CN109749983A - 一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,包含:步骤1、采用代表性细胞外基质成分生物材料构建适宜打印细胞的生物墨水;步骤2、以生理浓度将适宜皮肤附属器生成的各类蛋白因子与生物墨水混合;步骤3、向步骤2所得的混合液中加入细胞并混匀,选择打印参数后通过3D生物打印机,打印出带有活性皮肤附属器的人工皮肤模型;步骤4、根据皮肤移植部位的个体化需求,调整细胞数量和各类蛋白因子的浓度,以及打印参数,并在打印后将所得的3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。本发明提供的方法,能够提高人工皮肤的仿真性和生物功能性,可以更好地应用于皮肤缺损创面的移植。
Description
技术领域
本发明涉及一种医疗模型制造及应用领域的方法,具体地,涉及一种利用生物3D打印技术提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法。
背景技术
目前,用于治疗皮肤损伤最通常的方法是手术移植其他部位的皮肤到损伤部位,其最大的局限是正常皮肤的来源有限,难以满足大面积损伤治疗需求。利用体外培养扩增的细胞,结合框架蛋白形成组织工程皮肤或人皮肤的替代品,虽然在一定程度上具有取代同种异体皮肤移植的应用价值,但是其真正的应用与临床要求还有较大的差距。因此,如何提高工程化皮肤的仿真性和生物学性能以提高远期疗效等都是目前临床亟待解决的重要问题。
理想的人工皮肤应具备良好的生物相容性和生物降解性,植入体内后的降解和吸收速度应与细胞和(或)组织生长的速度相匹配,具有足够的力学强度、高孔隙率、高表面积,便于细胞的粘附和进入以及物质交换等。目前大部分研究表明,以动物胶原和糖胺多糖等为主要成分的海绵状真皮支架的工程化皮肤,虽能基本满足上述要求,但这些材料均不含皮肤附件,在移植后均无皮肤附属器官形成,从功能上来讲他们仅仅是敷料,还不是理想的工程化皮肤。这是目前工程化皮肤发展亟待攻克的科学问题和技术难题之一。之所以缺乏皮肤附件,主要是在以往工程化皮肤设计时没有考虑这方面需求,因此缺乏相关理论与关键技术。
同时,已有研究表明,微环境在器官与组织再生过程中发挥重要作用,而皮肤及其附属器的形成也极易受到微环境的影响。因此,体外构建适宜皮肤再生的微环境是提高工程化皮肤的仿真性和生物学性能以提高远期疗效的一种有效手段。然而微环境具有复杂多向性,体外构建需克服诸多障碍。
因此,新一代工程化皮肤的设计理念是:应具有与天然皮肤一致的皮肤附件并且活性及分布均能满足其功能需求。要达到这样的精准设计,需要借助生物3D打印技术才能得以完成。同时,要实现移植后的皮肤全功能再生,具有皮肤附属器特化潜能的细胞和适宜的微环境二者缺一不可,生物3D打印技术也可确保细胞和微环境的同时接入等关键技术的实现。
生物3D打印技术通过3D生物打印机(3D bio-printer;3D biology printer)来完成。3D生物打印机是一种能够在数字三维模型驱动下,按照增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元,制造医疗器械、组织工程支架和组织器官等制品的装备。这种机器首先读入由医学影像数据重建或设计的三维模型,将模型离散成多个片层,计算机控制打印喷头逐层″打印”打印由生物材料或细胞组成的“生物墨水”,不断重复这一过程,直至打印完成三维组织前体。随后,细胞开始重新组织、熔合,形成新的血管等组织结构。生物打印机不是利用一层层的塑料,而是利用一层层的生物材料或者细胞构造块,去制造真正的活体组织。3D生物打印机可以有多个打印喷头,喷头可以打印人体细胞,被称为“生物墨”;也可以打印纯生物材料,被称为“生物纸”。所谓生物纸其实是主要成分是水凝胶,可用作细胞生长的支架。3D生物打印机使用来自患者自己身体的细胞,所以不会产生排异反应。
3D生物打印时,首先在生物打印前,需要先计划细胞支架的结构并选择打印中会使用到的材质。开始打印前,要先取得患者器官的组织检体和医学影像。使用电脑断层和核磁共振取得患者的医学影像,是最常见的方法。取得影像后,利用软件将平面的医学影像重建出立体结构,并分离出预计要培养的细胞并加以增量后,便完成打印前的准备。这些细胞将和液态的特殊生物材质,在细胞混合器中混合。这种特殊生物材质能提供细胞生存所需的氧气与其他营养物质。在某些特殊情况,细胞甚至会被放入直径500微米的小球中,被保护起来。混入液体凝胶中的细胞并不需要细胞支架即可生存。这些细胞和营养基质的混合物将被放入管状的容器中,在打印的过程被挤压出来,以形成组织的形状。