CN117844744A - 一种软骨-黏膜复合组织及其构建方法和应用 - Google Patents
一种软骨-黏膜复合组织及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种软骨‑黏膜复合组织及其构建方法和应用，所述软骨‑黏膜复合组织的构建方法包括以下步骤：将软骨细胞种植于胶原水凝胶‑海绵支架上，于成软骨培养基中培养，形成组织工程软骨；获取黏膜组织样本，在中性蛋白酶溶液中孵育，孵育完成后剥下黏膜组织的上皮层；将黏膜组织的上皮层剪成组织块，将组织块均匀放置于组织工程软骨之上，然后于黏膜上皮‑软骨培养基中培养，即得软骨‑黏膜复合组织。本发明中构建方法构建形成了具有适当力学强度的非角化的软骨‑黏膜复合组织，具有高稳定性、高生物相容性，操作简单，仅需少量组织来源，更好地模拟睑板结膜的生理学结构以及支撑眼睑形态、润滑保护眼表的功能，重建眼睑后层的形态与功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程技术领域，具体地，涉及一种软骨-黏膜复合组织及其构建方法和应用。
背景技术
眼睑是面部的重要器官。外伤、肿瘤、先天性畸形等疾病可能导致眼睑缺损，影响面部的美学与功能。眼睑在解剖学上可以分为前板(由皮肤和眼轮匝肌构成)和后板(由睑板和睑结膜构成)。其中，组成眼睑后板的睑板与睑结膜是眼睑的重要结构，睑板主要由致密的结缔组织、丰富的弹力纤维和大量睑板腺所组成，为眼睑提供支持和维持其结构。睑结膜是由含杯状细胞的复层柱状上皮和少量结缔组织形成的，衬在眼睑内面的透明薄膜，分泌粘液提供润滑，使眼球运动更加便捷，同时保护与稳定眼球表面。
当眼睑后板因为先天性或后天性的原因缺如时，往往表现为睑板以及睑结膜同时缺如，此时需要使用睑板-结膜替代物于缺损处进行修补，以重建眼睑的形态与功能，同时避免睑板替代物直接接触角膜引起眼部不适与角膜并发症。
因此，理想的眼睑后板替代物需要同时具有以下特征：合适的机械力学特征以支撑眼睑的形状与运动，以及一层黏膜上皮层来保护及润滑眼表，减少眼睑与眼表的摩擦。
目前在临床上常用的重建策略是采用具有一定机械强度的睑板替代物，包括自体移植物(自体耳软骨、硬腭、鼻软骨等移植物)、异体移植物(脱细胞真皮等)、人工合成材料(多孔聚乙烯、聚己内酯等)，对于睑板缺损进行修补，再让缺损周围的睑结膜于睑板替代物表面自行再生，但是对于较大面积的结膜缺损，结膜自行上皮化再生结果往往不佳，易造成眼表炎症、瘢痕形成等后遗症。若额外增加黏膜替代物对结膜进行修复，则存在操作繁复，稳定性低等问题，且无法完全模拟眼睑后板生理结构，达到良好的睑板-结膜双层组织的功能与结构的重建。此外，目前常用的替代物自身均存在一定局限性：自体移植物易导致供区受损；异体移植物则有免疫排斥等导致的低稳定性与低安全性的问题；人工合成材料则因其低生物相容性易造成术后并发症。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种软骨-黏膜复合组织及其构建方法和应用，本发明提供的软骨-黏膜复合组织的构建方法中，仅仅使用一型胶原与自体细胞，同时构建组织工程软骨以及黏膜层，经过体外共培养，真正意义上构建了复合的双层软骨-黏膜组织，操作便捷，未引入其他材料，形成更符合天然器官的组织学结构，且更具有安全性与稳定性。
本发明第一方面提供了一种软骨-黏膜复合组织的构建方法，所述软骨-黏膜复合组织为睑板-结膜替代物，所述软骨-黏膜复合组织的构建方法包括以下步骤：
(1)将软骨细胞种植于支架上，培养形成组织工程软骨；
(2)获取黏膜组织样本，处理获得黏膜上皮层；
(3)将黏膜上皮层处理为小组织块，种植于组织工程软骨上，共培养至预定时间，获得同时具有黏膜上皮组织结构以及软骨组织结构的软骨-黏膜复合组织。
在本发明的一实施方式中，所述软骨细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)获取直径2-4mm的耳软骨组织样本，将获取的软骨组织样本清洗消毒后剪碎，向剪碎的软骨组织样本中加入NB4胶原酶溶液序贯消化，获得软骨细胞悬液；
(2)将获得的软骨细胞悬液种植于培养皿上，于增殖培养基中传代培养，获得大量的软骨细胞。
在本发明的一实施方式中，序贯消化包括以下步骤：
(1)在无菌手术条件取耳软骨组织片，经消毒清洗后，分离去除软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为较小的耳软骨碎片；
(2)在所述耳软骨碎片中加入NB4胶原酶溶液消化2-4h，将含软骨碎片的酶溶液过滤后通过离心获取第一批消化所得软骨细胞；
(3)再将过滤出的未消化的软骨片段继续进行2-4小时的消化，获得第二批消化所得软骨细胞；
(4)重复步骤(2)-(3)至软骨组织消化完全，将所有消化所得软骨细胞混合即得软骨细胞悬液。
在本发明的一实施方式中，所用的软骨细胞为第2-4代软骨细胞。
在本发明的一实施方式中，软骨细胞种植的支架为一型胶原-海绵水凝胶支架，所述一型胶原-海绵水凝胶支架由一型胶原水凝胶包被于一型胶原海绵支架的一个表面获得。
