CN106421916B - 组织工程皮肤及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组织工程皮肤及其制备方法，所述组织工程皮肤包括真皮层和表皮层，由种子细胞、细胞生长因子和生物支架材料通过生物3D打印技术制备而成。本发明制备的组织工程皮肤与天然皮肤相似，具有表皮层和真皮层，真皮层中含有血管、汗腺和毛囊，可批量生产，其形状、大小和厚度易于改变，可与创口紧密贴合，具有良好的生物相容性，可增强创面愈合后的皮肤弹性和柔韧性，可提高组织工程移植成功率。

Description

组织工程皮肤及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程皮肤技术领域，特别是涉及一种含附属器的全层组织工程皮肤及其制备方法。
背景技术
组织、器官缺损或功能障碍是危害人类健康的主要病因，也是导致患者死亡的主要原因之一，组织、器官缺损的修复和功能重建是医学领域面临的挑战。传统治疗手段往往需要牺牲自体组织进行移植修复，容易导致供区的创伤和功能受限，是一种“以创伤修复创伤”的无奈之举，而异体组织器官移植因缺乏合适的供体而受到极大的限制。随着医学科学的发展，组织器官缺损的治疗理念已逐渐从组织移植向组织工程转变。组织工程是指将工程学原理和生命科学相结合，研究开发用于组织和器官修复、改善和功能维持的生物替代物，属于再生医学范畴。临床上对组织器官的大量需求，促进了组织工程研究及其产业的快速发展，其中组织工程皮肤是所有组织工程器官中最早被研发出来、发展速度最快，也是目前技术最为成熟的组织工程产品。组织工程皮肤是通过在体外培养扩增大量的功能细胞，复合到支架材料，通过细胞与支架相互作用，诱导、生长形成三维的有活性的皮肤替代物。
目前，已经有多种皮肤产品问世，并用于临床治疗，取得了一定疗效。然而，组织工程皮肤距离真正理想的永久性皮肤替代物尚存有一定差距，尤其是目前的技术方法并不能在组织工程皮肤中构建出皮肤的附属器结构，如毛囊、汗腺等。而这些结构在皮肤创伤修复和重建过程中又起着至关重要的作用。因此，如何建立含有皮肤附属器的更接近天然皮肤的三维结构的人工皮肤是亟待解决的问题之一。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种含附属器的全层组织工程皮肤。
具体的技术方案如下：
一种组织工程皮肤，包括真皮层和表皮层，由种子细胞、细胞生长因子和生物支架材料通过生物3D打印技术制备而成；
所述种子细胞包括汗腺细胞、毛囊上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞和表皮干细胞，所述种子细胞均来自已经建立的成熟常规公知细胞系，并非直接由人体胚胎干细胞的诱导分化而来，并非通过非治疗目的的外科手术方法获得；
所述种子细胞来源于自体或同种异体，包括由成体干细胞或由iPS细胞人工培养分化而来的汗腺细胞、毛囊上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞，或直接取自人体经体外培养而得的汗腺细胞、毛囊上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞和表皮干细胞；
所述细胞生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子、重组人表皮生长因子、肝细胞生长因子、类胰岛素一号增长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子、肿瘤坏死因子α和骨形态发生蛋白2；
所述生物支架材料包括真皮支架材料和血管支架材料。
在其中一些实施例中，所述的真皮支架材料选自：
胶原蛋白、明胶、透明质酸、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白、蚕丝蛋白、分子量为10000-100000的壳聚糖、藻酸盐、聚乳酸、聚羟基丁酸酯、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚ρ-羟基丁酯、聚乳酸-已内酯、聚原酸酯、聚磷酸酯、聚酸酐-生物活性玻璃、聚羟基脂肪酸酯或聚对二氧化六环铜-丙二醇中的一种或几种。
在其中一些实施例中，所述的真皮支架材料为质量比7-10:1-2:1-2:3-5的胶原蛋白：壳聚糖：藻酸盐：聚乳酸。
在其中一些实施例中，所述的血管支架材料选自：
胶原蛋白、藻酸盐、甲壳素、葡萄糖明胶、弹性蛋白、多聚氨基酸、多肽、透明质酸、聚乙二醇酸、聚丙醇酸、聚乙醇酸、聚羟基乙酸、聚乳酸、聚L-乳酸及上述人工合成材料的共聚物、聚羟基烷酸酯或聚-4-羟基丁酸中的一种或几种。
在其中一些实施例中，所述的血管支架材料为质量比7-10:1-2:2-3:2-3的胶原蛋白：藻酸盐：聚乙二醇酸：聚乙醇酸。
