CN110225763B - 使用纤维蛋白支持物进行视网膜色素上皮移植的方法和材料 - Google Patents

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Abstract

该文献提供了用于进行视网膜色素上皮移植的方法和材料。例如，提供了用于使用纤维蛋白支持物进行视网膜色素上皮移植的方法和材料。

Description

使用纤维蛋白支持物进行视网膜色素上皮移植的方法和材料
背景技术
1.技术领域
本文涉及视网膜色素上皮移植。例如，本文涉及使用纤维蛋白支持物进行视网膜色素上皮移植的方法和材料。
2.背景信息
黄斑变性疾病代表多种疾病和病因，但通常源于视网膜色素上皮(RPE)功能障碍。RPE功能中涉及的蛋白质突变引起遗传性黄斑变性，包括卵黄样变(bestrophinopathies)。卵黄样变(例如，Best疾病)起因于Best1基因的突变，导致RPE功能障碍引起最终的感光细胞死亡。先前已报道患病率为16,000-21,500分之一(Dalvin等,Ophthalmic Genet.,Epub:1-5(2016))。虽然遗传性黄斑变性罕见，但年龄相关性黄斑变性(AMD)是第一世界国家失明的主要原因。据估计，到2050年美国将有500万例病例。AMD是一种更复杂的免疫和血管功能疾病，其直接影响RPE功能。
将RPE替代用于治疗黄斑变性一直是近年来的一个热门焦点。干细胞技术的现代进步使胚胎(ES)和诱导多能(IPS)干细胞成为移植的有吸引力选项。多个报告显示了将两种干细胞来源向RPE谱系分化的能力(Sonoda等,Nat.Protoc.,4:662-673(2009)；Johnson等,Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619(2015)；Brandl等,NeuroMolecular Med.,16:551-564(2014)；Idelson等,Cell Stem Cell.,5:396-408(2009)；Carr等,Mol.Vis.,15:283-295(2009))。ES-RPE和IPS-RPE均显示出正常的RPE功能，包括细胞标志物，吞噬作用和色素沉着(Singh等,Ophthalmol.Vis.Sci.,54:6767-6778(2013))。
发明内容
本文涉及RPE移植。虽然已经体外成功实现了RPE移植，但是在向临床应用的转化中存在许多困难。最早的试验试图将RPE单细胞悬浮液递送至干性AMD患者的视网膜下腔(Peyman等,Ophthalmic Surg.,22:102-108(1991)；和Schwartz等,The Lancet.,379:713-720(2012))。这些研究显示安全功效，没有报道不良反应(Schwartz等,The Lancet.,379:713-720(2012)；Schwartz等,The Lancet.,385:509-516(2015)；和Schwartz等,Ophthalmol.Vis.Sci.,57:ORSFc1-9(2016))。然而，移植的特征在于RPE附着和存活率低。如所预期的，在视敏度中未检测到重大改善(Schwartz等，The Lancet.,385:509-516(2015))。
作为上皮细胞，细胞-细胞接触参与RPE存活和功能。随后的试验关注用于移植的RPE单层细胞的生长。最近的一项研究利用RPE的胶原凝胶培养和胶原酶的使用在移植前将单层分离为单个单元(Kamao等，Stem Cell Rep.,2:205-218(2014)；和Sun等，Stem Cells,33:1543-1553(2015))。用这种模型移植无支持RPE单层的动物研究表明移植后附着细胞活力的改善。然而，一个问题是无法通过外科手术维持平坦，无皱纹的单层。因此，可以在靶标外并且以结块表型观察到细胞附着。已经进行了该策略的第一次人体试验(Mandai等，NEng J Med.,376:1038-1046(2017))并且临床试验正在进行中。
为了克服单层的维持，一般的组织工程策略是在分化过程和随后的植入过程中利用合成聚合物基质作为RPE的基础支持物。目前处于临床试验中的两种材料包括聚对二甲苯(Hu等,Ophthalmic Res.,48:186-191(2012)；和Diniz等,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,54:5087-5096(2013))和聚酯(Stanzel等,Stem CellRep.,2:64-77(2014))。可以修饰这些材料以产生微孔并改善细胞附着(Lu等,Biomed.Microdevices,14:659-667(2012)；McHugh等,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,55:1754-1762(2014)；和Lai等,PLoS ONE.8:e54058(2013))。这些材料也会缓慢降解，从而能够通过长期RPE分化方案培养细胞。由于这种缓慢的降解，在植入数月至数年后，材料可以保留在RPE和脉络膜之间，引起对慢性炎症和纤维化、低渗透性和可能降低的RPE存活率的担忧。此外，由于材料的刚性，存在对下面的脉络膜损伤的担忧，如先前的动物研究中所见(Diniz等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,54:5087-5096(2013))。
本文提供了用于RPE移植的使用纤维蛋白支持物的方法和材料。纤维蛋白可以是在其自聚合单体的前体活化后自发形成的交联原纤维网络。纤维蛋白通常在伤口愈合期间构成生理性形成的凝块，并且具有活化、形成、降解和清除的充分表征的级联(Undas等，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,31:e88-e99(2011))。例如，纤维蛋白凝胶可以通过纤溶酶原激活成纤溶酶而迅速降解，该激活过程是由酶如组织纤溶酶原激活物(tPA)激活的过程。纤维蛋白通常被称为纤维蛋白胶，在临床中用作软组织手术切口期间的天然密封剂，并且可商购获得。本文使用的纤维蛋白可以是高度粘合的，可以具有生物力学刚性，可以是生物相容的，并且可以是可降解的。
为了证实纤维蛋白作为RPE移植的基材的适合性，纤维蛋白水凝胶形成薄层、刚性水凝胶的性质是变化的，所述刚性水凝胶具有用于在小时尺度上降解的限定参数。然后，将优化的条件应用于iPSC-RPE单层。研究了分离纤维蛋白-RPE(FRPE)植入物的能力。在每个步骤(包括水凝胶降解)后评估体外细胞活力和表型，以确保细胞用于移植的潜在功效。如本文所述，纤维蛋白水凝胶可用作RPE移植的临时顶侧置放基材或基底支持基材。例如，可以使用本文提供的RPE单层/纤维蛋白植入物进行RPE移植。纤维蛋白支架可位于RPE单层的顶侧或基侧，以改善RPE附着。在某些情况下，RPE可以在纤维蛋白支持物上生长，以形成具有基底支持的单层。可以切割这些培养物以开发用于植入的单个单元。在其他实例中，纤维蛋白支架可位于RPE单层的顶侧以改善RPE附着。在一些情况下，多个(例如，两个，三个，四个或更多个)RPE单层/纤维蛋白植入物的模块化拼接可以提供大面积覆盖，并且可以使用激光定位来实现递送位置的精确度。在一些情况下，纤维蛋白支架可以在手术期间使用例如tPA在受控条件下降解。
一般地，本文一个方面的特征在于一种视网膜植入物，其包含或基本上由以下组成：(a)具有顶部表面和基底表面的视网膜色素上皮单层，和(b)附着于单层的顶部表面和/或基底表面的纤维蛋白水凝胶层。纤维蛋白水凝胶层的厚度可为约20μm至约400μm。植入物可包含纤溶酶原。植入物可包含每mL约0.1U的纤溶酶原至每mL约40U的纤溶酶原。在一些情况下，植入物可包含每mL约0.001U的纤溶酶原至每mL约40U的纤溶酶原。在一些情况下，纤维蛋白水凝胶层可以自动获得。
在另一方面，本文的特征在于一种用于制造视网膜植入物或视网膜下植入物的方法。该方法包括或基本上由以下组成：(a)获得具有顶部表面和基底表面的视网膜色素上皮单层，和(b)将纤维蛋白原和凝血酶涂层沉积到单层的顶部表面上。涂层可以为约20μm至约400μm厚。该方法的涂层可包含每mL约20mg纤维蛋白原至每mL约80mg纤维蛋白原。该方法的涂层可包含每mL约2U凝血酶至每mL约1500U凝血酶。该方法可包括将纤溶酶原沉积到单层的顶部表面上。该方法可以包括将纤维蛋白水凝胶内的纤溶酶原沉积到单层的顶部表面上。该方法的涂层可包含每mL约0.1U的纤溶酶原至每mL约40U的纤溶酶原。在一些情况下，植入物可包含每mL约0.001U的纤溶酶原至每mL约40U的纤溶酶原。
在另一方面，本文的特征在于一种用于制造视网膜植入物或视网膜下植入物的方法。该方法包括或基本上由以下组成：在含有蛋白酶抑制剂或抗纤维蛋白溶解剂(例如小分子蛋白酶抑制剂)的培养基中在纤维蛋白基底支持基材上培养视网膜上皮细胞。培养基可以包含蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂可以是抑肽酶。培养基可包含每mL约5U的抑肽酶至每mL约500U的抑肽酶。培养基还可包含纤溶酶原。培养基可包含每mL约0.1U纤溶酶原至每mL约40U纤溶酶原(例如，每毫升0.1U纤溶酶原至每毫升约30U纤溶酶原)。在一些情况下，植入物可包含每mL约0.001U的纤溶酶原至每mL约40U的纤溶酶原。在一些实例中，可以在即将移植之前将纤溶酶原添加到培养基中。纤维蛋白基础支持基材可包含内皮细胞。在一些情况下，内皮细胞获自选自以下的来源：iPSC衍生的内皮细胞，血液生长内皮细胞(BOEC)，内皮集落形成细胞(ECFC)，内皮祖细胞(EPC)和脐带静脉内皮细胞(UVEC)。纤维蛋白基础支持基材可包含RPE下(sub-RPE)组织细胞群。RPE下组织细胞群可包含黑素细胞，周细胞或成纤维细胞。在一些情况下，纤维蛋白基础支持基材可以自动获得。
另一方面，本文的特征在于一种视网膜植入物，其包含(a)具有顶部表面和基底表面的视网膜色素上皮单层，和(b)附着于该单层的基底表面的纤维蛋白水凝胶层。纤维蛋白水凝胶层的厚度可为约20μm至约400μm。植入物可包含纤溶酶原。植入物可包含每mL约0.1U纤溶酶原至每mL约40U纤溶酶原，或每mL约0.001U纤溶酶原至每mL约40U纤溶酶原。纤维蛋白水凝胶层可包含涂层。涂层可包含基膜蛋白，基质胶或Geltrex。在一些情况下，纤维蛋白水凝胶单层可以自动获得。
在另一个方面，本文涉及一种制备视网膜植入物的方法。该方法包括(a)获得纤维蛋白水凝胶层，(b)用试剂(agent)涂覆纤维蛋白水凝胶层的表面，和(c)在涂层上形成具有顶部表面和基底表面的视网膜色素上皮单层，其中基底表面比顶部表面更接近纤维蛋白水凝胶层。纤维蛋白水凝胶层的厚度可为约20μm至约400μm。纤维蛋白水凝胶层可包含每mL约20mg纤维蛋白原至每mL约80mg纤维蛋白原。纤维蛋白水凝胶层可包含每mL约2U凝血酶至每mL约1500U凝血酶。纤维蛋白水凝胶层可包含每mL约0.1U纤溶酶原至每mL约40U纤溶酶原，或每mL约0.001U纤溶酶原至每mL约40U纤溶酶原。在一些情况下，纤维蛋白水凝胶单层可以自动获得。
在另一个方面，本文涉及一种制备视网膜植入物的方法。该方法包括在包含蛋白酶抑制剂或抗纤维蛋白溶解剂的培养基中在纤维蛋白基底支持基材上培养视网膜上皮细胞。培养基可以包含蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂可以是抑肽酶。培养基可包含每mL约5U的抑肽酶至每mL约500U的抑肽酶。培养基可包含抗纤维蛋白溶解剂，抗纤维蛋白溶解剂可以是氨甲环酸(transexamic acid)或氨基己酸。培养基还可包含纤溶酶原。培养基可包含每mL约0.1U纤溶酶原至每mL约40U纤溶酶原，或每mL约0.001U纤溶酶原至每mL约40U纤溶酶原。纤维蛋白基础支持基材可包含内皮细胞。内皮细胞可获自选自以下的来源：iPSC衍生的内皮细胞，血液生长内皮细胞(BOEC)，内皮集落形成细胞(ECFC)，内皮祖细胞(EPC)和脐带静脉内皮细胞(UVEC)。纤维蛋白基底支持基材可包含涂层。涂层可包含基膜蛋白，基质胶或Geltrex。所述涂层可以在纤维蛋白基底支持基材上培养视网膜上皮细胞之前存在。纤维蛋白基础支持基材可包含RPE下组织细胞群。RPE下组织细胞群可包含黑素细胞，周细胞或成纤维细胞。在一些情况下，纤维蛋白基础支持基材可以自动获得。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。若有抵触，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
从下文的详述和所附权利要求中能够很容易地了解本发明的其他特征和优点。
附图说明
图1A是用于制备具有顶部纤维蛋白的RPE单层并将其装载到手术植入装置中的方法的示意图。图1B是用于制备具有基底纤维蛋白的RPE单层并将其装载到手术植入装置中的方法的示意图。
图2A是用于将具有顶部纤维蛋白的RPE单层植入眼睛中以治疗黄斑变性的方法的示意图。图2B是用于将具有基底纤维蛋白的RPE单层植入眼睛中以治疗黄斑变性的方法的示意图。
图3是纤维蛋白溶解过程的示意图。
图4A是用于形成薄层纤维蛋白凝胶的喷洒器系统的照片。图4B是喷洒器系统的喷嘴的放大照片。
图5是根据一些实施方式的纤维蛋白凝胶的照片。尺寸为1.5mm(W)×5mm(D)×200μm(H)。
图6是附着于RPE单层的顶部纤维蛋白的照片。
图7是附着于顶部纤维蛋白的RPE单层的活/死染色照片。附着细胞在2小时后存活。
图8是附着于顶部纤维蛋白的RPE单层的照片。图像显示附着于纤维蛋白的连续单层。
图9是细胞核的DAPI(蓝色)染色和ZO-1(细胞-细胞紧密连接蛋白)染色(红色)的照片。
图10包含显示用组织纤溶酶原激活物(tPA)处理2小时后纤维蛋白的生物材料降解的照片。纤维蛋白降解的时间范围可以是1小时至72小时。
图11包含描述改变纤维蛋白原浓度时降解动力学的图。纤溶酶原和tPA浓度是固定的。降解与速率常数无关。在纤维蛋白原浓度和降解时间之间观察到线性关系。