生物打印的接下来的步骤,将应用到生物墨水。生物墨水指的就是细胞与维生物质混合的液体基质。在这一步骤中,生物墨水将被放在生物打印机的墨水匣中,依照患者的医学影像资料,依序打印。生物打印所制造出来的初始组织物,将被送入细胞培养器中,慢慢地将充满细胞的初始组织培育成真正的组织。生物打印常常会需要将细胞平均散布到生物相容的支架上,这些生物相容的支架由积层制造法制造而成,最终形成了立体的组织似的架构。生物打印所制造的人工肝脏与人工肾脏,目前仍旧缺乏像是血管或是肾小管等的功能性单位,而且非常难以培育成多细胞的完整器官。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效精准的、可提高人工皮肤仿真性和功能性的制备人工皮肤的技术方法,能够解决人工皮肤移植后的皮肤功能性附属器的活性及分布控制等技术问题。
为了达到上述目的,本发明提供了一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述的方法包含:步骤1、采用代表性细胞外基质成分生物材料构建适宜打印细胞的生物墨水;生物墨水指的就是细胞与维生物质即代表性细胞外基质成分生物材料混合而成的液体基质。步骤2、以生理浓度将适宜皮肤附属器生成的各类蛋白因子与生物墨水混合;步骤3、向步骤2所得的混合液中加入细胞并混匀,选择打印参数后通过3D生物打印机,打印出带有活性皮肤附属器的人工皮肤模型;步骤4、根据皮肤移植部位的个体化需求,如某些部位需承载出汗功能,有些部位需要毛发等特征,在打印过程中调整细胞数量和各类蛋白因子的浓度等,以及打印参数,可根据皮肤附属器的不同种类做适当调整,选择最佳的构建参数;并在打印后将所得的3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。
上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述细胞包含皮肤附属器细胞、个性化定制所需皮肤细胞,或者可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞;所述的个性化定制所需皮肤细胞包含汗腺细胞、毛囊细胞、皮脂腺细胞、表皮细胞、真皮成纤维细胞、脂肪细胞,以及黑色素细胞等;所述的可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞包含间充质干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞,以及真皮干细胞等。皮肤附属器是胚胎发生中由表皮衍生而来,包括毛、皮脂腺、汗腺、指(趾)甲等。皮肤附属器对维持正常的皮肤功能具有重要作用。
上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述的代表性细胞外基质成分生物材料包含明胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、水凝胶、海藻酸钠,以及合成性生物材料PLGA(poly lactic-co-glycolic acid,聚乳酸-羟基乙酸共聚物)等中的任意一种或多种的混合物。
上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述的各类蛋白因子是包含Cthrc1、EGF、BMP4、BMP5、bFGF、VEGF等的诱导蛋白因子、生长因子以及各种趋化因子。
上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述的打印参数包含交联温度和时间,交联溶剂浓度,打印速度以及压力。
上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述的步骤3包含:步骤3.1、将配置好的混合有各类蛋白因子的存储于4℃的生物墨水取出,在37℃充分溶解,将1ml细胞悬液加入20ml生物墨水中,缓慢上下颠倒混匀,动作轻柔,防止混入太多小气泡;步骤3.2、将混匀的生物墨水移入3D生物打印机的打印筒,旋紧打印嘴活塞,使用封口膜封口;步骤3.3、将打印筒放入10℃水中静置,待生物墨水转变为胶状时,用喷嘴进行打印;步骤3.4、选择打印参数为:3D生物打印机的平台温度为10℃,喷头温度为8℃,打印速度为12mm/s,压力为0.1MPa~0.2MPa;步骤3.5、将打印出的3D打印块用CaCl2溶液进行交联;步骤3.6、吸去残留的CaCl2,用完全培养基洗两次,放入培养箱培养。完全培养基(Completemedium)是一种在基本培养基内加入一些富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质,即加入生长因子而制成的各种营养基,是微生物学上常用的一种培养基。基础培养基添加血清、抗生素等物质后,即为完全培养基,也叫(血清)细胞培养基。
