JP2010172247A - 積層型高密度培養人工組織の製造方法及び積層型高密度培養人工組織 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】1種類または複数の動物細胞、コラーゲン結合型細胞成長因子及び細胞外マトリックス成分を含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を形成する工程を含む人工組織の製造方法、及びその方法により得られる人工組織。
【選択図】なし。
Description
同じ結合組織でも、外側のそれと内側のそれとでは、
(1)細胞外マトリックスの構成成分が異なっており、
(2)同じ線維芽細胞であっても、存在する場所によって分泌する細胞成長因子や細胞外マトリックスの組成が異なっている。
これらの違いは、細胞外マトリックスの分子種やその量、あるいは細胞成長因子の種類と量が異なることによって引き起こされている。
本発明者らは、これらの違いを有する組織を人工的に再構築するには、
(1)埋め込む細胞を変えること、
(2)細胞外マトリックスの組成を変えること、
(3)細胞成長因子が拡散して均一化してしまわないようにするためには、細胞成長因子をコラーゲン結合型(CBD結合型)にすることが必要であることを確認して本発明を完成するに至った。
1.1種類または複数の動物細胞をコラーゲン結合型細胞成長因子及び細胞外マトリックス成分を含む細胞培養液中で培養することを特徴とする人工組織の製造方法。
2.前記1種類または複数の動物細胞を埋め込んだ細胞外マトリックスを積層させるに当たり、1種類または複数の動物細胞と細胞外マトリックス成分とを含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材(ポリ乳酸シートなど)とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を製造する工程の後、引き続いて、細胞外マトリックス成分と1種類または複数の動物細胞を含む異なる細胞培養液を用いて前記組織上に異なる高密度培養組織を形成する操作を少なくとも1回行う工程を実施して積層型高密度培養組織を形成する積層型高密度培養人工組織の製造方法において、初回及びその後の高密度培養組織製造工程のうち少なくとも1回の高密度培養組織製造工程における循環培養液中にコラーゲン結合型細胞成長因子を含有させる前記1記載の人工組織の製造方法。
3.コラーゲン結合型細胞成長因子の細胞成長因子が、上皮成長因子(EGF)、線繊芽細胞成長因子(FGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、肝細胞成長因子(HGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、神経栄養因子(NGF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)及びインシュリン様成長因子(IGF)からなる群から選ばれる1または2以上である前記1または2に記載の人工組織の製造方法。
4.コラーゲン結合型細胞成長因子としてコラーゲン結合型上皮成長因子(EGF−CBD)を表皮細胞と共に用いて人工皮膚を再構築する前記1〜3のいずれかに記載の人工組織の製造方法。
5.1種類または複数の動物細胞と細胞外マトリックス成分を含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を製造する閉鎖循環式高密度組織培養工程によって高密度真皮様組織を作成し、次いでコラーゲン結合型上皮成長因子(EGF−CBD)を表皮細胞と共に用いて人工皮膚を再構築する前記4に記載の人工組織の製造方法。
6.人工血管を再構築する前記1〜3のいずれかに記載の人工組織の製造方法。
7.細胞外マトリックス成分と1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を製造する工程の後、引き続いて、細胞外マトリックス成分と1種類または複数の動物細胞を含む異なる細胞培養液を用いて前記組織上に異なる高密度培養組織を形成する操作を少なくとも1回行う工程を実施して積層型高密度培養人工組織を形成する方法であって、順に