在本发明的一实施方式中，使用的一型胶原水凝胶浓度为1-10mg/ml，一型胶原海绵支架表面孔隙率为100～500um。
在本发明的一实施方式中，软骨细胞接种于一型胶原-水凝胶海绵支架的海绵支架面上。
在本发明的一实施方式中，将软骨细胞种植于支架上，于成软骨培养基中培养4-20天获得组织工程软骨。
在本发明的一实施方式中，所述成软骨培养基的组成如下：DMEM培养基、10％-20％胎牛血清、0％-5％青霉素-链霉素-谷氨酰胺、0％-5％N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、0％-5％丙酮酸钠、1-10ng/ml重组人转化生长因子β3、1-20μg/mL胰岛素、0.1mM-1mM抗坏血酸2-磷酸三钠盐。
在本发明的一实施方式中，获取的黏膜上皮层的大小为1-10mm2。
在本发明的一实施方式中，所述黏膜组织样本为口腔黏膜组织样本、鼻黏膜组织样本、结膜组织样本中的至少一种。
在本发明的一实施方式中，黏膜组织的上皮层获取方法如下：将黏膜组织清洗消毒后，在中性蛋白酶溶液中37℃孵育至黏膜层可以通过机械剥离，孵育完成后用无菌的器械剥下黏膜组织上皮层。
在本发明的一实施方式中，黏膜上皮组织接种于组织工程软骨未接种软骨细胞的一面上，即一型胶原-水凝胶海绵支架的水凝胶面。
在本发明的一实施方式中，黏膜上皮组织接种于组织工程软骨后，一同于黏膜上皮-软骨培养基中共同培养。
在本发明的一实施方式中，所述黏膜上皮-软骨培养基的组成如下：DMEM/F12培养基、10％-20％胎牛血清、0％-5％青霉素-链霉素-谷氨酰胺、0％-5％N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、1-20ng/ml重组人表皮生长因子、1-20μg/mL胰岛素、0.1ug-5ug/ml霍乱毒素、1-10ng/ml重组人转化生长因子β3、0.1mM-1mM抗坏血酸2-磷酸三钠盐。
在本发明的一实施方式中，黏膜上皮组织接种于组织工程软骨上后，共同于黏膜上皮-软骨培养基中首先浸没培养5-10天，后以气液平面培养的方式于黏膜上皮-软骨培养基中培养5-10天。本发明第二方面提供了一种软骨-黏膜复合组织，所述软骨-黏膜复合组织为睑板-结膜替代物，所述软骨-黏膜复合组织由上述所述构建方法构建所得。
本发明第三方面提供了上述软骨-黏膜复合组织在制备睑板-结膜替代物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、完全模拟眼睑后板组织学结构与功能：本发明提供的软骨-黏膜复合组织的构建方法中，同时构建了组织工程软骨以及黏膜层，经过体外共培养，真正意义上构建了复合的双层软骨-黏膜组织，形成更符合天然器官的组织学结构。此外，本发明方法构建的软骨-黏膜复合组织具有适当力学强度与一层成熟的黏膜上皮层，能更好地重建眼睑后板双层的形态与功能。
2、操作简便，高生物相容性，安全稳定：本发明仅采用临床上成熟使用的一型胶原材料以及自体细胞进行移植物的构建，未引入异体生物材料或人工合成材料，安全稳定，生物相容性高，无免疫排斥及外来病原感染等问题，且操作简便，易于实施，保证了重建结果的稳定性。
3、低供区损伤：本发明提供的软骨-黏膜复合组织的构建方法中，只需取小直径的耳软骨组织片与较小面积的口腔黏膜组织在体外胶原蛋白支架上进行扩增与培养，即可获得合适大小的软骨-黏膜复合组织作为睑板结膜替代物以进行眼睑缺损的修复，相对于传统的自体移植物来说有效减少了供区部位的损伤。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明中软骨-黏膜复合组织构建方法的流程图；
图2为实施例1中一型胶原水凝胶-海绵支架的组织学结果(图中箭头所指为水凝胶)；
图3为实施例1构建所得的软骨-黏膜复合组织的番红O(Safranine O)染色及II型胶原蛋白(Col II，标记为红色荧光)、角蛋白4(CK4，标记为绿色荧光)免疫荧光染色结果；
图4为未接种细胞的一型胶原-水凝胶海绵支架和实施例1制备的培养1，2，4周的软骨-黏膜复合组织(简称为构建物)的力学性能对比，其中图4中左图为拉伸曲线，右图为拉伸模量的数据对比；
图5为实施例2中术后8周兔双眼照片；
图6为实施例2中正常眼睑、术后8周实验组和术后8周对照组眼睑的番红O染色结果；
图7为实施例2中正常眼睑、术后2周实验组和术后2周对照组睑结膜的CK4、MUC5AC免疫荧光染色结果；
图8为实施例2中正常眼睑、术后2周实验组和术后2周对照组睑结膜的结膜层数及杯状细胞密度统计学分析比较结果图。
图9为实施例2中术后24周实验组和术后24周对照组的兔双眼照片及眼睑番红O染色结果。
图10为实施例3中提出的双层复合打印结构的设计图。
图11为实施例3中打印的结构大体图，其中：
A.打印的一型胶原水凝胶(左图)及纯PCL支架(右图)；
B.打印出的PCL-细胞水凝胶复合结构大体照片。
图12为实施例3中含活细胞的水凝胶打印结构活死染色及定量统计结果.