图12包含描述改变纤溶酶原浓度时降解动力学的图。纤维蛋白原和tPA浓度是固定的。速率常数取决于纤溶酶原浓度。在纤溶酶原浓度和降解时间之间观察到非线性关系。
图13是描绘改变tPA浓度时降解动力学的图。纤维蛋白原和纤溶酶原浓度是固定的。观察到大范围的降解时间。
图14A-C是在纤维蛋白凝胶中含有诱导多能干细胞(iPSC)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞的板的图像，在没有抑肽酶的培养基中(图14A)，或含有抑肽酶的培养基中于具有Geltrex涂层(图14B)或不具有Geltrex涂层(图14C)的板上培养两周。在培养基中包含抑肽酶看起来可以防止纤维蛋白凝胶降解。
图15A和15B是含有在含抑肽酶的基底纤维蛋白凝胶上培养的iPSC-RPE细胞的板在凝胶从板上分离后的图像。在凝胶分离后细胞保持粘附(图15A)，并且在切割凝胶后细胞去除最少(图15B)。
图16A和16B是在分离和切割凝胶后，在具有(图16A)或不具有(图16B)Geltrex涂层的板上，在纤维蛋白凝胶中用含抑肽酶的培养基培养的iPSC-RPE细胞的图像。细胞用钙黄绿素-AM染色，表明它们在分离和切割后仍然存活，并且其存活可能不需要Geltrex。
图17是在没有Geltrex涂层的情况下培养的纤维蛋白凝胶的边缘处iPSC-RPE细胞的图像。将凝胶从板上释放并切割，并用钙黄绿素-AM(活)和乙锭同型二聚体(死)染色细胞。活细胞呈绿色，死细胞呈红色。
图18A和18B是含有在纤维蛋白凝胶中培养的iPSC-RPE细胞的板的图像，所述纤维蛋白凝胶通过用0.1U/ml纤溶酶原和22U/ml组织纤溶酶原激活物(tPA)消化60(图18A)或96(图18B)小时来降解。细胞作为单层从板上分离。
图19是用纤溶酶原和tPA消化纤维蛋白凝胶96小时后单层中iPSC-RPE细胞的图像。细胞用钙黄绿素-AM(活)和乙锭同型二聚体(死)染色；活细胞呈绿色，死细胞呈红色。
图20是显示患病视网膜影响大表面积的照片。黄斑(圆圈区域)直径为5mm(25mm2)。视网膜为1200mm2。本文描述的方法和材料可用于解决整个黄斑或解决视网膜的其他区域。
图21是显示使用植入装置将RPE单层/纤维蛋白植入物递送到眼内感兴趣区域上的照片。
图22是显示使用激光工具固定植入物以防止其滑动的结果的照片。
图23是显示使用植入装置将第二RPE单层/纤维蛋白植入物递送到眼内感兴趣区域上的照片。第二植入物与第一植入物相邻放置，优选通过原始切口放置。
图24是显示使用激光工具固定第二植入物以防止其滑动的结果的照片。
图25是显示使用植入装置将第三RPE单层/纤维蛋白植入物递送到眼内感兴趣区域上的照片。第三植入物与第二植入物相邻放置，优选通过原始切口放置。
图26是显示使用激光工具固定第三植入物以防止其滑动的结果的照片。
图27是切成不同尺寸和形状规格的纤维蛋白支架的照片。
图28是用于将RPE单层/纤维蛋白植入物植入眼中的植入装置的一个实例的示意图。
图29包含用于将RPE单层/纤维蛋白植入物植入眼中的植入装置的一个原型的照片。
图30是可以通过图29的原型递送的植入物的照片。长度可以为约0.1mm至约3mm，宽度可以为约0.1至约2mm。
图31包含用于将RPE单层/纤维蛋白植入物植入眼中的植入装置的另一个原型的照片。
图32包含套管端口的照片，所述端口提供进入眼睛的多个入口并且保持眼压以防止眼睛塌陷。
图33是套管端口的示意图，所述端口提供进入眼睛的多个入口并且保持眼压以防止眼睛塌陷。长度可以为约0.1mm至约4mm，宽度可以为约0.1mm至约3mm。
图34是以1.5mm×5mm几何形状形成的纤维蛋白凝胶的机械强度数据。图34A显示了测试设置的示例。图34B示出了样品力与位移图，从中获得了斜率(机械强度)和最大力数据。图34C显示通过从20至80mg/mL改变纤维蛋白水凝胶的纤维蛋白原浓度时的机械强度和最大力。图34D显示了通过从100至300μm改变水凝胶厚度时的机械强度和最大力。
图35显示了纤维蛋白水凝胶结构的图像。图35A显示了在开始切割成1.5mm×5mm几何形状后的纤维蛋白水凝胶的宏观图像。图35B显示了使用光谱域光学相干断层扫描的纤维蛋白水凝胶的横截面视图。图35C显示了纤维蛋白水凝胶表面的扫描电子显微镜图像。图35D显示使用SEM的纤维蛋白水凝胶原纤维结构的更高放大倍数。图35E显示纤维蛋白水凝胶在较低的纤维蛋白原浓度(例如10mg/mL)下卷曲，但在按40mg/mL纤维蛋白原浓度形成时具有足够的强度以保持其形状。
图36A包含显示用组织纤溶酶原激活物加纤溶酶原(tPA+P)，纤溶酶原或tPA随时间处理后纤维蛋白降解的照片。图36B包含描述改变纤维蛋白原浓度时降解动力学的图。纤溶酶原和tPA浓度是固定的。降解与速率常数无关。观察到线性关系图，其绘制了当改变纤溶酶原浓度时的降解动力学。纤维蛋白原和tPA浓度是固定的。速率常数取决于纤溶酶原浓度。在纤溶酶原浓度和降解时间之间观察到非线性关系。图36B还包含描述改变tPA浓度时降解动力学的图。纤维蛋白原和纤溶酶原浓度是固定的。在tPA浓度和降解时间之间观察到非线性关系。
图37显示了需要将蛋白酶抑制剂如抑肽酶包含在内的数据。图37A显示了在有和没有抑肽酶补充剂的纤维蛋白上培养的iPSC-RPE的宏观视图。没有抑肽酶，纤维蛋白被降解，细胞不能附着形成单层细胞。图37B显示高达8,000U/mL的抑肽酶对iPSC-RPE没有任何毒性。图37C显示了抑肽酶浓度的变化如何影响iPSC-RPE单层形成。例如，在低于1U/mL的浓度下，单层内孔的发生率增加。图37D显示了在各种抑肽酶浓度下总iPSC-RPE单层的定量。
图38是在纤维蛋白水凝胶支持物上生长的iPSC-RPE的表征。图38A显示当在相差光学显微镜下观察时，iPSC-RPE表现为着色的鹅卵石状单层。图38B使用活/死测定法显示当在纤维蛋白上培养时iPSC-RPE是存活的。图38C显示由iPSC-RPE分泌的VEGF和PEDF的ELISA定量。图38D显示关键RPE标志物Best1，RPE65和CRALBP的蛋白质印迹分析，包括参考B-肌动蛋白。图38E显示了Best1，埃滋蛋白和ZO-1的免疫荧光染色。
图39A包含板的图像，所述板含有在纤维蛋白凝胶上培养的iPSC-RPE细胞，然后用0.1U/mL纤溶酶原和22U/mL组织纤溶酶原激活物(tPA)随时间降解该纤维蛋白凝胶。细胞作为单层从板上分离并形成皱纹和皱褶。图39B显示了纤维蛋白凝胶完全降解后iPSC-RPE的活/死测定。图39C是显示纤维蛋白降解之前和之后的定量iPSC-RPE活力的图。图39D是纤维蛋白完全降解后iPSC-RPE单层中ZO-1的免疫荧光染色，显示单层的保留。
图40是显示使用PCR在纤维蛋白凝胶上培养的iPSC-RPE的RNA概况的表。
图41是植入兔眼视网膜下腔的纤维蛋白水凝胶的照片。48小时后没有在眼睛中观察到纤维蛋白水凝胶的迹象。
图42A是比较来自纤维蛋白(F)、纤维蛋白加基质胶和基质胶对照的VEGF释放的图，图42B是比较来自纤维蛋白(F)、纤维蛋白加基质胶和基质胶对照的PEDF释放的图。所有三种样品之间两种生长因子的分泌相似。
图43包含在纤维蛋白或纤维蛋白加基质胶(F+MG)上生长的iPSC-RPE的埃滋蛋白和Zo-1的免疫荧光染色的图像。两组均显示出阳性，特征性的染色模式。
图44包含在纤维蛋白或纤维蛋白加基质胶(F+MG)上生长的iPSC-RPE的活/死测定的图像。组之间的细胞活力相似。
图45包含在纤维蛋白(F)或纤维蛋白加基质胶(FMG)上生长的iPSC-RPE的Best1、RPE65、CRALBP和B-肌动蛋白的Western印迹分析的图像。L是尺寸梯度。Best1，RPE65和CRALBP是RPE标志物。
图46是根据一实施方式的纤维蛋白水凝胶支持装置的侧视图。
图47是根据一实施方式的纤维蛋白水凝胶支持装置的俯视图。
图48是根据一实施方式的纤维蛋白水凝胶支持装置与纤维蛋白水凝胶的侧视图。
具体实施方式
本文涉及视网膜色素上皮移植。例如，本文提供使用纤维蛋白支持物进行视网膜色素上皮移植的方法和材料。如本文所述，纤维蛋白水凝胶可用作RPE移植的临时基材。纤维蛋白水凝胶可以是RPE的基底支持基材(图1B)或顶部置放的基材(图1A)。在某些情况下，RPE可以夹在两个纤维蛋白水凝胶之间；夹在一个基底支持基材和一个顶部置放的基材之间。
本文提供的RPE单层/纤维蛋白植入物可将RPE维持为平坦，无皱纹的单层。在一些情况下，纤维蛋白构型可在移植过程中提供机械支撑和保护，并可确保植入正确的RPE极性。在一些情况下，本文提供的RPE单层/纤维蛋白植入物可以减少潜在的慢性炎症，减少对RPE/布鲁赫膜附着的障碍并且可以保持脉络膜的扩散渗透性。
可以使用任何合适的方法来制备RPE单层的纤维蛋白基材。胶凝动力学可以与凝血酶浓度直接相关，并且纤维蛋白水凝胶的机械性质可以与初始纤维蛋白原浓度直接相关。在一些情况下，较高的纤维蛋白原浓度可导致交联增加和较硬的纤维蛋白水凝胶。通常，纤维蛋白水凝胶可以形成为薄片。在一些情况下，纤维蛋白水凝胶的压实可以进一步硬化水凝胶。
在一些情况下，可以通过喷涂或夹心法实现纤维蛋白薄膜沉积。在一个实例中，可以将纤维蛋白原和凝血酶(和任选的纤溶酶原)的混合物喷洒到RPE单层的顶侧，并使其完全凝胶化以获得顶部纤维蛋白涂层。在一个实例中，可以将纤维蛋白原和凝血酶(和任选的纤溶酶原)的液滴混合物置于RPE单层的顶侧，并且可以压缩或铺展液滴并使其完全凝胶化以实现顶部纤维蛋白涂层。
在一些情况下，薄层纤维蛋白的喷涂可用于形成纤维蛋白水凝胶。可以改变喷洒器系统，例如用于一般和腹腔镜手术的喷洒器系统，以产生如本文所述的纤维蛋白水凝胶。参见例如Chaurasia等(Transl.Vis.Sci.Technol.,1:2(2012))。本文提供的纤维蛋白水凝胶的厚度可为约10μm至约400μm(例如，约20μm至约400μm，约50μm至约400μm，约10μm至约200μm，或约50μm至约200μm)。
本文提供的纤维蛋白水凝胶可以用手术工具容易地操纵以精确定向和定位。在一些情况下，本文提供的纤维蛋白水凝胶可以是柔韧的，同时保持其原始形状和表面性质。在一些情况下，粘附细胞不会从本文提供的纤维蛋白水凝胶的表面脱离。
在一些情况下，本文提供的纤维蛋白水凝胶可以通过喷洒含有约0.01mg/mL至约80mg/mL纤维蛋白原(例如，约20mg/mL至约80mg/mL纤维蛋白原)的溶液来制备。在一些情况下，可以使用大于30mg/mL的纤维蛋白原(例如，约30mg/mL至约80mg/mL的纤维蛋白原)来产生可以用镊子操纵的纤维蛋白水凝胶。在一些情况下，本文提供的纤维蛋白水凝胶可以通过喷洒含有约40mg/mL至约60mg/mL纤维蛋白原的溶液来制备。
在一些情况下，本文提供的纤维蛋白水凝胶可以使用如本文所述的纤维蛋白原和约2U/mL至约1000U/mL凝血酶(例如，约10U/mL至约200U/mL凝血酶)制备。在一些情况下，可以使用大于5U/mL的凝血酶(例如，约10U/mL至约100/mL的凝血酶)来产生可以用镊子操纵的纤维蛋白水凝胶。在一些情况下，本文提供的纤维蛋白水凝胶可以通过喷洒含有约40mg/mL至约60mg/mL纤维蛋白原和约10U/mL至约100U/mL的凝血酶的溶液来制备。
在一些情况下，本文提供的纤维蛋白水凝胶可以预装有非活性纤溶酶原。例如，可以通过将非活性纤溶酶原与完整的纤维蛋白水凝胶结合而将非活性纤溶酶原预加载到纤维蛋白水凝胶中。在一些情况下，可以通过在递送纤维蛋白支持的RPE植入眼睛之前通过将纤溶酶原孵育和扩散到纤维蛋白凝胶中来实现纤溶酶原的纳入。在某些情况下，本文提供的含有纤溶酶原的RPE/纤维蛋白水凝胶植入物可以在植入物定位在眼睛内后暴露于tPA。在这些情况下，tPA暴露将纤溶酶原激活成纤溶酶，纤溶酶继而降解纤维蛋白水凝胶。纤溶酶浓度与本文所述的纤维蛋白降解动力学直接相关。在一些情况下，可以制备本文提供的纤维蛋白水凝胶以含有约0.001U/mL至约40U/mL纤溶酶原(例如，约0.5U/mL至约4U/mL纤溶酶原，约0.1U/mL至约30U/mL纤溶酶原，或约0.1U/mL至约40U/mL纤溶酶原)。在一些情况下，本文提供的RPE/纤维蛋白水凝胶植入物可以以具有纤溶酶原和/或组织纤溶酶原激活物的溶液中的悬浮液递送以植入眼睛中。
在一些情况下，本文提供的RPE/纤维蛋白水凝胶植入物可以在胶原凝胶上产生。在这种情况下，可以使用胶原酶(例如，约200U/mL至约1500U/mL的胶原酶)收获RPE/纤维蛋白水凝胶植入物。胶原酶不会干扰细胞-细胞相互作用，并允许RPE单层从胶原凝胶中分离。在胶原酶处理后，RPE单层也保持粘附于纤维蛋白水凝胶。在一些情况下，除了胶原酶之外或作为胶原酶的替代物，还可以使用分散酶(例如，约0.5U/mL至约10U/mL的分散酶)。
在一些情况下，本文提供的RPE/纤维蛋白水凝胶植入物可以在抗纤维蛋白溶解剂(例如蛋白酶抑制剂抑肽酶，例如，约5U/mL至约500U/mL抑肽酶)的存在下产生，以在整个培养期间保存纤维蛋白支架并防止纤维蛋白支持物的降解。可以如本文所述使用的其他抗纤维蛋白溶解剂，包括但不限于蛋白酶抑制剂(例如，巨球蛋白，凝血酶，凝血酶激活型纤维蛋白溶解抑制剂和羧肽酶)，丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)家族的成员(例如，抗胰蛋白酶，α2-抗纤溶酶，和纤溶酶原激活物抑制剂1和2)，金属蛋白酶抑制剂(如组织金属蛋白酶抑制剂1-4，巴马司他(Batimastat)，塞马司他(Cipemastat)和复拉司他(Ilorastat))和小分子(如氨基己酸(Amicar)，氨甲环酸(Lysteda)，肝素，α-N-乙酰基-L-赖氨酸甲酯(NALME)，维生素K和对氨基甲基-苯甲酸)。
如本文所述，本文提供的RPE/纤维蛋白水凝胶植入物的纤维蛋白水凝胶可以是用于递送RPE单层的短期(例如，小于72小时，或小于1周)的机械支持。例如，纤维蛋白水凝胶可以附着到RPE的顶部(顶端)侧以递送到眼睛的视网膜下腔，可以是生物相容的，并且可以使用如本文所述的tPA以可控方式快速降解。
在一些情况下，可将本文提供的RPE/纤维蛋白水凝胶植入物植入眼中以提供有效的RPE(图2A和2B)。