(1)肝臓の被膜に相当する結合組織を作成し、これに
(2)肝細胞に見立てた腫瘍性肝細胞層を重ね、次いで
(3)肝臓内にある結合組織に見立てた層を作成し人工肝臓を再構築することを特徴とする人工組織の製造方法。
8.液流制御部材が生分解性シートである前記2、5または7記載の人工組織の製造方法。
9.前記1〜8のいずれかに記載の方法により製造される人工組織。
本発明で得られる人工組織は、移植医療や新薬開発、薬効判定試験、感染実験などの分野で有用である。
新薬開発や感染実験は、プラスチック製培養皿上に播種した細胞を用いて行われているが、培養細胞と生体内における細胞では、同じ細胞種であっても機能発現が異なっている。本発明により簡便にかつ短時間で三次元培養組織を供給できるので新薬開発や感染実験への利用が期待できる。
先の出願(特許文献7:WO2006/088029号公報)により、細胞を分子状コラーゲン溶液に分散して還流し、コラーゲンの重合を制御しつつ積層することにより皮膚真皮または肝臓被膜に相当する均一な人工組織を得ることができる。本発明は、その人工組織の内、特定の層(例、上層、中層、下層)に細胞成長因子を固相化して固有の機能を持たせ、前記層のコラーゲンと密に接触する細胞の分化・増殖を特定の方向に誘導したものである。また特定の層に、例えば炎症抑制などの特定の機能を付与することを可能とするものである。これは細胞成長因子と不溶性コラーゲンへの結合性を示すタンパク質またはその一部であるコラーゲン結合ドメインとが融合したタンパク質を用いることによって、細胞成長因子を重合した不溶性コラーゲンへ固相化することにより実現される。すなわち、細胞成長因子をコラーゲンないしコラーゲン細線維に特異的に接着するタンパクの一部、すなわち、コラーゲン・バインディング・ドメイン(CBD)と融合することによって、組織の機能が再現できるようになった。
以下に、このような目的で使用可能なコラーゲン結合型細胞成長因子の一例であるコラーゲン結合型上皮成長因子(EGF−CBD)の調製法について説明する。
本融合タンパクの調製は次の3つの工程より行われる。
(1)細菌性コラゲナーゼのコラーゲン結合ドメイン(CBD)をコードする遺伝子断片を挿入した発現ベクターの構築工程、
(2)上皮成長因子(EGF)をコードする遺伝子断片の(1)の発現ベクターへの挿入によるEGF−CBDをコードする発現プラスミドの構築工程、
(3)(2)の発現プラスミドの宿主細胞への形質転換、融合タンパク質の生産と精製工程。
(1)細菌性コラゲナーゼのコラーゲン結合ドメイン(CBD)をコードする遺伝子断片を挿入した発現ベクターの構築工程
公知の細菌性コラゲナーゼの構造遺伝子を鋳型とし、PCR法などによってコラーゲン結合ドメインをコードするDNA断片を得た後、常法に従って任意の発現ベクター(例えば、グルタチオンS転移酵素(GST)との融合タンパク質として目的のタンパク質を生産するpGEX−4Tベクター)に挿入する方法によって得ることができる。
EGFを発現している細胞から常法に従って得られる全RNAから調製したcDNAライブラリーを鋳型とし、PCR法などによって上皮成長因子をコードするDNA断片を得た後、常法に従って(1)の発現ベクターへ挿入する方法によって得ることができる。この細胞は、ほ乳類由来の細胞であることが好ましく、特にヒト由来であることが最も好ましい。
使用した発現ベクターに対応する宿主細胞であれば、何れの宿主細胞であっても使用可能である。例えば、原核細胞用ベクターであれば原核細胞、昆虫用ベクターであれば昆虫細胞が挙げられる。また導入は常法にしたがって行うことができ、例えば、エレクトロポレーション法やカルシウム法が挙げられる。
本発明では、1種類または複数の動物細胞を埋め込んだ細胞外マトリックスを積層させるに当たり、1種類または複数の動物細胞と細胞外マトリックス成分とを含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を製造する工程の後、引き続いて、細胞外マトリックス成分と1種類または複数の動物細胞を含む異なる細胞培養液を用いて前記組織上に異なる高密度培養組織を形成する操作を少なくとも1回行う工程を実施して積層型高密度培養組織を形成する積層型高密度培養人工組織の製造方法において、初回及びその後の高密度培養組織製造工程のうち少なくとも1回の高密度培養組織製造工程における循環培養液中に、コラーゲン結合型細胞成長因子を含有させることにより人工組織を製造することができる。