在其中一些实施例中，所述真皮层是分别将含汗腺细胞和细胞生长因子a的微球载体、含毛囊上皮细胞和细胞生长因子a的微球载体、含成纤维细胞和细胞生长因子b的微球载体构建于真皮支架材料内，以及将含血管内皮细胞和细胞生长因子c的微球载体构建于血管支架材料的内表面而制成；
所述细胞生长因子a为重组人表皮生长因子、肝细胞生长因子和神经生长因子的一种或几种的组合；
所述细胞生长因子b为碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、重组人表皮生长因子、血小板衍生生长因子和肿瘤坏死因子α的一种或几种的组合；
所述细胞生长因子c为血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和肿瘤坏死因子α的一种或几种的组合。
在其中一些实施例中，所述表皮层是将含表皮干细胞和细胞生长因子d的微球载体构建于真皮支架材料表面而制成；
所述细胞生长因子d为重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、类胰岛素一号增长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子和骨形态发生蛋白2的一种或几种的组合。
本发明的另一目的是提供上述组织工程皮肤的制备方法。
具体的技术方案如下：
上述组织工程皮肤的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：培养基的配制
将体积比为8.5-9.5:1的DMEM/F12商用培养液与胎牛血清混合为基础培养液；再按500ml基础培养液加入胰岛素2～50ng，氢化可的松10～500μg，碱性成纤维细胞生长因子2～50μg，转化生长因子-β5～10μg，血管内皮生长因子2～25μg，重组人表皮生长因子2～10μg，肝细胞生长因子5～10μg，三碘甲状腺原氨酸1～2μg，亚硒酸钠5～10μg，青霉素30～50mg，链霉素30～50mg，腺嘌呤12～17mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，牛垂体提取液5～10mg，制备成组织工程皮肤的培养基；
步骤2：3D打印生物墨水的制备
(1)生物支架材料的制备
在4℃条件下，按7-10：1-2:1-2:3-5的质量比将胶原蛋白：壳聚糖：藻酸盐：聚乳酸混合作为真皮支架材料；
按7-10：1-2:2-3:2-3的质量比将胶原蛋白：藻酸盐：聚乙二醇酸：聚乙醇酸混合作为血管支架材料；
用0.45-0.55M的醋酸分别将上述真皮支架材料和血管支架材料配制成浓度为8mg/ml-18mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射25-35min，再按体积比分别加入9.5-10.5％的胎牛血清和10％终浓度为90～140mg/ml的DMEM/F12商用培养液，调pH为7.2～7.4，制成真皮支架凝胶溶液和血管支架凝胶溶液；
(2)种子细胞与微载体复合体的构建
以明胶、海藻酸盐、壳聚糖和聚氨酯的任一种或是几种的组合为原料通过乳化法制备微球载体；
将含质量比为3-6:1-2:1-2的碱性成纤维细胞生长因子和重组人表皮生长因子及转化生长因子-β的溶液a，含质量比为5-7:3-5的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液b，含质量比为5-7:3-5的重组人表皮生长因子和肝细胞生长因子的溶液c，含质量比为5-7:3-5的重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液d分别滴加在经过冷冻干燥的微球载体上，溶液a、溶液b、溶液c、溶液d与微球载体的质量比均分别为5-6:4-5，在室温下保持25-35min以使生长因子完全融入微球载体；
将上述融入生长因子后的微球载体用DMEM/F12商用培养液浸泡24h后，平铺于12孔板中，加入所述基础培养液，然后接种种子细胞：将成纤维细胞接种于含溶液a的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养，得微载体复合体凝胶悬液a；将血管内皮细胞接种于含溶液b的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养，得微载体复合体凝胶悬液b；将毛囊上皮细胞和汗腺细胞分别接种于含溶液c的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养，得微载体复合体凝胶悬液c；将表皮干细胞接种于含溶液d的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养，得微载体复合体凝胶悬液d；
步骤3：生物3D打印
(1)对所需部位的皮肤进行CT设备扫描感应，根据感应到的信息生成对应的皮肤信息，计算机将该皮肤信号转换为三维模型；
(2)由计算机将上述三维模型转换成生物3D打印机能够识别的图形文件；