图13为实施例3中打印的PCL-软骨细胞水凝胶结构于体外成软骨培养1-3周的番红O染色结果及体视镜下大体表现(白色虚线表示组织学切面)。
图14为实施例3中打印的PCL-软骨细胞水凝胶结构于体外成软骨培养1-3周的II型胶原蛋白(Col II)免疫荧光染色结果。
图15为实施例3中打印的不含细胞的水凝胶以及不同比例PCL-软骨细胞水凝胶结构于体外成软骨培养3周拉伸模量及弯曲模量结果对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
理想的眼睑后板替代物的特征包括足以支撑眼睑形状的合适机械力学特性，以及一层保护和润滑眼表的黏膜上皮层。目前临床上采用的重建策略主要包括以下方法：自体移植物(如自体软骨与黏膜等)、异体移植物(如脱细胞真皮等)以及人工合成材料(如多孔聚乙烯等)。然而，对于较大面积的眼睑后板缺损，这些修复方法对于结膜的重建往往不理想，可能引发眼表炎症、瘢痕形成等后遗症。若额外采用结膜替代物(如自体黏膜、脱细胞羊膜等)对于结膜进行修复，则一方面操作复杂，增加了植入物引起异物反应的风险，另一方面还存在结合不稳定、双层结构易脱开及丢失等问题，无法完全模拟眼睑后板精细且薄层的复合组织结构，无法同时完全重建眼睑后板支持作用和润滑作用。
此外，目前临床常用的移植物本身也存在很多问题，例如，(1)自体来源的移植物由于取材于自身的组织，来源十分有限，对于眼睑后板大面积缺损的患者，在自体耳软骨、硬腭、鼻中隔软骨等供区大量取材，会导致供区部位受损，造成出血、供体区域畸形、瘢痕形成等并发症，影响患者的生活质量；(2)人工合成材料由于难以完全模拟天然组织的生物学结构，具有较低的生物相容性，导致疼痛、植入物位置偏移、植入物暴露等术后并发症；(3)而来源于异体的组织，不仅可能有传播传染性疾病的风险，还可能引起免疫排斥性，导致局部炎症，使重建结果欠佳。
因此，本发明提出了一种软骨-黏膜复合组织，利用耳软骨细胞与黏膜细胞构建的组织工程睑板-结膜复合替代物。
本发明提出的构建方法，构建了双层活细胞的结构，更加接近于眼睑后板的天然组织学结构，可以同时对睑板层和结膜层进行重建，改善了眼睑后板重建的效果。在本发明的构建方法中，采用了体外扩增细胞的方式，减少了对供区部位的需求，以降低术后并发症的发生。本发明提出的方法采用自体细胞和已在临床上成熟使用的一型胶原来构建工程化移植物，避免了引入其他异体或人工合成物质可能带来的疾病传播风险和免疫排斥问题，提高了稳定性和安全性。此外，本发明提出的方案通过体外共同培养的方式，同时构建软骨层和黏膜层，操作相对简便且培养时间较短，实现了真正的复合组织的构建，增加了替代物结构的稳定性。
以下通过下面结具体实施例对本发明进行详细说明。
以下实施例和/或对比例中所用培养基的配制如下：
(1)软骨培养基：含10％胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素-谷氨酰胺、10mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、1mM丙酮酸钠、10ng/mL重组人转化生长因子β3、10μg/mL胰岛素、0.1mM抗坏血酸2-磷酸三钠盐的Dulbecco的改良Eagle培养基。
(2)传代培养基：DMEM+10％FBS+1～10ng/ml重组人转化生长因子β1+1～10ng/ml成纤维细胞生长因子2。
(3)黏膜上皮-软骨培养基：含10％胎牛血清，100U/ml青霉素-链霉素-谷氨酰胺，50mg/ml庆大霉素，10ng/ml重组人上皮生长因子，10μg/mL胰岛素，0.1ug/ml霍乱毒素、10ng/mL重组人转化生长因子β3、0.1mM抗坏血酸2-磷酸三钠盐的1:1Dulbecco的改良Eagle培养基/Ham's F-12营养混合物培养基。
上述三种培养基经0.22μm无菌过滤器进行消毒，4℃保存备用。
实施例1
本实施例提供了一种软骨-黏膜复合组织的构建方法，通过该方法构建所得软骨-黏膜复合组织能够应用于制备睑板-结膜替代物。
本实施例中获取的耳软骨与口腔黏膜来自上海交通大学附属第九人民医院整复外科确诊的睑板缺损患者。
本实施例中的软骨-黏膜复合组织的构建方法具体包括以下步骤：
(1)一型胶原-水凝胶海绵支架制备：在超净台中使用3mg/ml的一型胶原水凝胶300ul滴至一型胶原蛋白海绵支架表面(大小为10mm×5mm×1mm，购自北京益尔康生物工程有限公司)，置入37℃培养箱中至凝胶成型，取出备用；其中，需要说明的是一型胶原-水凝胶海绵支架的海绵支架面指的是支架滴未加水凝胶的一面，而水凝胶面指的是胶原支架滴加水凝胶的另一面。
