CN105311001B - 用于肝再生的负载vegf的水凝胶纤维膜及其制备方法 - Google Patents
用于肝再生的负载vegf的水凝胶纤维膜及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105311001B CN105311001B CN201510289106.2A CN201510289106A CN105311001B CN 105311001 B CN105311001 B CN 105311001B CN 201510289106 A CN201510289106 A CN 201510289106A CN 105311001 B CN105311001 B CN 105311001B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fibre film
- aquagel fibre
- supported
- preparation
- egf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜及其制备方法，属于医疗材料技术领域。本发明所述的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法，包括以下步骤：在水凝胶纤维膜上加入外源性VEGF 1000ng/张，进行冻干，在冻干的水凝胶纤维膜上涂上一层可降解的5‑12.5wt％的聚已内酯/聚乳甘酸，获得用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜。本发明所述的制备方法利用电场和单向机械拉伸促使纤维束内部分子链进行取向，使得纤维内部和表面有纳米取向特征，并且纤维的机械和生物性能优越。所应用的高分子水凝胶纤维材料已广泛用于临床，并有很好的安全使用纪录，因此有较好的临床转化前景。
Description
技术领域
本发明属于医疗材料技术领域，特别涉及一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜及其制备方法。
背景技术
肝切除后余肝再生不足是影响安全肝切除的重要因素，因此提高术后余肝再生能力是一个亟待解决的问题。生长因子具有促进余肝再生的作用，目前将外源性生长因子输送至肝脏的策略主要包括直接注射法、转染生长因子基因至作用细胞、高分子可降解微球包裹生长因子等。但是，(1)生长因子在体内半衰期非常短，大多在数秒至数分钟内失去活性，因此直接注射后生长因子会迅速失活；(2)采用转染方法具有转染效率低下和细胞毒性的缺点；(3)高分子可降解微球包裹生长因子在于生长因子容易失活，以及分子量大的生长因子在微球内不宜释放。
VEGF(vascular endothelial growth factor，血管内皮生长因子)和HGF(hepatocyte growth factor，肝细胞生长因子)已被证明可促进肝组织再生。近期研究证实VEGF在肝窦内皮细胞(SECs)的分裂、迁移过程中扮演着重要的角色。通过结合SECs上面VEGF受体(flt-1和KDR/flk-1)调控血管通透性。我们前期研究显示大鼠肝切除后前24小时内肝脏内源性VEGF表达显著降低，影响肝再生过程中早期SECs的增殖，表明VEGF在促进肝再生过程中起着重要作用。Assy等首次采用全身系统给予外源性VEGF促进大鼠30％肝切除后余肝再生。此后多个研究证实采用上述方法给予外源性VEGF可促血管再生进而促进肝再生。然而，采用静脉注射给药促进肝再生的效率低。由于肝脏血流丰富，以往采用局部给药方式所提供的促进肝再生的药物不易在肝脏停留，导致作用浓度不足而缺乏有效性。因而，解决有效控制肝脏局部释放生长因子这一问题将大大提高临床肝切除后再生的成功率，并扩大肝切除作为临床治疗手段的范围，以挽救更多肝癌患者。因此目前亟待找到一种新的将外源性生长因子输送至肝脏的策略方法。
发明内容
为克服上述现有生长因子给药技术效率低、靶向性差的缺点及不足，本发明的首要目的在于提供一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法。本发明结合电纺丝技术的优势和天然可降解生物材料的特点，设计了一种新型电拉伸水凝胶纤维的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜。将包裹生长因子的纤维膜贴附于术后肝脏创面并控释生长因子，具有高效促进余肝再生的性能。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法，包括以下步骤：
负载步骤：
所述的水凝胶纤维膜为海藻酸钙水凝胶纤维膜、纤维蛋白水凝胶纤维膜、明胶水凝胶纤维膜或透明质酸水凝胶纤维膜中的一种。
所述的海藻酸钙水凝胶纤维膜，可以通过下述制备方法获得：将1.5-3.0wt％藻酸盐和0.1-0.6wt％聚氧乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，使用20-100mMCaCl2稳定，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得海藻酸盐水凝胶纤维膜。
