CN110721340A - 一种交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法和用途 - Google Patents

一种交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于微流控的交联微球制备方法，包括以下步骤：利用推注泵装置推动预先制得的水相溶液和油相溶液的注射器，水油两相溶液在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴，在紫外固化灯下照射，制得PEGDA光交联微球；所述PEGDA光交联微球通入的氢氧化钠溶液中，制得PEGDA‑壳聚糖交联微球。所述交联微球直径范围为240～440μm，通过水相溶液和油相溶液的流速和流速比控制。该制备方法灵活，易操作。一种可注射型软骨细胞复合体的制备方法，包括以下步骤：A1，制备交联微球；A2，交联微球搭载软骨细胞。本发明将生物细胞搭载在具有双网络水凝胶体系的交联微球上，经过生物细胞的增殖、分化，制备成可注射型细胞复合体，是一种应用广泛的新型组织修复材料。

Description

一种交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法和 用途
技术领域
本发明涉及组织工程领域，特别是涉及一种交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法和用途。
背景技术
人体的关节软骨保证着关节的稳定性和人体的运动能力。创伤或关节炎等疾病破坏软骨的正常组织结构，造成面积大小不同的软骨缺损。关节表面覆盖的软骨作为保证运动灵活性和准确性的特殊组织，其自我修复能力差，一旦发生软骨的损伤和病变，病情会逐渐加重并直接造成关节疼痛和运动功能受限。各种创伤和病理因素导致的关节软骨损伤在骨科临床极其常见，由于关节软骨自我修复能力差，在缺乏适当保护的情况下可加速其退行性病变，最终导致严重的骨关节炎。所以，软骨损伤早期的修复是骨科医生面临的一项重大挑战。此外，随着病情加重，患者的身体负担和经济负担亦会随之增加。研发一种可在软骨损伤早期进行修复的材料尤为重要。
在运动医学领域中，骨与关节损伤的修复与治疗已成为临床医生面临的主要问题之一。传统手术治疗方法主要包括关节镜下冲洗、微骨折、自体软骨移植和自体软骨细胞移植。一方面，这些传统治疗方法所修复的组织往往不具有类天然软骨组织的生物学性能，一段时间内便会出现患部功能退化。另一方面，传统治疗方法只能在短期内满足治疗需要，不仅费用昂贵，而且会出现炎症和排斥反应等副作用，长期治疗效果仍备受争议。此外，传统的可降解吸收支架与体外培养的细胞共培养后，需要经过处理，使支架的形状大小和缺损部位一致，然后才能进行移植手术。这个过程中，既增加了修复支架受感染的风险，又增加了患者经历移植手术的二次创伤。因此，针对现有技术不足，本发明提供一种交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法以克服现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法和用途。该方法具有制备的交联微球直径范围精准可控，制备方法灵活、易操作的特点。该方法制备所得的PEGDA-壳聚糖交联微球具有双网络水凝胶体系，兼顾优异的力学性能和优异的生物相容性，是生物细胞粘附和增殖的理想载体。
为实现上述目的，本发明的第一个方面提供了一种基于微流控的交联微球的制备方法，步骤如下：
利用推注泵装置推动水相溶液和油相溶液的注射器，水油两相溶液在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴，在90～120W、350～400nm紫外固化灯下照射1～2min，制得PEGDA光交联微球；所述PEGDA光交联微球通入0.3～0.6 mol/L的氢氧化钠溶液中，进行壳聚糖的物理交联，制得具有双网络水凝胶体系的PEGDA-壳聚糖交联微球；
具体的，水相溶液是预先制备的，水相溶液的制备具体为：
在体积分数为1～2％的乙酸中加入壳聚糖固体，配制成壳聚糖溶液，再加入PEGDA，并以锡箔纸包裹容器避光；
继续加入光引发剂I2959，以500～800r/min的转速、均匀搅拌2～3h，制得水相溶液，装入注射器中避光备用；
在水相溶液中，壳聚糖的质量分数为1～2％，PEGDA的质量分数为5～10％，光引发剂I2959的质量分数为0.25～0.5％；