(2)在无菌手术条件下使用活检钻取来源于患者的直径为2mm的耳软骨组织片，经0.25％氯霉素溶液消毒与无菌PBS清洗后，在超净台内，分离去除软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为1mm×1mm的耳软骨碎片；
(3)在所述耳软骨碎片中加入1.5mg/mL的NB4胶原酶溶液消化6h，得到软骨细胞悬液；
(4)取步骤(3)得到的软骨细胞悬液，接种于细胞培养皿上，加入至传代培养基中进行传代培养；
(5)取传代至第2代的软骨细胞，以4×104个细胞/mm3的密度种植于步骤(1)中一型胶原-水凝胶海绵支架的海绵支架面上，加入成软骨培养基，置于37℃、5％二氧化碳条件培养箱中培养1周，形成基于胶原海绵支架的组织工程软骨；
(6)在无菌手术条件下取同一患者的约2×3mm大小口腔黏膜，经抗真菌-抗生素消毒半小时，无菌PBS清洗后，加入在1.2U/ml的中性蛋白酶溶液中37℃孵育2-3小时，孵育完成后用无菌的手术刀与镊子去除上皮层下的基质组织获得上皮组织层；
(7)收集消化好获得的上皮组织，用无菌手术刀切割为较小的组织块，均匀放置于步骤(5)中培养1周获得的组织工程软骨的水凝胶面上，置于37℃、5％二氧化碳条件培养箱中，分为三组，三组分别于黏膜上皮-软骨培养基中培养1周、2周、4周，获得口腔黏膜-组织工程软骨复合移植物。
试验例1
通过实施例1中构建方法构建所得软骨-黏膜复合组织能够应用于制备睑板-结膜替代物，本试验例中对实施例1中所得软骨-黏膜复合组织的性能进行测定。
(1)对实施例1中所得一型胶原水凝胶包被胶原海绵支架的组织学特性进行测定；
一型胶原水凝胶包被胶原海绵支架于4％多聚甲醛固定1小时，脱水后石蜡包埋，以4um厚度制成石蜡切片。采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining，HE染色)对于一型胶原水凝胶-海绵支架进行组织学特性的鉴定，结果如图2所示，以大小为10mm×5mm×1mm的未经处理的一型胶原蛋白海绵支架作为对照，结果显示，与未处理的支架对比，制备的支架在在上方的位置可见疏松的胶原海绵支架孔隙之间水凝胶的填充，形成了孔隙率上密下疏双层的结构，其中较小的孔隙率适合黏膜细胞增殖生长，而较大的孔隙率适合软骨细胞外基质的沉积，表面本实施例制备的一型胶原-水凝胶海绵支架适合黏膜-软骨双层结构的构建。
(2)对实施例1中构建所得软骨-黏膜复合组织的组织学特性进行测定
将实施例1中于黏膜上皮-软骨培养基中培养2周构建所得软骨-黏膜复合组织于4％多聚甲醛固定24小时，脱水后石蜡包埋，以4um厚度制成石蜡切片。采用番红O-固绿染色(Safranine O staining，染色试剂盒来自北京索莱宝科技有限公司)，角蛋白4(cytokeratin4，CK4)及II型胶原蛋白(Collagen type II，Col II)的免疫荧光染色(CK4抗体购买自Sigma-Aldrich公司，Col II抗体购买自上海帛龙生物科技有限公司)，综合评价本实施例制备的黏膜-软骨复合移植物的组织学特性。结果如图3所示，本实施例构建的移植物有清晰的双层黏膜-软骨结构，番红O染色阳性，说明软骨层具有丰富的糖胺聚糖；荧光染色显示软骨层II型胶原蛋白阳性，黏膜层角蛋白4阳性，表明本实施例1中构建所得软骨-黏膜复合组织是在组织学上是由成熟的软骨结构和黏膜结构构成。
(3)对实施例1中构建所得软骨-黏膜复合组织的力学性能进行测定
采用拉伸应力试验测试对实施例1中构建所得软骨-黏膜复合组织的力学性能，以步骤(1)中构建的与组织大小相同(10mm×5mm×1mm)的未接种细胞的一型胶原-水凝胶海绵支架作为对照。使用动态机械分析Q800系统(美国TA仪器)对实施例1中构建所得软骨-黏膜复合组织进行测试，以确定以下内容：(1)拉伸-伸长曲线，在0.5N的预拉力和2mm/min的恒定应变速率下获得，直至断裂；以及(2)拉伸模量，应力-应变曲线线性部分的斜率。只有在构建物中部出现明显断裂点时才收集数据。
结果如图4所示，与未接种细胞的一型胶原-水凝胶海绵支架相比，实施例1中共同培养时间分别为1周、2周、4周构建所得软骨-黏膜复合组织拉伸的应力-应变曲线斜率明显增加，拉伸模量均明显增加，说明实施例1中构建所得软骨-黏膜复合组织在培养2-4周时具有更大的弹性，从而可以更好地包裹眼球，支撑与维持眼睑的形态与正常活动。