(3)将步骤2制备的真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液以及含不同种子细胞的微载体复合体凝胶悬液分别装入对应的生物3D打印机的墨盒中；
(4)通过计算机操控生物3D打印机进行打印；
(5)打印完成后即得所述组织工程皮肤，并立即置于所述培养基中，在37℃、5％CO2孵箱中培养。
生物3D打印的打印方式主要有三类，即喷墨生物打印，微挤压成型生物打印和激光辅助生物打印，优选的，所述生物3D打印的打印方式为微挤压成型生物打印。
生物3D打印的打印机具有两种类型，即含2个以上喷头的多喷头生物打印机和含2条以上生物墨水输送管路的单喷头生物打印机。其中含2个以上喷头的多喷头生物打印机通过计算机程序精确控制每一个喷头的先后顺序和沉积位置，而每一个喷头只含一种生物墨水；含2条以上生物墨水输送管路的单喷头生物打印机只有一个喷头，该喷头上具有多条生物墨水输送管路，每一条生物墨水输送管路含有一种生物墨水，计算机通过控制生物墨水输送管路的先后顺序和喷头的沉积位置来进行生物打印。本发明采用含2个以上喷头的多喷头生物打印机或含2条以上生物墨水输送管路的单喷头生物打印机均可达到打印全层组织工程皮肤的目的。
在其中一些实施例中，所述真皮支架凝胶溶液和所述血管支架凝胶溶液的动力粘度均为30×107mPa·s-6×107mPa·s。
在其中一些实施例中，所述微球载体的粒径为100μm-200μm。
微球载体用于给种子细胞提供营养和生长因子，种子细胞贴壁生长，使种子细胞不会迅速死亡。优选的，所述微球载体粒径为100μm-200μm，既可以给种子细胞提供足够营养，又可以把含血管内皮生长因子的微球载体置于所打印的血管支架内。
在其中一些实施例中，所述种子细胞在每个微球载体上的接种数量为50-200。
微球载体上的种子细胞接种数量不易过大或过小，因为种子细胞过多容易导致营养物质的快速消耗，而过少则不能保证种子细胞均能存活，故优选的，所述种子细胞在每个微球载体上的接种数量为50～200。
在其中一些实施例中，所述种子细胞与微球载体的复合培养时间为5-7天。
在其中一些实施例中，制备步骤均在4℃、5％CO2万级洁净环境下进行。
生物3D打印是在数字三维模型驱动下，按照增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，制造医疗器械、组织工程支架和组织器官等制品。本发明由汗腺细胞、毛囊上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、表皮干细胞和生物支架材料结合生物3D打印技术制成具有细胞活性的含血管和皮肤附属器的全层组织工程皮肤，实现短时间内快速构建与天然皮肤相似的人工皮肤的方法，对临床创面和整形美容治疗具有重要的意义。
本发明制备的全层组织工程皮肤与天然皮肤相似，具有表皮层和真皮层，真皮层中含有血管、汗腺和毛囊，可批量生产，其形状、大小和厚度易于改变，可与创口紧密贴合，具有良好的生物相容性，可增强创面愈合后的皮肤弹性和柔韧性，可提高组织工程移植成功率。
血管内皮细胞与微载体复合体通过生物3D打印技术构建于血管支架材料内表面制成含活性血管内皮细胞的人工血管，所述人工血管可进一步生成内径大小不一的分支毛细血管，该毛细血管为真皮基质内的成纤维细胞、汗腺细胞、毛囊细胞及血管内皮细胞提供营养通道，使上述细胞保持生物活性。
本发明的全层组织工程皮肤的制备方法具有较多的优点：以真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液和含不同种子细胞与微载体复合体溶液为生物墨水，结合生物3D打印技术制备出含血管和皮肤附属器的全层组织工程皮肤，皮肤附属器包括汗腺和毛囊附属器；打印过程中微球载体给种子细胞提供营养和生长因子，种子细胞贴壁生长，具有抗机械挤压的作用，细胞存活率高；生物3D打印和培养总时间短，在临床创面治疗中可以一次性重建皮肤，以供手术室短时间内快速构建组织工程皮肤。
上述技术方案的有效果：
(1)以真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液和含不同种子细胞与微载体复合体溶液为生物墨水，结合生物3D打印技术制备出含血管和皮肤附属器的全层组织工程皮肤，皮肤附属器包括汗腺和毛囊附属器；
(2)打印过程中微球载体给种子细胞提供营养和生长因子，种子细胞贴壁生长，具有抗机械挤压的作用，细胞存活率高；
(3)生物3D打印和培养总时间短，在临床创面治疗中可以一次性重建皮肤，以供手术室短时间内快速构建组织工程皮肤；
(4)上述组织工程皮肤与天然皮肤相似，具有表皮层和真皮层，真皮层中含有血管、汗腺和毛囊，可批量生产；
(5)上述组织工程皮肤的形状、大小和厚度易于改变，可与创口紧密贴合，具有良好的生物相容性；
(6)上述组织工程皮肤可增强创面愈合后的皮肤弹性和柔韧性，可提高组织工程移植成功率。
附图说明