具体的，油相溶液是预先制备的，油相溶液的制备具体为：
在矿物油中加入span-80，配制成span-80溶液，制得油相溶液，装入注射器中备用；
在油相溶液中，span-80的质量分数为5～10％。
优选的，上述交联微球直径范围为240～440μm。
优选的，上述交联微球直径范围通过水相溶液和油相溶液的流速和流速比控制。
优选的，微流控芯片由玻璃片及通过玻璃片装配的油相毛细管、水相毛细管、油相针头、水相针头和硅胶软管构成；
油相针头与油相毛细管装配，水相针头与水相毛细管装配，油相毛细管的出口套有硅胶软管；
水相溶液通过水相针头进入水相毛细管，油相溶液通过油相针头进入油相毛细管；
水相毛细管为圆管，其内径为0.1mm、外径为0.3mm；油相毛细管为方管，其内径为0.3mm、外径为0.5mm。
优选的，上述油包水型乳液液滴在100W、365nm紫外固化灯下照射。
具体的，预先制得的水相溶液装入1mL注射器中避光备用；预先制得的油相溶液，装入20mL注射器中备用；上述推注泵装置设置有单推注泵或者双推注泵。
优选的，利用单推注泵推动所述1mL注射器和20mL注射器，水油两相溶液流速比恒定为1:18，水相溶液流速为3.15～10μL/min的情况下，在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴。
优选的，利用双推注泵推动所述1mL注射器和20mL注射器，水相溶液流速恒定为10μL/min，水油两相溶液流速比为1:6至1:18.4的情况下，在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴。
本发明利用微流控技术制备PEGDA光交联微球，并在PEGDA光交联微球的基础上，增加壳聚糖的物理交联，制得具有双网络水凝胶体系的PEGDA-壳聚糖交联微球，兼顾优异的力学性能和优异的生物相容性，是生物细胞粘附和增殖的理想载体。该制备方法制得的交联微球直径范围精准可控。该制备方法灵活，易操作，技术人员可以根据实际需要定制目标直径的交联微球。
本发明的第二个目的是提供一种可注射型软骨细胞复合体的制备方法，通过如下步骤进行：
A1，采用上述基于微流控的制备方法制备交联微球；
A2，交联微球搭载软骨细胞：
A21，将步骤A1所制备的交联微球清洗清毒后放入完全培养基浸泡3～4h 后，去除完全培养基，制得表面孵育过的洁净交联微球；
A22，将表面孵育过的洁净交联微球与软骨细胞以数量比1:50～1:200的比例混合，补充完全培养基，然后整体放入培养箱中培养2～3h，得到可注射型交联微球搭载软骨细胞复合体。
本发明的第三个目的是提供上述交联微球在制备可注射型软骨细胞复合体中的用途。
具体的，交联微球搭载的生物细胞还可以是骨细胞、肌腱细胞、角膜细胞、皮肤细胞、血管细胞或者气管细胞中的一种。
本发明的有益效果是：
(1)利用微流控技术制备PEGDA光交联微球，并在PEGDA光交联微球的基础上，增加壳聚糖的物理交联，制得具有双网络水凝胶体系的PEGDA-壳聚糖交联微球，兼顾优异的力学性能和优异的生物相容性，是生物细胞粘附和增殖的理想载体。该制备方法制得的交联微球直径范围精准可控。该制备方法灵活，易操作，技术人员可以根据实际需要定制目标直径的交联微球。
(2)本发明通过将生物细胞搭载在具有双网络水凝胶体系的交联微球上，经过生物细胞的增殖、分化，制备成可注射型细胞复合体，用作组织修复的材料。将该可注射型细胞复合体注射到组织缺损部位，可修复、维持或改善损伤组织的生物功能。该可注射型细胞复合体具有修复效率高、长期稳定性强、规格精准可控的多种优势，是理想的组织修复材料。
附图说明
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1是交联微球及其可注射型软骨细胞复合体的制备方法工艺流程图；
图2是实施例2中含有FITC荧光素的交联微球(直径为240μm)的荧光显微镜照片；
图3是实施例2中含有FITC荧光素的交联微球的扫描电镜照片(a为放大 1000倍照片，b为放大50倍照片)；
图4是实施例4和实施例7中水相和油相溶液在不同流速和流速比控制下制得的交联微球的扫描电镜照片(a-直径为440μm；b-直径为120μm；c-直径为370μm；d-直径为195μm)；
图5是实施例3中直径为240μm的交联微球搭载软骨细胞共同培养1天后进行活/死染色的共聚焦激光扫描显微镜照片；