实施例2
本实施例提供了一种兔来源的软骨-黏膜复合组织的构建方法，通过该方法构建的软骨-黏膜复合组作为睑板-结膜替代物，并植入兔子眼睑后板的缺损处，用以评价本发明制备方法制得软骨-黏膜复合组织用于制备睑板-结膜替代物的治疗性能。
1、兔子自体口腔黏膜-组织工程软骨复合移植物的制备
(1)胶原支架包被：在超净台中使用3mg/ml的一型胶原水凝300ul滴至一型胶原蛋白海绵支架表面(大小为10mm×5mm×1mm)，置入37℃培养箱中至凝胶成型，取出备用；
(2)在无菌手术条件下使用活检钻取来源于新西兰白兔的直径2mm的耳软骨组织片，经0.25％氯霉素溶液消毒与无菌PBS清洗后，在超净台内，分离去除软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为1mm×1mm的耳软骨碎片。
(3)在所述耳软骨碎片中加入1.8mg/mL的NB4胶原酶溶液消化8h，得到软骨细胞悬液，其中，每1g耳软骨碎片加入1mL所述的NB4胶原酶溶液；
(4)取适量步骤(2)得到的软骨细胞悬液，接种于细胞培养皿上，加入培养基进行传代培养；
(5)取传代至第3代的软骨细胞，以4×104个细胞/mm3的密度种植于步骤(1)中一型胶原-水凝胶海绵支架的海绵支架面上，加入成软骨培养基，置于37℃、5％二氧化碳条件培养箱中培养1周，形成兔子自体组织工程软骨。
(6)在无菌手术条件下取同一只新西兰兔的约2×2mm大小口腔黏膜，经抗真菌-抗生素消毒半小时，无菌PBS清洗，加入在2.4U/ml的中性蛋白酶溶液中37℃孵育2小时，孵育完成后用无菌的手术刀与镊子去除上皮层下的基质组织获得上皮组织层；
(7)收集消化好获得的上皮组织，用无菌手术刀切割为1mm2大小的组织块，均匀放置于步骤(5)中培养1周获得的组织工程软骨的水凝胶面上，置于37℃、5％二氧化碳条件培养箱中，于黏膜上皮-软骨培养基中培养2周，获得口腔黏膜-组织工程软骨复合移植物。
(8)在同一只新西兰兔的双眼上眼睑分别制造距离睑缘2mm的、大小为8×4mm的睑板-结膜缺损，将步骤(7)培养好的自体口腔黏膜-组织工程软骨复合移植物修剪为合适的大小，缝合于兔的右眼眼睑缺损处，作为实验组；左眼眼睑在构建睑板-结膜缺损后不做任何处理，作为对照组。共对15只兔子双眼进行手术，并设立2周(睑结膜快速重建结果的观察)，8周(眼睑形态重建结果的观察)及24周(观察眼睑重建的长期表现)后观察兔子眼睑的恢复情况，每个时间点随机选取5只兔子进行拍照记录，然后处死兔子取双侧眼睑组织，进行包埋切片和组织学染色。
2、实验结果
如图5所示，术后8周，实验组右眼外观正常，睑缘线条流畅清晰，弧度正常；对照组左眼睑缘不平整，弧度欠流畅，局部有凹陷瘢痕形成(白色色箭头示)；眼睑结膜面可见，实验组结膜面光滑，未见明显瘢痕及挛缩，而对照组结膜显著瘢痕形成。
如图6所示，正常眼睑的睑板由致密的纤维组织和丰富的睑板腺构成，可为眼睑提供足够的支撑；实验组眼睑的睑板位置由植入的自体组织工程软骨替代，番红O染色阳性，表明软骨内存在丰富的II型胶原和基质，为眼睑提供充分的支撑；而对照组眼睑的睑板缺失，睑板处由瘢痕样纤维组织取代。
如图7所示，采用CK4及粘蛋白5ac(Mucin 5AC，MUC5AC)荧光染色对于重建的结膜进行评估(MUC5AC抗体购买自英国Abcam公司)。正常眼睑的睑结膜由4～6层复层的CK4阳性的结膜上皮细胞和MUC5AC阳性的分散于复层上皮之间的杯状细胞组成；术后2周，实验组睑结膜由3-6层连续的结膜上皮细胞构成，其间分散着杯状细胞；而对照组的睑板上无法形成单层连续上皮，并且没有杯状细胞存在。
如图8所示，对于结膜层数(由免疫荧光染色中CK4阳性的层数计算)及镜下每视野杯状细胞密度(由免疫荧光染色中每视野下MUC5AC阳性的细胞数计算)的统计显示，对照组结膜层数明显减少，再生的结膜上皮缺少杯状细胞，而实验组的结膜层数与正常睑结膜无明显差异，杯状细胞则略少于正常睑结膜，显著高于对照组。
如图9所示，术后24周，实验组右眼外观及弧度正常，未见明显挛缩畸形；对照组左眼睑缘畸形，有凹陷瘢痕形成(白色色箭头示)；番红O染色显示，实验组中植入的软骨部分转归为纤维组织；对于睑结膜组织学结构的观察可见，实验组重建的睑结膜长期为多层、平整的上皮结构，而对照组睑结膜仅1-3层，且不均匀。