組織は、一般的に
(1)異なった機能を持った組織が層状に配列し、
(2)各組織はコラーゲン細線維をはじめとする高密度の細胞外物質(細胞外マトリックス)中に複数の細胞が配置している。
この基本構造は、様々な細胞を埋め込んだ密度の高い細胞外物質を重ね合わせることにより再現できる。これを可能にする技術が「閉鎖循環式高密度組織培養装置」(リアクター)を用いる本発明の方法である。再構築する組織が目的とする特異的機能を示すためには、機能を持った細胞とその機能発現を促す細胞成長因子が必要である。多くの細胞成長因子は組織内で産生され機能を発現している。そのため特定の機能タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子工学的な手法によって細胞に組み込む方法などが試みられてきた。しかしながら導入された遺伝子から産生されるたんぱく量の制御が困難で、腫瘍化する可能性などからその適応は限られている。
人工組織の作成方法を、消化管や血管をモデルに図2を参照しつつ説明する。
(1)コラーゲン、1種類または複数の動物細胞およびコラーゲン結合型細胞成長因子を含む培養液を循環培養して第1の組織(結合組織)を再構成する。
すなわち、適当な濃度の各型コラーゲン、ヒト線維芽細胞あるいは多能性幹細胞および適当な濃度の線維芽細胞成長因子(FGF)とコラーゲン結合ドメイン(CBD)を組み合わせた融合たんぱく質を含むDMEM(培養液)適量を閉鎖循環式高密度組織作成装置にて4〜6時間還流する。これにより血管や神経の通路ともなるため血管内皮細胞成長因子(VEGF)や神経成長因子(NGF)をCBDと結合したたんぱく質が組み込まれ、例えば消化管では外膜などの結合組織が形成される。
すなわち、適量のDMEMを1時間程度還流した後、平滑筋細胞あるいは多能性幹細胞と適当な濃度に調整した基底膜成分を含むDMEMを還流液中に必要量追加し、2時間程度還流する。この操作により消化管や血管では中膜と呼ばれる組織が形成される。
すなわち、適当な濃度のIII 型、V型コラーゲン、ヒト線維芽細胞あるいは多能性幹細胞および適当な濃度のFGF−CBDを含むDMEM(培養液)適量を閉鎖循環式高密度組織作成装置にて2時間程度還流する。この操作により消化管や血管では内膜と呼ばれる組織が形成される。
すなわち、血管であれば内皮細胞を、消化管であれば上皮細胞を単独であるいは多能性幹細胞とともに懸濁した培養液に交換して2時間程度還流する。また、軟骨などの比較的均一な組織では、適当な濃度のII型コラーゲンとヒト軟骨細胞あるいは多能性幹細胞を含むDMEM(培養液)適量を閉鎖循環式高密度組織培養装置にて4〜6時間還流することにより軟骨組織が形成される。
これまで、人工皮膚を作成するには、まず線維芽細胞とコラーゲンの混合液を中性pH、37℃に保つことによって低密度真皮様組織を作成する。この低密度コラーゲンゲルに表皮細胞を播種すると細胞はゲル内に沈み込んでしまうため、ゲルを培養液中で3〜7日間培養することにより封じ込んだ線維芽細胞の作用よってゲルが元の1/10のサイズになるまで収縮し高密度真皮様組織(以下、収縮ゲルという。)を作成する必要がある。しかし、本発明では、リアクターによって約6時間で高密度真皮様組織を得ることができ、ただちに表皮細胞を播種することができる。収縮ゲルでは3〜7日間の培養中に線維芽細胞から基底膜成分の一部や細胞成長因子が分泌され、表皮細胞の増殖に適した環境が整えられている。しかしながら収縮ゲル内の線維芽細胞は同時にコラーゲン細線維を分解するマトリックス・メタロプロテアーゼも分泌するため、出来上がった人工皮膚の自己融解も早い。そのため人工皮膚として利用できる期間が短いという欠点がある。
(1)リアクターを用いて短時間で高密度真皮様組織を作成し、次いで
(2)細胞成長因子とコラーゲン結合ドメイン(CBD)を組み合わせた融合タンパク質を表皮細胞と共に用いることにより表皮層を再構成する方法を提供したものである。
すなわち、本発明では、