图6是实施例3中直径为440μm的交联微球搭载软骨细胞共同培养1天后进行活/死染色的共聚焦激光扫描显微镜照片。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1。
一种基于微流控的交联微球制备方法，步骤如下：
利用推注泵装置推动水相溶液和油相溶液的注射器，水油两相溶液在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴，在90～120W、350～400nm紫外固化灯下照射1～2min，制得PEGDA光交联微球；所述PEGDA光交联微球通入0.3～0.6 mol/L的氢氧化钠溶液中，进行壳聚糖的物理交联，制得具有双网络水凝胶体系的PEGDA-壳聚糖交联微球。
需要说明的是，PEGDA(聚乙二醇二丙烯酸酯)具有低粘度、低皮肤刺激性、附着力佳和水溶性等特点，其制成的水凝胶是一种理想的生物组织支架材料。壳聚糖是天然的碱性多糖，学名为聚-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。壳聚糖无毒且具备生物相容性、生物可降解性、黏膜粘附性等优良性能，是一种优良的生物组织工程材料。由于壳聚糖分子中含有大量氨基，所以壳聚糖可以电解质的形式均匀分布在酸性水溶液中。将壳聚糖溶解于1-2％(v/v)乙酸中，目的是使其能够均匀分布于PEGDA水凝胶网络中。通过氢氧化钠溶液中和后， PEGDA水凝胶网络上的(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖铵盐重新获得质子，形成(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，壳聚糖单体进一步发生物理交联，在 PEGDA水凝胶网络上交联出壳聚糖水凝胶网络。
该水相溶液是预先制备的，水相溶液的制备具体为：
在体积分数为1～2％的乙酸中加入壳聚糖固体，配制成壳聚糖溶液，再加入PEGDA，并以锡箔纸包裹容器避光；
继续加入光引发剂I2959，以500～800r/min的转速、均匀搅拌2～3h，制得水相溶液，装入注射器中避光备用；
该水相溶液中，壳聚糖的质量分数为1～2％，PEGDA的质量分数为5～10％，光引发剂I2959的质量分数为0.25～0.5％；
该油相溶液是预先制备的，油相溶液的制备具体为：
在矿物油中加入span-80，配制成span-80溶液，制得油相溶液，装入注射器中备用；
该油相溶液中，span-80的质量分数为5～10％。
该交联微球直径范围为240～440μm。
该交联微球直径范围通过水相溶液和油相溶液的流速和流速比控制。
该微流控芯片由玻璃片及通过玻璃片装配的油相毛细管、水相毛细管、油相针头、水相针头和硅胶软管构成；
油相针头与油相毛细管装配，水相针头与水相毛细管装配，油相毛细管的出口套有硅胶软管；
水相溶液通过水相针头进入水相毛细管，油相溶液通过油相针头进入油相毛细管；
水相毛细管为圆管，其内径为0.1mm、外径为0.3mm；油相毛细管为方管，其内径为0.3mm、外径为0.5mm。
该油包水型乳液液滴在100W、365nm紫外固化灯下照射。
该预先制得的水相溶液装入1mL注射器中避光备用；该预先制得的油相溶液，装入20mL注射器中备用；该推注泵装置设置有单推注泵或者双推注泵。
利用单推注泵推动所述1mL注射器和20mL注射器，水油两相溶液流速比恒定为1:18，水相溶液流速为3.15～10μL/min的情况下，在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴。
利用双推注泵推动所述1mL注射器和20mL注射器，水相溶液流速恒定为 10μL/min，水油两相溶液流速比为1:6至1:18.4的情况下，在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴。
本实施例利用微流控技术制备PEGDA光交联微球，并在PEGDA光交联微球的基础上，增加壳聚糖的物理交联，制得具有双网络水凝胶体系的PEGDA- 壳聚糖交联微球，兼顾优异的力学性能和优异的生物相容性，是生物细胞粘附和增殖的理想载体。该制备方法制得的交联微球直径范围精准可控。该制备方法灵活，易操作，技术人员可以根据实际需要定制目标直径的交联微球。
实施例2。
一种基于微流控的交联微球制备方法，其操作步骤与实施例1相同，不同之处在于：该预先制备的水相溶液中添加有FITC荧光素，其在水相溶液中的质量分数为0.015～0.030％。