图1为本发明按实施例1所制备的全层组织工程皮肤的照片；
图2为本发明按实施例2所制备的全层组织工程皮肤的照片；
图3为本发明按实施例3所制备的全层组织工程皮肤的照片；
图4为本发明按实施例4所制备的全层组织工程皮肤的照片；
图5为本发明按实施例5所制备的全层组织工程皮肤的照片。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例一种组织工程皮肤的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：培养基的配制
将体积比为9:1的DMEM/F12(1:1)商用培养液与胎牛血清混合为基础培养液；再按500ml基础培养液标准加入胰岛素2ng，氢化可的松10μg，碱性成纤维细胞生长因子2μg，转化生长因子-β5μg，血管内皮生长因子2μg，重组人表皮生长因子2μg，肝细胞生长因子5μg，三碘甲状腺原氨酸1μg，亚硒酸钠5μg，青霉素30mg，链霉素30mg，腺嘌呤12mg，转铁蛋白1mg，维生素C5mg，牛垂体提取液5mg，制备成全层组织工程皮肤的培养基。
其中碱性成纤维细胞生长因子促进真皮细胞的分化和增殖，血管内皮生长因子促进血管内皮细胞的分化和增殖，重组人表皮生长因子促进汗腺细胞和表皮干细胞细胞的分化和增殖，肝细胞生长因子促进毛囊上皮细胞的分化和增殖。
步骤2：3D打印生物墨水的制备
(1)生物支架材料的制备：
在4℃条件下，按质量比将胶原蛋白(I型胶原：III型胶原＝1:3)7：壳聚糖1：藻酸盐1：聚乳酸3混合作为真皮支架材料；
按质量比将胶原(I型胶原：III型胶原＝1:3)7：藻酸盐1：聚乙二醇酸2：聚乙醇酸2混合作为血管支架材料；
用0.5M的醋酸分别将上述真皮支架材料和血管支架材料配制成浓度为8mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射30min，再按体积比分别加入10％的胎牛血清和10％终浓度为90mg/ml的DMEM/F12(1:1)培养液，调pH为7.2～7.4，制成真皮支架凝胶溶液和血管支架凝胶溶液。
(2)种子细胞与微载体复合体的构建：
取0.2ml失水山梨糖醇脂肪酸酯与30ml液体石蜡充分搅拌均匀后倒入三口烧瓶中，于50℃高速搅拌；将质量分数为20％的明胶水溶液真空抽气泡，取4.5mL缓慢滴加入到三口瓶中，调节搅拌速度至450r/min，搅拌10min，溶液变得浑浊，形成乳状液后在保持搅拌速度不变条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于5℃，继续搅拌15min，缓慢滴加25％的戊二醛0.1ml，在450r/min下继续搅拌2h；加入12ml丙酮，搅拌3min后静置，待溶液分层后，可以看到制备出的淡黄色微球沉淀在最下层，倒掉溶液后将微球泡在10ml丙酮溶液中，于5℃固化24h；取出微球后用1mol/L的氨基乙酸浸泡30min，除掉未反应的戊二醛，用丙酮、异丙醇、二次水反复洗涤，有机溶剂挥发后得到淡黄色粉末状明胶微粒载体。
将含质量比为3:1:1的碱性成纤维细胞生长因子和重组人表皮生长因子及转化生长因子-β的溶液a，含质量比为5:3的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液b，含质量比为5:3的重组人表皮生长因子和肝细胞生长因子的溶液c，含质量比为5:3的重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液d分别滴加在经过冷冻干燥的微球载体上，溶液a、溶液b、溶液c、溶液d与微球载体的质量比均分别为5:4，在室温下保持25min以使生长因子完全融入微球载体。
取灭菌后的上述微球载体用DMEM/F12(1:1)培养液浸泡24h后，平铺于12孔板中，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养液，将成纤维细胞接种于含溶液a的微球载体，将血管内皮细胞接种于含溶液b的微球载体，将毛囊上皮细胞和汗腺细胞分别接种于含溶液c的微球载体，将表皮干细胞接种于含溶液d的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养5-7天。
步骤3.生物3D打印过程
采用含2个以上喷头的多喷头生物打印机，打印方式为微挤压成型生物打印，打印过程是在4℃、5％CO2万级洁净环境下完成。
(1)对所需部位的皮肤进行CT设备扫描感应，根据感应到的信息生成对应的皮肤信息，计算机将该皮肤信号转换为三维模型；
(2)由计算机将上述三维模型转换成生物3D打印机能够识别的STL(StereoLithography)格式图形文件，并拷贝到与生物3D打印机连接的计算机，控制生物3D打印机工作；
(3)打印前用相关软件将STL图形文件转换为g代码，输入到与生物3D打印机连接的计算机；