(1)1種類または複数の動物細胞と細胞外マトリックス成分を含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を製造する閉鎖循環式高密度組織培養工程によって高密度真皮様組織を作成し、次いで、
(2)コラーゲン結合型細胞成長因子を表皮細胞と共に用いて人工皮膚を再構築する。
人工皮膚は、例えば以下の(1)〜(4)に従って作成することができる。
(1)0.5mg/mLアテロコラーゲン(I−AC高研Co.Ltd.)、ヒト線維芽細胞(HFO;2×107個)を含むDMEM(培養液)200mLを閉鎖循環式高密度組織作成装置にて6時間還流する。
(2)装置より人工真皮組織を取り出し、アスコルビン酸2グルコピラノース(AA2G:84.3mg/mL)を添加した2mLのDMEMで1週間培養し、次いで同濃度のアスコルビン酸2グルコピラノースと合成マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤(CGS10mM)を添加したDMEMでさらに1週間培養した。
(3)内径10.5mm高さ5mmのガラス製円筒を人工真皮組織上に置き、EGF−CBD(0.95μg/mL)と培養表皮細胞(4×105個)を懸濁したDMEMとヒト型表皮成長因子(hEGF)無添加 Epi-life(1:1)の混合培養液(0.4mL)を同円筒内に注ぐ。円筒からの漏れがないことを確認し、一晩培養する。
(4)円筒をはずして人工皮膚全体を持ち上げ、その上部を空気に曝しながら(2)で用いた培養液を2日毎に交換して培養する(図3)。
肝臓は被膜と呼ばれる結合組織に覆われている(図7の光学顕微鏡像参照)。そこでまず被膜に相当する結合組織をリアクター内に作成し、次いで肝細胞に見立てた腫瘍性肝細胞(HepG2)層を重ね、最後に肝臓内にある結合組織に見立てた層を作成する(図8)。
すなわち、本発明では、細胞外マトリックス成分と1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を製造する工程の後、引き続いて、細胞外マトリックス成分と1種類または複数の動物細胞を含む異なる細胞培養液を用いて前記組織上に異なる高密度培養組織を形成する操作を少なくとも1回行う工程を実施して積層型高密度培養人工組織を形成する方法であって、順に、(1)肝臓の被膜に相当する結合組織を作成し、これに(2)肝細胞に見立てた腫瘍性肝細胞層を重ね、次いで(3)肝臓内にある結合組織に見立てた層を作成することにより人工肝臓を製造することができる。
人工肝臓は、例えば、下記の(1)〜(5)に従って作成することができる。
(1)0.5mg/mL I型アテロコラーゲン(I−AC高研Co.Ltd.)、ヒト線維芽細胞(HFO;1〜2 × 107個)を含むDMEM(培養液)100mLを閉鎖循環式高密度組織作成装置にて6時間還流する。
(2)50mL DMEMに付け替え、還流開始直後にHepG2細胞(2〜4 × 107個)懸濁液2mLをリアクターの上流より5〜10分間の間に全量を投入する。
(3)DMEM(50mL)を2時間還流する。
(4)0.5mg/mLアテロコラーゲン(I−AC高研Co.Ltd.)を含むDMEM(培養液)50mLにて3時間還流する。
(5)完成した積層型人工肝組織を循環培養装置に移し、10%牛胎児血清を含むDMEM中にて3日間循環培養する。
本例では、ステンレス製円筒(16)内にPLAシート(13)、その下側にステンレスメッシュ(14)を配設する。好ましくは、ステンレス製円筒(16)は、その内周にツバ(18)を備えており、必要に応じて漏出防止用部材(例えば、シリコンゴムリング)を1つはPLAシート(13)の上に重ね(12)、もう1つはステンレスメッシュ(14)の下に重ねる(15)。さらに、液の漏出防止用部材として例えばスペーサー(11)を重ねる。図1ではこれらの部材を取り出して示してあるが、使用時にはこれらの部材を、ステンレス製円筒(16)内のツバ(18)で固定されるように装着し、流路内に設置する。