按本实施例制得的含有FITC荧光素的交联微球，用去离子水以800～1000 r/min的转速，离心3～5min后，去除上清液，所得交联微球可直接在荧光显微镜下观察表征，如图2所示。
将上述离心清洗后的交联微球用30％，50％，70％，90％的乙醇梯度脱水，用乙酸异戊酯浸泡，进行超临界CO2流体萃取冻干处理，该干燥的交联微球可在扫描电子显微镜下观察表征，如图3所示。
本实施例制备的交联微球，添加有FITC荧光素，有利于在荧光显微镜观察交联微球的直径范围，进一步指导技术人员获得制备交联微球的目标工作参数。
实施例3。
一种可注射型软骨细胞复合体的制备方法，通过如下步骤进行：
A1，采用实施例1的方法制备交联微球；
A2，交联微球搭载软骨细胞：
A21，将步骤A1所制备的交联微球清洗清毒后放入完全培养基浸泡3～4h 后，去除完全培养基，制得表面孵育过的洁净交联微球；
A22，将表面孵育过的洁净交联微球与软骨细胞以数量比1:50～1:200的比例混合，补充完全培养基，然后整体放入培养箱中培养2～3h，得到可注射型交联微球搭载软骨细胞复合体。
如图5所示，直径为240μm的交联微球搭载软骨细胞共同培养1天后进行活/死染色，其共聚焦激光扫描显微镜照片显示细胞的生长状况良好。
如图6所示，直径为440μm的交联微球搭载软骨细胞共同培养1天后进行活/死染色，其共聚焦激光扫描显微镜照片显示细胞的生长状况良好。
本实施例通过将生物细胞搭载在具有双网络水凝胶体系的交联微球上，经过生物细胞的增殖、分化，制备成可注射型细胞复合体，用作组织修复的材料。将该可注射型细胞复合体注射到组织缺损部位，可修复、维持或改善损伤组织的生物功能。该可注射型细胞复合体具有修复效率高、长期稳定性强、规格精准可控的多种优势，是理想的组织修复材料。
实施例4。
一种基于微流控的交联微球制备方法，其操作步骤与实施例2相同，不同之处在于：利用单推注泵推动所述1mL注射器和20mL注射器，1mL注射器内径为4.69mm，20mL注射器内径为20.05mm，根据公式：
Figure BDA0002293987990000081
可得，水油两相溶液流速比ν水相：ν油相恒定为1:18。
当水相溶液流速为5μL/min的情况下，可制得直径为370μm的交联微球，其荧光显微镜照片如附图4(c)所示。
本实施例制备的交联微球，规格适中，在其上搭载软骨细胞，细胞的粘附和增殖情况良好。最终制得的可注射型软骨细胞复合体，适合修复面积不大的损伤部位。
实施例5。
一种基于微流控的交联微球制备方法，其操作步骤与实施例4相同，不同之处在于：当水相溶液流速为3.15μL/min的情况下，可制得直径为440μm的交联微球。
本实施例制备的交联微球，直径较大，在其上搭载软骨细胞，搭载初期可以粘附更多的细胞，有利于细胞的增殖和分化。最终制得较大规格的可注射型软骨细胞复合体，适合修复面积较大的损伤部位。
实施例6。
一种基于微流控的交联微球制备方法，其操作步骤与实施例4相同，不同之处在于：当水相溶液流速为10μL/min的情况下，可制得直径为240μm的交联微球，其荧光显微镜照片如附图3所示。
本实施例制备的交联微球规格是细胞粘附和增殖所需要的最小表面积，在其上搭载软骨细胞，搭载初期粘附的细胞相对较少，但细胞仍然能够正常增殖和分化。最终制得较小规格的可注射型软骨细胞复合体，适合修复面积较小的微小损伤。
实施例7。
一种基于微流控的交联微球制备方法，其操作步骤与实施例2相同，不同之处在于：利用双推注泵推动所述1mL注射器和20mL注射器，水相溶液流速恒定为10μL/min，当水油两相溶液流速比ν水相：ν油相为1:6时，即油相溶液流速为60μL/min，可制得直径为440μm的交联微球，其荧光显微镜照片如附图4 (a)所示。
本实施例制备的交联微球，直径较大，在其上搭载软骨细胞，搭载初期可以粘附更多的细胞，有利于细胞的增殖和分化。最终制得较大规格的可注射型软骨细胞复合体，适合修复面积较大的损伤部位。
实施例8。
一种基于微流控的交联微球制备方法，其操作步骤与实施例7相同，不同之处在于：当水油两相溶液流速比ν水相：ν油相为1:18.4时，即油相溶液流速为184 μL/min，可制得直径为240μm的交联微球。
本实施例制备的交联微球规格是细胞粘附和增殖所需要的最小表面积，在其上搭载软骨细胞，搭载初期粘附的细胞相对较少，但细胞仍然能够正常增殖和分化。最终制得较小规格的可注射型软骨细胞复合体，适合修复面积较小的微小损伤。