所述的纤维蛋白水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得：从含有0.67wt％纤维蛋白原，1.0wt％藻酸钠和0.1wt％聚氧化乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，用含有50mMCaCl2的5U/ml的凝血酶中交联20分钟，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得纤维蛋白水凝胶纤维膜。
所述的明胶水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得：通过3.2wt％的甲基丙烯酸酯胶，0.9wt％藻酸盐，0.1wt％聚氧化乙烯和0.4wt％紫外发光剂(Irgacure 2959)，于50mMCaCl2溶液交联20分钟，然后在365nm波长的紫外光下照射10分钟，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得明胶水凝胶纤维膜。
所述的透明质酸水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得：以1wt％硫醇化透明质酸，0.7wt％藻酸盐和0.2wt％聚氧化乙烯，在50mMCaCl2和1wt％聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)中交联进行制备，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得透明质酸水凝胶纤维膜。
上述水凝胶纤维膜冻干后，将合适浓度和体积的生长因子溶液加到冻干的水凝胶纤维膜，即每张膜规格为1cm×0.5cm，加入外源性VEGF 1000ng/张。待生长因子完全吸收后，再冻干即获得负载生长因子的水凝胶纤维膜。该水凝胶纤维膜还可加载其他生长因子包括HGF等，剂量范围为500-1000ng。每张膜的尺寸可以根据手术创面任意更改大小，通常为1cm×0.5cm-2cm×2cm，这些尺寸适用于大鼠动物实验。临床使用时可制备更大的尺寸。
为了调节生长因子释放速率，在冻干的水凝胶纤维膜上可以采取溶液喷涂或浸涂方法、涂上一层可降解的聚己内酯/聚乳甘酸涂层。溶液浓度可以使用5-12.5wt％。
本发明中的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法完全使用水溶剂，避免有机溶剂，因此可用此方法在水凝胶纤维中包裹生长因子，并最小程度影响其生物活性。
一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜由上述制备方法获得。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明结合电纺丝技术的优势和天然可降解生物材料的特点，设计了一种新型电拉伸水凝胶纤维的制备方法。所述的制备方法的重要特征就是利用电场和单向机械拉伸促使纤维束内部分子链进行取向，使得纤维内部和表面有纳米取向特征，并且纤维的机械和生物性能优越。目前已用这一方法制备出几种天然高分子水凝胶纤维，包括海藻酸、胶原蛋白、血纤蛋白、透明质酸及其混合纤维等。这些天然高分子原材料已广泛用于临床，并有很好的安全使用纪录，因此有较好的临床转化前景。
附图说明
图1为水凝胶纤维膜的制备及其特性；其中，a为电纺水凝胶纤维膜的示意图，b为海藻酸钙的水凝胶纤维；c为纤维蛋白的水凝胶纤维；d-f为水凝胶纤维表面纳米取向特征，d为海藻酸钙的水凝胶纤维表面纳米取向特征，e为纤维蛋白的水凝胶纤维表面纳米取向特征，f透明质酸的水凝胶纤维表面纳米取向特征；g为冻干纤维束外观；h为冻干纤维膜外观；I为水凝胶纤维制成管状结构的外观；j为单根纤维重叠后在偏光显微镜下现示完全消光，证实纤维内部高度取向。
图2为带聚己内酯(PCL)/聚乳甘酸(PLGA)涂层的水凝胶纤维膜对生长因子释放速率的影响结果图。
图3为干预组和对照组术后肝转氨酶变化趋势图；其中，a为ALT变化趋势图；b为AST变化趋势图。
图4干预组和对照组术后余肝内源性VEGF mRNA表达规律图。
图5干预组和对照组术后余肝内源性flt-1和KDR/flk-1mRNA表达规律图；其中，a为内源性flt-1表达规律图，b为KDR/flk-1mRNA表达规律图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.制备方法及原料：
海藻酸钙水凝胶纤维膜：将1.5-3.0wt％藻酸盐和0.1-0.6wt％聚氧乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，使用20-100mMCaCl2稳定，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、制备海藻酸盐水凝胶纤维膜；
纤维蛋白水凝胶纤维膜：从含有0.67wt％纤维蛋白原，1.0wt％藻酸钠和0.1wt％聚氧化乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，用含有50mMCaCl2的5U/ml的凝血酶中交联20分钟，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、制备纤维蛋白水凝胶纤维膜；
明胶水凝胶纤维膜：通过3.2wt％的甲基丙烯酸酯胶，0.9wt％藻酸盐，0.1wt％聚氧化乙烯和0.4wt％紫外发光剂(Irgacure 2959)，于50mMCaCl2溶液交联20分钟，然后在365nm波长的紫外光下照射10分钟，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、制备获得明胶水凝胶纤维膜。