(4)将步骤2制备的真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液和含不同种子细胞与微载体复合体凝胶悬液分别装入对应的生物3D打印机的墨盒中；
(5)通过打印程序和STL图形文件的g代码由计算机操控生物3D打印机从而控制上述真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液和含不同种子细胞与微载体复合体凝胶悬液的喷头的先后顺序和沉积位置，打印方式为微挤压成型生物打印；
(6)平铺打印完成后即得含附属器的全层组织工程皮肤，并立即置于所述培养基中，液面与皮肤表面齐平，在37℃、5％CO2孵箱中培养等待移植，培养期间每天更换培养液或在缓慢流速非循环的培养液中进行培养，之后形成含附属器的全层组织工程皮肤。
实施例2
本实施例一种组织工程皮肤的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：培养基的配制
将体积比为9:1的DMEM/F12(1:1)商用培养液与胎牛血清混合为基础培养液；再按500ml基础液标准加入胰岛素25ng，氢化可的松300μg，碱性成纤维细胞生长因子25μg，转化生长因子-β8μg，血管内皮生长因子10μg，重组人表皮生长因子5μg，肝细胞生长因子8μg，三碘甲状腺原氨酸1.5μg，亚硒酸钠8μg，青霉素40mg，链霉素40mg，腺嘌呤15mg，转铁蛋白5mg，维生素C15mg，牛垂体提取液8mg，制备成全层组织工程皮肤的培养基。
其中碱性成纤维细胞生长因子促进真皮细胞的分化和增殖，血管内皮生长因子促进血管内皮细胞的分化和增殖，重组人表皮生长因子促进汗腺细胞和表皮干细胞细胞的分化和增殖，肝细胞生长因子促进毛囊上皮细胞的分化和增殖。
步骤2：3D打印生物墨水的制备
(1)生物支架材料的制备：
在4℃条件下，按质量比将胶原8：壳聚糖1.5：藻酸盐1.5：聚乳酸4混合作为真皮支架材料，按质量比将胶原8：藻酸盐1.5：聚乙二醇酸2.5：聚乙醇酸2.5混合作为血管支架材料，用0.5M的醋酸分别将上述真皮支架材料和血管支架材料配制成浓度为14mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射30min，再按体积比分别加入10％的胎牛血清和10％终浓度为120mg/ml的DMEM/F12(1:1)培养液，调pH为7.2～7.4，制成真皮支架和血管支架的凝胶溶液。
(2)种子细胞与微载体复合体的构建：取0.2ml失水山梨糖醇脂肪酸酯与30ml液体石蜡充分搅拌均匀后倒入三口烧瓶中，于50℃高速搅拌；将质量分数为20％的明胶水溶液真空抽气泡，取4.5mL缓慢滴加入到三口瓶中，调节搅拌速度至450r/min，搅拌10min，溶液变得浑浊，形成乳状液后在保持搅拌速度不变条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于5℃，继续搅拌15min，缓慢滴加25％的戊二醛0.1ml，在450r/min下继续搅拌2h；加入12ml丙酮，搅拌3min后静置，待溶液分层后，可以看到制备出的淡黄色微球沉淀在最下层，倒掉溶液后将微球泡在10ml丙酮溶液中，于5℃固化24h；取出微球后用1mol/L的氨基乙酸浸泡30min，除掉未反应的戊二醛，用丙酮、异丙醇、二次水反复洗涤，有机溶剂挥发后得到淡黄色粉末状明胶微粒载体。
将含质量比为5:1:1的碱性成纤维细胞生长因子和重组人表皮生长因子及转化生长因子-β的溶液a，含质量比为3:2的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液b，含质量比为3:2的重组人表皮生长因子和肝细胞生长因子的溶液c，含质量比为3:2的重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液d分别滴加在经过冷冻干燥的微球载体上，溶液a、溶液b、溶液c、溶液d与微球载体的质量比均为5:4，在室温下保持30min以使生长因子完全融入微球载体。
取灭菌后的上述微球载体用DMEM/F12(1:1)培养液浸泡24h后，平铺于12孔板中，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养液，将成纤维细胞接种于含溶液a的微球载体，将血管内皮细胞接种于含溶液b的微球载体，将毛囊上皮细胞和汗腺细胞分别接种于含溶液c的微球载体，将表皮干细胞接种于含溶液d的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养5-7天。
步骤3.生物3D打印过程
采用含2个以上喷头的多喷头生物打印机，打印方式为微挤压成型生物打印，打印过程是在4℃、5％CO2万级洁净环境下完成。
(1)对所需部位的皮肤进行CT设备扫描感应，根据感应到的信息生成对应的皮肤信息，计算机将该皮肤信号转换为三维模型；