本文还提供了使用本文提供的RPE/纤维蛋白水凝胶植入物治疗眼部病症如高度近视，血管样条纹和黄斑变性的方法。一些分类为黄斑变性并且可以如本文所述进行治疗的疾病包括但不限于与年龄相关的黄斑变性(AMD)，中央萎缩，卵黄样变，Leber先天性黑蒙，无脉络膜症，Gyrate萎缩，Sorsby黄斑营养不良，线粒体遗传性糖尿病和耳聋(MTDD)，氯喹相关视网膜病变，M-L症(malattia leventinese)，北卡罗来纳州营养不良，高鸟氨酸血症，中央浆液性脉络膜视网膜病变，成人发病型中央凹黄斑(foveomacular)营养不良和Stargardt病。例如，可以制备哺乳动物(例如人)用于眼科手术，并且产生视网膜下脱离以暴露受损的RPE区域(图20)。此时，可以使用诸如图28、29或31中所示的植入装置将RPE/纤维蛋白水凝胶植入物递送到感兴趣的区域上(图21)。在一些情况下，套管(参见例如图32和33)可用于进入眼睛。在一些情况下，可以使用气相气泡将RPE/纤维蛋白水凝胶植入物推入就位。激光工具(例如，用于糖尿病性视网膜病变的激光工具)可用于通过激光光凝来固定植入物，防止其滑动(图22)。此时，植入装置可用于将第二RPE单层/纤维蛋白植入物递送到眼睛内的感兴趣区域上(图23)。第二植入物可与第一植入物相邻放置，优选通过原始切口或套管放置。可以使用激光工具将第二植入物固定，防止其滑动(图24)。植入装置可用于将第三RPE单层/纤维蛋白植入物递送到眼睛内的感兴趣区域上(图25)。第三植入物可与第二植入物相邻放置，优选通过原始切口或套管放置。可以使用激光工具将第三植入物固定，防止其滑动(图26)。虽然本节描述了植入三个RPE单层/纤维蛋白植入物，但可以使用任何适当的数量来覆盖待治疗的区域。例如，可以将一个，两个，三个，四个，五个，六个或更多个RPE单层/纤维蛋白植入物植入被治疗的单个眼睛内。通常，这种模块化拼接方法可以允许临床医生根据患者的需要个性化植入物，可扩展到大面积，适用于视网膜的任何区域，并减少所需的切口数量。
在一些情况下，机械冲头可用于设计具有特定形状或尺寸的RPE单层/纤维蛋白植入物(参见例如图27)。形成纤维蛋白植入物的其他方法可包括使用定制模具的胶凝浇铸、激光显微切割显微镜和3D打印。
用于将本文提供的RPE单层/纤维蛋白植入物植入眼睛中的植入装置可以是具有机械喷射控制的柱塞式装置。在一些情况下，植入装置可以设计成递送各种尺寸的RPE单层/纤维蛋白植入物并且能够使用夹式尖端快速插入多个植入物。在一些情况下，本文提供的植入装置可具有液体储器以维持细胞和水凝胶的水合。在一些情况下，本文提供的植入装置设计用于单手操作和使用。
在涉及使用纤维蛋白基底支持物的情况下，可以将预血管化策略与RPE培养组合以形成脉络膜组织。纤维蛋白可通过各种方法血管化，包括通过使用微流体装置(Moya等，Methods Mol.Biol.,1202:21-7(2014))，3D打印(Pinnock等，Methods,99:20-7(2016))，以及包封在基质内的内皮细胞的自发血管形成(Mishra等，Biomaterials,77:255-66(2016))。这些策略可以与预血管化的纤维蛋白的顶部RPE单层培养组合以形成RPE-脉络膜复合物。RPE-脉络膜可以是黄斑变性疾病的治疗剂，其中脉络膜和RPE都是功能失调的，包括干性AMD。内皮细胞(EC)可以从各种来源获得，例如iPSC衍生的内皮细胞，血液生长内皮细胞(BOEC)，内皮集落形成细胞(ECFC)，内皮祖细胞(EPC)和脐静脉内皮细胞(UVEC)。
在涉及使用纤维蛋白基底支持物的情况下，可以将多细胞群组织与RPE培养物组合以形成移植组织。纤维蛋白支持物可以加载有在亚RPE组织中发现的其他细胞类型，包括黑素细胞、脉络膜周细胞和成纤维细胞。
本文还提供了纤维蛋白水凝胶支持装置，其可用于在悬浮于细胞培养基中的纤维蛋白水凝胶上生长细胞。在一些情况下，这允许以不需要将支架与固体基质分离并且允许培养基在细胞生长和分化时进入细胞的基底表面的方式形成本文提供的RPE/纤维蛋白水凝胶植入物。在一个实施方式中，所述装置可包括两个单独的部件，其可容易地彼此连接以将支架材料保持在悬浮状态(图46-48)。顶部件可以是圆柱形内管，其可以插入底部基件中以按压并固定夹在其间的纤维蛋白水凝胶层(图48)。底部基件可包括侧壁和具有中心开口的环形底部。顶部圆柱形内管可由底部基件保持和支持。这两个组件可以例如通过注塑成型由任何适当的材料制成，所述材料包括但不限于特氟隆，硅树脂或其他塑料。在某些情况下，可以使用聚苯乙烯。每个部件的尺寸可以如图46-48所示。在一些情况下，顶部圆柱形内管可通过螺纹、卡扣配合或夹紧机构接合底部基件。
在一些情况下，可以在施用细胞之前涂覆本文提供的纤维蛋白水凝胶。例如，本文提供的纤维蛋白水凝胶可在施用细胞之前用基底膜基质和/或基底膜蛋白(例如基质胶或其他试剂)涂覆。可用于涂覆本文提供的纤维蛋白水凝胶的其他试剂的实例包括但不限于Geltrex，层粘连蛋白511，层粘连蛋白521，玻连蛋白(victronectin)，胶原，明胶及其组合。在一些情况下，基质胶和Geltrex可以互换使用，因为它们都是源自小鼠肉瘤细胞的基底膜基质。
以下通过实施例进一步说明本发明，这些实施例对于权利要求书描述的本发明范围不构成约束。
实施例
实施例1-纤维蛋白水凝胶用于IPSC-RPE移植的用途
化学品
纤维蛋白原来自三种来源：来自Ethicon公司的Evicel(60mg/mL)，来自Baxter公司的Tisseel(95mg/mL)，以及来自Sigma-Aldrich公司的研究级材料(57mg/mL)。凝血酶也来自三个来源：来自的Ethicon公司的Evicel的部分，来自Baxter公司的Tisseel的部分，以及来自Sigma-Aldrich公司的研究级材料。纤溶酶原是获自Sigma-Aldrich公司的研究级材料。重组组织纤溶酶原激活物(tPA)是获自Sigma-Aldrich公司的研究级材料。
细胞
如其他地方所述通过修饰产生IPSC-RPE细胞(Johnson等,Investig.Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619(2015))。使用具有顶部和基底培养基的膜支持物，包括transwell或HA膜。根据制造商的方案，用胶原凝胶涂覆膜表面，或者或随后，用Geltrex或基质胶溶液涂覆，以多至0.1mg/mL在37℃下持续2小时。然后将细胞铺板并使其形成单层长达一个月。对于该研究，使用的IPSC-RPE来自健康对照患者。在diff阶段5之后使用细胞。在100欧姆以上测量跨上皮阻抗。在使用前注意到色素沉着。
形成薄层纤维蛋白凝胶
通过改变纤维蛋白原浓度和凝血酶浓度形成纤维蛋白凝胶。最初通过板夹层法形成薄层凝胶，其中将纤维蛋白原和凝血酶溶液的混合物夹在具有200μm间隙厚度的塑料模具内的两层封口膜之间。使溶液在潮湿的37℃下胶凝长达1小时。除去封口膜，并在使用前将凝胶水合并在PBS中洗涤。通过该方法形成的凝胶具有196±90μm的平均厚度。
或者，使用喷洒器系统形成薄层纤维蛋白凝胶。双显微注射器系统(WPI)连接到泵控制器，泵控制器连接到计算机。将两个1-mL注射器(每个都含有纤维蛋白原和凝血酶溶液)安装到显微注射器装置上，并将二对一混合器连接件连接到注射器上。然后将混合器连接至雾化喷嘴(The Lee Co公司)。还将CO2气体调节器连接到喷嘴，以提供用于雾化的空气压力。图4A和4B示出了设置。
为了形成薄的纤维蛋白凝胶，改变空气压力和分散的液体量(0.3-1.5巴)。使用自定义MATLAB脚本来改变喷洒器的时间和速率。调节器上的气压由脚踏板控制变化。喷洒后，使溶液在潮湿的37℃下胶凝长达1小时。在使用前将凝胶水合并在PBS中洗涤。
凝胶厚度测量
在使用喷洒器系统形成凝胶后，将凝胶用0.01mg/mL FITC异硫氰酸酯溶液染色1小时并摇动。通过随后用PBS洗涤以除去未标记的FITC。穿过凝胶拍摄共聚焦z系列图像，测量FITC染色切片的量度以获得厚度。
力学
使用如他处所述的加压测试获得凝胶生物力学(Uehara等，J.Bone JointSurg.Am.,97:1792-1798(2015))。测量用各种纤维蛋白原浓度和厚度制成的凝胶。简而言之，将凝胶安装到定制的不锈钢块上。使用扁平圆柱形铝压头进行加压测试。直径为1.3毫米。使用Bose Electroforce 3200致动器进行测试。使用10克Honeywell微型称重传感器测量力。使用Bose Electroforce 3200内部线性可变差动变压器测量位移。使用Lab VIEW收集数据。以0.05mm/s进行静态挠曲试验直至断裂。绘制应力和应变曲线并拟合线性区域以得到杨氏模量值。
降解动力学
使用夹心法制备各种凝胶，具有不同的纤维蛋白原浓度(40-60mg/mL)。凝血酶浓度似乎不影响刚度或降解动力学，该浓度保持恒定在100U/mL。通过在胶凝之前与纤维蛋白原浓度混合，将不同的纤溶酶原浓度(0.8-4.0U/mL)加载到凝胶内。形成后，使用定制尺寸的手持式空心冲头对凝胶冲孔。形状为椭圆形，高1.5毫米，宽5毫米(图5)。将冲孔的凝胶在各种浓度的tPA溶液(0.1-1,000U/mL)中孵育。随着时间的推移，对悬浮液取样。为了阐明每个变量(即纤维蛋白原，纤溶酶原和tPA的浓度)的作用，在各变量变化时保持另外两个不变。
按照制造商的方案，使用660nm蛋白质测定法定量纤维蛋白降解产物(FDP)。使用已知FDP浓度的标准曲线从吸光度值获得浓度。使用指数拟合模型，利用浓度对时间的图来获得速率常数。
分离纤维蛋白/RPE植入物
在纤维蛋白凝胶置放之前和之后均获得细胞分离。用PBS洗涤膜支持物上的细胞。将细胞在基底750U/mL纯化的胶原酶(Worthington公司)或DMEM中1U/mL分散酶(Stem CellTech公司)中孵育长达30分钟。移出transwell并干燥，同时切割膜并置于封口膜的顶端。然后将纤维蛋白喷洒在顶端，并使其完全胶凝。或者，使用夹心法将纤维蛋白原和凝血酶混合物置放在顶部RPE单层上并使其完全胶凝。水合后，使用镊子剥离纤维蛋白/RPE系统(FRPE)。然后将FRPE在培养基中孵育。
或者，用PBS洗涤膜支持物上的细胞。移除PBS后，将纤维蛋白喷洒在顶端并使其完全胶凝。水合后，将细胞在基底750U/mL纯化的胶原酶或DMEM中的1U/mL分散酶中孵育长达30分钟。小心地切下膜并置于培养皿中并用PBS浸没。然后使用钳剥离FRPE，或使用细胞刮刀刮下。
FRPE染色和成像
为了确定单层表型的维持，将FRPE就ZO-1染色，ZO-1是一种在上皮细胞中发现的细胞-细胞连接蛋白。将FRPE样品冲孔并在10％福尔马林中固定1小时。如别处所述进行染色((Johnson等,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619-4630(2015))。用NGS封闭固定的细胞，在一抗中于4℃孵育过夜，并在二抗中孵育2小时。使用Aquamount将样品安装在载玻片上，并在Nikon荧光显微镜下成像。
获得TEM图像以观察纤维蛋白和RPE的相互作用。将FRPE样品在2.5％戊二醛中固定1小时。处理固定样品用于树脂嵌入，切割并安装0.5μm切片。在TEM显微镜上进行成像。
活/死测定
使用明视场显微镜随时间监测冲孔的FRPE植入物。为了确定细胞活力，根据制造商的方案，在FRPE上使用活/死试剂盒。在FITC光谱下观察活细胞(吸收：495nm；发射：520nm)，并且在TRITC光谱下观察死细胞(吸收：543nm；发射：560nm)。以百分比计算细胞活力(活染细胞除以可视化的总细胞)。
PCR
在细胞上完成PCR以在从培养支持物分离后24小时和纤维蛋白支持物降解后24小时确认细胞的功能。标志物包括PEDF，RPE65，Best1和对照。
结果
图5显示了成功使用分散酶将纤维蛋白附着到RPE的顶部表面并从培养表面脱离。机械冲孔后，细胞仍粘附于纤维蛋白。
将RPE细胞附着于凝胶表面(图6)，并且钙黄绿素-AM染色的存在表明附着于纤维蛋白的细胞仍然存活(图7)。观察到纤维蛋白成功附着到RPE单层的顶部表面，其中大区域保持单层和色素沉着(图8)。该量表显示了该方法对于更大的植入物生成的可扩展性。DAPI(蓝色)和ZO-1(红色)显示在顶部附着于纤维蛋白的RPE单层染色(图9)。ZO-1的存在表明存在通过细胞-细胞连接的单层。在纤溶酶原的存在下，tPA用于溶解纤维蛋白凝胶(图10)。没有tPA，纤溶酶原未被激活，凝胶不会降解。
对于固定的纤溶酶原和tPA浓度，纤维蛋白原浓度对凝胶的降解动力学没有影响，因为速率常数与纤维蛋白原浓度无关(p＝0.35)(图11)。在固定的纤维蛋白原和tPA浓度下，纤溶酶原浓度对凝胶的降解动力学有影响，因为速率常数随着纤溶酶原浓度的增加而增加(p＝0.005)(图12)。因此，通过增加纤溶酶原浓度，总降解时间呈指数降低。对于固定的纤维蛋白原和纤溶酶原浓度，tPA浓度增加与降解时间中的指数衰减相关(图13)。在没有抑肽酶的情况下观察到纤维蛋白支架上的RPE培养物(图14A)，其中RPE在3-4天内降解纤维蛋白基材，导致许多细胞死亡。极少数细胞残留，未观察到单层形成的表型。通过在培养基中包含抑肽酶，观察到RPE存活和单层形成(图14B)。该形成似乎与Geltrex涂层无关，表明RPE可直接附着于纤维蛋白(图14C)。
观察到纤维蛋白基底支持物RPE培养物的移动(图15A)，并且在机械冲孔后RPE保持附着(图15B)。
在机械冲孔后，附着于纤维蛋白基底支持物的RPE仍然存活(图16)。此外，活性和对基材的粘附性与Geltrex涂层无关。
获得了冲孔的纤维蛋白基底支持RPE的活/死图像的特写(图17)。极端边缘显示细胞活力丧失增加，可能是由于机械冲孔过程中的持续应力。该区域的细胞活力为83.1％。
获得纤维蛋白基底支持物的时间流逝降解(图18)。60小时后，凝胶边缘降解，显示出自身卷曲的单层。96小时后，超过50％的凝胶降解，剩余的RPE单层自身卷曲并折叠。120小时后凝胶完全降解。该结果表明需要来自纤维蛋白的机械支撑以维持RPE的平坦，无皱纹表型。