透明质酸水凝胶纤维膜：以1wt％硫醇化透明质酸，0.7wt％藻酸盐和0.2wt％聚氧化乙烯，在50mMCaCl2和1wt％聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)中交联进行制备，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得透明质酸水凝胶纤维膜。
电纺水凝胶纤维膜的示意图如图1a所示。这一过程完全使用水溶剂，避免有机溶剂，因此可用此方法在水凝胶纤维中包裹生长因子，并最小程度影响其生物活性。
水凝剂纤维膜的制备及其特性如图1所示；其中，a为电纺水凝胶纤维膜的示意图，b为海藻酸钙的水凝胶纤维；c为纤维蛋白的水凝胶纤维；d-f为水凝胶纤维表面纳米取向特征，d为海藻酸钙的水凝胶纤维表面纳米取向特征，e为纤维蛋白的水凝胶纤维表面纳米取向特征，f透明质酸的水凝胶纤维表面纳米取向特征；g为冻干纤维束外观；h为冻干纤维膜外观；I为水凝胶纤维制成管状结构的外观；j为单根纤维重叠后在偏光显微镜下现示完全消光，证实纤维内部高度取向。
在水凝胶纤维成膜上加入外源性VEGF 1000ng/张，进行冻干，在冻干的水凝胶纤维膜上涂上一层可降解的5-12.5wt％的聚己内酯(PCL)/聚乳甘酸(PLGA)，获得用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜。
实验中运用这一方法制备了一系列具有不同释放速率的水凝胶纤维膜(如图2)。结果显示高浓度聚酯涂层减缓因子释放速率，但10％和12.5％PCL涂层给出同样的释放曲线。
对纤维的力学性能和降解性能进行调节，并选择优化条件以控制纤维直径和膜性能。(1)通过物理交联或特异性酶促反应交联来调节水凝胶纤维的强度。(2)通过肝素共纺丝方法将肝素包裹在纤维中，使用0.5％的肝素载入量可减慢生长因子释放、增加生长因子在膜中的稳定性，以及纤维膜的降解稳定性。
针对肝再生，着重测试纤维蛋白和海藻酸/纤维蛋白混合纤维膜，因为该纤维蛋白对于内皮细胞具有高度的粘附性能，对于肝组织有良好的粘附性能。在纤维蛋白中加入海藻酸钙可以提高物理交联度，可显著提高复合纤维膜的力学性能。
2.水凝胶纤维膜生物相容性的检测：
该纤维膜所使用的材料都已广泛应用于临床，且具有较好的组织及细胞相容性。胶原蛋白、纤维蛋白、海藻酸、聚酯等材料都有很好的止血效果。水凝胶纤维膜支持软组织干细胞(人脂肪组织衍生的干细胞和神经干细胞)、内皮细胞和心肌细胞的粘附和增生性能。更重要的是，内皮细胞和成血管前体细胞在纤维膜上可以良好生长。且到目前为止还未观察到任何不良反应，证实这种纤维膜具有促进组织再生的优良生物性能。
3.在体评估水凝胶纤维膜促进肝功能恢复的效应
实验采用大鼠70％肝切除模型在体评估水凝胶干预效应。肝功能检测提示水凝胶干预可将丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)峰值较对照组提前12个小时，提示可加速肝功能的恢复(图3)。
实验采用qRT-PCR技术检测术前及术后各时间点余肝内源性VEGF及其受体mRNA的表达量。术后前36小时干预组VEGF及其受体表达量较对照组显著升高(图4、5)，前期研究表明在该时间段高表达VEGF可促进肝细胞增殖。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
在水凝胶纤维膜上加入外源性VEGF 1000ng/张，每张膜为1cm×0.5cm规格，进行冻干，在冻干的水凝胶纤维膜上涂上一层可降解的5-12.5wt%的聚已内酯/聚乳甘酸，获得用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜；所述的水凝胶纤维膜为海藻酸钙水凝胶纤维膜、纤维蛋白水凝胶纤维膜、明胶水凝胶纤维膜或透明质酸水凝胶纤维膜中的一种。
2.根据权利要求1所述的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法，其特征在于：所述的海藻酸钙水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得：将1.5-3.0wt%藻酸盐和0.1-0.6wt%聚氧乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，使用20-100 mMCaCl2稳定，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得海藻酸钙水凝胶纤维膜。
3.根据权利要求1所述的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法，其特征在于：所述的纤维蛋白水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得：将含有0.67wt%纤维蛋白原，1.0wt%藻酸钠和0.1wt%聚氧化乙烯的水溶液装于注射器中，在3-5kV电压条件下，喷射入收集池中；在循环收集池中，用含有50 mMCaCl2的5U/ml的凝血酶交联20分钟，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得纤维蛋白水凝胶纤维膜。