(2)由计算机将上述三维模型转换成生物3D打印机能够识别的STL(StereoLithography)格式图形文件，并拷贝到与生物3D打印机连接的计算机，控制生物3D打印机工作；
(3)打印前用相关软件将STL图形文件转换为g代码，输入到与生物3D打印机连接的计算机；
(4)将步骤2制备的真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液和含不同种子细胞与微载体复合体凝胶悬液分别装入对应的生物3D打印机的墨盒中；
(5)通过打印程序和STL图形文件的g代码由计算机操控生物3D打印机从而控制上述真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液和含不同种子细胞与微载体复合体凝胶悬液的喷头的先后顺序和沉积位置，打印方式为微挤压成型生物打印；
(6)平铺打印完成后即得含附属器的全层组织工程皮肤，并立即置于所述培养基中，液面与皮肤表面齐平，在37℃、5％CO2孵箱中培养等待移植，培养期间每天更换培养液或在缓慢流速非循环的培养液中进行培养，之后形成含附属器的全层组织工程皮肤。
实施例3
本实施例一种组织工程皮肤的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：培养基的配制
将体积比为9:1的DMEM/F12(1:1)商用培养液与胎牛血清混合为基础培养液；再按500ml基础液标准加入胰岛素50ng，氢化可的松500μg，碱性成纤维细胞生长因子50μg，转化生长因子-β10μg，血管内皮生长因子25μg，重组人表皮生长因子10μg，肝细胞生长因子10μg，三碘甲状腺原氨酸2μg，亚硒酸钠10μg，青霉素50mg，链霉素50mg，腺嘌呤17mg，转铁蛋白10mg，维生素C30mg，牛垂体提取液10mg，制备成全层组织工程皮肤的培养基。其中碱性成纤维细胞生长因子促进真皮细胞的分化和增殖，血管内皮生长因子促进血管内皮细胞的分化和增殖，重组人表皮生长因子促进汗腺细胞和表皮干细胞细胞的分化和增殖，肝细胞生长因子促进毛囊上皮细胞的分化和增殖。
步骤2：3D打印生物墨水的制备
(1)生物支架材料的制备：在4℃条件下，按质量比将胶原10：壳聚糖2：藻酸盐2：聚乳酸5混合作为真皮支架材料，按质量比将胶原10：藻酸盐2：聚乙二醇酸3：聚乙醇酸3混合作为血管支架材料，用0.5M的醋酸分别将上述真皮支架材料和血管支架材料配制成浓度为18mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射30min，再按体积比分别加入10％的胎牛血清和10％终浓度为140mg/ml的DMEM/F12(1:1)培养液，调pH为7.2～7.4，制成真皮支架和血管支架的凝胶溶液。
(2)种子细胞与微载体复合体的构建：取0.2ml失水山梨糖醇脂肪酸酯与30ml液体石蜡充分搅拌均匀后倒入三口烧瓶中，于50℃高速搅拌；将质量分数为20％的明胶水溶液真空抽气泡，取4.5mL缓慢滴加入到三口瓶中，调节搅拌速度至450r/min，搅拌10min，溶液变得浑浊，形成乳状液后在保持搅拌速度不变条件下迅速改为冰浴，使体系温度低于5℃，继续搅拌15min，缓慢滴加25％的戊二醛0.1ml，在450r/min下继续搅拌2h；加入12ml丙酮，搅拌3min后静置，待溶液分层后，可以看到制备出的淡黄色微球沉淀在最下层，倒掉溶液后将微球泡在10ml丙酮溶液中，于5℃固化24h；取出微球后用1mol/L的氨基乙酸浸泡30min，除掉未反应的戊二醛，用丙酮、异丙醇、二次水反复洗涤，有机溶剂挥发后得到淡黄色粉末状明胶微粒载体。
将含质量比为5:2:2的碱性成纤维细胞生长因子和重组人表皮生长因子及转化生长因子-β的溶液a，含质量比为7:5的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液b，含质量比为7:5的重组人表皮生长因子和肝细胞生长因子的溶液c，含质量比为7:5的重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液d分别滴加在经过冷冻干燥的微球载体上，溶液a、溶液b、溶液c、溶液d与微球载体的质量比均为6:5，在室温下保持35min以使生长因子完全融入微球载体。
取灭菌后的上述微球载体用DMEM/F12(1:1)培养液浸泡24h后，平铺于12孔板中，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养液，将成纤维细胞接种于含溶液a的微球载体，将血管内皮细胞接种于含溶液b的微球载体，将毛囊上皮细胞和汗腺细胞分别接种于含溶液c的微球载体，将表皮干细胞接种于含溶液d的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养5-7天。
步骤3：生物3D打印过程
采用含2个以上喷头的多喷头生物打印机，打印方式为微挤压成型生物打印，打印过程是在4℃、5％CO2万级洁净环境下完成。