获得了在凝胶完全降解的区域中RPE单层的活/死图像的特写(图19)。折叠被视为失焦区域。总体而言，细胞活力仍然很高，并且与降解前细胞的活力相当。
显示了使用外科手术工具递送RPE/纤维蛋白植入物(图29)。该工具使用静水压力使植入物流入和流出装置。
这些结果表明，使用40-60mg/mL的纤维蛋白原浓度可以实现适当的刚度，并且凝胶厚度可以为约50μm至约300μm(例如，约100μm至约200μm，或约50μm至约200μm)。这些结果还表明，在用胶原酶和纤溶酶原处理后，细胞-细胞连接可以保持完整。
本文提供的结果表明，通过调节纤维蛋白原、纤溶酶原和tPA的浓度，纤维蛋白基材的降解动力学可在约1.5小时至约20小时之间变化。
实施例2-抑肽酶对纤维蛋白附着和细胞活力的影响
进行研究以确定抑肽酶对纤维蛋白凝胶附着和维持以及细胞活力的影响。在含有50U/mL抑肽酶的培养基中，将iPSC-RPE细胞在具有(图14B)和不具有(图14C)Geltrex涂层的纤维蛋白凝胶上培养两周。在培养基中包含抑肽酶看起来可以防止纤维蛋白凝胶降解。此外，这些研究表明，细胞与纤维蛋白凝胶的附着可能与Geltrex的存在无关。在凝胶从板释放后细胞保持粘附(图15A)，并且在切割凝胶后细胞去除最少(图15B)。
为了评估用抑肽酶培养两周，然后分离并切割凝胶后iPSC-RPE细胞在纤维蛋白凝胶中的活力，用钙黄绿素-AM(活)和乙锭同型二聚体(死亡)染色细胞。分离和切割后细胞保持存活，无论存在Geltrex(图16A)或不存在Geltrex(图16B)。在将凝胶从板上切下并切割后，仔细检查用抑肽酶和有或没有Geltrex培养的凝胶边缘处的细胞，发现大多数细胞是有活力的，尽管在凝胶周围明显有一些死细胞(图17)。
为了评估凝胶降解对培养细胞的影响，含有iPSC-RPE细胞的纤维蛋白凝胶通过用0.1U/mL纤溶酶原和22U/mL tPA消化而降解。在60(图18A)和96(图18B)小时拍摄图像，显示细胞作为单层从板上分离。单层细胞用钙黄绿素-AM(活)和乙锭同型二聚体(死亡)染色，以评估凝胶消化96小时后的活力，显示大部分细胞保持存活(图19)。
实施例3-用顶部纤维蛋白的视网膜色素上皮单层的方案
1)将2.5mg/mL胶原蛋白胶凝到纤维素酯膜滤器插入物上。
a.1.0-5.0mg/mL胶原蛋白。
b.纤维素酯，聚碳酸酯，PTFE，TCPS膜过滤器。
2)用1:5稀释的基质胶涂覆胶原蛋白表面。
a.范围:1:1-1:50稀释。
b.基质胶、Geltrex或纯化的层粘连蛋白。
3)以0.5x106个细胞/cm2铺板细胞。
a.0.1-2.0x106个细胞/cm2。
4)培养约2周。
a.1-6周。
5)用PBS洗涤细胞。
6)干燥细胞表面。
7)喷洒80μl混合的50mg/mL纤维蛋白原、2U/mL纤溶酶原和100U/mL凝血酶，总流速为80uL/秒，0.8巴持续1秒，高度为10cm。
a.喷洒30-200μL混合物。
b.30-70mg/mL纤维蛋白原。
c.0.1-4.0U/mL纤溶酶原。
d.10-600U/mL凝血酶。
e.30-400μL/秒流速。
f.0.6-1.2巴。
g.5-15cm高度。
8)纤维蛋白原在37℃下胶凝1小时。
a.胶凝30分钟至2小时。
9)用PBS再水化。
10)通过将插入物置于750U/mL胶原酶上来分离单层。
a.400-1500U/mL胶原酶。
11)用PBS轻轻洗涤。
12)将纤维蛋白-RPE植入物转移到平坦表面并冲出多个植入物。
13)将植入物装入手术装置。
14)为手术准备眼睛。
15)将植入物插入视网膜下腔。
16)激光固定。
17)在视网膜下腔平铺多个植入物。
18)闭眼。
19)24小时后，玻璃体内注射100μL的4,000U/mL组织纤溶酶原激活物。
a.手术后3-72小时。
b.50-200μL注射。
c.100-35,000U/mL。
该方案产生由顶部纤维蛋白水凝胶支持的RPE单层。
实施例4-用基底纤维蛋白支持物的视网膜色素上皮单层的方案
1)使30mg/mL纤维蛋白原和100U/mL凝血酶的混合溶液铺板胶凝。
a.20-80mg/mL纤维蛋白原。
b.10-600U/mL凝血酶。
c.旋动板确保均匀涂抹。
d.使用模具将凝胶压缩至所需厚度。
e.厚度：50μm至1mm。
f.将混合物置于TCPS、聚碳酸酯、纤维素酯上。
g.或者，使用模具预先形成平板纤维蛋白凝胶并安装到细胞培养插入物上。
h.将混合物喷涂到表面上。
2)用1:5稀释的基质胶涂覆凝胶表面。
a.范围:1:1-1:50稀释。
b.基质胶，Geltrex，层粘连蛋白521，层粘连蛋白511。
c.涂覆步骤不是必需的。
3)以0.5x106个细胞/cm2铺板细胞。
a.0.1-2.0x106个细胞/cm2。
4)用含有50U/mL抑肽酶的培养基培养2周。
a.范围:20-150U/mL
b.1-10周。
5)通过从支持物上剥离纤维蛋白来移动纤维蛋白-RPE。
6)任选：将纤溶酶原加载到基底纤维蛋白凝胶中。
a.在纤溶酶原溶液中孵育纤维蛋白-RPE。
i.0.001-40U/mL(例如1-40U/mL)纤溶酶原。
ii.2-6小时。
7)任选：顶部凝胶，用于提供额外支持。
a.喷洒80μl混合的50mg/mL纤维蛋白原、2U/mL纤溶酶原和100U/mL凝血酶，总流速为80uL/秒，0.8巴持续1秒，高度为10cm。
i.喷洒30-200μL混合物。
ii.30-70mg/mL纤维蛋白原。
iii.0.1-4.0U/mL纤溶酶原。
iv.10-600U/mL凝血酶。
v.30-400μL/秒流速。
vi.0.6-1.2巴。
vii.高度5-15cm。
b.纤维蛋白原在37℃下胶凝1小时。
i.胶凝30分钟至2小时。
8)将纤维蛋白-RPE植入物转移到平坦表面并冲出多个植入物。
9)将植入物装入手术装置。
10)为手术准备眼睛。
11)将植入物插入视网膜下腔。
12)激光固定。
13)在视网膜下腔平铺多个植入物。
14)闭眼。
15)24小时后，玻璃体内注射100μL的4,000U/mL组织纤溶酶原激活物。
a.手术后3-72小时。
b.50-200μL注射。
c.100-35,000U/mL。
该方案用基底纤维蛋白支持物产生RPE单层。
实施例5-眼睛治疗方案
诊所获得患者皮肤活组织检查并将其送至GMP设施以生产iPSC-RPE细胞，如其他地方所述(Sonoda等,Nat.Protoc.,4:662-673(2009)；Johnson等,Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619(2015)；Brandl等,NeuroMolecular Med.,16:551-564(2014)；Idelson等,CellStem Cell.,5:396-408(2009)；和Carr等,Mol.Vis.,15:283-295(2009))。使用细胞培养插入物在纤维蛋白水凝胶上培养iPSC-RPE长达3个月。将RPE/纤维蛋白凝胶切割成患者需要的规格。将切割的植入物转载入植入装置的尖端部件中，储存在含有或不含纤溶酶原的培养基中，并运送到诊所。
将预装有RPE/纤维蛋白凝胶的夹子部件插入植入装置中。患者准备接受手术。进行标准的3端口玻璃体切除术，然后使用精细插管形成水泡，然后使用视网膜剪刀进行视网膜切开术。在巩膜(或脱离的视网膜)中产生切口(例如，3mm或1.5mm切口)。将植入装置的尖端插入眼睛的视网膜切开术下处，并且部署植入物。使用激光将植入物固定到位。用另外的植入物重复这一过程以覆盖正在治疗的区域。使用硅油或全氟化碳液体乳闭合视网膜脱离。将巩膜切口缝合闭合。经玻璃体腔注射tPA。患者康复并愈合。一旦愈合，进行视觉测试以确认治疗。
实施例6-纤维蛋白水凝胶作为用于移植RPE单层的无异种且可快速降解的支持物
进行以下操作以确认纤维蛋白作为RPE移植的基材的适合性。通过改变纤维蛋白原和凝血酶的浓度来产生多种纤维蛋白水凝胶，以形成薄的刚性水凝胶，其具有确定参数以在数小时内降解。随后，利用优化的条件产生其上培养iPSC-RPE的纤维蛋白凝胶，形成分化良好的单层细胞。最后，纤维蛋白支持物在体外降解，并评估该降解对RPE单层的影响。本文提供的结果证明，纤维蛋白水凝胶可以用作RPE从干细胞分化的长寿命基材，该基材随后可以在递送至视网膜下腔后在受控环境下快速降解。
化学品
纤维蛋白原和凝血酶获自Ethicon公司(新泽西州萨默维尔)(Evicel，纤维蛋白原，60mg/mL)，Baxter公司(伊利诺伊州迪尔菲尔德)(Tisseel，纤维蛋白原，95mg/mL)和Sigma-Aldrich公司(密苏里州圣路易斯市)(纤维蛋白原，57mg/mL)。纤溶酶原和重组的组织纤溶酶原激活物(tPA)获自Sigma-Aldrich公司。
形成薄层纤维蛋白凝胶
通过改变纤维蛋白原浓度和凝血酶浓度形成纤维蛋白凝胶。初步研究显示凝血酶浓度导致的变化最小，所有实验均使用终浓度为100U/mL的凝血酶。对于无细胞实验，通过使用厚度定制模具形成薄层凝胶，所述厚度定制模具由两块聚碳酸酯板和2层封闭膜组成，其具有范围为0至200μm的限定厚度间隔物。混合后立即将纤维蛋白原和凝血酶溶液的混合物夹在两层之间，并使溶液在37℃下在潮湿的培养箱中胶凝1-2小时。除去顶板和石蜡膜后，将凝胶水合并在PBS中洗涤。使用定制的机械冲头切出尺寸类似的凝胶，呈长椭圆形，1.5mm×5mm。小心翼翼地使用钳操纵凝胶。
凝胶厚度测量
使用OCT对冲孔的凝胶成像以确定厚度。使用AIM台设置Envisu R4110(Leica公司；德国韦茨拉尔)，相机和附加的远心镜头朝下置于凝胶上方。在成像之前，将凝胶置于PBS中的透明60mm培养皿中。对凝胶进行A和B扫描，并且每个凝胶的厚度在四个随机位置上取平均值。
电子显微分析
使用Hitachi S-4700(Hitachi高科技公司；伊利诺伊州绍姆堡)和Hitachi SEM软件(V3.6)获得纤维蛋白水凝胶的扫描电子显微镜(SEM)图像。将凝胶在含有二价阳离子的pH7的0.1M磷酸盐缓冲液中的2.5％多聚甲醛和1％戊二醛中固定过夜。然后使用二氧化碳对凝胶进行临界点干燥，将凝胶安装在铝棒上，并使用金-钯溅射涂覆60秒。
力学
使用如他处所述的设置利用突起测试获得凝胶生物力学(Uehara等，J.BoneJoint Surg.Am.,97:1792-1798(2015))。测量用各种纤维蛋白原浓度和厚度制成的凝胶。简而言之，将凝胶安装至具有2mm内径的环钳(WPI公司；佛罗里达州萨拉索塔)，对其进行打磨以增加抓力。将钳安装到XY平台(Klinger公司；加州欧文市)以使压头与凝胶对齐(图34A)。使用具有1.3mm外径的定制扁平圆柱形铝压头进行测试。测试是在自定义构建的z-平台驱动器上进行的。使用10g微型载荷传感器(Honeywell公司；新泽西州莫里斯平原)测量力，并使用LabVIEW V12.0(美国国家仪器(National Instruments)公司；得克萨斯州奥斯汀市)收集数据。以1mm/s进行静态挠曲试验直至断裂。绘制力和位移曲线并拟合，使得线性区域给出机械应力值(图34B)。还获得了最大载荷作为曲线的峰值。
降解动力学
通过改变纤维蛋白原，纤溶酶原或组织纤溶酶原激活物(tPA)的浓度来确定凝胶降解动力学。凝血酶浓度似乎不影响刚度或降解动力学，该浓度保持恒定在10U/mL。使用定制冲头生成尺寸相同的凝胶(1.5mm×5.0mm长椭圆形)。将冲孔的凝胶在各种浓度的纤溶酶原(0.01-1U/mL)和tPA溶液(0.1-1,000U/mL)中孵育。为了阐明每个变量(纤维蛋白原，纤溶酶原和tPA的浓度)的作用，在各变量变化时保持另外两个不变。
随着时间的推移，对悬浮液取样。按照制造商的方案，使用660nm蛋白质测定法(生命技术(Life Technologies)公司；加利福尼亚州卡尔斯巴德)定量纤维蛋白降解产物(FDP)。使用已知FDP浓度的标准曲线从吸光度值获得浓度。使用指数拟合模型假设一级动力学，利用浓度对时间的图来获得速率常数。
细胞
使用由21岁白人女性供体产生的iPSC系006-BIOTR-001(Johnson等，Investig.Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619(2015))。由LAgen实验室公司(明尼苏达州罗彻斯特市)使用他处(Johnson等，Investig.Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619(2015))描述的分化方法从该细胞系产生iPSC-RPE细胞。
通过在培养物表面的底部(60mm，6孔板，12孔板或12孔Transwell)混合纤维蛋白原(最终：30mg/mL)和凝血酶(最终：10U/mL)溶液制备纤维蛋白凝胶，并使用定制的Teflon重物使凝胶表面变平坦光滑。然后将凝胶在5％CO2、37℃湿培养箱中孵育1-2小时。在铺板之前用PBS洗涤凝胶。
如别处所述进行RPE传代((Johnson等,Investig.Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619(2015))。将悬浮的细胞以0.4-0.5×106个细胞/mL的密度接种到纤维蛋白或基质胶涂覆的表面。含2％(v/v)B27和1％(v/v)抗真菌/抗生素(生命技术公司)的RPE分化培养基(RPEM(LAgen实验室公司))补充有不同浓度的抑肽酶以保留纤维蛋白凝胶。培养基每2天更换一次。在使用前将RPE在凝胶上培养6-10周。适当时，将在基质胶涂覆的组织培养聚苯乙烯上培养的RPE用作阳性对照。
RPE免疫荧光
免疫荧光用于可视化iPSC-RPE中的蛋白质表达。将样品在-20℃下在100％冰冷的甲醇中固定10分钟。染色如他处所述进行(Johnson等，Investig.Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619(2015))，使用1：1000稀释的以下一抗：多克隆兔抗-Best1(pAB125)；多克隆兔抗埃滋蛋白(细胞信号传导公司(Cell Signaling)；美国马萨诸塞州丹弗斯市)；和多克隆兔抗ZO1(生命技术公司)。使用Fluoromount将样品固定在载玻片上，并使用Nikon E600荧光显微镜(Nikon公司；日本东京)成像。
活/死测定
根据制造商的方案使用LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒(生命技术公司)进行活/死测定。使用FITC滤镜观察活细胞(吸收：495nm；发射：520nm)，并且使用TRITC滤镜观察死细胞(吸收：543nm；发射：560nm)。使用在纤维蛋白上培养的降解之前或之后的RPE单层。使用1U/mL纤溶酶原和100U/mL tPA实现降解。细胞活力计算为活染细胞的百分比除以可视化的总细胞。将实验组的结果标准化为对照组。
PCR
将在纤维蛋白上培养的RPE刮入1X DPBS中，在4℃下以5,000g离心5分钟。将细胞在Trizol中裂解，并使用总RNA分离试剂盒(Zymo公司；加州欧文市)分离总RNA。用不含RNA酶的DNA酶I(Roche生物公司；瑞士巴塞尔)处理总RNA。用Superscript III逆转录酶(生命技术公司)从总RNA合成cDNA。用寡dT(生命技术公司)引导总RNA。使用Primer-BLAST软件设计引物(Ye等，BMC Bioinformatics,13:134(2012))。仙台病毒引物序列来自CytoTuneTM-iPS2.0仙台重编程试剂盒。从IDT公司(爱荷华州科尔维尔)订购脱盐引物。在应用生物系统公司(Applied Biosystems)QuantStudio 5qPCR仪器上使用10-100ng输入cDNA和PowerUpSybr Green主混合物(应用生物系统公司；加利福尼亚州福斯特城)的进行40个PCR循环。根据引物组的退火温度对PCR反应进行分批。如果CT小于37个循环，则认为存在基因。
ELISA
使用预先包被的板，使用ELISA测定试剂盒(RND系统公司；明尼苏达州明尼阿波利斯)，按照制造商的方案，从48小时后收集的培养基中定量VEGF和PEDF分泌。使用标准曲线测定总蛋白质。
Western印迹
用1％Triton-X，20mM Tris，150mM NaCl和5mM EDTA，pH 8.0从TPI缓冲液中的纤维蛋白上刮下RPE。将细胞在4℃下裂解1小时。使用制造商的溶液试剂盒和方案，将样品稀释并在基于毛细管电泳的蛋白质印迹仪(蛋白质样品印迹(Protein Simple Wes)公司；加州圣琼斯)上分离。一抗包括RPE65(401.8B11.3D9)，卵黄状黄斑病蛋白(Bestrophin)1(pAB125)，CRALBP(B2)和β-肌动蛋白(AC-15)。
统计
使用JMP 10(SAS公司；北科罗拉多州凯利)分析数据。对于纤维蛋白机械测试和降解研究，使用单向ANOVA检验。对于抑肽酶毒性研究，使用双向ANOVA检验。在ANOVA分析后，使用Tukey HSD检验在组间检验显著性。对于所有细胞定量数据，使用斯氏t检验来比较各个组。p<0.05被认为有统计学显著性。
结果
凝胶形成的机械性能
本文提供的用于RPE移植的材料可以设计成薄的层状片，其具有足够的强度以在用手术器械操纵的同时保持平坦度。使用定制模具(50mm×50mm正方形，400μm厚)来制备厚度相同的凝胶，同时改变纤维蛋白原和凝血酶的浓度。凝血酶浓度不影响以高于1U*mL-1*mg-2纤维蛋白原的浓度制备的纤维蛋白水凝胶的机械性质，如别处所述(Rowe等，ActaBiomater.,3:59-67(2007))。以固定的凝血酶浓度(100U/mL)进行以下工作。
纤维蛋白产生光滑、薄且刚性的不透明凝胶(图35A)。水合后没有明显的纤维蛋白凝胶溶胀。凝胶的边缘定义明确。OCT成像证明，通过该方法形成的凝胶具有200±30μm的平均厚度(图35B)，在基于模具尺寸预期的范围内。纤维蛋白凝胶的SEM图像显示出光滑的表面(图35C)，具有类似于他处所述的纤维蛋白的纤维状微结构(Filová等,J.Biomed.Mater.Res.A.,90A:55-69(2009)；图35D)
使用尺寸为1.5mm×5mm的定制成椭圆形冲头从由定制模具中形成的大片纤维蛋白产生尺寸类似的水凝胶。选择1.5mm×5mm的尺寸以平衡覆盖黄斑表面区域(直径5mm)的需要，同时保持小切口以进行植入。通过这些尺寸，可以排列3个植入物以覆盖黄斑表面积的>90％，同时需要<3mm的切口。随着纤维蛋白原浓度的增加，在这种几何形状中冲孔的纤维蛋白凝胶看起来硬度更高。用钳将不同纤维蛋白原浓度的凝胶从PBS中提起，以定性观察其保持形状和支持其水合重量的能力(图35E)。当从PBS中取出并自身折叠时，10mg/mL浓度的凝胶显示凝胶立即卷曲。由20和30mg/mL纤维蛋白原浓度制成的凝胶表现出减少的卷曲，并且40mg/mL及以上没有表现出卷曲。所有凝胶都表现出足够的可塑性，以在放回PBS后恢复到扁平形状。以40mg/mL或更高的纤维蛋白原浓度制成的凝胶看起来柔韧、耐用且可用各种手术器械操作。由于溶液的高粘度，从非常高浓度的纤维蛋白原溶液中获得凝胶可能是困难的，测试的最高浓度是80mg/mL。然而，在由40mg/mL和80mg/mL制成的凝胶之间没有观察到刚性的可见差异。
定量地，在300μm的固定厚度下的机械强度随着纤维蛋白原浓度增加而增加(图34C)。对于由20、40、60和80mg/mL纤维蛋白原制成的凝胶，机械强度分别为0.016±0.012N/mm、0.039±0.011N/mm、0.035±0.013N/mm和0.045±0.012N/mm(n＝5,p＝0.003)。在组内，20mg/mL浓度组与40mg/mL(p＝0.027)和80mg/mL(p＝0.006)在统计学上不同。最大屈服力也随着纤维蛋白原浓度的增加而增加。20、40、60和80mg/mL纤维蛋白原的最大力值分别为0.036±0.038N、0.081±0.039N、0.086±0.035N和0.111±0.033N(n＝5,p＝0.030)。在组内，相对于80mg/mL组，只有20mg/mL浓度组有统计学差异(p＝0.023)。
在具有不同厚度间隔物的定制模具中浇铸凝胶后，冲压出纤维蛋白凝胶，使用OCT成像以量化实际厚度，并安装用于机械测试。为确保正确处理较薄的凝胶，将纤维蛋白原浓度固定在60mg/mL，同时改变厚度。使用OCT，100μm组具有91±13μm的实际厚度，200μm组为198±10μm，并且300μm组为298±9μm(n＝5)。改变厚度显示出与机械强度和最大力的直接指数关系(图34D)。厚度为100μm时，机械强度为0.004±0.003N/mm，最大力为0.004±0.003N，而厚度为200μm时，机械强度为0.020±0.013N/mm，最大力为0.032±0.028N。厚度为300μm时，机械强度为0.043±0.019N/mm，最大力为0.094±0.031N。厚度对机械强度有显著影响(n＝3，p＝0.034)，100μm组在统计学上不同于300μm组(p＝0.029)。类似地，厚度对最大力具有显著影响(n＝3，p＝0.010)，其中300μm组与100μm(p＝0.009)和200μm(p＝0.045)组显著不同。定性地，与200μm和300μm凝胶相比，100μm凝胶难以用手术器械操纵，因为它们容易撕裂。200μm厚度似乎是具有足够的机械强度用于手术操作的最薄凝胶。
纤维蛋白水凝胶的降解动力学
当在室温下在PBS中无菌储存时，纤维蛋白凝胶本身没有经历明显的降解。迄今为止，纤维蛋白凝胶已在室温下储存>9个月。当暴露于tPA时，PBS中的纤维蛋白凝胶未经历显著降解(图36A)。然而，当加入纤溶酶原和tPA的组合时，纤维蛋白凝胶开始迅速降解。降解随着凝胶的整体变薄而进行，一些凝胶破碎成较小的碎片。当没有残留的可见残余物时，认为降解完成。
对于降解动力学研究，使用与用于机械研究的相同尺寸的200μm厚的纤维蛋白水凝胶(1.5mm×5mm，长椭圆形)。通过固定另外两种浓度来研究三种不同组分(纤维蛋白原，纤溶酶原和tPA)的浓度的作用(图36B)。在恒定的纤溶酶原(0.1U/mL)和tPA浓度(100U/mL)下，使用各种纤维蛋白原浓度产生的凝胶的降解动力学速率常数：对于40mg/mL为0.023±0.002分钟-1、对于50mg/mL为0.025±0.001分钟-1、和对于55mg/mL为0.025±0.005分钟-1。纤维蛋白原浓度对速率常数没有影响(n＝3，p＝0.55)，表明零级动力学。因此，降解时间与纤维蛋白原浓度线性相关：40mg/mL为100±10分钟，50mg/mL为113±13分钟，40mg/mL为120±10分钟。由于在40mg/mL以上的凝胶的机械刚度没有检测到差异，因此确定40mg/mL浓度是能够快速降解的刚性凝胶的最佳条件。
在固定的纤维蛋白原(40mg/mL)和tPA浓度(100U/mL)下，纤溶酶原浓度变化对降解速率常数和总降解时间有影响。不同纤溶酶原浓度下的降解速率常数：1U/mL时为0.363±0.048分钟-1，0.5U/mL时为0.116±0.008分钟-1，0.1U/mL时为0.025±0.002分钟-1，0.05U/mL时为0.0083±0.0055分钟-1，和0.01U/mL时为0.0048±0.0013分钟-1(n＝3，p<0.001)。在组内，1U/mL组(P<0.001)和0.5U/mL组(p<0.003)与所有其他组不同。不同纤溶酶原浓度的总降解时间：1U/mL时为7±1分钟，0.5U/mL时为24±3分钟，0.1U/mL时为34±3分钟，0.05U/mL时为81±16分钟，在0.01U/mL时为177±32分钟(n＝3，p<0.001)。在组内，0.01U/mL组(P<0.001)和0.05U/mL组(p＝0.03)与所有其他组统计学上不同。
在固定的纤维蛋白原浓度(40mg/mL)和纤溶酶原浓度(0.1U/mL)下，降解速率常数相对于tPA浓度增加，直至达到100U/mL的平台期。在不同tPA浓度下的降解速率常数值：1U/mL时为0.011±0.003分钟-1，10U/mL时为0.021±0.003分钟-1，100U/mL时为0.039±0.002分钟-1，和1,000U/mL时为0.042±0.005分钟-1(n＝3，p<0.001)。在组内，1U/mL(p＝0.036)和10U/mL(p＝0.036)组与所有其他组显著不同。总降解时间类似地在100U/mL tPA浓度下接近平台期。在不同tPA浓度下的总降解时间为：1U/mL时170±17分钟，10U/mL时113±12分钟，100U/mL时65±9分钟，和1,000U/mL时57±6分钟(n＝3，p<0.001)。在组内，1U/mL组(p<0.001)和10U/mL组(p＝0.004)与所有其他组统计学不同。
纤维蛋白上的RPE培养需要抑肽酶
对于RPE培养，使用定制的Teflon重物以使弯液面变平从而形成纤维蛋白凝胶以适合各种细胞培养形式。使用以40mg/mL纤维蛋白原浓度形成的纤维蛋白凝胶进行所有细胞培养。最初在纤维蛋白上培养的RPE在最初48小时内降解基材(图37A)。为解决此问题，使用蛋白酶抑制剂抑肽酶。抑肽酶已获FDA批准用于人类。
为了确定可能有用的抑肽酶浓度范围，确定抑肽酶是否对iPSC-RPE表现出任何毒性。为实现此目的，在96孔板中的iPSC-RPE上使用活/死测定。以2天的间隔向细胞进料补充有抑肽酶的培养基，抑肽酶浓度范围为250U/mL至8,000U/mL(图37B)。将活细胞的百分比标准化为0U/mL对照组中存在的活细胞的百分比。测试的所有抑肽酶浓度的活力与对照没有差异(图37B)。使用双向ANOVA，在8周试验的过程中，在所测试的任何浓度的抑肽酶中均未观察到活力显著降低(n＝3，p>0.999)。
为了确定维持纤维蛋白支持所必需的抑肽酶的最佳量，将抑肽酶以0.5U/mL至50U/mL的浓度添加至RPE培养基中，并且随时间定性监测支持RPE单层的纤维蛋白水凝胶的存在。1周后，在8周的过程中拍摄各组的显微照片(图37C)。在0U/mL时，大部分凝胶被降解，并且在2天内观察到最小的细胞附着。附着于表面的细胞不形成单层。在0.5U/mL组中，大部分凝胶在培养2天后保持完整。在该浓度下，iPSC-RPE细胞在纤维蛋白凝胶得以保留的斑块上生长，但不在凝胶降解的区域中生长(图37C，星号)。在接受1-10U/mL的组中，随着抑肽酶浓度的增加，观察到更少的降解凝胶斑块。
暴露于10U/mL至50U/mL的抑肽酶浓度的凝胶保持完整，覆盖整个板的表面，并显示出单层iPSC-RPE的覆盖。1周后，定量地，细胞附着的表面积百分比在0U/ml时为20.0±8.9％，在0.5U/mL时为93.6±1.3％，在1U/mL时为98.1±0.9％，在5U/mL时为99.7±0.5％，在10U/mL时为99.8±0.2％(n＝3，p<0.001；图37D)。在组内，0U/mL对照与所有其他组显著不同(p<0.001)。总体而言，添加25U/mL抑肽酶可在超过8个月中防止纤维蛋白的RPE降解。
纤维蛋白上RPE的表型
在纤维蛋白上培养的iPSC-RPE被着色并形成鹅卵石单层细胞(图38A)。活/死测定证实细胞是有活力的(图38B)。使用一组20个关键RPE标志物通过qPCR进行RPE表型的验证(图40)。如果在第37个循环PCR之前观察到峰，则认为存在标志物。与在基质胶涂覆的组织培养塑料上生长的iPSC-RPE观察到的相似，在纤维蛋白凝胶上生长10周的iPSC-RPE中检测到所有RPE标志物(特别是RPE65、CRALBP和MITF)。多能性标志物LIN28A和仙台病毒递送的“Yamanaka”因子(KLF，KOS，c-myc)的标志物在所有组中均为阴性。
Western印迹分析用于证实RPE标志物的蛋白质表达(图38D)。在来自在纤维蛋白凝胶上生长的iPSC-RPE的裂解物中观察到RPE65，Best 1和CRALBP(归一化为α-肌动蛋白)的条带。对Best 1，埃滋蛋白和ZO-1进行免疫荧光染色(图38E)。先前报道的在基质胶涂覆的transwell上生长的iPSC-RPE中的Best1，埃滋蛋白和ZO-1的染色用作参考(Johnson等，Investig.Ophthalmol.Vis.Sci.,56:4619(2015))。Best1定位于细胞的基底外侧表面。埃滋蛋白是微绒毛的标志物，在细胞顶部表面上观察到斑点，表明存在微绒毛。观察到ZO-1呈现所有细胞的边界，表明存在连接复合物和单个单层。
通过ELISA定量VEGF和PEDF的RPE分泌(图38C)。用RPE培养48小时后，来自纤维蛋白组的培养基的VEGF浓度为6.46±0.23ng/mL。纤维蛋白组的PEDF浓度为6.41±1.61μg/mL，基质胶对照的PEDF浓度为6.10±0.53μg/mL(n＝3，p＝0.822)。因此，在纤维蛋白水凝胶或组织培养塑料上生长的RPE之间没有发现差异。
在基质胶涂覆的纤维蛋白水凝胶上培养iPSC-RPE获得了类似的结果。例如，VEGF和PEDF的ELISA定量表明在纤维蛋白+基质胶涂层上培养的iPSC-RPE类似地释放到单独的纤维蛋白水凝胶和基质胶涂覆的TCPS(图42)。免疫荧光染色显示在纤维蛋白或纤维蛋白+基质胶涂层上培养的iPSC-RPE之间具有类似的埃滋蛋白和ZO-1模式(图43)。活/死测定显示，在纤维蛋白或纤维蛋白+基质胶上生长的iPSC-RPE的活力相似(图44)。Western印迹分析显示在纤维蛋白或纤维蛋白+基质胶上生长的iPSC-RPE表达Best1、RPE65和CRALBP(图45)。
纤维蛋白的降解留下完整的RPE单层
该研究的目的是为RPE单层的生长和移植产生可快速降解的支持物。已建立参数以产生可快速降解并具有适当大小和机械强度的纤维蛋白水凝胶，进行以下操作以确定iPSC-RPE单层的存在和抑肽酶中的生长是否改变了凝胶的降解动力学以及降解是否改变了体外iPSC-RPE的活力。基于使用凝胶无iPSC-RPE累积的数据，使用0.5U/mL纤溶酶原和100U/mL tPA进行降解研究。如图39A所示，当纤维蛋白开始降解时，RPE单层开始从边缘自身卷曲(图39A)。在没有纤维蛋白支持物剩余的区域中观察到皱纹。在纤维蛋白仍然完整的区域，RPE看起来平坦。一旦完全降解，RPE仍保持为单层片，具有许多卷曲和皱纹，并且难以用手术器械处理。然而，RPE表现为连续的着色组织(图39A)。
为了在纤维蛋白支持物降解后确认RPE的活力，在纤维蛋白完全降解后24小时进行活/死测定(图39B和39C)。将存活标准化为在降解前在纤维蛋白上培养的存活RPE的百分比。降解前RPE的归一化活力值为100.0±3.9％，降解后为101.1±10.5％(n＝3，p＝0.877)。
最后，利用免疫荧光检测纤维蛋白降解后ZO-1的存在(图39D)。完成纤维蛋白降解后24小时，固定的RPE单层显示出ZO-1的阳性染色。无支持的RPE单层的染色与未降解的纤维蛋白上的单层染色无法区分。
虽然本文提供的某些结果是使用iPSC衍生的RPE获得的，但是没有理由认为本文所述的纤维蛋白水凝胶材料不能用于衍生自其他来源例如ESC和成体干细胞的RPE。
本文提供的结果证明纤维蛋白可用作RPE移植的材料。纤维蛋白可以以各种形状和尺寸形成，具有适合RPE递送的机械硬度和降解性质。本文提供的结果还证明蛋白酶抑制剂如抑肽酶可用于减缓RPE降解纤维蛋白的能力。此外，当iPSC-RPE在蛋白酶抑制剂如抑肽酶存在下在纤维蛋白上培养时，细胞可以在表型上看起来与RPE相似。在纤维蛋白降解后，RPE可以保持为活的单层。
实施例7-植入含有RPE单层的纤维蛋白水凝胶
将纤维蛋白水凝胶植入兔眼的视网膜下腔(图41)。通过在定制模具中混合纤维蛋白原(最终：40mg/mL)和凝血酶(最终：100U/mL)溶液来制备纤维蛋白水凝胶，产生薄片(200μm)。加入少量台盼蓝以使凝胶在植入后更容易可视化。将植入物冲压成1.5mm×5mm的长椭圆形几何形状。一旦准备后，将植入物装入植入装置中。为了进行手术植入，将白色雌性新西兰兔(3kg)麻醉并准备进行手术。进行标准的3端玻璃体切除术，然后使用精细插管形成水泡，并使用视网膜剪刀进行视网膜切开术。使用3.2mm狭缝刀穿过巩膜形成切口。将植入装置插入眼睛中并定位在视网膜切开处下。植入物部署就位。移除植入装置后，缝合巩膜切口。在动物苏醒之前，植入物可以看作是扁平视网膜下的平板。48小时后处死动物，收获眼睛。大体解剖检查未发现纤维蛋白水凝胶剩余的证据。
其他实施方式
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 梅约医学教育与研究基金会（Mayo Foundation for Medical Educationand Research）
<120> 使用纤维蛋白支持物进行视网膜色素上皮移植的方法和材料
<130> 07039-1619WO1
<150> 62/431,259
<151> 2016-12-07
<160> 76
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ctcttgctgg aaggctggat 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 13
aagctgcttg agagggtctt t 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 14
acggccttgc catcatactt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 15
ccagggttca ggtttggttc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 16
catctgtgga gggtcttggg 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 17
aatacaggaa cttgaaatgc aggc 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 18
atgctgaagg aggtcttggc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 19
cgggagatct ctgagaccga 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 20
ggatgagagt gcccagttcc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 21
cgcatcaagg agttgggaat 20
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 22
ctccaggcgg cgagagt 17
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 23
ctgctcatcg gctgttggta 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 24
gagcattggg aaccacaggt 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 25
tgcctgggat tcttctcaca g 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 26
tgcttcataa gtctgcgcct at 22
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 27
ttgacagtat ttttgagcag tggc 24
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 28
gacacagcaa gctcacaagc 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 29
tctgaaggtt ctgatgccag c 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 30
gctggtgatg agagcaaggt 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 31
aagcaagtga agggatctgc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 32
tcacagaggt ttggcttccg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 33
cgctctaagg gttctgctct 20
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 34
tcctgggcag acaccttctt a 21
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 35
atcctgctta tccttgtgct ga 22
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 36
gggtcattgt cagccgcttt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 37
ggtggacacc atcgtgaaag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 38
gaagccattt catagcgggc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 39
aatgtcacct ggggcattca 20
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 40
aaaagcccat cctgtacatt acaaa 25
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 41
cttcaagggg cagtgggtaa c 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 42
ggacttggtg acttcgcctt 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 43
tccgaaccaa gcttcgtatc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 44
tagcgaaagt gccaaagctg 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 45
tggacacctc ctggctattg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 46
gggccaggat gaagtcgtag 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 47
ctgcagttcg aggtgctcat 20
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 48
aggcggccgg cagag 15
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 49
accactttta ggtcggctca 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 50
tctggtccgg agattctgct 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 51
aactcttcct gaggcaggtg g 21
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 52
ggaatctacg gggtgggttt 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 53
gccagacgat catgcagcta 20
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 54
gcagtctaca tgctaaatca gagg 24
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 55
tcgagggtgc aggtatggtt 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 56
tctgaactca cttcccgagc 20
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 57
gatcaagatc attgctcctc ctg 23
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 58
ctgcgcaagt taggttttgt ca 22
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 59
ctctgctcct cctgttcgac 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 60
accaaatccg ttgactccga 20
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 61
agatcaaaag gagacaggtg ct 22
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 62
aatagccccc acccattgtg 20
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 63