こうしたコラーゲンは、得ようとするコラーゲンを含む生体組織を原料として、酸、酵素、アルカリ等により可溶化して用いることができる。また、アレルギー反応や拒否反応を解消ないし抑制するため、酵素処理によって分子末端のテロペプチドを全部または一部を除去することが好ましい。このようなコラーゲン材料としては、例えば、豚皮由来I型コラーゲン、豚腱由来I型コラーゲン、牛鼻軟骨由来II型コラーゲン、魚から抽出したI型コラーゲン、遺伝子組換え型のコラーゲンあるいはこれらの混合物等が挙げられる。但し、これらは例示であり、目的に応じ他の種類も利用可能である。例えば、基底膜に相当する組織を形成する場合にはIV型を用いる。
(1)Clostridium histolyticum colH (GenBankアクセス番号D29981)のDNA配列番号1中塩基番号2719〜3391の領域をpGEX−4T−2プラスミドのSmaI部位に常法に従って挿入した。
牛皮より抽出したI型アテロコラーゲン(I−AC高研Co.Ltd.)とヒト線維芽細胞(HFO;2×107個)をリアクターにて6時間還流したところ、湿重量約1gの人工結合組織を得ることができた。リアクターの閉鎖循環回路内の還流培養液中に含まれるI型コラーゲン濃度を経時的に測定したところ、培養液中のI型アテロコラーゲン濃度は、還流開始50分には、約1/10まで、急速に減少したことから(図9)、培養液中の溶存I型コラーゲンは、重合してコラーゲン細線維を形成して、リアクター内に蓄積したと考えられる。
なお、本実施例において、リアクターは以下のものを使用した。
リアクターは直径22mm高さ17mmの円筒状をなしている(図1A)。リアクター内部は、上から金属スペーサー(11)、シリコンゴムリング(12)、PLAシート(13)、ステンレスメッシュ(14)、シリコンゴムリング(15)を、スリット(17)を設けたステンレス製円筒(16)内に張り出したリブ(ツバ)(18)上に積み重ねる(図1B)。培養液中の細胞外マトリックスと細胞はPLAシート上に堆積する(図1C)。図1Aおよび図1Cにおいて、矢印は還流液の方向を示している。図1Bはリアクター内部の構造を示す。図1Cに示されるように、高強度人工組織(10)はPLAシート上に堆積している。
肝臓の皮膜は、線維芽細胞とコラーゲン細線維が高密度に集積した結合組織であり、その皮膜内に、肝実質細胞の作る肝細胞索、類洞、グリソン鞘などが立体的に配置された組織複合体である。そこで、結合組織性の皮膜を持った肝組織の再構成を試みた。
バイオリアクター(エイブル社製)をリアクターとして用い、PET製のメッシュ・シートを支持体として、線維芽細胞(HFO;1.0 × 107個)を添加した0.5mg/mL I型アテロコラーゲン含有DMEM100mLを6時間還流した。次いでDMEM50mLに還流液を交換し、還流開始直後にHepG2細胞(2〜4 × 107個)を2mLのDMEMに懸濁した液をリアクターの上流より5〜10分間かけて回路内に投入し、その後さらに2時間還流した。引き続き0.5mg/mL I型アテロコラーゲン含有DMEM50mLを3時間還流して積層型人工肝組織を作成した。積層型肝組織を循環培養型リアクターに移し、さらに3日間循環培養した。
計11時間の閉鎖循環培養によりコラーゲン細線維、線維芽細胞、HepG2細胞からなる白いゼリー状の組織塊がPETシート上に堆積していた。光顕観察の結果コラーゲン細線維と線維芽細胞からなる2層の結合組織間にHepG2細胞が集積していた(図12)。図12はリアクターを用いて作成した人工肝臓の光学顕微鏡像(ヘマトキシリン・エオジン染色)を示す。上下二層の人工結合組織(C)間に多数の肝細胞(HepG2;H)が観察される(スケールは50μm)。
アルブミンは、肝臓で合成されて血液中に分泌され、全身の細胞は、血液からこれを取り入れ利用している。ヒトの正常血清濃度は、3.8〜5.3g/dL(38,000〜53,000μg/mL)である。従って、アルブミン合成能を調べることにより、作成した人工肝臓の機能を評価することができる。本実施例では、肝細胞の替わりに、腫瘍化した肝細胞より株化されたHepG2細胞を用いている。そのため、アルブミン合成能はもとより低値である。そこで、ALBUWELL II 測定キット(Exowell 社)を用いて、培養液のアルブミン濃度を競合的ELISA法によって測定した。培養液中に分泌されたアルブミン濃度は、培養3日目において、通常の平板培養では0.5μg/mL程度であったが、本法を用いて3次元複合組織にすることにより、3μg/mL以上の高値を示していた(図13)。