(1)对所需部位的皮肤进行CT设备扫描感应，根据感应到的信息生成对应的皮肤信息，计算机将该皮肤信号转换为三维模型；
(2)由计算机将上述三维模型转换成生物3D打印机能够识别的STL(StereoLithography)格式图形文件，并拷贝到与生物3D打印机连接的计算机，控制生物3D打印机工作；
(3)打印前用相关软件将STL图形文件转换为g代码，输入到与生物3D打印机连接的计算机；
(4)将步骤2制备的真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液和含不同种子细胞与微载体复合体凝胶悬液分别装入对应的生物3D打印机的墨盒中；
(5)通过打印程序和STL图形文件的g代码由计算机操控生物3D打印机从而控制上述真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液和含不同种子细胞与微载体复合体凝胶悬液的喷头的先后顺序和沉积位置，打印方式为微挤压成型生物打印；
(6)平铺打印完成后即得含附属器的全层组织工程皮肤，并立即置于所述培养基中，液面与皮肤表面齐平，在37℃、5％CO2孵箱中培养等待移植，培养期间每天更换培养液或在缓慢流速非循环的培养液中进行培养，之后形成含附属器的全层组织工程皮肤。
实施例4
将实施例2步骤2种子细胞与微载体复合体的构建中的明胶更换为海藻酸钠，其余操作和原料配比不变，制备含附属器的全层组织工程皮肤。
实施例5
将实施例2步骤3，3D打印过程中的生物打印机更换为含2条以上生物墨水输送管路的单喷头生物打印机，其余操作和原料配比不变，制备含附属器的全层组织工程皮肤。
由实施例1-5所制备的全层组织工程皮肤均与天然皮肤相似，具有表皮层和真皮层，真皮层中含有血管和汗腺、毛囊皮肤附属器，可与创口紧密贴合，具有良好的生物相容性，可增强创面愈合后的皮肤弹性和柔韧性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种组织工程皮肤，包括真皮层和表皮层，其特征在于，由种子细胞、细胞生长因子和生物支架材料通过生物3D打印技术制备而成；
所述真皮层是分别将含汗腺细胞和细胞生长因子a的微球载体、含毛囊上皮细胞和细胞生长因子a的微球载体、含成纤维细胞和细胞生长因子b的微球载体构建于真皮支架材料内，以及将含血管内皮细胞和细胞生长因子c的微球载体构建于血管支架材料的内表面而制成；
所述细胞生长因子a为重组人表皮生长因子、肝细胞生长因子和神经生长因子的一种或几种的组合；
所述细胞生长因子b为碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、重组人表皮生长因子、血小板衍生生长因子和肿瘤坏死因子α的一种或几种的组合；
所述细胞生长因子c为血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β和肿瘤坏死因子α的一种或几种的组合；
所述表皮层是将含表皮干细胞和细胞生长因子d的微球载体构建于真皮支架材料表面而制成；
所述细胞生长因子d为重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、类胰岛素一号增长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子和骨形态发生蛋白2的一种或几种的组合；
所述生物支架材料包括真皮支架材料和血管支架材料。
2.根据权利要求1所述的组织工程皮肤，其特征在于，
所述的真皮支架材料选自：胶原蛋白、明胶、透明质酸、4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、纤维蛋白、蚕丝蛋白、分子量为10000-100000的壳聚糖、藻酸盐、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸-已内酯、聚原酸酯、聚磷酸酯、聚酸酐-生物活性玻璃、聚羟基脂肪酸酯或聚对二氧化六环酮-丙二醇中的一种或几种；
所述的血管支架材料选自：胶原蛋白、藻酸盐、甲壳素、葡萄糖明胶、弹性蛋白、多聚氨基酸、多肽、透明质酸、聚乙二醇酸、聚丙醇酸、聚乙醇酸、聚羟基乙酸、聚乳酸及上述人工合成材料的共聚物、聚羟基烷酸酯或聚-4-羟基丁酸中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的组织工程皮肤，其特征在于，
所述的真皮支架材料为质量比7-10:1-2:1-2:3-5的胶原蛋白：壳聚糖：藻酸盐：聚乳酸；
所述的血管支架材料为质量比7-10:1-2:2-3:2-3的胶原蛋白：藻酸盐：聚乙二醇酸：聚乙醇酸。
4.权利要求1-3任一项所述的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：培养基的配制