由以上结果可知，实验组通过在睑板缺损处植入自体口腔黏膜-组织工程软骨复合移植物作为睑板-结膜替代物，可以为眼睑提供足够的支撑，并有效重建了结膜上皮，保持了其稳定性和杯状细胞的密度，成功地修复了眼睑后板缺损，达成了形态与功能的同时重建，且具有长期的安全性与稳定性。
实施例3
本实施例提供了一种3D打印构建的活细胞双层黏膜-软骨复合组织。采用人耳软骨细胞结合高分子材料、水凝胶通过3D打印技术构建成黏膜-软骨复合组织，用于人眼睑缺损修复。其中由人耳软骨细胞及高分子材料构建的软骨层用于替代睑板，并维持眼睑的形态；由水凝胶打印的促黏膜生长层用于替代结膜，发挥促进结膜生长，润滑眼球，减少角膜刺激的功能。本实施例中构建的复合组织可以同时具有支撑、润滑的重要功能，且可以根据不同患者的缺损情况进行个性化的结构设计，真正实现功能、美观以及个性化的修复结果。
本实施例中利用3D打印技术，将细胞、生长因子和支架结合在一起形成一个完整的整体结构，同时打印双层结构，实现双层结构的同步构建；利用3D打印技术模拟天然组织器官的三维结构，增加构建的准确性，以便替代物模拟天然组织的生理功能；利用3D打印技术，结合患者影像学建模，构建符合患者个性化器官结构的移植物。
本实施例中的3D打印构建的活细胞双层黏膜-软骨复合组织通过以下步骤构建所得：
1、试剂的配制
软骨培养基：含10％胎牛血清、100U/mL青霉素-链霉素-谷氨酰胺、10mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、1mM丙酮酸钠、10ng/mL重组人转化生长因子β3、10μg/mL胰岛素、0.1mM抗坏血酸2-磷酸三钠盐的Dulbecco的改良Eagle培养基。
传代培养基：DMEM+10％FBS+1～10ng/ml重组人转化生长因子β1+1～10ng/ml成纤维细胞生长因子2。
2、软骨细胞的准备
(1)在无菌手术条件下使用活检钻取来源于患者的直径为2mm的耳软骨组织片，经0.25％氯霉素溶液消毒与无菌PBS清洗后，在超净台内，分离去除软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为1mm×1mm的耳软骨碎片。
(2)在所述耳软骨碎片中加入1.5mg/mL的NB4胶原酶溶液消化6h，得到软骨细胞悬液，其中，每1g耳软骨碎片加入1mL所述的NB4胶原酶溶液；
(3)取适量步骤(2)得到的软骨细胞悬液，接种于细胞培养皿，加入培养基进行传代培养；
3、GelMA水凝胶细胞悬液溶液制备：
(1)配制浓度0.25％的LAP引发剂(苯基磷酸锂盐，lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate)标准溶液：打开包装，取20ml PBS，加入含LAP的棕色瓶中，40-50℃水浴加热15分钟，震荡数次；
(2)用引发剂标准溶液配制5％度的GelMA(Gelatin Methacryloyl，甲基丙烯酰化明胶)水凝胶溶液：称量1g GelMA放入离心管中，裹上锡箔纸，加入引发剂溶液，60-70℃水浴20-30分钟，震荡数次；溶解后带入超净台内，使用0.22um滤器过滤
(3)取出传到第3代的软骨细胞，消化后计数，将细胞以配制1×106/ml GelMA的细胞悬液：重悬所需的GelMA量＝细胞总数(百万)/10×1ml，共制备30-40ml左右的生物墨水；
4、复合结构的打印
(1)软骨层打印：使用PCL(Polycaprolactone，聚己内酯)和GelMA细胞悬液共打印，打印设计模型见图10右图，固化方式为紫外光照射固化。
(2)黏膜再生层打印：使用3mg/ml的一型胶原水凝胶进行打印，打印设计模型见图10左图，固化方式为37度半小时自然固化。
(3)打印结构培养：将打印的结构无菌PBS清洗后，加入于成软骨培养基，于37℃培养箱中进行培养1，2，3周。
5、结构检验及结果
对本实施例制备得到的双层复合打印结构进行打印微观结构准确性、打印细胞活性、组织学特性、生物力学性能等测定，从而达到质控目的。
(1)打印结构准确性：采用放大照片拍摄双层打印的微观结构以及手动测量的方式评估打印的准确性。如图11所示，打印的水凝胶以及PCL-细胞结构均具有准确且均匀分布的微观结构(PCL为乳白色线状结构，含细胞水凝胶为透明线状结构)，且测量微观结构数据符合打印建模数据，证明了打印结构的准确性。
(2)打印结构细胞活性的鉴定：采用活死细胞染色(Live/dead染色)来验证打印出来的结构的细胞活性，活死细胞染色试剂盒购买自赛默飞公司，染色后立刻于共聚焦荧光显微镜下查看染色情况。细胞活性与打印方式以及水凝胶紫外线固化时间均相关。如图12所示，含软骨细胞的GelMA水凝胶打印结构在紫外线固化大于3秒时可以维持形态。活死细胞染色结果显示，在荧光显微镜下活细胞染上绿色荧光，死细胞则染上红色荧光，镜下图片证明细胞在打印结构中分布均匀，通过ImageJ软件对于不同荧光定量统计，显示在紫外线固化5秒以下时细胞存活率大于百分之九十，证明打印结构中的细胞有较高的活性。
(3)活细胞复合打印结构的组织学特性测定
采用番红O染色、II型胶原蛋白(Col II)免疫荧光染色，综合评价本实施例制备的打印结构的组织学特性。
采用来自北京索莱宝科技有限公司的番红O-固绿染色试剂盒对于冰冻切片进行染色，结果如图13所示，本实施例构建的复合打印结构在体外培养1，2，3周时维持了打印的微观结构，含软骨细胞的水凝胶在3周时有清晰的软骨细胞结构，番红O染色阳性，说明具有丰富的糖胺聚糖。采用购买自上海帛龙生物科技有限公司的Col II抗体对于冰冻切片免疫荧光染色，如图14所示，含细胞的水凝胶II型胶原蛋白阳性(在荧光显微镜下为红色)，表明本实施例打印获得的PCL-水凝胶复合软骨结构是在组织学上没有发生肥大的稳定软骨。
(4)活细胞复合打印结构的力学性能测定
采用拉伸应力试验测试本实施例制备的复合打印结构的力学性能，以不含细胞的纯GelMA水凝胶支架作为对照。使用动态机械分析Q800系统(美国TA仪器)对构建物进行测试，以确定以下内容：(1)拉伸-伸长曲线，在0.5N的预拉力和2mm/min的恒定应变速率下获得，直至断裂；以及(2)拉伸模量，应力-应变曲线线性部分的斜率。只有在构建物中部出现明显断裂点时才收集数据。
结果如图15所示，与未接种细胞的GelMA水凝胶相比，本实施例制备的复合打印结构拉伸模量明显增加，说明复合结构具有更大的弹性与硬度，且可以根据调整两种打印材料的比例进行力学强度的调节，从而可以更好地适应患者的情况，更好地包裹眼球，支撑眼睑结构，维持眼睑的正常活动。
本实施例中采用高分子材料和细胞水凝胶交错的特殊微观3D打印结构来构建支撑架构作为修复替代物(软骨-黏膜复合组织)，一方面高分子材料具有较强的支撑性和较慢的降解速度，可以维持长时间的形状稳定，另一方面包裹自体软骨细胞的水凝胶增加了材料的生物相容性，且形成软骨组织，使此替代组织能够长期存在，而且通过调整两种打印材料的比例进行力学强度的调节，从而可以更好地模拟各种情况下替代物需要重建的支撑功能强度，达到更好的修复效果。
本实施例提供了一种3D打印构建的活细胞双层黏膜-软骨复合组织进行眼睑后板替代物修复，同时进行双层结构的修复，一方面模拟了眼睑后板的天然组织学结构，另一方面有效改善了眼睑后板的功能修复结果，相比分开修复双层组织的替代物，具有更好的功能性与稳定性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
Claims (18)
1.一种软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，所述软骨-黏膜复合组织的构建方法包括以下步骤：
(1)将软骨细胞种植于支架上，培养形成组织工程软骨；
(2)获取黏膜组织样本，处理获得黏膜上皮层；
(3)将黏膜上皮层处理为小组织块，种植于组织工程软骨上，共培养至预定时间，获得同时具有黏膜上皮组织结构以及软骨组织结构的软骨-黏膜复合组织。
2.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，所述软骨细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)获取直径2-4mm的耳软骨组织样本，将获取的软骨组织样本清洗消毒后剪碎，向剪碎的软骨组织样本中加入NB4胶原酶溶液序贯消化，获得软骨细胞悬液；
(2)将获得的软骨细胞悬液种植于培养皿上，于增殖培养基中传代培养，获得大量的软骨细胞。
3.根据权利要求2所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，序贯消化包括以下步骤：
(1)在无菌手术条件取耳软骨组织片，经消毒清洗后，分离去除软骨表面的皮肤和软骨膜，剩余部分进一步处理为较小的耳软骨碎片；
(2)在所述耳软骨碎片中加入NB4胶原酶溶液消化2-4h，将含软骨碎片的酶溶液过滤后通过离心获取第一批消化所得软骨细胞；