上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述的步骤3.1中,在37℃充分溶解是将装有生物墨水的离心管完全浸入37℃的水浴锅中,时间大于或等于1小时。
上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述的步骤3.1中,1ml细胞悬液中含有的细胞数大于或等于1.0×107。
上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述的步骤3.3中,将打印筒放入10℃水中静置30min,待生物墨水转变为胶状时,用310μm喷嘴进行打印。
上述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其中,所述的步骤3.5中,将打印出的3D打印块在4℃加入1ml质量浓度为10%的CaCl2溶液作为溶剂,交联10min。
本发明提供的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法具有以下优点:
本发明采用代表性细胞外基质成分生物材料如明胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、水凝胶、海藻酸钠和合成性生物材料PLGA等以及多种成分的混合基质材料,构建适宜打印细胞(包括皮肤附属器细胞或者可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞等)的生物墨水:以生理浓度将适宜皮肤附属器生成的各类蛋白因子与墨水混合,在不同参数条件下(交联温度和时间、溶剂浓度等)完成打印过程。根据移植部位的个体化需求,在相应位置设计皮肤附属器的分布,如某些部位需承载出汗功能,有些部位需要毛发等特征,在上述打印过程中调整相应皮肤附属器细胞的数量或诱导皮肤附属器生成的成体干细胞数量及各类蛋白因子的浓度等。打印参数等也可根据皮肤附属器的不同种类做适当调整,选择最佳的构建参数,打印后将3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。
由于生物3D打印技术能够在时间空间层面精准定位细胞和组织发生所必需的微环境成分,在整合组织器官构建方面有着其他技术无法超越的优势。因此,本发明以生物3D打印技术为手段,仿生设计并构建了适宜于皮肤及其附属器再生的微环境,具有高效精准的特点,可提高人工皮肤仿真性和功能性。生物3D打印的研究与应用近年来发展迅猛,但目前利用生物3D打印完成皮肤及功能附属器的精准构建,在国内外尚属首创,该发明填补了该领域的空白。另外,3D打印微结构对再生的影响研究一直缺乏直观证据,该发明证明适合的3D打印微结构和打印几何参数更有利于细胞分化和形态发生。该成果从时间及空间可控性和直观性角度出发,为明确三维微环境对干细胞分化具有调节作用提供了有力科学证据。此外,干细胞诱导分化在构建过程中也起到不可或缺的作用。利用工程化原理、间充质干细胞诱导分化和生物3D打印等创新技术相接合,势必成为新型人工皮肤研发和制造的趋势。
附图说明
图1为本发明的实施例中利用生物3D打印机打印出带有活性皮肤附属器的皮肤模型的示意图。
其中,图1A为打印过程示意图。图1B为免疫荧光显示打印模块中培养不同时间活细胞和死细胞示意图。图1C为培养14d(天)后打印模块中细胞增殖检测(荧光为Ki-67阳性细胞)示意图。图1D为培养3d(D3)、7d(D7)、14d(D14)后细胞聚团与组织形态示意图,PD+/-:3D打印过程中加或不加诱导蛋白。
图2为本发明的实施例中3D打印皮肤模型中汗腺特异标志物和分泌相关蛋白在转录水平和翻译水平的表达示意图。
其中,图2A为qRT-PCR检测培养3d、7d、14d后3D/PD+和3D/PD-中K8、K18、Fxyd2、Aqp5和ATP1a1的表达示意图。图2B为免疫荧光检测培养3d、7d、14d后3D/PD+和3D/PD-中K8、K18的表达示意图。图2C为培养3d、7d、14d后3D/PD+和3D/PD-中分泌功能蛋白ATP1a1和游离钙浓度检测示意图。
图3为本发明的实施例中2D培养体系中MSC和汗腺细胞中汗腺特异角蛋白和分泌相关蛋白表达的对照示意图。