将体积比为8.5-9.5:1的DMEM/F12商用培养液与胎牛血清混合为基础培养液；再按500ml基础培养液加入胰岛素2～50ng，氢化可的松10～500μg，碱性成纤维细胞生长因子2～50μg，转化生长因子-β5～10μg，血管内皮生长因子2～25μg，重组人表皮生长因子2～10μg，肝细胞生长因子5～10μg，三碘甲状腺原氨酸1～2μg，亚硒酸钠5～10μg，青霉素30～50mg，链霉素30～50mg，腺嘌呤12～17mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，牛垂体提取液5～10mg，制备成组织工程皮肤的培养基；
步骤2：3D打印生物墨水的制备
（1）生物支架材料的制备
在4℃条件下，按7-10：1-2:1-2:3-5的质量比将胶原蛋白：壳聚糖：藻酸盐：聚乳酸混合作为真皮支架材料；
按7-10：1-2:2-3:2-3的质量比将胶原蛋白：藻酸盐：聚乙二醇酸：聚乙醇酸混合作为血管支架材料；
用0.45-0.55M的醋酸分别将上述真皮支架材料和血管支架材料配制成浓度为8mg/ml-18mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射25-35min，再按体积比分别加入9.5-10.5％的胎牛血清和10％终浓度为90～140mg/ml的DMEM/F12商用培养液，调pH为7.2～7.4，制成真皮支架凝胶溶液和血管支架凝胶溶液；
（2）种子细胞与微载体复合体的构建
以明胶、海藻酸盐、壳聚糖和聚氨酯的任一种或是几种的组合为原料通过乳化法制备微球载体；
将含质量比为3-6:1-2:1-2的碱性成纤维细胞生长因子和重组人表皮生长因子及转化生长因子-β的溶液a，含质量比为5-7:3-5的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液b，含质量比为5-7:3-5的重组人表皮生长因子和肝细胞生长因子的溶液c，含质量比为5-7:3-5的重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的溶液d分别滴加所述微球载体上，溶液a、溶液b、溶液c、溶液d与微球载体的质量比均分别为5-6:4-5，在室温下保持25-35min以使生长因子完全融入微球载体；
将上述融入生长因子后的微球载体用DMEM/F12商用培养液浸泡24h后，平铺于12孔板中，加入所述基础培养液，然后接种种子细胞：将成纤维细胞接种于含溶液a的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养，得微载体复合体凝胶悬液a；将血管内皮细胞接种于含溶液b的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养，得微载体复合体凝胶悬液b；将毛囊上皮细胞和汗腺细胞分别接种于含溶液c的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养，得微载体复合体凝胶悬液c；将表皮干细胞接种于含溶液d的微球载体，置于37℃、5％CO2孵箱中进行复合培养，得微载体复合体凝胶悬液d；
步骤3：生物3D打印
（1）对所需部位的皮肤进行CT设备扫描感应，根据感应到的信息生成对应的皮肤信息，计算机将该皮肤信号转换为三维模型；
（2）由计算机将上述三维模型转换成生物3D打印机能够识别的图形文件；
（3）将步骤2制备的真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液以及含不同种子细胞的微载体复合体凝胶悬液分别装入对应的生物3D打印机的墨盒中；
（4）通过打印程序和所述图形文件，由计算机操控生物3D打印机从而控制所述真皮支架凝胶溶液、血管支架凝胶溶液和含不同种子细胞与微载体复合体凝胶悬液的喷头的先后顺序和沉积位置进行打印，形成所述真皮层和表皮层；
（5）打印完成后即得所述组织工程皮肤，并立即置于所述培养基中，在37℃、5％CO2孵箱中培养。
5.根据权利要求4所述的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，所述真皮支架凝胶溶液和所述血管支架凝胶溶液的动力粘度均为6×107mPa·s -30×107mPa·s。
6.根据权利要求4所述的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，所述微球载体的粒径为100μm -200μm。
7.根据权利要求4所述的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，所述种子细胞与微球载体的复合培养时间为5-7天。
8.根据权利要求5-7任一项所述的组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，制备步骤均在4℃、5％CO2万级洁净环境下进行。
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