｅｎｉｕｍ（ＩＴＳ；Ｇｉｂｃｏ）を添加して製造し、７日間培養して、ＦＣＳＣを根源細胞（Ｍｙｏｂｌａｓｔ）に分化させた。

培養７日後、根源細胞への分化の確認のために、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）を行って、Ｍｙｆ５とＭｙｏＤとの発現レベルを確認した。

その結果、図１５ないし図１７のように、筋肉分化初期に主要因子として作用するＭｙｆ５及びＭｙｏＤの発現が表れることによって、ＦＣＳＣシートが根源細胞に分化されたことを確認することができた。

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。

本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び範囲、そして、その均等概念から導出される、あらゆる変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されねばならない。

Claims

幹細胞及び幹細胞由来の細胞外基質を有効成分として含む、組織接着及び分化特性を有する組織癒合用組成物。
前記組織は、角膜、上皮、成長板、骨、軟骨、靭帯、筋肉、及び皮膚組織からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１に記載の組織癒合用組成物。
前記組成物は、ゲル状またはシート状であることを特徴とする、請求項１に記載の組織癒合用組成物。
請求項１に記載の組成物で２つ以上の組織を付着させて製造される、移植用組織。
（ａ）胎児軟骨組織から幹細胞を分離して培養する段階と、
（ｂ）前記培養された幹細胞及びその細胞外基質を含む細胞膜を収得する段階と、
（ｃ）前記収得された細胞膜を遠心分離して細胞ペレットを収得する段階と、
（ｄ）前記収得された細胞ペレットを培地で培養する段階と、
を含む、請求項１に記載の組織癒合用組成物の製造方法。
前記（ｂ）段階の細胞膜収得は、細胞の分離段階なしに底面に付着された細胞と共に細胞外基質をいずれも含んで収得することを特徴とする、請求項５に記載の組織癒合用組成物の製造方法。
前記（ｄ）段階の培養期間によって組成物の圧縮強度、付着力及び塗布性が調節されることを特徴とする、請求項５に記載の組織癒合用組成物の製造方法。
前記組織は、角膜、上皮、成長板、骨、軟骨、靭帯、筋肉、及び皮膚組織からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項５に記載の組織癒合用組成物の製造方法。
幹細胞及び幹細胞由来の細胞外基質を有効成分として含む、組織接着特性を有する組織癒合用組成物。