(3)再将过滤出的未消化的软骨片段继续进行2-4小时的消化，获得第二批消化所得软骨细胞；
(4)重复步骤(2)-(3)至软骨组织消化完全，将所有消化所得软骨细胞混合即得软骨细胞悬液。
4.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，所用的软骨细胞为第2-4代软骨细胞。
5.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，软骨细胞种植的支架为一型胶原-海绵水凝胶支架，所述一型胶原-海绵水凝胶支架由一型胶原水凝胶包被于一型胶原海绵支架的一个表面获得。
6.根据权利要求5所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，使用的一型胶原水凝胶浓度为1-10mg/ml，一型胶原海绵支架表面孔隙率为100～500um。
7.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，软骨细胞接种于一型胶原-水凝胶海绵支架的海绵支架面上。
8.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，将软骨细胞种植于支架上，于成软骨培养基中培养4-20天获得组织工程软骨。
9.根据权利要求8所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，所述成软骨培养基的组成如下：DMEM培养基、10％-20％胎牛血清、0％-5％青霉素-链霉素-谷氨酰胺、0％-5％N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、0％-5％丙酮酸钠、1-10ng/ml重组人转化生长因子β3、1-20μg/mL胰岛素、0.1mM-1mM抗坏血酸2-磷酸三钠盐。
10.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，获取的黏膜上皮层的大小为1-10mm2。
11.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，所述黏膜组织样本为口腔黏膜组织样本、鼻黏膜组织样本、结膜组织样本中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，黏膜组织的上皮层获取方法如下：将黏膜组织清洗消毒后，在中性蛋白酶溶液中37℃孵育至黏膜层可以通过机械剥离，孵育完成后用无菌的器械剥下黏膜组织上皮层。
13.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，黏膜上皮组织接种于组织工程软骨未接种软骨细胞的一面上，即一型胶原-水凝胶海绵支架的水凝胶面。
14.根据权利要求1所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，黏膜上皮组织接种于组织工程软骨后，一同于黏膜上皮-软骨培养基中共同培养。
15.根据权利要求14所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，所述黏膜上皮-软骨培养基的组成如下：DMEM/F12培养基、10％-20％胎牛血清、0％-5％青霉素-链霉素-谷氨酰胺、0％-5％N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、1-20ng/ml重组人表皮生长因子、1-20μg/mL胰岛素、0.1ug-5ug/ml霍乱毒素、1-10ng/ml重组人转化生长因子β3、0.1mM-1mM抗坏血酸2-磷酸三钠盐。
16.根据权利要求14所述的软骨-黏膜复合组织的构建方法，其特征在于，黏膜上皮组织接种于组织工程软骨上后，共同于黏膜上皮-软骨培养基中首先浸没培养5-10天，后以气液平面培养的方式于黏膜上皮-软骨培养基中培养5-10天。
17.一种软骨-黏膜复合组织，其特征在于，所述软骨-黏膜复合组织为睑板-结膜替代物，所述软骨-黏膜复合组织由权利要求1-16任一项所述构建方法构建所得。
18.权利要求17所述的软骨-黏膜复合组织在制备睑板-结膜替代物中的应用。
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