actgacggag cccgagaag 19
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 64
ttgctcggtt ctcttcaccc 20
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 65
ttggcttaat gagactggga cc 22
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 66
acatcaccac accaacactg a 21
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 67
gtgacgcaga aggcctca 18
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 68
tgcaccaggt ctgagtgttc 20
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 69
ggatcactag gtgatatcga gc 22
<210> 70
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 70
accagacaag agtttaagag atatgtatc 29
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 71
ttcctgcatg ccagaggagc cc 22
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 72
aatgtatcga aggtgctcaa 20
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 73
atgcaccgct acgacgtgag cgc 23
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 74
accttgacaa tcctgatgtg g 21
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 75
taactgacta gcaggcttgt cg 22
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 76
tccacataca gtcctggatg atgatg 26

Claims (13)

1.一种视网膜植入物，包含（a）具有顶部表面和基底表面的视网膜色素上皮单层，所述视网膜色素上皮单层是平坦，无皱纹的单层和（b）直接附着于所述单层的所述基底表面的纤维蛋白水凝胶层，其中顶部表面无纤维蛋白水凝胶层，其中所述纤维蛋白水凝胶层的厚度为200μm至400μm和制成所述水凝胶层的纤维蛋白原浓度为40-80mg/mL；其中所述植入物在包含10U/mL的抑肽酶至50U/mL的抑肽酶的培养基内，纤维蛋白水凝胶层保持完整，和其中当所述视网膜植入物从培养基中取出植入哺乳动物眼部时所述纤维蛋白水凝胶层降解；所述植入物包括纤溶酶原或其中在即将移植之前将纤溶酶原添加到培养基中。
2.如权利要求1所述的植入物，其中所述纤维蛋白水凝胶层的厚度为200μm。
3.如权利要求1所述的植入物，其中所述植入物包含纤溶酶原。
4. 如权利要求1所述的植入物，其中所述植入物包含0.1 U纤溶酶原/mL至40 U纤溶酶原/mL，或0.001 U纤溶酶原/mL至40 U纤溶酶原/mL。
5.一种制备视网膜植入物的方法，其中所述方法包括在培养基中于纤维蛋白基底支持基材上培养视网膜上皮细胞，所述培养基包含10U/mL的抑肽酶至50U/mL的抑肽酶，以形成具有顶部表面和基底表面的视网膜色素上皮单层，其中所述单层的基底表面附着在所述纤维蛋白基底支持基材上，其中顶部表面无纤维蛋白水凝胶层，其中所述纤维蛋白基底支持基材是纤维蛋白水凝胶层，所述纤维蛋白水凝胶层厚度为200μm至400μm和制成所述水凝胶层的纤维蛋白原浓度为40-80mg/mL；其中所述植入物在包含10U/mL的抑肽酶至50U/mL的抑肽酶的培养基内，纤维蛋白水凝胶层保持完整，和其中当所述视网膜植入物从培养基中取出植入哺乳动物眼部时所述纤维蛋白水凝胶层降解；所述植入物包括纤溶酶原或其中在即将移植之前将纤溶酶原添加到培养基中。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述培养基包含抗纤维蛋白溶解剂，并且所述抗纤维蛋白溶解剂是氨甲环酸或氨基己酸。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述培养基还包含纤溶酶原。
8. 如权利要求7所述的方法，其中所述培养基包含0.1 U纤溶酶原/mL至40 U纤溶酶原/mL，或0.001 U纤溶酶原/mL至40 U纤溶酶原/mL。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述纤维蛋白基底支持基材包含内皮细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述内皮细胞获自选自以下的来源：iPSC衍生的内皮细胞，血液生长内皮细胞（BOEC），内皮集落形成细胞（ECFC），内皮祖细胞（EPC）和脐带静脉内皮细胞（UVEC）。
11.如权利要求5所述的方法，其中所述纤维蛋白基底支持基材包含RPE下组织细胞群。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述RPE下组织细胞群包括黑素细胞、周细胞或成纤维细胞。
13.如权利要求5所述的方法，其中所述纤维蛋白水凝胶层包含2U/ml到1500U/ml的凝血酶。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3045464C (en) 2016-12-07 2023-10-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for using fibrin supports for retinal pigment epithelium transplantation
EP3635094A4 (en) * 2017-06-05 2021-03-17 Mayo Foundation for Medical Education and Research PROCESSES AND MATERIALS FOR THE CULTURE, PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF STEM CELLS
CN108893442A (zh) * 2018-07-25 2018-11-27 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法
CN108823160B (zh) * 2018-07-25 2020-08-21 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法
US20220000664A1 (en) * 2019-02-08 2022-01-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Implantation device
AU2021377273A1 (en) * 2020-11-13 2023-06-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Fibrin hydrogels

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2161659A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Yao Liu Retinal pigment epithelium transplantation
WO1994025569A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Photogenesis, Incorporated Retinal pigment epithelium transplantation
US6045791A (en) * 1992-03-06 2000-04-04 Photogenesis, Inc. Retinal pigment epithelium transplantation
US6607522B1 (en) * 2000-03-16 2003-08-19 General Hospital Corporation Methods for tissue welding using laser-activated protein solders
CN101500594A (zh) * 2006-06-22 2009-08-05 西来昂诊疗公司 通过调节巨蛋白活性治疗眼病的方法和组合物
CN103007355A (zh) * 2011-09-20 2013-04-03 同济大学 一种水凝胶-纳米纤维膜及其制备方法和用途
CN103656742A (zh) * 2013-11-29 2014-03-26 温州医科大学 功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法
CN105349492A (zh) * 2011-05-18 2016-02-24 加利福尼亚大学董事会 用于治疗视网膜疾病的组合物及方法

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5487739A (en) 1987-11-17 1996-01-30 Brown University Research Foundation Implantable therapy systems and methods
AU771994B2 (en) 1996-12-02 2004-04-08 Ipxmedical, Llc Compositions and methods for treating or preventing inflammatory diseases
US20110171185A1 (en) 1999-06-30 2011-07-14 Klimanskaya Irina V Genetically intact induced pluripotent cells or transdifferentiated cells and methods for the production thereof
AU775149B2 (en) 1999-10-21 2004-07-22 Alcon Inc. Sub-tenon drug delivery
US7867186B2 (en) 2002-04-08 2011-01-11 Glaukos Corporation Devices and methods for treatment of ocular disorders
EP1556063A2 (en) 2002-10-04 2005-07-27 TissueTech, Inc. Retinal pigment epithelial cell cultures on amniotic membrane and transplantation
CA2541334A1 (en) * 2002-10-04 2004-04-22 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Sealants for skin and other tissues
WO2004038004A2 (en) 2002-10-23 2004-05-06 The Research Foundation Of State University Of Newyork Fibrin-based tissue-engineered vasculature
US20040236343A1 (en) 2003-05-23 2004-11-25 Taylor Jon B. Insertion tool for ocular implant and method for using same
US20050186672A1 (en) 2004-01-27 2005-08-25 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Tissue system with undifferentiated stem cells derived from corneal limbus
WO2005090550A1 (ja) 2004-03-18 2005-09-29 Biomaster, Inc. 幹細胞の増殖法
US7511025B2 (en) 2004-06-16 2009-03-31 Trustees Of Dartmouth College Compositions and methods for inhibiting the synthesis or expression of MMP-1
US20060047250A1 (en) 2004-08-30 2006-03-02 Hickingbotham Dyson W Fluid delivery device
JP5109030B2 (ja) * 2005-07-25 2012-12-26 茂 木下 シート状組成物
US20070060887A1 (en) 2005-08-22 2007-03-15 Marsh David A Ophthalmic injector
