CN103007355A - 一种水凝胶-纳米纤维膜及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域，涉及一种纳米纤维聚合物复合膜及其制备方法和用途。该纳米纤维聚合物复合膜，其下层为水凝胶纳米纤维膜、中层为Matrigel基质胶层、上层为视网膜色素上皮细胞层。该纳米纤维聚合物复合膜作为生物支架用于支持RPE细胞的生长和移植。该纳米纤维膜柔软、有弹性、渗透性好、可生物降解并且具有与细胞外基质相似的结构。这些属征有利于RPE单层细胞的粘附、分化，便于外科手术操作，移植后可通过代谢过程排出体外，对人体无害。本发明结合生物纳米材料和细胞工程，其成功研发给老年性黄斑变性(AMD)患者带来光明和希望，并将产生巨大的经济效益和社会效益。

Description

一种水凝胶-纳米纤维膜及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医学领域，涉及一种纳米纤维聚合物复合膜及其制备方法和用途。

背景技术

老年性黄斑变性(Age-related Macular Degeneration，AMD)是一种多因素复合作用的眼底病，是导致老年人失明的常见疾病之一。该视网膜退行性疾病表现为中心视力进行性减退，常导致阅读和其他行为障碍。虽然目前对这种病还没有特效的治疗方法，但科学家们在干细胞领域的研究为这类病人带来了治愈的曙光，即把培养在适当聚合物支架上的视网膜色素上皮细胞(RPE)移植入眼睛内以替代退化的细胞。这种治疗方案要求支架具有生物活性和可降解性，而视网膜下腔有限的路径则要求支架的大小和机械特性需达到最优化。

RPE是Bruch膜上的连续单层细胞，位于视网膜感光细胞外节段和脉络膜之间。RPE与视网膜感光细胞层共同组成功能单位，以提供视觉的转换界面。RPE细胞是视网膜新陈代谢最活跃的部分，控制营养成分在脉络膜和感光细胞层间的转运，以及代谢废物通过Bruch膜由感光细胞层的排出。随着年龄的增长，代谢废物阻塞RPE和Bruch膜引起积累损伤，并导致RPE脱离或代谢活性的降低，继而引起光感受器的凋亡和视觉的不可逆丧失。Bruch膜是脉络膜最里面的一层，厚度约有2-4μm，由五层结构组成，里面的三层包含胶原(collagen)及弹性蛋白纤维(elastic fibers)，侧翼为基底膜。这几层结构的作用是储存生长因子和其他营养物质，以调节细胞的功能。上皮细胞与基底膜的粘附依赖于细胞膜相关的整合素受体与特异识别序列的结合，如存在于基底膜的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸序列(Arginine-Glycine-Aspartic acid，RGD sequence)。另外，基底膜的三维结构表面复杂，布满大小为30-400nm的小孔，这种纳米级基质特征可以调节细胞的粘附、迁移、增殖和分化等基本行为。RPE细胞具有正常视网膜结构和功能是移植治疗黄斑变性的重要前提。将老化的RPE细胞通过外科手术剥离，再将RPE细胞或其前体细胞移植其内，这些细胞将整合到原有的上皮细胞并恢复光感受器功能。如果将RPE细胞悬液直接用于移植，则因其不能与基底膜正常粘附，RPE细胞将会发育为没有功能作用的异常取向或多层结构，并最终导致移植失败。介于RPE细胞的单层结构和正确的极化对上皮细胞机能恢复的重要性，将RPE种植在适宜的组织工程支架上将是治愈老年性黄斑变性的最有希望的方向。

目前已经开发了多种天然和人工合成的载体以替代Bruch膜的功能，如人类羊膜或猪晶状体囊，这些捐赠而来的膜片在视网膜组织工程中经常用到。但这些替代物除了有一定局限性和传播疾病的风险外，也有其他的缺陷，如基于坚硬关联的胶原支持物，在RPE移植时很难与视网膜下腔形状保持一致，而胶质包被的晶状体前囊太松软，且在视网膜下腔操作时容易卷曲。相比之下，人工聚合体支持物，如能水解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚癸二酸丙三醇酯、聚羟基脂肪酸酯或不可降解的聚二甲基硅氧烷和聚醚尿烷，可能是RPE单层细胞形成的理想底物，但是他们都不具备RPE成功移植所需要的所有条件，如多孔性、充足的渗透性、适宜的厚度和可降解等性能。

发明内容

本发明的目的是针对现有天然和人工合成载体的不足，提供一种纳米纤维聚合物复合膜及其制备方法和用途。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种纳米纤维聚合物复合膜，其下层为水凝胶纳米纤维膜、中层为Matrigel基质胶层、上层为视网膜色素上皮细胞层。

所述的水凝胶纳米纤维膜中由包含以下质量分数的组分制成：10-20％硫酸软骨素、0.05-0.1％H₂O₂和0.0003125-0.000625％辣根过氧化物酶和79.899375-89.9496875％的磷酸缓冲液制成。

所述的视网膜色素上皮细胞层为单层。

上述铺有RPE细胞的纳米纤维聚合物复合膜的下层水凝胶纳米纤维膜质地柔软、有弹性、渗透性好、可生物降解并且具有与细胞外基质相似的结构，有利于RPE单层细胞的粘附、分化，便于外科手术操作，移植后可通过代谢过程排出体外，对人体无害；中层Matrigel是一种可溶性的基底膜基质，可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料，主要成分包括：层黏连蛋白、胶原IV等，同时含组织纤维酶原活化因子、TGF-β成纤维细胞及其它生长因子，可有效帮助RPE细胞的附着和分化；上层RPE细胞是多角形、镶嵌的单层细胞，呈极性排列。

一种上述纳米纤维聚合物复合膜的制备方法，包含如下步骤：

(1)称取硫酸软骨素、H₂O₂和辣根过氧化物酶(HRP)并充分混匀；

(2)将步骤(1)制备的混合物加到细胞培养板中，放置于培养箱中，然后在细胞培养板的每孔加入0.5-2mL视网膜色素上皮细胞培养基覆盖该混合物，于培养箱中过夜，制得水凝胶纳米纤维膜；

(3)将步骤(2)中细胞培养板的培养基吸掉，每孔铺上0.5-2mL稀释的基质胶Matrigel，以利于视网膜色素上皮细胞的生长，放入培养箱2-4h，待用；

(4)吸除培养有视网膜色素上皮细胞培养板(以6孔细胞培养板计)中的培养基，每孔加0.5-2mL磷酸盐缓冲液，以除掉残留的培养基，每孔加0.5-1mL质量分数0.25％的胰酶-EDTA，放入培养箱2-5min，待85-95％细胞脱离板壁后，每孔加1-2mL视网膜色素上皮细胞培养基以终止胰酶-EDTA作用，吹打后转移离心管中；

(5)离心，去除上清，加1-2mL视网膜色素上皮细胞培养基悬浮细胞，并计数；将浓度为10⁴～10⁶个/mL的视网膜色素上皮细胞接种到步骤(3)中制备好的纳米纤维膜上；放置于培养箱中培养，每2-3天换视网膜色素上皮细胞培养基；

(6)待细胞有80-90％铺满培养板底后，将细胞连同聚合物膜及Matrigel切下，用于临床细胞移植。

所述的步骤(1)中硫酸软骨素、H₂O₂和辣根过氧化物酶(HRP)溶解在磷酸缓冲液中，其质量分数分别为10-20％0.05-0.1％和0.0003125-0.000625％。

所述的视网膜色素上皮细胞培养基，包含以下组分：

α修饰最小必需培养基     500mL，

N1补充物                 5mL，

谷氨酰胺-青霉素-链霉素   5mL，

非必需氨基酸             5mL，

牛磺酸                   125mg，

氢化可的松               10g，

三碘甲状腺原氨酸         0.0065g，

热灭活胎牛血清           25～75mL。

所述的步骤(2)的培养时间为3-5h。

所述的培养箱的条件为37℃，5％CO2_。

所述的步骤(3)中Matrigel以磷酸盐缓冲液稀释，两者的体积比为1∶10-1∶20。

所述的步骤(5)中离心的操作条件为常温，转速为800-1500rpm，离心时间为3-5min。

一种上述纳米纤维聚合物复合膜用于视网膜色素上皮细胞移植材料的用途。

本发明的优点在于：

目前已开发的天然和人工合成载体，如人类羊膜或猪晶状体囊，除了有一定局限性和传播疾病的风险外，也有其他的缺陷，如基于坚硬关联的胶原支持物，在RPE移植时很难与视网膜下腔形状保持一致，而胶质包被的晶状体前囊太松软，且在视网膜下腔操作时容易卷曲；人工聚合体支持物，如能水解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚癸二酸丙三醇酯、聚羟基脂肪酸酯或不可降解的聚二甲基硅氧烷和聚醚尿烷，都不具备RPE成功移植所需要的所有条件，如多孔性、充足的渗透性、适宜的厚度和可降解等性能。本发明将纳米材料和细胞工程相结合，弥补了现有天然和人工合成载体的不足，开发出的水凝胶-纳米纤维膜柔软、有弹性、渗透性好、可生物降解并且具有与细胞外基质相似的结构，这些特征有利于RPE单层细胞的粘附、分化，便于外科手术操作，移植后可通过代谢过程排出体外，对人体无害。

具体实施方式

本发明可以按如下所述选择所需的试剂：

α修饰最小必需培养基        MEM，αmodification(Sigma，USA)，

N1补充物                    N1supplement(Sigma，USA)，

谷氨酰胺-青霉素-链霉素      Glutamine-penicillin-streptomycin(Sigma，USA)，

非必需氨基酸                Non essential amino acids(Sigma，USA)，

牛磺酸                      Taurine(Sigma，USA)，

氢化可的松                  Hydrocortisone(Sigma，USA)，

三碘甲状腺原氨酸            Triiodo-thyronin(Sigma，USA)，

热灭活胎牛血清              Fetal bovine serum，heat inactivated(Invitrogen，USA)，

基质胶                      Matrigel(BD，USA)，

0.25％胰酶-EDTA              0.25％Trypsin-EDTA(Invitrogen，USA)。

硫酸软骨素                   Chondroitin Sulfate(Sigma，USA)，

过氧化氢                     H₂O₂(Sigma，USA)，

辣根过氧化物酶               Horseradish Peroxidase(HRP)(Sigma，USA)。

溶液配方：

1)12.5-25wt％硫酸软骨素：125-250mg硫酸软骨素溶于磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液)，定容至1mL；

2)0.5-1wt％H₂O₂：100μL 1-2％H₂O₂用磷酸盐缓冲液稀释至200μL；

3)10-20U/mL辣根过氧化物酶(HRP，300U/mg)：取5-10μL浓度为5mg/mL的HRP用磷酸盐缓冲液稀释至800μL。

4)Matrigel(BD Biosciences，cat.no.356234)：用磷酸盐缓冲液1∶10-1∶20稀释

5)RPE细胞培养基：

实施例1

1)分别将上述配制的200μL硫酸软骨素，25μL H₂O₂和25μL辣根过氧化物酶(HRP)加到1.5mL离心管中，充分混匀；

2)将步骤(1)制备的混合物加到24孔细胞培养板中，每孔加100μL，于37℃，5％CO₂培养箱中放置4h；每孔加0.5mL培养基，放入培养箱中过夜；

3)将步骤(2)中细胞培养板的培养基吸除，每孔铺0.5mL Matrigel，以利于RPE细胞的生长，放入培养箱2h，待用；

4)吸除培养有RPE细胞培养板(以6孔细胞培养板计)中的培养基，每孔加1mL PBS，以除掉残留的培养基，吸除PBS后，每孔加0.5mL含量为0.25％的胰酶-EDTA，放入培养箱2-5min，待85-95％RPE细胞脱离板壁后，每孔加培养基1mL以终止胰酶-EDTA作用，吹打后转移至15mL离心管中；

5)常温，800-1500rpm离心3-5min，去除上清，加RPE细胞培养基悬浮细胞，并计数；将浓度为10⁵个/mL的RPE细胞接种到步骤(3)中铺有基质胶Matrigel的纳米纤维膜上，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2-3天RPE细胞换培养基；

6)待RPE细胞有80-90％铺满培养板底后，将细胞连同纳米纤维聚合物膜切下，用于临床细胞移植。

实施例2

1)分别将上述配制的200μL硫酸软骨素，25μL H₂O₂和25μL辣根过氧化物酶(HRP)加到1.5mL离心管中，充分混匀；

2)将步骤(1)制备的混合物加到24孔细胞培养板中，每孔加100μL，于37℃，5％CO₂培养箱中放置3h；每孔加1mL培养基，放入培养箱中过夜；

3)将步骤(2)中细胞培养板的培养基吸除，每孔铺1mL Matrigel，以利于RPE细胞的生长，放入培养箱3h，待用；

4)吸除培养有RPE细胞培养板(以6孔细胞培养板计)中的培养基，每孔加0.5mL PBS，以除掉残留的培养基，吸除PBS后，每孔加0.75mL含量为0.25％的胰酶-EDTA，放入培养箱2-5min，待85-95％RPE细胞脱离板壁后，每孔加培养基1.5mL以终止胰酶-EDTA作用，吹打后转移至15mL离心管中；

5)常温，800-1500rpm离心3-5min，去除上清，加RPE细胞培养基悬浮细胞，并计数；将浓度为10⁵个/mL的RPE细胞接种到步骤(3)中铺有基质胶Matrigel的纳米纤维膜上，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2-3天RPE细胞换培养基；

6)待RPE细胞长满后，将细胞连同纳米纤维聚合物膜切下，用于临床细胞移植。

实施例3

1)分别将上述配制的200μL硫酸软骨素，25μL H₂O₂和25μL辣根过氧化物酶(HRP)加到1.5mL离心管中，充分混匀；

2)将步骤(1)制备的混合物加到24孔细胞培养板中，每孔加100μL，于37℃，5％CO₂培养箱中放置5h；每孔加2mL培养基，放入培养箱中过夜；

3)将步骤(2)中细胞培养板的培养基吸除，每孔铺2mL Matrigel，以利于RPE细胞的生长，放入培养箱4h，待用；

4)吸除培养有RPE细胞培养板(以6孔细胞培养板计)中的培养基，每孔加2mL PBS，以除掉残留的培养基，吸除PBS后，每孔加1mL含量为0.25％的胰酶-EDTA，放入培养箱2-5min，待85-95％RPE细胞脱离板壁后，每孔加培养基2mL以终止胰酶-EDTA作用，吹打后转移至15mL离心管中；

5)常温，800-1500rpm离心3-5min，去除上清，加RPE细胞培养基悬浮细胞，并计数；将浓度为10⁵个/mL的RPE细胞接种到步骤(3)中铺有基质胶Matrigel的纳米纤维膜上，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2-3天RPE细胞换培养基；

6)待RPE细胞长满后，将细胞连同纳米纤维聚合物膜切下，用于临床细胞移植。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米纤维聚合物复合膜，其特征在于：其下层为水凝胶纳米纤维膜、中层为Matrigel基质胶层、上层为视网膜色素上皮细胞层。

2.根据权利要求1所述的纳米纤维聚合物复合膜，其特征在于：所述的视网膜色素上皮细胞层为单层；

或所述的水凝胶纳米纤维膜中由包含以下质量分数的组分制成：10-20％硫酸软骨素、0.05-0.1％H₂O₂和0.0003125-0.000625％辣根过氧化物酶和79.899375-89.9496875％的磷酸缓冲液。

3.一种上述权利要求1～2中任一所述的纳米纤维聚合物复合膜的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：

(1)称取硫酸软骨素、H₂O₂和辣根过氧化物酶并充分混匀；

(2)将步骤(1)制备的混合物加到细胞培养板中，放置于培养箱中，然后在细胞培养板的每孔加入0.5-2mL视网膜色素上皮细胞培养基覆盖该混合物，于培养箱中过夜，制得水凝胶纳米纤维膜；

(3)将步骤(2)中细胞培养板的培养基吸掉，每孔铺上0.5-2mL稀释的基质胶Matrigel，放入培养箱2-4h，待用；

(4)吸除培养有视网膜色素上皮细胞培养板中的培养基，每孔加0.5-2mL磷酸盐缓冲液，除掉残留的培养基，再在每孔加0.5-1mL质量分数0.25％的胰酶-EDTA，放入培养箱2-5min，待85-95％细胞脱离板壁后，每孔加1-2mL视网膜色素上皮细胞培养基，吹打后转移离心管中；

(5)离心，去除上清，加1-2mL视网膜色素上皮细胞培养基悬浮细胞，并计数；将浓度为10⁴～10⁶个/mL的视网膜色素上皮细胞接种到步骤(3)中制备好的纳米纤维膜上；放置于培养箱中培养，每2-3天换视网膜色素上皮细胞培养基；

(6)待细胞有80-90％铺满培养板底后，将细胞连同聚合物膜及Matrigel切下，用于临床细胞移植。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中硫酸软骨素、H₂O₂和辣根过氧化物酶溶解在磷酸缓冲液中，其质量分数分别为10-20％、0.05-0.1％和0.0003125-0.000625％。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的视网膜色素上皮细胞培养基，包含以下组分：

α修饰最小必需培养基        500mL，

N1补充物                    5mL，

谷氨酰胺-青霉素-链霉素      5mL，

非必需氨基酸                5mL，

牛磺酸                      125mg，

氢化可的松                  10g，

三碘甲状腺原氨酸            0.0065g，

热灭活胎牛血清              25～75mL。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)的培养时间为3-5h。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的培养箱的条件为37℃，5％CO₂。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中Matrigel以磷酸盐缓冲液稀释，两者的体积比为1∶10-1∶20。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(5)中离心的操作条件为常温，转速为800-1500rpm，离心时间为3-5min。

10.一种上述权利要求1-2中任一所述的纳米纤维聚合物复合膜用于视网膜色素上皮细胞移植材料的用途。