实施例9。
一种交联微球在制备可注射型软骨细胞复合体中的用途。该交联微球搭载的生物细胞还可以是骨细胞、肌腱细胞、角膜细胞、皮肤细胞、血管细胞或者气管细胞等。该可注射型细胞复合体可修复骨组织、肌肉组织、角膜组织、皮肤组织、血管壁和支气管壁等，应用广泛，为组织工程的临床应用和研究提供了一种新型的修复材料。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种基于微流控的交联微球的制备方法，其特征在于，
利用推注泵装置推动水相溶液和油相溶液的注射器，水油两相溶液在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴，在90～120W、350～400nm紫外固化灯下照射1～2min，制得PEGDA光交联微球；所述PEGDA光交联微球通入0.3～0.6mol/L的氢氧化钠溶液中，进行壳聚糖的物理交联，制得具有双网络水凝胶体系的PEGDA-壳聚糖交联微球；
所述水相溶液是预先制备的，水相溶液的制备具体为：
在体积分数为1～2％的乙酸中加入壳聚糖固体，配制成壳聚糖溶液，再加入PEGDA，并以锡箔纸包裹容器避光；
继续加入光引发剂I2959，以500～800r/min的转速、均匀搅拌2～3h，制得水相溶液，装入注射器中避光备用；
在水相溶液中，壳聚糖的质量分数为1～2％，PEGDA的质量分数为5～10％，光引发剂I2959的质量分数为0.25～0.5％；
所述油相溶液是预先制备的，油相溶液的制备具体为：
在矿物油中加入span-80，配制成span-80溶液，制得油相溶液，装入注射器中备用；
在油相溶液中，span-80的质量分数为5～10％。
2.根据权利要求1所述的基于微流控的交联微球的制备方法，其特征在于，所述交联微球直径范围为240～440μm。
3.根据权利要求2所述的基于微流控的交联微球的制备方法，其特征在于，所述交联微球直径范围通过水相溶液和油相溶液的流速和流速比控制。
4.根据权利要求3所述的基于微流控的交联微球的制备方法，其特征在于，微流控芯片由玻璃片及通过玻璃片装配的油相毛细管、水相毛细管、油相针头、水相针头和硅胶软管构成；
油相针头与油相毛细管装配，水相针头与水相毛细管装配，油相毛细管的出口套有硅胶软管；
水相溶液通过水相针头进入水相毛细管，油相溶液通过油相针头进入油相毛细管；
水相毛细管为圆管，其内径为0.1mm、外径为0.3mm；油相毛细管为方管，其内径为0.3mm、外径为0.5mm。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的基于微流控的交联微球的制备方法，其特征在于，所述油包水型乳液液滴在100W、365nm紫外固化灯下照射。
6.根据权利要求5所述的基于微流控的交联微球的制备方法，其特征在于，预先制得的水相溶液装入1mL注射器中避光备用；预先制得的油相溶液，装入20mL注射器中备用；所述推注泵装置设置有单推注泵或者双推注泵。
7.根据权利要求5所述的基于微流控的交联微球的制备方法，其特征在于，利用单推注泵推动所述1mL注射器和20mL注射器，水油两相溶液流速比恒定为1:18，水相溶液流速为3.15～10μL/min的情况下，在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴。
8.根据权利要求5所述的基于微流控的交联微球的制备方法，其特征在于，利用双推注泵推动所述1mL注射器和20mL注射器，水相溶液流速恒定为10μL/min，水油两相溶液流速比为1:6至1:18.4的情况下，在微流控芯片出口通道形成油包水型乳液液滴。
9.一种可注射型软骨细胞复合体的制备方法，其特征在于，通过如下步骤进行：
A1，采用如权利要求1至8任意一项所述的方法制备交联微球；
A2，交联微球搭载软骨细胞：
A21，将步骤A1所制备的交联微球清洗清毒后放入完全培养基浸泡3～4h后，去除完全培养基，制得表面孵育过的洁净交联微球；
A22，将表面孵育过的洁净交联微球与软骨细胞以数量比1:50～1:200的比例混合，补充完全培养基，然后整体放入培养箱中培养2～3h，得到可注射型软骨细胞复合体。
10.如权利要求1-8任意一项所述的交联微球在制备可注射型软骨细胞复合体中的用途。
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