11 スペーサー
12 シリコンゴムリング
13 PLAシート
14 ステンレスメッシュ
15 シリコンゴムリング
16 ステンレス製円筒
17 スリット
18 リブ(ツバ)
100 ガラスリング
101 人工真皮
102 培養液
103,104 皮膚モデル用培地
Claims (9)
- 1種類または複数の動物細胞をコラーゲン結合型細胞成長因子及び細胞外マトリックス成分を含む細胞培養液中で培養することを特徴とする人工組織の製造方法。
- 前記1種類または複数の動物細胞を埋め込んだ細胞外マトリックスを積層させるに当たり、1種類または複数の動物細胞と細胞外マトリックス成分とを含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を製造する工程の後、引き続いて、細胞外マトリックス成分と1種類または複数の動物細胞を含む異なる細胞培養液を用いて前記組織上に異なる高密度培養組織を形成する操作を少なくとも1回行う工程を実施して積層型高密度培養組織を形成する積層型高密度培養人工組織の製造方法において、初回及びその後の高密度培養組織製造工程のうち少なくとも1回の高密度培養組織製造工程における循環培養液中にコラーゲン結合型細胞成長因子を含有させる請求項1記載の人工組織の製造方法。
- コラーゲン結合型細胞成長因子の細胞成長因子が、上皮成長因子(EGF)、線繊芽細胞成長因子(FGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、肝細胞成長因子(HGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、神経栄養因子(NGF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)及びインシュリン様成長因子(IGF)からなる群から選ばれる1または2以上である請求項1または2に記載の人工組織の製造方法。
- コラーゲン結合型細胞成長因子としてコラーゲン結合型上皮成長因子(EGF−CBD)を表皮細胞と共に用いて人工皮膚を再構築する請求項1〜3のいずれかに記載の人工組織の製造方法。
- 1種類または複数の動物細胞と細胞外マトリックス成分を含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を製造する閉鎖循環式高密度組織培養工程によって高密度真皮様組織を作成し、次いでコラーゲン結合型上皮成長因子(EGF−CBD)を表皮細胞と共に用いて人工皮膚を再構築する請求項4に記載の人工組織の製造方法。
- 人工血管を再構築する請求項1〜3のいずれかに記載の人工組織の製造方法。
- 細胞外マトリックス成分と1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を循環培養する経路内に、液流制御部材とメッシュ部材とを、メッシュ部材が液流に対して前記液流制御部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記液流制御部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させ高密度培養組織を製造する工程の後、引き続いて、細胞外マトリックス成分と1種類または複数の動物細胞を含む異なる細胞培養液を用いて前記組織上に異なる高密度培養組織を形成する操作を少なくとも1回行う工程を実施して積層型高密度培養人工組織を形成する方法であって、順に
(1)肝臓の被膜に相当する結合組織を作成し、これに
(2)肝細胞に見立てた腫瘍性肝細胞層を重ね、次いで
(3)肝臓内にある結合組織に見立てた層を作成し人工肝臓を再構築することを特徴とする人工組織の製造方法。 - 液流制御部材が生分解性シートである請求項2、5または7記載の人工組織の製造方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法により製造される人工組織。
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