ITTO20060282A1 (it) 2006-04-14 2007-10-15 Univ Degli Studi Torino Mezzo di coltura e composizione farmaceutica per la rigenerazione del tessuto cartilagineo relativo procedimento relativi usi e prodotti
US9039761B2 (en) 2006-08-04 2015-05-26 Allergan, Inc. Ocular implant delivery assemblies with distal caps
EP2886646B1 (en) 2007-04-18 2019-08-14 Hadasit Medical Research Services & Development Limited Stem cell-derived retinal pigment epithelial cells
US8821861B2 (en) 2007-10-05 2014-09-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Fibrin sealant
US20120219737A1 (en) 2007-10-19 2012-08-30 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Production of extracellular matrix, conditioned media and uses thereof
US8425473B2 (en) 2009-01-23 2013-04-23 Iscience Interventional Corporation Subretinal access device
CA3066806C (en) 2009-08-24 2023-03-07 David M. Gamm Substantially pure human retinal progenitor, forebrain progenitor, and retinal pigment epithelium cell cultures and methods of making the same
PT2471902T (pt) * 2009-08-25 2018-08-02 Univ Granada Produção de tecidos artificiais por meio da engenharia de tecidos utilizando biomateriais de agarose-fibrina
WO2011084550A2 (en) 2009-12-16 2011-07-14 Eyevation, Llc Delivery and extraction devices
JP2013520239A (ja) * 2010-02-22 2013-06-06 マッツォッキ，ルディ，エイ 網膜を再構成するための最小限侵襲方法及び装置
WO2011109712A2 (en) 2010-03-04 2011-09-09 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Bioengineered human corneal stromal tissue
US9267099B2 (en) 2010-03-15 2016-02-23 Indiana University Research And Technology Corporation Engineered lumenized vascular networks and support matrix
EP2383333B1 (en) 2010-04-28 2015-05-27 Technische Universität Dresden Method for producing polarized retinal progenitor cells from pluripotent stem cells and their differentiation into retinal pigment epithelium cells
GB201011313D0 (en) 2010-07-05 2010-08-18 Ucl Business Plc Implantation devices, methods and implants
CN104758118B (zh) 2010-10-15 2018-04-06 科尼尔赛德生物医学公司 用于进入眼睛的装置
US9132152B2 (en) 2011-02-10 2015-09-15 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for generating induced pluripotent stem cells
KR101994492B1 (ko) 2011-02-25 2019-06-28 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소 망막 색소 상피 세포 시이트의 제조 방법
JP5816452B2 (ja) 2011-03-31 2015-11-18 株式会社セルシード 細胞シート移植治具及びその利用方法
WO2012177968A1 (en) 2011-06-22 2012-12-27 The Schepens Eye Research Institute, Inc. A scaffold for subretinal cell transplantation and drug delivery
KR101389850B1 (ko) 2012-05-04 2014-04-29 이화여자대학교 산학협력단 심장전구세포의 배양방법 및 그 용도
EP2858593B1 (en) 2012-06-12 2020-09-30 Alcon Inc. Intraocular gas injector
WO2014047520A1 (en) 2012-09-20 2014-03-27 Danisco Us Inc. Microtiter plates for controlled release of culture components to cell cultures
CN105007841A (zh) 2012-12-31 2015-10-28 乔治·D.·福卢什 用于大量出血的冻干纤维蛋白封闭剂
AU2014212230B2 (en) 2013-02-01 2019-07-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method for generating retinal pigment epithelium (RPE) cells from induced pluripotent stem cells (iPSCs)
US9587221B2 (en) 2013-11-11 2017-03-07 Auburn University Encapsulation and cardiac differentiation of hiPSCs in 3D PEG-fibrinogen hydrogels
WO2015077498A1 (en) 2013-11-20 2015-05-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for treating disorders of the eye
US20150159134A1 (en) 2013-12-11 2015-06-11 Pfizer Limited Method for producing retinal pigment epithelial cells
WO2015087231A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Pfizer Limited Method for producing retinal pigment epithelial cells
JP6495603B2 (ja) * 2014-09-03 2019-04-03 テルモ株式会社 シート状細胞培養物とフィブリンゲルとの積層体の製造方法
KR101613478B1 (ko) 2014-09-22 2016-04-19 (주)안트로젠 중간엽줄기세포-하이드로겔을 함유하는 조성물 및 이의 제조방법
EP3011981A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-27 Histocell, S.L. A biomaterial scaffold for regenerating the oral mucosa
TWI711455B (zh) 2015-05-13 2020-12-01 臺北榮民總醫院 多層視網膜細胞移植物
WO2017044483A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method for reproducible differentiation of clinical-grade retinal pigment epithelium cells
EP3347457B1 (en) 2015-09-08 2021-10-27 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Macs-based purification of stem cell-derived retinal pigment epithelium
US10307289B2 (en) 2016-08-19 2019-06-04 Drug Delivery Company, Llc Sub-cutaneous medicinal dosage delivery implant system
CA3045464C (en) 2016-12-07 2023-10-17 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for using fibrin supports for retinal pigment epithelium transplantation
EP3579851A4 (en) 2017-02-08 2020-10-07 Hadasit Medical Research Services And Development LIGHT-RECEPTOR CELLS FOR THE TREATMENT OF RETINAL DISEASES
EP3635094A4 (en) 2017-06-05 2021-03-17 Mayo Foundation for Medical Education and Research PROCESSES AND MATERIALS FOR THE CULTURE, PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF STEM CELLS
US20220000664A1 (en) 2019-02-08 2022-01-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Implantation device

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6045791A (en) * 1992-03-06 2000-04-04 Photogenesis, Inc. Retinal pigment epithelium transplantation
CA2161659A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Yao Liu Retinal pigment epithelium transplantation
WO1994025569A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Photogenesis, Incorporated Retinal pigment epithelium transplantation
US6607522B1 (en) * 2000-03-16 2003-08-19 General Hospital Corporation Methods for tissue welding using laser-activated protein solders
CN101500594A (zh) * 2006-06-22 2009-08-05 西来昂诊疗公司 通过调节巨蛋白活性治疗眼病的方法和组合物
CN105349492A (zh) * 2011-05-18 2016-02-24 加利福尼亚大学董事会 用于治疗视网膜疾病的组合物及方法
CN103007355A (zh) * 2011-09-20 2013-04-03 同济大学 一种水凝胶-纳米纤维膜及其制备方法和用途
CN103656742A (zh) * 2013-11-29 2014-03-26 温州医科大学 功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S A Mousa.Role of hypoxia and extracellular matrix-integrin binding in the modulation of angiogenic growth factors secretion by retinal pigmented epithelial cells.1999,第74卷(第1期),第135-143页. *
人视网膜色素上皮细胞在两种Bruch膜替代物上的生长研究比较;李筠萍;《中国博士学位论文全文数据库》;20130115;E073-14 *

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