4.根据权利要求1所述的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法，其特征在于：所述的明胶水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得：通过3.2wt%的甲基丙烯酸酯胶，0.9wt%藻酸盐，0.1wt%聚氧化乙烯和0.4wt%紫外发光剂，于50 mMCaCl2溶液交联20分钟，然后在365nm波长的紫外光下照射10分钟，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得明胶水凝胶纤维膜。
5.根据权利要求4所述的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法，其特征在于：所述的紫外发光剂为Irgacure 2959。
6.根据权利要求1所述的用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜的制备方法，其特征在于：所述的透明质酸水凝胶纤维膜，通过下述制备方法获得：以1wt%硫醇化透明质酸，0.7wt%藻酸盐和0.2wt%聚氧化乙烯，在50 mMCaCl2和1wt%聚乙二醇二丙烯酸酯中交联进行制备，通过调节电纺射流着陆的位置，在气-液交界面可形成一张连续的水凝胶层，然后将其收集、获得透明质酸水凝胶纤维膜。
7.一种用于肝再生的负载VEGF的水凝胶纤维膜由权利要求1～6任一项所述的制备方法获得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510289106.2A CN105311001B (zh) | 2015-06-01 | 2015-06-01 | 用于肝再生的负载vegf的水凝胶纤维膜及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510289106.2A CN105311001B (zh) | 2015-06-01 | 2015-06-01 | 用于肝再生的负载vegf的水凝胶纤维膜及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105311001A CN105311001A (zh) | 2016-02-10 |
| CN105311001B true CN105311001B (zh) | 2018-07-31 |
Family
ID=55239968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510289106.2A Active CN105311001B (zh) | 2015-06-01 | 2015-06-01 | 用于肝再生的负载vegf的水凝胶纤维膜及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105311001B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107794601B (zh) * | 2017-09-12 | 2020-01-21 | 浙江理工大学 | 用于制备高海藻含量纳米纤维的纺丝液及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103007355A (zh) * | 2011-09-20 | 2013-04-03 | 同济大学 | 一种水凝胶-纳米纤维膜及其制备方法和用途 |
-
2015
- 2015-06-01 CN CN201510289106.2A patent/CN105311001B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103007355A (zh) * | 2011-09-20 | 2013-04-03 | 同济大学 | 一种水凝胶-纳米纤维膜及其制备方法和用途 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| "Chitosan–hyaluronic acid hydrogel coated poly(caprolactone) multiscale bilayer scaffold for ligament regeneration";S. Deepthi et al.;《Chemical Engineering Journal》;20150115;第260卷;第478-485页 * |
| "Strengthening Alginate/Polyacrylamide Hydrogels Using Various Multivalent Cations";Can Hui Yang et al.;《ACS Applied Materials & Interfaces》;20131015;第5卷(第21期);第10418- 10422页 * |
| "Surface modification with fibrin/hyaluronic acid hydrogel on solid-free form-based scaffolds followed by BMP-2 loading to enhance bone regeneration";Sun-Woong Kang et al.;《Bone》;20110201;第48卷(第2期);第298-306页 * |