其中,图3A为2D培养时MSC和S汗腺细胞(SG)中K8/K18的表达示意图。图3B为2D培养MSC和汗腺细胞及汗腺细胞团中ATP1a1表达和游离钙离子检测示意图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式作进一步地说明。
本发明提供的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,该方法包含:
步骤1、采用代表性细胞外基质成分生物材料构建适宜打印细胞的生物墨水。生物墨水指的就是细胞与维生物质即代表性细胞外基质成分生物材料混合而成的液体基质。
细胞包含皮肤附属器细胞、个性化定制所需皮肤细胞,或者可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞;所述的个性化定制所需皮肤细胞包含汗腺细胞、毛囊细胞、皮脂腺细胞、表皮细胞、真皮成纤维细胞、脂肪细胞,以及黑色素细胞等;所述的可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞包含间充质干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞,以及真皮干细胞等。皮肤附属器是胚胎发生中由表皮衍生而来,包括毛、皮脂腺、汗腺、指(趾)甲等。皮肤附属器对维持正常的皮肤功能具有重要作用。
代表性细胞外基质成分生物材料包含明胶、壳聚糖、透明质酸、胶原(collagen)、水凝胶、海藻酸钠,以及合成性生物材料PLGA(poly lactic-co-glycolic acid,聚乳酸-羟基乙酸共聚物)等中的任意一种或多种的混合物。
步骤2、以生理浓度将适宜皮肤附属器生成的各类蛋白因子与生物墨水混合。
各类蛋白因子是包含Cthrc1(胶原三螺旋重复蛋白1)、EGF(表皮细胞生长因子)、BMP4(骨形态发生蛋白4)、BMP5(骨形态发生蛋白5)、bFGF(成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)等的诱导蛋白因子、生长因子以及各种趋化因子。
步骤3、向步骤2所得的混合液中加入细胞并混匀,选择打印参数后通过3D生物打印机,打印出带有活性皮肤附属器的人工皮肤模型。
打印参数包含交联温度和时间,交联溶剂浓度,打印速度以及压力。
步骤3包含:
步骤3.1、将配置好的混合有各类蛋白因子的存储于4℃的生物墨水取出,在37℃充分溶解,将1ml细胞悬液加入20ml生物墨水中,缓慢上下颠倒混匀,动作轻柔,防止混入太多小气泡;在37℃充分溶解是将装有生物墨水的离心管完全浸入37℃的水浴锅中,时间大于或等于1小时。1ml细胞悬液中含有的细胞数大于或等于1.0×107。
步骤3.2、将混匀的生物墨水移入3D生物打印机的打印筒,旋紧打印嘴活塞,使用封口膜封口。
步骤3.3、将打印筒放入10℃水中静置,待生物墨水转变为胶状时,用喷嘴进行打印;优选地,将打印筒放入10℃水中静置30min,待生物墨水转变为胶状时,用310μm喷嘴进行打印。
步骤3.4、选择打印参数为:3D生物打印机的平台温度为10℃,喷头温度为8℃,打印速度为12mm/s,压力为0.1MPa~0.2MPa。
步骤3.5、将打印出的3D打印块用CaCl2溶液进行交联;优选地,将打印出的3D打印块在4℃加入1ml质量浓度为10%的CaCl2溶液作为溶剂,交联10min。
步骤3.6、吸去残留的CaCl2,用完全培养基洗两次,放入培养箱培养。完全培养基(Complete medium)是一种在基本培养基内加入一些富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质,即加入生长因子而制成的各种营养基,是微生物学上常用的一种培养基。基础培养基添加血清、抗生素等物质后,即为完全培养基,也叫(血清)细胞培养基。
步骤4、根据皮肤移植部位的个体化需求,如某些部位需承载出汗功能,有些部位需要毛发等特征,在打印过程中调整细胞数量和各类蛋白因子的浓度等,以及打印参数,可根据皮肤附属器的不同种类做适当调整,选择最佳的构建参数;并在打印后将所得的3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。
下面结合实施例对本发明提供的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法做更进一步描述。
实施例1:利用生物3D打印机打印出带有活性汗腺的皮肤模型。
根据皮肤移植部位的个体化需求,如某些部位需承载出汗功能,有些部位需要毛发等特征,在打印过程中调整细胞数量和各类蛋白因子的浓度等,以及打印参数,可根据皮肤附属器的不同种类做适当调整,选择最佳的构建参数;并在打印后将所得的3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。优选地,采用成体干细胞(人骨髓间充质干细胞MSC)和汗腺微环境诱导所必需的Cthrc1蛋白因子与墨水混合,如果打印同时带有汗腺和毛囊的皮肤需加入10-100ng/ml不等的EGF、BMP4、BMP5,在不同参数条件下(交联温度和时间、溶剂浓度等)完成可诱导MSC重编程再生汗腺的体外三维微环境的打印过程,确定最佳的微环境构建参数,将打印模块置于适宜MSC的培养条件下继续培养。同时将相同浓度的Cthrc1、EGF、BMP4、BMP5等蛋白因子添加至BM-MSCs(bone marrow mesenchymalstem cells,骨髓间充质干细胞)的2D培养体系作为对照。参见图1所示。
具体打印和培养过程如下:
(1)从4℃取出配好的生物墨水(打印汗腺时需加入至少80ng/ml Cthrc1),37℃充分溶解(离心管完全浸入37℃水浴锅至少1小时),将细胞悬液1ml(约1.0-2.0×107MSC细胞,根据所需汗腺数量可在此范围内调整)加入20ml生物墨水,缓慢上下颠倒混匀,动作轻柔,防止混入太多小气泡。
(2)将混好的生物墨水移入打印筒,旋紧打印嘴活塞,封口膜封口。
(3)将打印筒放入10℃水中静置30min,待生物墨水转变为胶状时,装上不同孔径喷嘴进行打印(打印汗腺时尽量选用310μm喷嘴,更有利于汗腺聚集成团后在3D结构中伸展,但也可根据汗腺分布调整选用240μm、420μm喷嘴进行打印)。
(4)打印参数:平台10℃,喷头8℃,12mm/s,压力0.10MPa-0.2MPa。
(5)3D打印块用10%CaCl2 1ml 4℃交联10min。
(6)吸去残留的CaCl2,用完全培养基洗两次,放入培养箱培养。
实施例2:3D打印皮肤模型中MSC定向分化为汗腺组织的检测。
MSC定向分化为汗腺细胞将表达特异角蛋白K8/K18,首先提取3D打印模块中培养3d(天)、7d、14d的细胞进行转录组水平的分析。K8/K18在3D/PD+(即3D打印加诱导蛋白组)中高于3D/PD-(即3D打印未加诱导蛋白组),而且在3D/PD-中表达量与MSC相似,这表明诱导蛋白在汗腺诱导过程中起重要作用且可以用于调控汗腺细胞数量。K8/K18是单层上皮中表达的主要的杂聚中间纤维。通过与2D培养比较,K8/K18表达在3D模块中均高于2D培养体系,这表明3D结构性因素在MSC分化过程中也起重要的协同作用。
免疫荧光结果进一步验证了MSC分化的过程。在3D/PD+中,培养7d后K8/K18开始表达,培养14d后其表达增加;在3D/PD-中,K8/K18始终不表达。通过检测与分泌相关的基因表达可以评估诱导汗腺细胞是否具有发汗和分泌的功能。所有分泌相关的基因Fxyd2,ATP1a1和水通道蛋白Aqp5在3D/PD+中表达最高。这表明3D模块中的细胞间接触可能是细胞聚集促进分泌功能的原因。
如图2所示,3D打印皮肤模型中汗腺特异标志物和分泌相关蛋白在转录水平和翻译水平的表达。A.qRT-PCR检测培养3d、7d、14d后3D/PD+和3D/PD-中K8、K18、Fxyd2、Aqp5和ATP1a1的表达(数据显示用均值±标准差);B.免疫荧光检测培养3d、7d、14d后3D/PD+和3D/PD-中K8、K18的表达(细胞核为DAPI荧光染色,标尺=50μm);C.培养3d、7d、14d后3D/PD+和3D/PD-中分泌功能蛋白ATP1a1和游离钙浓度检测(细胞核为DAPI荧光染色,标尺=50μm)。*p<0.05,3D培养的细胞以MSCs为对照,用Dunnett’s test(Dunnett-t检验)分析。
如图3所示,2D培养体系中MSC和汗腺细胞中汗腺特异角蛋白和分泌相关蛋白表达的对照。A.2D培养时MSC和S汗腺细胞(SG)中K8/K18的表达(细胞核为DAPI荧光染色,标尺=200μm);B.2D培养MSC和汗腺细胞及汗腺细胞团中ATP1a1表达和游离钙离子检测(细胞核为DAPI荧光染色,标尺=50μm)。
本发明提供的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,包含两部分内容:1)、利用3D生物打印机打印出带有活性皮肤附属器的皮肤模型;2)、根据移植部位的个体化需求,在相应位置设计皮肤附属器的分布。旨在提高人工皮肤的仿真性和生物功能性,更好的应用于皮肤缺损创面的移植,能够解决人工皮肤移植后的皮肤功能性附属器的活性及分布控制等技术问题,适用于所有皮肤功能性附件(包含汗腺、毛囊、皮脂腺等)及个性化人工皮肤定制所需的功能性皮肤细胞(黑色素细胞、支撑细胞如脂肪细胞等)的接入及定植,以及加载具有抑制创面炎症反应,促进血管新生及再上皮化等功能性生长因子。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍,但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后,对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此,本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述的方法包含:
步骤1、采用代表性细胞外基质成分生物材料构建适宜打印细胞的生物墨水;
步骤2、以生理浓度将适宜皮肤附属器生成的各类蛋白因子与生物墨水混合;
步骤3、向步骤2所得的混合液中加入细胞并混匀,选择打印参数后通过3D生物打印机,打印出带有活性皮肤附属器的人工皮肤模型;
步骤4、根据皮肤移植部位的个体化需求,调整细胞数量和各类蛋白因子的浓度,以及打印参数,并在打印后将所得的3D人工皮肤模型置于适宜不同附属器生长的培养条件下继续培养。
2.如权利要求1所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述细胞包含皮肤附属器细胞、个性化定制所需皮肤细胞,或者可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞;所述的个性化定制所需皮肤细胞包含汗腺细胞、毛囊细胞、皮脂腺细胞、表皮细胞、真皮成纤维细胞、脂肪细胞,以及黑色素细胞;所述的可以诱导皮肤附属器生成的成体干细胞包含间充质干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞,以及真皮干细胞。
3.如权利要求1所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述的代表性细胞外基质成分生物材料包含明胶、壳聚糖、透明质酸、胶原、水凝胶、海藻酸钠,以及合成性生物材料PLGA中的任意一种或多种的混合物。
4.如权利要求1所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述的各类蛋白因子是包含Cthrc1、EGF、BMP4、BMP5、bFGF、VEGF的诱导蛋白因子、生长因子以及趋化因子。
5.如权利要求1所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述的打印参数包含交联温度和时间,交联溶剂浓度,打印速度以及压力。
6.如权利要求1所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述的步骤3包含:
步骤3.1、将配置好的混合有各类蛋白因子的存储于4℃的生物墨水取出,在37℃充分溶解,将1ml细胞悬液加入20ml生物墨水中,缓慢上下颠倒混匀;
步骤3.2、将混匀的生物墨水移入3D生物打印机的打印筒,旋紧打印嘴活塞,使用封口膜封口;
步骤3.3、将打印筒放入10℃水中静置,待生物墨水转变为胶状时,用喷嘴进行打印;
步骤3.4、选择打印参数为:3D生物打印机的平台温度为10℃,喷头温度为8℃,打印速度为12mm/s,压力为0.1MPa~0.2MPa;
步骤3.5、将打印出的3D打印块用CaCl2溶液进行交联;
步骤3.6、吸去残留的CaCl2,用完全培养基洗两次,放入培养箱培养。
7.如权利要求6所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述的步骤3.1中,在37℃充分溶解是将装有生物墨水的离心管完全浸入37℃的水浴锅中,时间大于或等于1小时。
8.如权利要求6所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述的步骤3.1中,1ml细胞悬液中含有的细胞数大于或等于1.0×107。
9.如权利要求6所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述的步骤3.3中,将打印筒放入10℃水中静置30min,待生物墨水转变为胶状时,用310μm喷嘴进行打印。
10.如权利要求6所述的提高人工皮肤中附属器活性及控制其分布的方法,其特征在于,所述的步骤3.5中,将打印出的3D打印块在4℃加入1ml质量浓度为10%的CaCl2溶液作为溶剂,交联10min。
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