| "Talioring of Growth Factor Release from Electrospun Hydrogel Microfibers for Applications in Regenerative Medicine";Brook Jeang;《Johns Hopkins Sherida Libraries》;20150813 * |
| "电纺制备PLGA／可溶性蛋壳膜蛋白纤维膜及其性能研究";刘更等;《口腔医学》;20120228;第32卷(第2期);第69-72,114页 * |
| "血管内皮生长因子(VEGF)乳液法电纺纤维膜的体外研究";卢映蓉等;《现代生物医学进展》;20141031;第14卷(第28期);第5443-5445,5506页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105311001A (zh) | 2016-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fornasari et al. | Natural-based biomaterials for peripheral nerve injury repair | |
| Doblado et al. | Biomaterials for neural tissue engineering | |
| Liu et al. | Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery | |
| Sepantafar et al. | Stem cells and injectable hydrogels: synergistic therapeutics in myocardial repair | |
| JP4619789B2 (ja) | 皮膚およびその他の組織のためのシーラント | |
| De Ruiter et al. | Designing ideal conduits for peripheral nerve repair | |
| US6991652B2 (en) | Tissue engineering composite | |
| CN102488926B (zh) | 一种用于尿道重建的组织工程支架及其制备方法 | |
| CN106729980B (zh) | 一种用于外周神经修复的仿生神经移植物及其制备方法 | |
| JP2004508305A (ja) | 電気処理されたフィブリンをベースとするマトリックスおよび組織 | |
| CN102488929B (zh) | 一种含血管内皮生长因子的再生丝素蛋白组织工程支架及其制备方法 | |
| CN104231288B (zh) | 一种高强度胶原凝胶及其制备方法 | |
| Chandika et al. | Recent advances in biological macromolecule based tissue-engineered composite scaffolds for cardiac tissue regeneration applications | |
| Pal et al. | Therapeutic neovascularization promoted by injectable hydrogels | |
| CN105536055B (zh) | 一种形状记忆型高弹性活性纳米纤维支架及其应用 | |
| CN105169486B (zh) | 一种结合去细胞神经应用的神经修复材料 | |
| CN103736153A (zh) | 单层及双层聚己内酯基引导组织再生膜及其制备方法 | |
| Park et al. | 3D bioprinting of a trachea-mimetic cellular construct of a clinically relevant size | |
| CN103877617A (zh) | 可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶及其制备方法和使用方法 | |
| Yan et al. | Advances in the application of supramolecular hydrogels for stem cell delivery and cartilage tissue engineering | |
| Amiryaghoubi et al. | Hydrogel-based scaffolds for bone and cartilage tissue engineering and regeneration | |
| CN110721340A (zh) | 一种交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法和用途 | |
| CN115109367B (zh) | 一种可注射水凝胶及其制备方法与应用 | |
| CN104548196B (zh) | 一种基于乙烯基‑巯基交联的组织工程支架材料及其制备方法 | |
| CN103933619B (zh) | 神经修复材料及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |