WO2014038599A1 - 人工皮膚組織、人工皮膚モデル及びそれらの製造方法 - Google Patents

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coated
tissue layer
artificial skin
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明石満
松崎典弥
縄野政彰
橋本公二
白方裕司
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国立大学法人大阪大学
株式会社ビーエムティーハイブリッド
国立大学法人愛媛大学
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    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present disclosure relates to an artificial skin tissue, an artificial skin model, and manufacturing methods thereof.
  • Patent Documents 2 and 3 As an alternative to animal experiments, there is an in vitro test using a cultured skin model. Therefore, research on various cultured skins and the like has been conducted (for example, Patent Documents 2 and 3).
  • JP 2012-115254 A Japanese Patent No. 2773058 WO2005 / 087286
  • dendritic cells such as Langerhans cells located in the epidermis layer play a central role.
  • the artificial skin model used for the evaluation includes dendritic cells such as Langerhans cells.
  • the cultured skins of Patent Documents 2 and 3 do not contain dendritic cells such as Langerhans cells, and it cannot be said that the immune response in the skin can be sufficiently evaluated with these cultured skins. For this reason, an artificial skin model including dendritic cells is required.
  • the present invention provides an artificial skin tissue and an artificial skin model containing dendritic cells, and a new method capable of producing them.
  • the present disclosure includes, as one or more embodiments, a dermal tissue layer comprising an extracellular matrix component and a laminated cell; A basal layer containing type IV collagen formed on the dermis tissue layer; An epidermis layer formed on the basal layer, At least one of the dermis tissue layer and the epidermis layer relates to an artificial skin tissue containing dendritic cells.
  • the present disclosure as one or a plurality of embodiments, culturing coated cells whose surface is coated with a coating containing an extracellular matrix component to form a dermal tissue layer in which the coated cells are laminated, Contacting type IV collagen on the dermis tissue layer, forming a basal layer containing type IV collagen on the dermis tissue layer, and arranging epidermis cells on the basal layer to form an epidermis layer; Including The present invention relates to a method for producing an artificial skin tissue, wherein at least one of the dermis tissue layer and the epidermis layer contains dendritic cells.
  • the coated cell having a cell surface coated with a coating containing an extracellular matrix component is cultured to form a dermis tissue layer in which the coated cells are laminated, and the dermis Including contacting a type IV collagen on the tissue layer to form a basal layer containing type IV collagen on the dermis tissue layer, and arranging an epidermis cell on the basal layer to form an epidermis layer.
  • the invention relates to a method for producing an artificial skin model, wherein at least one of the dermis tissue layer and the epidermis layer comprises dendritic cells.
  • the present disclosure includes a dermis tissue layer including extracellular matrix components and laminated cells, a basal layer including type IV collagen formed on the dermis tissue layer, and the basal layer.
  • the present invention relates to an artificial skin model having an epidermis layer formed thereon, wherein at least one of the dermis tissue layer and the epidermis layer contains dendritic cells and is produced by the production method of the present disclosure.
  • an artificial skin tissue containing dendritic cells and a new method capable of producing the same can be provided.
  • a new method capable of manufacturing an artificial skin model including dendritic cells can be provided.
  • FIG. 1A and 1B are examples of confocal laser scanning microscope (CLSM) images of the artificial skin model of Example 1.
  • FIG. 2A to 2D are examples of confocal laser scanning microscope (CLSM) images of the artificial skin model of Example 2.
  • FIG. 3 is an example of a graph showing the relationship between the amount of LPS added and the amount of IL-6 produced from the dermis tissue layer.
  • FIG. 4 is an example of a graph showing the relationship between the amount of LPS added and the amount of IL-6 produced from the dermis tissue layer.
  • FIG. 5 is an example of a confocal laser scanning microscope (CLSM) image 30 hours after LPS addition.
  • type IV collagen (hereinafter also referred to as “collagen IV”) is formed between a dermis tissue layer and an epidermis layer formed by culturing coated cells whose surface is coated with a coating containing an extracellular matrix component. ) Based on the knowledge that the laminated structure of the dermis tissue layer is excellent in long-term stability and an artificial skin model into which dendritic cells are introduced can be produced.
  • artificial skin tissue refers to a structure of human skin, particularly a structure including an epidermis layer and a dermis tissue layer, and a reproduction or imitation of the environment.
  • the artificial skin tissue of the present disclosure includes a dermis tissue layer including an extracellular matrix component and a layered cell, a basal layer including collagen IV formed on the dermis tissue layer, and a basal layer. And a skin layer formed on the layer, and at least one of the dermis tissue layer and the skin layer contains dendritic cells.
  • the artificial skin tissue of the present disclosure is preferably an experiment or test tool that can be used for drug evaluation such as a drug efficacy test, a pharmacological test, and a safety test on the skin of the test substance, It can contain what can be a transplant material.
  • an artificial skin model refers to a reproduction or imitation of the structure of human skin, particularly a structure including the epidermis layer and the dermis tissue layer and its environment.
  • an artificial skin model of the present disclosure includes a dermis tissue layer including an extracellular matrix component and cells laminated, a basal layer including collagen IV formed on the dermis tissue layer, and a basal layer. And a skin layer formed on the layer, and at least one of the dermis tissue layer and the skin layer contains dendritic cells.
  • the artificial skin model is preferably an experiment or test tool that can be used for drug evaluation such as a drug efficacy test, a pharmacological test, and a safety test on the skin of a test substance.
  • drug evaluation such as a drug efficacy test, a pharmacological test, and a safety test on the skin of a test substance.
  • an artificial skin model manufactured by the manufacturing method of the present disclosure unless otherwise specified, “artificial skin tissue” and “artificial skin model” are collectively referred to as “artificial skin model”.
  • dendritic cells include, in one or more embodiments, dermal dendritic cells, Langerhans cells, and the like, and may include these progenitor cells.
  • the artificial skin model of the present disclosure may include a tissue appendage organ included in the skin and / or a cell constituting the tissue in addition to the dendritic cell.
  • tissue appendages include blood vessels, lymph vessels, sebaceous glands, sweat glands, hairs, and hair follicles.
  • cells constituting tissue appendages include vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, immune cells other than dendritic cells, melanocytes, hair follicle cells, hair papilla cells, sebaceous gland cells, and adipocytes.
  • the artificial skin model of this indication may contain the cell other than the above in one or some embodiment. Examples of other cells include cancer cells and cells that exist or can exist around cancer.
  • coated cell refers to a cell containing a coating containing extracellular matrix components and cells, and the cell surface of which is covered by the coating.
  • the cells to be coated are not particularly limited, and one or more embodiments include fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, neurons, tissue stem cells, embryonic stem cells, and Adhesive cells such as immune cells can be mentioned.
  • the cell may be a human-derived cell or a non-human-derived cell. One type of cell may be used, or two or more types may be used.
  • the coated cells can be prepared by the method disclosed in JP2012-115254A.
  • the “dermal tissue layer” refers to an assembly of cells and extracellular matrix components, in which cells are laminated three-dimensionally, preferably the dermis form of the skin And / or something similar or mimicking the environment.
  • the dermis tissue layer may contain the above-mentioned tissue appendages and / or cells constituting the tissue appendages.
  • the method for producing an artificial skin model of the present disclosure includes culturing coated cells having a cell surface coated with a coating containing an extracellular matrix component to form a dermis tissue layer in which the coated cells are laminated, and the dermis tissue Contacting type IV collagen on the layer to form a basal layer containing type IV collagen on the dermis tissue layer, and arranging epidermal cells on the basal layer to form an epidermis layer.
  • an artificial skin model including a dermis tissue layer and an epidermis layer capable of measuring percutaneous electrical resistance (TER) can be manufactured.
  • the barrier function of the skin (skin layer) can be evaluated in a state closer to in vivo.
  • the mechanism by which the artificial skin model manufactured by the manufacturing method of the present invention can measure TER is not clear, but is estimated as follows. That is, by inducing differentiation of epidermal cells on the dermal tissue layer formed by culturing coated cells, the denseness in the epidermal layer is improved, adjacent epidermal cells are in close contact with each other, and between them It is thought that a tight junction is formed in the surface.
  • the present invention is not limited to these mechanisms.
  • an artificial skin model manufactured by the method for manufacturing an artificial skin model of the present disclosure includes a pair and a junction formed between cells of the epidermis layer, and a dendritic shape in the epidermis layer and / or dermis tissue layer. Since it contains cells, it is possible to provide an artificial skin model that enables drug evaluation and / or immune response evaluation in a state closer to that of actual skin.
  • the dermis tissue layer is formed by culturing coated cells whose surface is coated with a coating containing an extracellular matrix component. By culturing coated cells whose surface is coated with a coating containing an extracellular matrix component, the coated cells are accumulated, and further, adjacent coated cells adhere together via a coating containing an extracellular matrix component, A dermal tissue layer in which coated cells are laminated in three dimensions can be formed.
  • the coated cell includes a cell and a coating containing an extracellular matrix component that covers the cell.
  • extracellular matrix component refers to an in vivo body that fills the space outside the cell in the living body and performs a function such as a skeletal role, a role of providing a scaffold, and a role of holding a biological factor.
  • the extracellular matrix component may further contain a substance that can perform functions such as a skeletal role, a role of providing a scaffold, and a role of retaining a biological factor in in vitro cell culture.
  • the coating containing the extracellular matrix component preferably includes a film containing the substance A and a film containing the substance B that interacts with the substance A.
  • a protein or polymer having an RGD sequence hereinafter also referred to as “substance having an RGD sequence”
  • a protein or polymer having the RGD sequence are used as a combination of the substance A and the substance B.
  • a combination with a protein or polymer that interacts with the protein hereeinafter also referred to as “substance having interaction”
  • a protein or polymer that has a positive charge hereinafter also referred to as “substance with a positive charge”.
  • a protein or polymer having a negative charge hereinafter also referred to as “substance having a negative charge”.
  • the thickness of the coating containing an extracellular matrix component is preferably 1 nm to 1 ⁇ 10 3 nm, or 2 nm to 1 ⁇ 10 2 nm, and the dermis tissue layer in which the coated cells are laminated more densely Is more preferably 3 nm to 1 ⁇ 10 2 nm.
  • the thickness of the coating containing the extracellular matrix component can be appropriately controlled by, for example, the number of membranes constituting the coating.
  • the coating containing the extracellular matrix component is not particularly limited, and may be a single layer, for example, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 layers or more.
  • the thickness of a film can be calculated
  • Culturing the coated cells is performed, for example, by seeding the coated cells on a substrate and incubating for a certain time. By this incubation, the adjacent coated cells adhere to each other through the coating containing the extracellular matrix component, and the coated cells are laminated in three dimensions, and the interval between the adjacent coated cells becomes close, and the dense structure is formed. A dermal tissue layer is formed.
  • Incubation conditions are not particularly limited and can be appropriately determined depending on the cells.
  • the incubation temperature is 4-60 ° C., 20-40 ° C., or 30-37 ° C. in one or more embodiments. Incubation times are 1 hour to 168 hours, 3 hours to 24 hours, or 3 hours to 12 hours in one or more embodiments.
  • the medium is not particularly limited and can be appropriately determined depending on the cell.
  • Eagle's MEM medium Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RDMI, GlutaMax medium, or serum-free medium Etc.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle medium
  • MEM Modified Eagle medium
  • Minimum Essential medium RDMI
  • GlutaMax medium or serum-free medium Etc.
  • the density of the coated cells at the time of seeding can be appropriately determined according to, for example, the number of cell layers contained in the dermis tissue layer to be formed. In one or a plurality of embodiments, 1 ⁇ 10 2 cells / cm 3 to 1 ⁇ 10 6 9 pieces / cm 3 , 1 ⁇ 10 4 pieces / cm 3 to 1 ⁇ 10 8 pieces / cm 3 , or 1 ⁇ 10 5 pieces / cm 3 to 1 ⁇ 10 7 pieces / cm 3 .
  • the culture of the coated cells is preferably carried out on a membrane filter, more preferably a culture plate equipped with a membrane filter, more preferably, because it facilitates preparation and handling of gas-liquid culture for induction of epidermal cell differentiation.
  • a culture plate having a housing part and a base part, the base part being a membrane filter.
  • the housing part is preferably transparent.
  • a commercial item may be used for this culture plate. Examples of commercially available products include Transwell (registered trademark), Cell Culture Insert (trade name), and the like.
  • the pore size of the membrane filter is not particularly limited as long as the cultured cells can be retained on the membrane filter. In one or a plurality of embodiments, the pore size is 0.1 ⁇ m to 2 ⁇ m, and other groups 0.4 ⁇ m to 1.0 ⁇ m. It is. Examples of the material of the membrane include polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, or polytetrafluoroethylene (PTFE).
  • PET polyethylene terephthalate
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the dermal tissue layer thus formed is, for example, after the formation of the dermal tissue layer, for example, 2 weeks or more, preferably 3 weeks or more, more preferably 4 weeks or more, still more preferably 5 weeks or more, and even more preferably. Can retain the laminated structure of cells even when stored for 6 weeks or more, and can be excellent in long-term stability.
  • the formation of the dermis tissue layer may be performed once or may be repeated a plurality of times. By repeating the treatment a plurality of times, a multi-layered dermis tissue layer in which more cells are laminated can be formed.
  • the thickness of the dermis tissue layer and the number of cells stacked in the dermis tissue layer are not particularly limited.
  • the number of cells stacked in the dermis tissue layer is 3 layers or more, 5 layers or more from the viewpoint of exerting properties and / or functions equivalent to those of living tissues such as humans. , 6 or more layers, 10 or more layers, or 15 or more layers are preferable.
  • the upper limit of the number of cells to be stacked is not particularly limited, but in one or more embodiments, it is 100 layers or less, 50 layers or less, 40 layers or less, 30 layers or less, or 20 layers or less.
  • the dermis tissue layer is formed by culturing coated cells and dendritic cells whose surfaces are coated with a coating containing an extracellular matrix component. It may include.
  • the basal layer can be produced by bringing collagen IV into contact with the dermis tissue layer.
  • the contact with collagen IV can be performed by applying, dipping, dropping, or spraying a collagen IV-containing liquid onto the base layer.
  • the collagen IV-containing liquid may contain collagen IV, and in one or a plurality of embodiments, contains collagen IV and a solvent or dispersion medium (hereinafter also referred to as “solvent”).
  • a solvent or dispersion medium hereinafter also referred to as “solvent”.
  • the content of collagen IV in the collagen IV-containing liquid is 0.0001 to 1% by mass, 0.01 to 0.5% by mass, or 0.02 to 0.1% by mass. preferable.
  • the solvent include an aqueous solvent such as water, phosphate buffered saline (PBS), and a buffer solution in one or more embodiments.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the buffer examples include Tris buffer such as Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, citrate-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, Britton-Robinson buffer Or GTA buffer.
  • Tris buffer such as Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, citrate-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, Britton-Robinson buffer Or GTA buffer.
  • the pH of the solvent is not particularly limited, and in one or more embodiments, 3 to 11, 6 to 8, or 7.2 to 7.4 is preferable.
  • the basal layer may contain laminin in one or more embodiments.
  • the basal layer includes collagen IV and laminin, in one or more embodiments, it is preferable that the collagen layer and laminin are alternately contacted with the dermal tissue layer.
  • the epidermal layer can be formed by culturing epidermal cells on the basal layer and then inducing differentiation of the epidermal cells by gas-liquid culture.
  • epidermal cells for example, epidermal keratinocytes can be used.
  • epidermal cells For culturing epidermal cells, for example, it is preferable to inoculate epidermal cells on a dermis tissue layer and incubate for a certain period of time.
  • the epidermal cells may be epidermal cells whose surface is coated with a coating containing an extracellular matrix component, or epidermal cells whose surface is not coated with a coating containing an extracellular matrix component. Good. From the viewpoint of easy operation, it is preferable to use epidermal cells whose surface is not covered with a coating containing an extracellular matrix component.
  • the dermis tissue layer is first coated with a coating containing an extracellular matrix component by the method disclosed in JP2012-115254A.
  • Incubation conditions are not particularly limited and can be appropriately determined depending on the cells.
  • the incubation temperature is 4-60 ° C., 20-40 ° C., or 30-37 ° C. in one or more embodiments.
  • the incubation time is 1 to 3 days, or 1 to 2 days in one or more embodiments.
  • the medium is not particularly limited and can be appropriately determined according to the cell, and a medium used for the growth of epidermal cells is preferable.
  • Examples of the medium used for the growth of epidermal cells include a serum-free medium.
  • the serum-free medium for example, MCDB153 medium, EpiLife (registered trademark) medium, medium in which the amino acid composition of these mediums is modified, or Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) and Ham F-12 medium in a predetermined ratio And the like.
  • the medium in which the amino acid composition of the MCDB153 medium is modified includes the amino acid ratio of MCDB153 medium: L-aspartic acid (salt) 1.5 to 4 times, L-isoleucine (salt) 22 to 26 times, L-glutamine (Salt) 1.5-3 times, L-glutamic acid (salt) 1.1-2 times, L-tyrosine (salt) 3-6 times, L-tryptophan (salt) 5-7 times, L -0.4 to 0.7 times valine (salt), 2 to 4 times L-histidine (salt), 0.4 to 0.7 times L-proline (salt), L-phenylalanine (salt) 4-7 times, L-methionine (salt) 4-6 times, L-lysine (salt) 1.1-2 times, and the content of L-glutamine (salt) in the total amino acid is 65 wt.
  • MCDB153 modified media etc. made to be at least% (for example, JP-A-2005-269923).
  • the medium may contain, for example, salts or vitamins.
  • the salts include potassium chloride, sodium chloride, magnesium chloride, and disodium monohydrogen phosphate.
  • vitamins include choline chloride, cyanocobalamin, nicotinamide, D-pantothenic acid or a salt thereof, pyridoxine hydrochloride or pyridoxal hydrochloride, D-biotin, thiamine hydrochloride, riboflavin, folic acid, DL- ⁇ -lipoic acid, or myo- And inositol.
  • the density of epidermal cells at the time of seeding is 1 ⁇ 10 2 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells / cm 2 , 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 8 cells / cm 2 , or 1 ⁇ 10 5 pieces / cm 2 to 1 ⁇ 10 7 pieces / cm 2 .
  • the gas-liquid culture is performed by exchanging the medium with a keratinized medium and then incubating the epidermal cell surface exposed to air.
  • the incubation temperature is, for example, 4 to 60 ° C., preferably 20 to 40 ° C., more preferably 30 to 37 ° C.
  • the incubation time is, for example, 1 day to 40 days, preferably 5 days to 30 days, more preferably 7 days to 10 days.
  • the keratinized medium for example, a medium obtained by adding calcium and / or fetal calf serum to the medium used for the growth of the epidermal cells can be used.
  • the calcium concentration of the medium is preferably about 0.4 mM to 2.0 mM, for example.
  • the dermis tissue layer and / or epidermis layer includes dendritic cells.
  • dendritic cells are cultured by mixing with coated cells (for example, fibroblasts, etc.) for constituting the dermis tissue layer or forming dermis tissue layer. You may arrange
  • an epidermis layer it may be mixed and cultured with epidermal cells, or may be placed and cultured between cell layers in which epidermal cells are laminated.
  • Dendritic cells may be coated with a coating comprising an extracellular matrix component in one or more embodiments.
  • Density of dendritic cells at the time of seeding can be appropriately determined according to, for example, the number of cell layers contained in the dermis tissue layer and / or epidermis layer.
  • the density of the dendritic cells is 3 / cm 2 to 200000 / cm 2 , 20000 / cm 2 to 100,000 / cm 2 in one or more embodiments. Or 40000 / cm 2 to 80000 / cm 2 .
  • the ratio of dendritic cells to coated cells is, in one or more embodiments, 1: 99-99.
  • the culture conditions can be the same as the formation of the dermis tissue layer.
  • the density of the dendritic cells is 3 cells / cm 2 to 200000 cells / cm 2 , 20000 cells / cm 2 to 100000 cells / cm 2 in one or more embodiments, Or 40,000 pieces / cm 2 to 80,000 pieces / cm 2 . It is.
  • the ratio of dendritic cells to epidermal cells is, in one or more embodiments, 1: 99-99: 1, 10: 90-90. : 10, or 10:90 to 50:50.
  • the method for manufacturing an artificial skin model of the present disclosure may include forming a tissue appendage organ in the dermis tissue layer.
  • the cells constituting the tissue appendage are mixed with the coated cells (for example, fibroblasts, etc.) for constituting the dermis tissue layer and cultured.
  • the cells constituting the tissue appendage can be cultured by placing them between the cell layers on which the coated cells for constituting the dermis tissue layer are laminated.
  • the cells constituting the tissue appendage between the cell layers are arranged, for example, by placing the cells constituting the tissue appendage on the cell layer on which the coated cells are laminated and culturing for a predetermined period as necessary. This can be done by placing coated cells on top. Therefore, in the method of manufacturing an artificial skin model of the present disclosure, in the formation of the dermis tissue layer, the coated cell is cultured to form a cell layer in which the coated cell is laminated, and the tissue appendage is configured on the cell layer. Arranging the cells, and arranging the coated cells on the cell layer on which the cells constituting the tissue appendage are arranged, and culturing to form a cell layer on which the coated cells are laminated may be included.
  • the formation of the tissue appendage is a cell layer in which cells constituting the tissue appendage are coated with cells. It is preferable to carry out by culturing in a state sandwiched between. As described above, by culturing the cells constituting the tissue appendage while being sandwiched between the cell layers, a dense vascular network or lymphatic network closer to the human body can be formed.
  • vascular endothelial cells may be used as cells constituting the tissue appendage.
  • the cells constituting the tissue appendage are lymphatic endothelium. Cells can be used.
  • the cells constituting the tissue appendages are as described above.
  • stem cells and / or progenitor cells of the cells constituting the tissue appendage may be used.
  • the cells that make up the tissue appendages may be the same as the coated cells used to form the dermis tissue layer, but those with a coating containing an extracellular matrix component on the cell surface may be used. Further, it may be used as it is without forming a film. From the viewpoint of improving working efficiency, a cell having a coating containing an extracellular matrix component on the cell surface is preferred.
  • the number of cells to be seeded, the culture conditions, and the like can be appropriately determined according to the cells constituting the tissue appendage. Formation of the coating containing the extracellular matrix component can be performed in the same manner as the above-described coated cells.
  • the method for producing an artificial skin model of the present disclosure may include producing coated cells.
  • Coated cells can be prepared by contacting the cells with extracellular matrix components, improving adhesion between adjacent coated cells in the dermal tissue layer, and obtaining a dermal tissue layer in which the coated cells are more closely laminated. For this reason, in one or a plurality of embodiments, it is preferable to prepare by alternately contacting the substance A and the substance B.
  • the combination of the substance A and the substance B is a combination of a substance having an interaction, which is also called a substance having an RGD sequence, or a combination of a substance having a positive charge and a substance having a negative charge. Is mentioned.
  • a substance having an RGD sequence refers to a protein or polymer having an “Arg-Gly-Asp” (RGD) sequence, which is an amino acid sequence responsible for cell adhesion activity.
  • RGD Arg-Gly-Asp
  • having an RGD sequence may originally have an RGD sequence, or may have a RGD sequence chemically bound thereto.
  • the substance having the RGD sequence is preferably biodegradable.
  • Examples of the protein having an RGD sequence include conventionally known adhesive proteins or water-soluble proteins having an RGD sequence.
  • the adhesive protein include fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin, and collagen.
  • Examples of the water-soluble protein having an RGD sequence include collagen, gelatin, albumin, globulin, proteoglycan, enzyme, or antibody to which the RGD sequence is bound.
  • polymers having an RGD sequence examples include naturally derived polymers and synthetic polymers.
  • examples of the naturally-derived polymer having an RGD sequence include water-soluble polypeptides, low molecular peptides, polyamino acids such as ⁇ -polylysine or ⁇ -polylysine, and sugars such as chitin or chitosan.
  • examples of the synthetic polymer having an RGD sequence include polymers or copolymers having an RGD sequence such as a linear type, graft type, comb type, dendritic type, or star type.
  • polystyrene resin examples include polyurethane, polycarbonate, polyamide, or a copolymer thereof, polyester, poly (N-isopropylacrylamide-co-polyacrylic acid), polyamidoamine dendrimer, polyethylene oxide, poly ⁇ -caprolactam. , Polyacrylamide, or poly (methyl methacrylate- ⁇ -polyoxyethylene methacrylate).
  • the substance having the RGD sequence is preferably fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin, polylysine, elastin, collagen to which the RGD sequence is bound, gelatin, chitin or chitosan to which the RGD sequence is bound, and more preferably fibronectin.
  • the substance that interacts refers to a protein or polymer that interacts with a substance having an RGD sequence.
  • “interact” means, for example, electrostatic interaction, hydrophobic interaction, hydrogen bond, charge transfer interaction, covalent bond formation, specific interaction between proteins, and / or van der Waals. It means that a substance that interacts with a substance having an RGD sequence chemically and / or physically by force or the like is close enough to be able to bind, adhere, adsorb, or exchange electrons.
  • the interacting substance is preferably biodegradable.
  • Examples of the protein that interacts with a substance having an RGD sequence include collagen, gelatin, proteoglycan, integrin, enzyme, or antibody.
  • Examples of the polymer that interacts with a substance having an RGD sequence include a naturally-derived polymer or a synthetic polymer.
  • Examples of naturally-derived polymers that interact with a substance having an RGD sequence include water-soluble polypeptides, low-molecular peptides, polyamino acids, sugars such as elastin, heparin, heparan sulfate or dextran sulfate, and hyaluronic acid. .
  • polyamino acid examples include polylysine such as ⁇ -polylysine or ⁇ -polylysine, polyglutamic acid, or polyaspartic acid.
  • synthetic polymer that interacts with a substance having an RGD sequence examples include a polymer or copolymer having an RGD sequence such as a linear type, graft type, comb type, dendritic type, or star type.
  • polystyrene resin examples include polyurethane, polyamide, polycarbonate, or a copolymer thereof, polyester, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyethylene glycol-graft-polyacrylic acid, poly (N-isopropylacrylamide-co -Polyacrylic acid), polyamidoamine dendrimer, polyethylene oxide, poly ⁇ -caprolactam, polyacrylamide, poly (methyl methacrylate- ⁇ -polyoxymethacrylate) and the like.
  • polyester examples include polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyethylene glycol-graft-polyacrylic acid, poly (N-isopropylacrylamide-co -Polyacrylic acid), polyamidoamine dendrimer, polyethylene oxide, poly ⁇ -caprolactam, polyacrylamide, poly (methyl methacrylate- ⁇ -polyoxymethacrylate) and the like.
  • the interacting substance is preferably gelatin, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, globulin, albumin, polyglutamic acid, collagen, or elastin, more preferably gelatin, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, or collagen, More preferred is gelatin, dextran sulfate, heparin, or hyaluronic acid.
  • the combination of the substance having the RGD sequence and the substance that interacts is not particularly limited as long as it is a combination of different substances that interact with each other, and either one is a polymer or protein containing the RGD sequence, and the other is this. It may be a polymer or protein that interacts with.
  • Examples of the combination of the substance having an RGD sequence and the substance having an interaction include, for example, fibronectin and gelatin, fibronectin and ⁇ -polylysine, fibronectin and hyaluronic acid, fibronectin and dextran sulfate, fibronectin and heparin, fibronectin and collagen, laminin and gelatin Laminin and collagen, polylysine and elastin, vitronectin and collagen, RGD-bound collagen or RGD-bound gelatin and collagen or gelatin, and the like.
  • fibronectin and gelatin fibronectin and ⁇ -polylysine, fibronectin and hyaluronic acid, fibronectin and dextran sulfate, fibronectin and heparin, or laminin and gelatin are preferable, and fibronectin and gelatin are more preferable.
  • sequence, and the substance which has interaction may be one each, respectively, and may use 2 or more types together in the range which shows interaction, respectively.
  • a substance having a positive charge refers to a protein or polymer having a positive charge.
  • a protein having a positive charge for example, a water-soluble protein is preferable.
  • the water-soluble protein include basic collagen, basic gelatin, lysozyme, cytochrome c, peroxidase, or myoglobin.
  • the positively charged polymer include naturally-derived polymers and synthetic polymers. Examples of naturally occurring polymers include water-soluble polypeptides, low molecular peptides, polyamino acids, sugars such as chitin or chitosan, and the like.
  • polyamino acid examples include polylysine such as poly ( ⁇ -lysine) and poly ( ⁇ -lysine), polyarginine, and polyhistidine.
  • synthetic polymer examples include linear polymers, graft polymers, comb polymers, dendritic polymers, and star polymers or copolymers.
  • polymer or copolymer examples include polyurethane, polyamide, polycarbonate, or a copolymer thereof, polyester, polydiallyldimethylammonium chloride (PDDA), polyallylamine hydrochloride, polyethyleneimine, polyvinylamine, or polyamideamine dendrimer. Etc.
  • a substance having a negative charge refers to a protein or polymer having a negative charge.
  • a protein having a negative charge for example, a water-soluble protein is preferable.
  • the water-soluble protein include acidic collagen, acidic gelatin, albumin, globulin, catalase, ⁇ -lactoglobulin, thyroglobulin, ⁇ -lactalbumin, or egg white albumin.
  • the negatively charged polymer include naturally derived polymers and synthetic polymers. Examples of naturally derived polymers include water-soluble polypeptides, low molecular peptides, polyamino acids such as poly ( ⁇ -lysine), dextran sulfate, and the like.
  • Examples of the synthetic polymer include linear polymers, graft polymers, comb polymers, dendritic polymers, and star polymers or copolymers.
  • Examples of the polymer or copolymer include polyurethane, polyamide, polycarbonate, and copolymers thereof, polyester, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide methylpropane sulfonic acid, and terminal carboxylated polyethylene glycol. , Polydiallyldimethylammonium salt, polyallylamine salt, polyethyleneimine, polyvinylamine, or polyamidoamine dendrimer.
  • Examples of the combination of the positively charged substance and the negatively charged substance include ⁇ -polylysine salt and polysulfonate, ⁇ -polylysine and polysulfonate, chitosan and dextran sulfate, polyallylamine hydrochloride and polystyrene sulfone.
  • Examples of the polysulfonate include sodium polysulfonate (PSS).
  • the substance having a positive charge and the substance having a negative charge may each be one kind, or two or more kinds may be used in combination within a range showing an interaction.
  • cells are first brought into contact with a solution A containing a substance having an RGD sequence, and then contacted with a solution B containing a substance having an interaction with the substance having an RGD sequence.
  • a solution A containing a substance having an RGD sequence a substance having an RGD sequence
  • a solution B containing a substance having an interaction with the substance having an RGD sequence The method will be described.
  • the cells are brought into contact with the solution A.
  • a film containing a substance having an RGD sequence is formed on the cell surface, and the cell surface is covered with a film containing a substance having an RGD sequence.
  • the contact between the cells and the solution A can be performed, for example, by applying or adding the solution A to the cells, immersing the cells in the solution A, dropping or spraying the solution A on the cells, or the like.
  • the contact condition can be appropriately determined according to a contact method, a substance having an RGD sequence and / or a cell type, a concentration of a contained liquid, and the like.
  • the contact time is preferably 30 seconds to 24 hours, 1 minute to 60 minutes, 1 minute to 15 minutes, 1 minute to 10 minutes, or 1 minute to 5 minutes.
  • the ambient temperature at the time of contact and / or the temperature of the contained liquid is preferably 4 to 60 ° C., 20 to 40 ° C., or 30 to 37 ° C.
  • Solution A only needs to contain a substance having an RGD sequence, and preferably contains a substance having an RGD sequence and a solvent or dispersion medium (hereinafter also referred to as “solvent”).
  • solvent a solvent or dispersion medium
  • the content of the substance having an RGD sequence in the solution A is 0.0001 to 1% by mass, 0.01 to 0.5% by mass, or 0.02 to 0.1% by mass.
  • the solvent include an aqueous solvent such as water, phosphate buffered saline (PBS), and a buffer solution in one or more embodiments.
  • the buffer examples include Tris buffer such as Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, citrate-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, Britton-Robinson buffer Or GTA buffer.
  • Tris buffer such as Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, citrate-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, Britton-Robinson buffer Or GTA buffer.
  • the pH of the solvent is not particularly limited, and in one or more embodiments, 3 to 11, 6 to 8, or 7.2 to 7.4 is preferable.
  • the solution A may further contain a salt, a cell growth factor, a cytokine, a chemokine, a hormone, a bioactive peptide, a pharmaceutical composition, or the like.
  • the pharmaceutical composition part include a therapeutic agent, preventive agent, inhibitor, antibacterial agent, or anti-inflammatory agent for diseases.
  • the salt include sodium chloride, calcium chloride, sodium hydrogen carbonate, sodium acetate, sodium citrate, potassium chloride, sodium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, sodium succinate and the like.
  • One kind of salt may be contained, or two or more kinds of salts may be contained.
  • Both the solution A and the solution B may contain a salt, or one of them may contain a salt.
  • the salt concentration in the solution A is not particularly limited, but is, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 6 M to 2M, preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M to 1M, more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M to 0.05M. It is.
  • the removal can be performed by, for example, centrifugation or filtration.
  • the removal by centrifugation can be performed, for example, by centrifuging in a state where the cells are dispersed in the solution A, and then removing the supernatant. Centrifugation conditions can be appropriately determined depending on the type of cells, the concentration of cells, and the composition of inclusions contained in the solution A.
  • Washing can be performed, for example, by centrifugation or filtration. Washing by centrifugation can be performed, for example, by adding a solvent to the cells from which the supernatant has been removed, and performing centrifugation and removal of the supernatant.
  • the solvent used for washing is preferably the same as the solvent of the solution A.
  • the cell covered with the membrane containing the substance having the RGD sequence is brought into contact with the solution B.
  • a membrane containing a substance that interacts with the surface of the membrane containing the substance having the RGD sequence is formed, and the cell surface covered with the membrane containing the substance having the RGD sequence is covered with the membrane containing the substance that interacts.
  • the contact with the solution B can be performed in the same manner as the contact with the solution A, except that a substance that interacts instead of the substance having the RGD sequence is used.
  • the extracellular surface in which the membrane containing the substance having the GD sequence and the membrane containing the interacting substance are alternately laminated on the entire cell surface A coating containing a matrix component can be formed.
  • the number of times that the solution A or the solution B is brought into contact with the cells can be appropriately determined according to, for example, the thickness of the coating containing the extracellular matrix component to be formed.
  • an artificial skin model of the present disclosure relates to an artificial skin model manufactured by the manufacturing method of the present disclosure.
  • An artificial skin model of the present disclosure includes a dermis tissue layer including an extracellular matrix component and laminated cells, a basal layer including type IV collagen formed on the dermis tissue layer, and formed on the basal layer. And at least one of the dermis tissue layer and the epidermis layer contains dendritic cells.
  • the artificial skin model of the present disclosure it is possible to evaluate, for example, a drug efficacy test, an immune response, a pharmacological test, and a safety test of a test substance in an environment close to actual skin.
  • the artificial skin model of this indication can also be used as a coating
  • a tight junction is formed between adjacent epidermal cells.
  • the barrier function of the skin layer by measuring TER can be evaluated.
  • the artificial skin model of the present disclosure preferably includes a tissue appendage formed in the dermis tissue layer.
  • the number of cells laminated in the dermis tissue layer is not particularly limited, and is 3 layers or more, 5 layers or more, 6 layers or more, or 10 layers or more from the viewpoint of exerting properties and functions equivalent to human skin. It is.
  • the upper limit of the number of cells to be stacked is not particularly limited, and is, for example, 100 layers or less, 50 layers or less, 40 layers or less, 30 layers or less, or 20 layers or less.
  • the present invention relates to a method for evaluating irritation to a skin of a test substance using the artificial skin model of the present disclosure.
  • the test substance can be evaluated in an environment close to actual skin as compared with the conventional method.
  • the evaluation method of the present disclosure can be an extremely useful tool in, for example, the evaluation of the dynamics of drugs of various molecular weights in the creation (screening) of new drugs and the development in the development of cosmetics and quasi drugs.
  • the evaluation method of the present disclosure can be performed, for example, by bringing a test substance into contact with the artificial skin model and measuring an immune response due to contact with the test substance.
  • the response can be measured, for example, by measuring TER.
  • the test substance refers to a substance to be evaluated, and examples thereof include inorganic compounds and organic compounds.
  • the present invention relates to a test substance irritation evaluation kit.
  • the evaluation kit of the present disclosure includes the artificial skin model of the present disclosure. According to the evaluation kit of the present disclosure, for example, the evaluation method of the present disclosure can be performed more simply.
  • the evaluation kit may further include a product including at least one of a reagent, a material, a tool, and a device used for a predetermined inspection, and an instruction (instruction manual) for the evaluation.
  • the present invention relates to an artificial skin model manufacturing kit.
  • the kit for producing an artificial skin model of the present disclosure preferably includes, for example, a reagent used for forming a film containing an extracellular matrix component and an instruction describing a method for producing the artificial skin model of the present disclosure.
  • the artificial skin model of the present disclosure can be manufactured more easily.
  • the artificial skin model manufacturing kit of the present disclosure may further include a base material on which a dermis tissue layer is formed.
  • a base material on which a dermis tissue layer is formed for example, the artificial skin model of the present disclosure can be manufactured more easily and in a short time, and further, the time until the tissue appendage is formed can be increased. Can be shortened.
  • a dermis tissue layer comprising an extracellular matrix component and laminated cells; A basal layer containing type IV collagen formed on the dermis tissue layer; An epidermis layer formed on the basal layer, An artificial skin tissue, wherein at least one of the dermis tissue layer and the epidermis layer contains dendritic cells.
  • [A2] culturing coated cells having a cell surface coated with a coating containing an extracellular matrix component to form a dermal tissue layer in which the coated cells are laminated; Contacting type IV collagen on the dermis tissue layer, forming a basal layer containing type IV collagen on the dermis tissue layer, and arranging epidermis cells on the basal layer to form an epidermis layer; Including A method for producing an artificial skin tissue, wherein at least one of the dermis tissue layer and the epidermis layer contains dendritic cells.
  • the production method according to [A2], wherein the formation of the dermis tissue layer includes culturing the coated cells and dendritic cells whose surfaces are coated with a coating containing an extracellular matrix component.
  • [A4] The production method according to [A2] or [A3], wherein the formation of the epidermis layer includes arranging epidermal cells and dendritic cells on the basal layer.
  • Formation of the basal layer includes contacting type IV collagen or laminin with the dermis tissue layer such that a type IV collagen layer and a laminin layer are alternately formed on the dermis tissue layer.
  • [A6] The production method according to any one of [A2] to [A5], wherein the coated cell includes a fibroblast whose surface is coated with a coating containing an extracellular matrix component.
  • the artificial skin tissue according to [A8], wherein the ratio of dendritic cells in the dermis tissue layer to cells other than dendritic cells forming the dermis tissue layer is 1:99 to 50:50.
  • [B1] culturing a coated cell having a cell surface coated with a coating containing an extracellular matrix component to form a dermis tissue layer in which the coated cell is laminated; Contacting type IV collagen on the dermis tissue layer, forming a basal layer containing type IV collagen on the dermis tissue layer, and arranging epidermis cells on the basal layer to form an epidermis layer; Including A method for producing an artificial skin model, wherein at least one of the dermis tissue layer and the epidermis layer comprises dendritic cells.
  • [B2] The production method according to [B1], wherein the formation of the dermis tissue layer includes culturing the coated cells and dendritic cells whose surfaces are coated with a coating containing an extracellular matrix component.
  • [B3] The production method according to [B1] or [B2], wherein the formation of the epidermis layer includes arranging epidermal cells and dendritic cells on the basal layer.
  • Formation of the basal layer includes contacting type IV collagen or laminin with the dermis tissue layer such that a type IV collagen layer and a laminin layer are alternately formed on the dermis tissue layer.
  • [B5] The production method according to any one of [B1] to [B4], wherein the coated cell is a fibroblast whose surface is coated with a coating containing an extracellular matrix component.
  • QCM quartz oscillator microbalance
  • MoDC-coated cells were prepared by performing a total of 9 steps (coating layer thickness: 6 nm).
  • a 0.2 mg / mL Tris solution of collagen IV was added to the surface of the obtained dermis tissue layer and incubated for 1 hour to form a basal layer containing collagen IV on the dermis tissue layer (thickness: 2.4). nm).
  • KC 1.8 ⁇ 10 5 keratinocytes
  • the medium was replaced with a keratinized medium (stratified medium), and the cell culture insert was placed so that the membrane filter of the cell culture insert was located at the gas-liquid interface of the keratinized medium.
  • differentiation induction was performed by gas-liquid culture at 37 ° C. for 7 days to prepare an artificial skin model.
  • MoDC-coated cells are colored with a green fluorescent dye (trade name: Cell Tracker TM Green Fluorescent Probe, product code: PA-3011), and NHDF-coated cells are red fluorescent dye (product). Name: Cell Tracker TM Orange Fluorescent Probe, product code: PA-3012), and KC colored with blue fluorescent dye (trade name: Cell Tracker TM Blue).
  • FIG. 1A is a CLSM image of an artificial skin model
  • FIG. 1B is a CLSM image of a three-dimensional culture before differentiation induction.
  • the cells stained in red are NHDF
  • the cells stained in blue are KC
  • the cells stained in green are MoDC.
  • an artificial skin model in which dendritic cells were introduced into the dermis layer could be created by the method of the present disclosure. Dendritic cells were also observed to adhere, suggesting survival in the dermis layer.
  • Example 2 The first three-dimensional culture layer, except seeded and MoDC coated cells 5 ⁇ 10 4 cells and HUVEC coated cells 5 ⁇ 10 4 cells each, were produced artificial skin model in the same manner as in Example 1. That is, first 2.5 ⁇ 10 5 NHDF-coated cells were seeded, 20% FBS-containing DMEM was added, and cultured for 1 day to form the first three-dimensional culture layer (NHDF: 3 layers).
  • the HUVEC-coated cells were prepared in the same procedure as the coated cells of Example 1 except that human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were used instead of NHDF.
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • FIG. 2A An example of the confocal laser scanning microscope (CLSM) image of the obtained artificial skin model is shown in FIG. 2A is an image one day after induction of KC differentiation
  • FIG. 2B is an image two days after induction of KC differentiation
  • FIG. 2C is an image five days after induction of KC differentiation
  • FIG. 2D is an image six days after induction of KC differentiation. is there.
  • the cells stained in red are NHDF
  • the cells stained in blue are HUVEC
  • the cells stained in green are MoDC.
  • an artificial skin model in which dendritic cells and a capillary network were introduced into the dermis layer could be created by the method of the present disclosure. It was suggested that the dendritic cells survived in the presence of the capillary network.
  • a dermal tissue layer (without dendritic cells) was prepared in the same manner as in Example 1 except that “NHDF-coated cells only” was used instead of “mixture of NHDF-coated cells and MoDC-coated cells”.
  • the immune response evaluation similar to the above was performed using the obtained dermis tissue layer.
  • FIG. 3 is an example of a graph showing the relationship between the amount of LPS added and the amount of IL-6 produced from the dermis tissue layer.
  • both the dermis tissue layer containing dendritic cells and the dermis tissue layer not containing dendritic cells increased the amount of IL-6 produced as the amount of LPS added increased.
  • the dermis tissue layer containing dendritic cells significantly improved IL-6 production compared to the dermis tissue layer not containing dendritic cells.
  • Example 4 [Production of skin model] First, the dermis tissue layer produced in the same manner as in Example 1 was immersed in a collagen IV / 50 mM Tris HCl solution (pH 7.4) for 20 minutes to coat the dermis tissue layer with collagen IV. After inoculating 1.8 ⁇ 10 5 KCs and culturing them in an adhesion medium for 2 days, differentiation induction was carried out by exposing them to a gas-liquid interface for 7 days in a keratinized medium (stratified medium) to produce an artificial skin model.
  • a collagen IV / 50 mM Tris HCl solution pH 7.4
  • differentiation induction was carried out by exposing them to a gas-liquid interface for 7 days in a keratinized medium (stratified medium) to produce an artificial skin model.
  • FIG. 4 is an example of a graph showing the relationship between the amount of LPS added and the amount of IL-6 produced from the dermis tissue layer.
  • FIG. 4 in the artificial skin model having an epidermis layer, no change was observed in the IL-6 production amount depending on the amount of LPS added.
  • the artificial skin model of Example 4 it is predicted that a physical barrier function is exhibited by tight junctions formed between cells of the epidermis layer, and LPS did not permeate.
  • NHDF-coated cells were seeded and cultured, and four layers of NHDF were laminated. Then, human skin microvascular endothelial cell (NHDMEC) -coated cells were seeded and cultured, and one layer of NHDMEC was laminated. Next, NHDF-coated cells were seeded thereon and cultured, and four layers of NHDF were laminated. After culturing in 2.3 ml of 10% FBS-containing DMEM for 3 days, 5.0 ⁇ 10 4 MoDCs were seeded and 2.3 ml of 10% The cells were cultured in DMEM containing FBS for 1 day. Thereby, a dermis tissue layer was formed. LPS was added at 1 ⁇ g / ml in the insert in which the obtained dermal tissue layer was disposed, and observation was performed with a confocal laser microscope for 30 hours.
  • NHDMEC human skin microvascular endothelial cell
  • FIG. 5 is an example of a confocal laser scanning microscope (CLSM) image 30 hours after LPS addition.
  • CLSM confocal laser scanning microscope
  • an artificial skin model capable of evaluating the permeability of a test substance and the micro response associated therewith.
  • the present disclosure is useful in the fields of cosmetics, medicine, pharmaceuticals, and the like.

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Abstract

樹状細胞を含む人工皮膚モデルを製造可能な新たな方法を提供する。細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成することを含み、前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が樹状細胞を含む、人工皮膚モデルの製造方法。

Description

人工皮膚組織、人工皮膚モデル及びそれらの製造方法
　本開示は、人工皮膚組織、人工皮膚モデル及びそれらの製造方法に関する。
　化粧品、医薬品及び医薬部外品等といったヒトに直接適用される物質の研究開発において、薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった物質の評価試験は重要である。これらの試験は、従来、マウスやラット等の動物を用いて行われているが、近年、動物愛護の観点から動物実験の見直しが求められている。このため、生体外で細胞の三次元組織を製造するために様々な方法が提案されている（例えば、特許文献１）。
　また、動物実験に代わる実験方法の１つとして、培養皮膚モデルを用いたin vitro試験等がある。そのため、様々な培養皮膚等の研究が行われている（例えば、特許文献2及び３等）。
特開２０１２－１１５２５４号公報 特許２７７３０５８号 ＷＯ２００５／０８７２８６
　皮膚免疫では、例えば、表皮層に位置するランゲルハンス細胞等の樹状細胞が中心的な役割を担うことが知られている。このため、皮膚における免疫応答を評価するには、評価に用いる人工皮膚モデルがランゲルハンス細胞等の樹状細胞を含むことが重要となる。しかしながら、例えば、特許文献２及び３の培養皮膚にはランゲルハンス細胞等の樹状細胞が含まれておらず、これらの培養皮膚では皮膚における免疫応答を十分に評価できるとはいえない。このため、樹状細胞を含む人工皮膚モデルが求められている。
　そこで、本発明は、樹状細胞を含む人工皮膚組織及び人工皮膚モデル、及びそれらを製造可能な新たな方法を提供する。
　本開示は、一又は複数の実施形態として、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態として、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織の製造方法に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態として、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚モデルの製造方法に関する。
　本開示は、一又は複数の実施形態として、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、前記基底層上に形成された表皮層とを有し、前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含み、本開示の製造方法により製造される人工皮膚モデルに関する。
　本開示によれば、例えば、樹状細胞を含む人工皮膚組織、及びそれを製造可能な新たな方法を提供できる。本開示によれば、例えば、樹状細胞を含む人工皮膚モデルを製造可能な新たな方法を提供できる。
図１Ａ及びＢは、実施例１の人工皮膚モデルの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像の一例である。 図２Ａ～Ｄは、実施例２の人工皮膚モデルの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）画像の一例である。 図３は、LPSの添加量と、真皮組織層からのIL-6の産生量との関係を示すグラフの一例である。 図４は、LPSの添加量と、真皮組織層からのIL-6の産生量との関係を示すグラフの一例である。 図５は、LPS添加30時間後の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像の一例である。
　本開示は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養して形成した真皮組織層と表皮層との間に、ＩＶ型コラーゲン（以下、「コラーゲンＩＶ」ともいう）を含む基底層を形成することによって、真皮組織層の積層構造の長期安定性が優れ、樹状細胞が導入された人工皮膚モデルを作製できるという知見に基く。
　本明細書において「人工皮膚組織」とは、ヒトの皮膚の構造、特に表皮層と真皮組織層とを含む構造及びその環境を再現又は模倣したものをいう。本開示の人工皮膚組織は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、真皮組織層上に形成されたコラーゲンＩＶを含む基底層と、基底層上に形成された表皮層とを有し、真皮組織層及び表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含むものをいう。本開示の人工皮膚組織は、一又は複数の実施形態において、好ましくは被検物質の皮膚に対する薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった薬剤評価のために利用可能な実験又は試験ツールや、皮膚移植用材料となりうるものを含みうる。
　本明細書において「人工皮膚モデル」とは、ヒトの皮膚の構造、特に表皮層と真皮組織層とを含む構造及びその環境を再現又は模倣したものをいう。本開示の人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、真皮組織層上に形成されたコラーゲンＩＶを含む基底層と、基底層上に形成された表皮層とを有し、真皮組織層及び表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含むものをいう。また、人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、好ましくは被検物質の皮膚に対する薬効試験、薬理試験及び安全性試験等といった薬剤評価のために利用可能な実験又は試験ツールとなりうるものを含み、より好ましくは本開示の製造方法により製造された人工皮膚モデルを含む。なお、本明細書の以下の記載において、特に言及しない限りは、「人工皮膚組織」及び「人工皮膚モデル」をまとめて「人工皮膚モデル」という。
　本明細書において「樹状細胞」としては、一又は複数の実施形態において、真皮樹状細胞、及びランゲルハンス細胞等が挙げられ、これらの前駆細胞をも含みうる。
　本開示の人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、樹状細胞以外に、皮膚に含まれる組織付属器官及び又はそれを構成する細胞等を含んでいてもよい。組織付属器官としては、例えば、血管、リンパ管、脂腺、汗腺、毛、及び毛嚢等が挙げられる。組織付属器官を構成する細胞としては、例えば、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、樹状細胞以外の免疫細胞、メラニン細胞、毛胞細胞、毛乳頭細胞、皮脂腺細胞、及び脂肪細胞等が挙げられる。また、本開示の人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、上記以外のその他の細胞を含んでいてもよい。その他の細胞としては、例えば、癌細胞、癌周辺に存在する又は存在しうる細胞等が挙げられる。
　本明細書において「被覆細胞」とは、細胞外マトリックス成分を含む被膜と細胞とを含み、その細胞表面が該被膜によって被覆されている細胞をいう。被覆される細胞としては、特に限定されるものではなく、一又は複数の実施形態として、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。細胞は、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の由来の細胞であってもよい。細胞は、一種類でもよいし、二種類以上を用いてもよい。被覆細胞は、一又は複数の実施形態において、特開２０１２－１１５２５４号公報に開示された方法により作製できる。
　本明細書において「真皮組織層」とは、細胞と細胞外マトリックス成分との集合体で構成されるものであって、細胞が三次元に積層されたものをいい、好ましくは皮膚の真皮の形態及び又は環境に類似及び又は模したものをいう。真皮組織層は、上記の組織付属器官及び又はそれを構成する細胞を含んでいてもよい。
　［人工皮膚モデルの製造方法］
　本開示の人工皮膚モデルの製造方法は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成することを含む。
　本開示の人工皮膚モデルの製造方法によれば、経皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定可能な、真皮組織層と表皮層とを含む人工皮膚モデルを製造することができる。このため、本発明の人工皮膚モデルによれば、例えば、in vivoにより近い状態で皮膚（表皮層）のバリア機能の評価を行うことができる。本発明の製造方法により製造される人工皮膚モデルがＴＥＲを測定できるメカニズムは定かではないが、以下のように推測される。すなわち、被覆細胞を培養することにより形成された真皮組織層上で、表皮細胞の分化誘導を行うことにより、表皮層における緻密性が向上し、隣接する表皮細胞同士が密着し、かつそれらの間にタイトジャンクションが形成されるものと考えられる。但し、本発明はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
　皮膚では、表皮層の細胞間に形成されたタイトジャンクションが物質の移動を制限する物理的バリアとして機能するとともに、ランゲルハンス細胞がセンサのような免疫学的バリアとして機能すること等によって、外部からの病原菌や刺激物等といった異物の侵入を制御する機能を果たしている。本開示の人工皮膚モデルの製造方法により製造される人工皮膚モデルは、一又は複数の実施形態において、表皮層の細胞間に対とジャンクションが形成され、かつ表皮層及び又は真皮組織層に樹状細胞を含むことから、実際の皮膚により近い状態で薬剤評価及び又は免疫応答評価が可能な人工皮膚モデルを提供できる。
　［真皮組織層］
　真皮組織層は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養することにより形成される。細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された被覆細胞を培養することにより、被覆細胞が集積され、さらには細胞外マトリックス成分を含む被膜を介して隣接する被覆細胞同士が接着することにより、被覆細胞が三次元に積層された真皮組織層を形成することができる。
　被覆細胞は、細胞と、細胞を覆う細胞外マトリックス成分を含む被膜とを含む。本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、生体内で細胞の外の空間を充填し、骨格的役割、足場を提供する役割、及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たす生体内物質をいう。また、細胞外マトリックス成分は、さらに、in vitro細胞培養において骨格的役割、足場を提供する役割及び又は生体因子を保持する役割等の機能を果たしうる物質を含んでいてもよい。
　細胞外マトリックス成分を含む被膜は、物質Ａを含む膜と、前記物質Ａと相互作用する物質Ｂを含む膜とを含むことが好ましい。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「ＲＧＤ配列を有する物質」ともいう）と前記ＲＧＤ配列を有するタンパク質若しくは高分子と相互作用するタンパク質若しくは高分子（以下、「相互作用を有する物質」ともいう）との組み合わせ、又は、正の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「正の電荷を有する物質」ともいう）と負の電荷を有するタンパク質若しくは高分子（以下、「負の電荷を有する物質」ともいう）との組み合わせである。
　細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚みは、一又は複数の実施形態において、１ｎｍ～１×１０3ｎｍ、又は２ｎｍ～１×１０2ｎｍが好ましく、被覆細胞がより密に積層された真皮組織層が得られるという理由から、３ｎｍ～１×１０2ｎｍがより好ましい。細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚みは、例えば、被膜を構成する膜の数によって適宜制御することができる。細胞外マトリックス成分を含む被膜は、特に制限されず、１層であってもよいし、例えば、３、５、７、９、１１、１３、１５層又はそれ以上の多層であってもよい。なお、被膜の厚みは、実施例に記載の方法により求めることができる。
　被覆細胞の培養は、例えば、基材上に被覆細胞を播種し、一定時間インキュベーションすることにより行う。このインキュベーションにより、細胞外マトリックス成分を含む被膜を介して隣接する被覆細胞が互いに接着し、被覆細胞が三次元に積層されるとともに、隣接する被覆細胞同士の間隔が密になり、緻密な構造の真皮組織層が形成される。インキュベーションの条件は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定できる。インキュベーション温度は、一又は複数の実施形態において、４～６０℃、２０～４０℃、又は３０～３７℃である。インキュベーション時間は、一又は複数の実施形態において、１時間～１６８時間、３時間～２４時間、又は３時間～１２時間である。培地は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定でき、例えば、Eagle's MEM培地、Dulbecco's Modified Eagle培地(DMEM)、Modified Eagle培地(MEM)、Minimum Essential培地、RDMI、GlutaMax培地、又は無血清培地等が挙げられる。
　播種時の被覆細胞の密度は、例えば、形成する真皮組織層に含まれる細胞層数等に応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、１×１０2個／ｃｍ3～１×１０9個／ｃｍ3、１×１０4個／ｃｍ3～１×１０8個／ｃｍ3、又は１×１０5個／ｃｍ3～１×１０7個／ｃｍ3である。
　被覆細胞の培養は、表皮細胞の分化誘導のための気液培養の準備や取扱が容易となるという理由から、メンブレンフィルタ上で行うことが好ましく、より好ましくはメンブレンフィルタを備える培養プレート、さらに好ましくはハウジング部と基底部とを備え、基底部がメンブレンフィルタである培養プレートを用いて行う。ハウジング部は、透明であることが好ましい。該培養プレートは、市販品を使用してもよい。市販品としては、例えば、トランスウェル（登録商標）、セルカルチャーインサート（商品名）等が挙げられる。
　メンブレンフィルタの孔径は、培養した細胞がメンブレンフィルタ上に保持可能な範囲であれば特に制限されず、一又は複数の実施形態において、０．１μｍ～２μｍ、また他派０．４μｍ～１．０μｍである。また、メンブレンの材質は、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、又はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等が挙げられる。
　このようにして形成された真皮組織層は、例えば、真皮組織層の形成後、例えば、２週間以上、好ましくは３週間以上、より好ましくは４週間以上、さらに好ましくは５週間以上、さらにより好ましくは６週間以上保存した場合であっても細胞の積層構造が保持でき、長期安定性に優れうる。真皮組織層の形成は、１回であってもよいし、複数回繰り返し行ってもよい。複数回繰り返し行うことにより、より多くの細胞が積層された多層の真皮組織層を形成することができる。
　真皮組織層の厚み及び真皮組織層において積層される細胞の数（層数）は特に制限されない。真皮組織層において積層される細胞の数（層数）は、一又は複数の実施形態において、ヒト等の生体組織とより同等の性質及び又は機能を発揮させる観点から、３層以上、５層以上、６層以上、１０層以上、又は１５層以上が好ましい。積層される細胞数の上限は特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、１００層以下、５０層以下、４０層以下、３０層以下、又は２０層以下である。
　本開示の人工皮膚モデルの製造方法において、真皮組織層の形成は、一又は複数の実施形態において、被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含んでいてもよい。
　［基底層］
　基底層は、真皮組織層にコラーゲンＩＶを接触させることにより作製することができる。コラーゲンＩＶとの接触は、一又は複数の実施形態において、コラーゲンＩＶ含有液を基底層に塗布、浸漬、滴下、又は噴霧すること等により行うことができる。
　コラーゲンＩＶ含有液は、コラーゲンＩＶを含んでいればよく、一又は複数の実施形態において、コラーゲンＩＶと溶媒又は分散媒体（以下、「溶媒」ともいう）とを含む。コラーゲンＩＶ含有液における、コラーゲンＩＶの含有量は、一又は複数の実施形態において、０．０００１～１質量％、０．０１～０．５質量％、又は０．０２～０．１質量％が好ましい。溶媒としては、一又は複数の実施形態において、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、グリシルグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、又はＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、３～１１、６～８、又は７．２～７．４が好ましい。
　基底層は、コラーゲンＩＶに加えて、一又は複数の実施形態において、ラミニンを含んでいてもよい。基底層がコラーゲンＩＶとラミニンとを含む場合、一又は複数の実施形態において、真皮組織層にコラーゲンＩＶとラミニンとを交互に接触されることが好ましい。
　［表皮層］
　表皮層は、基底層上で表皮細胞を培養した後、気液培養して表皮細胞を分化誘導させることによって形成することができる。表皮細胞としては、例えば、表皮角化細胞が使用できる。
　表皮細胞の培養は、例えば、真皮組織層上に表皮細胞を播種し、一定時間インキュベーションすることが好ましい。表皮細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された表皮細胞を用いてもよいし、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆されていない表皮細胞を用いてもよい。操作が簡便になる点から、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆されていない表皮細胞を用いることが好ましい。この場合、表皮細胞を真皮組織層上に接着させるため、特開２０１２－１１５２５４号公報に開示された方法により真皮組織層上を先に細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆することが好ましい。インキュベーションの条件は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定できる。インキュベーション温度は、一又は複数の実施形態において、４～６０℃、２０～４０℃、又は３０～３７℃である。インキュベーション時間は、一又は複数の実施形態において、１日～３日、又は１日～２日である。
　培地は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定でき、表皮細胞の増殖に用いられる培地が好ましい。表皮細胞の増殖に用いられる培地としては、例えば、無血清培地が挙げられる。無血清培地としては、例えば、MCDB153培地、EpiLife（登録商標）培地、これらの培地のアミノ酸組成等が改変された培地、又はDulbecco's Modified Eagle培地(DMEM)とハムF-12培地とを所定の割合で混合した培地等が挙げられる。MCDB153培地のアミノ酸組成が改変された培地としては、MCDB153培地のアミノ酸比率を、Ｌ－アスパラギン酸（塩）を１．５～４倍、Ｌ－イソロイシン（塩）を２２～２６倍、Ｌ－グルタミン（塩）を１．５～３倍、Ｌ－グルタミン酸（塩）を１．１～２倍、Ｌ－チロシン（塩）を３～６倍、Ｌ－トリプトファン（塩）を５～７倍、Ｌ－バリン（塩）を０．４～０．７倍、Ｌ－ヒスチジン（塩）を２～４倍、Ｌ－プロリン（塩）を０．４～０．７倍、Ｌ－フェニルアラニン（塩）を４～７倍、Ｌ－メチオニン（塩）を４～６倍、Ｌ－リジン（塩）１．１～２倍になるようにし、総アミノ酸中のＬ－グルタミン（塩）の含有量を６５重量％以上にしたMCDB153改変培地等がある（例えば、特開2005-269923号公報）。なお、MCDB153培地のアミノ酸組成は表１の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　培地は、例えば、塩類、又はビタミン類等を含んでいてもよい。塩類としては、例えば、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、リン酸一水素二ナトリウム等が挙げられる。ビタミン類としては、例えば塩化コリン、シアノコバラミン、ニコチン酸アミド、Ｄ－パントテン酸又はその塩、塩酸ピリドキシン又は塩酸ピリドキサール、Ｄ－ビオチン、塩酸チアミン、リボフラビン、葉酸、ＤＬ－α－リポ酸、又はミオ－イノシトール等が挙げられる。
　播種時の表皮細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、１×１０2個／ｃｍ2～１×１０9個／ｃｍ2、１×１０4個／ｃｍ2～１×１０8個／ｃｍ2、又は１×１０5個／ｃｍ2～１×１０7個／ｃｍ2である。
　気液培養は、培地を角化培地に培地交換した後、表皮細胞の表面を空気に曝した状態でインキュベーションすることによって行う。インキュベーション温度は、例えば、４～６０℃、好ましくは２０～４０℃、より好ましくは３０～３７℃である。インキュベーション時間は、例えば、１日～４０日、好ましくは５日～３０日、より好ましくは７日～１０日である。角化培地（重層化培地）は、上記表皮細胞の増殖に用いた培地に、例えば、カルシウム、及び又はウシ胎仔血清を添加した培地等が使用できる。培地のカルシウム濃度は、例えば、約０．４ｍＭ～２．０ｍＭとすることが好ましい。
　［樹状細胞］
　本開示の人工皮膚モデルの製造方法において、真皮組織層及び/又は表皮層は樹状細胞を含む。樹状細胞は、一又は複数の実施形態において、真皮組織層の形成において、真皮組織層を構成するための被覆細胞（例えば、線維芽細胞等）と混合させて培養したり、あるいは、真皮組織層を構成するための被覆細胞が積層された細胞層間に配置して培養してもよい。また、表皮層の形成において、表皮細胞と混合されて培養してもよいし、表皮細胞が積層された細胞層間に配置して培養してもよい。樹状細胞は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で被覆されていてもよい。
　播種時の樹状細胞の密度は、例えば、真皮組織層及び／又は表皮層に含まれる細胞層数等に応じて適宜決定できる。真皮組織層に樹状細胞を配置する場合、樹状細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、３個／ｃｍ2～２０００００個／ｃｍ2、２００００個／ｃｍ2～１０００００個／ｃｍ2、又は４００００個／ｃｍ2～８００００個／ｃｍ2である。真皮組織層を構成するための被覆細胞と混合して配置する場合、樹状細胞と被覆細胞との比率（樹状細胞：被覆細胞）は、一又は複数の実施形態において、１：９９～９９：１、１０：９０～９０：１０、又は１０：９０～５０：５０である。樹状細胞を、真皮組織層を構成するための被覆細胞と混合して配置する場合、その培養条件は真皮組織層の形成と同様の条件で行うことができる。表皮層に樹状細胞を配置する場合、樹状細胞の密度は、一又は複数の実施形態において、３個／ｃｍ2～２０００００個／ｃｍ2、２００００個／ｃｍ2～１０００００個／ｃｍ2、又は４００００個／ｃｍ2～８００００個／ｃｍ2である。である。表皮細胞と混合して配置する場合、樹状細胞と表皮細胞との比率（樹状細胞：表皮細胞）は、一又は複数の実施形態において、１：９９～９９：１、１０：９０～９０：１０、又は１０：９０～５０：５０である。
　本開示の人工皮膚モデルの製造方法は、一又は複数の実施形態において、真皮組織層内に組織付属器官を形成することを含んでいてもよい。組織付属器官の形成は、例えば、真皮組織層の形成において、組織付属器官を構成する細胞を、真皮組織層を構成するための被覆細胞（例えば、線維芽細胞等）と混合させて培養すること、あるいは、組織付属器官を構成する細胞を、真皮組織層を構成するための被覆細胞が積層された細胞層間に配置して培養すること等により行うことができる。細胞層間への組織付属器官を構成する細胞の配置は、例えば、被覆細胞が積層された細胞層上に組織付属器官を構成する細胞を配置し、必要に応じて所定の期間培養した後、その上に被覆細胞を配置すること等により行うことができる。このため、本開示の人工皮膚モデルの製造方法は、真皮組織層の形成において、被覆細胞を培養して被覆細胞が積層された細胞層を形成すること、細胞層上に組織付属器官を構成する細胞を配置すること、及び組織付属器官を構成する細胞が配置された細胞層上に被覆細胞を配置し、培養して被覆細胞が積層された細胞層を形成することを含んでいてもよい。
　組織付属器官として血管及びリンパ管といった網の目のように組織内に形成される器官を形成する場合、組織付属器官の形成は、組織付属器官を構成する細胞を被覆細胞が積層された細胞層で挟んだ状態で培養することにより行うことが好ましい。このように、細胞層間に挟まれた状態で組織付属器官を構成する細胞を培養することにより、ヒトの生体内により近い緻密な血管網又はリンパ管網が形成されうる。組織付属器官として血管を形成する場合、組織付属器官を構成する細胞は血管内皮細胞を使用すればよく、組織付属器官としてリンパ管を形成する場合は、組織付属器官を構成する細胞はリンパ管内皮細胞を使用すればよい。
　組織付属器官を構成する細胞は、上記のとおりである。また、組織付属器官を構成する細胞に加えて又は替えて、組織付属器官を構成する細胞の幹細胞及び又は前駆細胞を使用してもよい。組織付属器官を構成する細胞は、真皮組織層の形成に用いる被覆細胞と同様に、細胞表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成したものを使用してもよいし、表皮層の形成と同様に、被膜を形成することなくそのまま使用してもよい。作業効率の向上の観点からは、細胞表面に細胞外マトリックス成分を含む被膜が形成された細胞が好ましい。播種する細胞の数、及び培養条件等は、組織付属器官を構成する細胞等に応じて適宜決定できる。細胞外マトリックス成分を含む被膜の形成は、上記の被覆細胞と同様に行うことができる。
　本開示の人工皮膚モデルの製造方法は、被覆細胞を作製することを含んでいてもよい。被覆細胞は、細胞を、細胞外マトリックス成分に接触させることにより調製でき、真皮組織層において隣接する被覆細胞間の接着性が向上され、被覆細胞がより密に積層された真皮組織層が得られるという理由から、一又は複数の実施形態において、物質Ａと物質Ｂとに交互に接触させて調製することが好ましい。物質Ａと物質Ｂとの組み合わせとしては、上記の通り、ＲＧＤ配列を有する物質ともいう、相互作用を有する物質との組み合わせ、又は、正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせが挙げられる。
　（ＲＧＤ配列を有する物質）
　ＲＧＤ配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する物質は、生分解性であることが好ましい。
　ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、例えば、従来公知の接着性タンパク質、又はＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質等が挙げられる。接着性タンパク質としては、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、又はコラーゲン等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質としては、例えば、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、又は抗体等が挙げられる。
　ＲＧＤ配列を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α－ポリリジン又はε－ポリリジン等のポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド－ｃｏ－ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε－カプロラクタム、ポリアクリルアミド、又はポリ（メタクリル酸メチル－γ－ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
　ＲＧＤ配列を有する物質は、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、キチン、又はキトサンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンである。
　（相互作用する物質）
　相互作用する物質とは、ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等により、化学的及び又は物理的にＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
　ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用するタンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、又は抗体等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する高分子としては、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はデキストラン硫酸等の糖、及びヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、例えば、α－ポリリジン又はε－ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、又はポリアスパラギン酸等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール－グラフト－ポリアクリル酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド－ｃｏ－ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε－カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸メチル－γ－ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。
　相互作用する物質は、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、又はエラスチンが好ましく、より好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、又はコラーゲン、さらに好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、又はヒアルロン酸である。
　ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用する物質との組み合わせは、特に制限されず、相互作用する異なる物質の組み合わせであればよく、いずれか一方がＲＧＤ配列を含む高分子又はタンパク質であり、他方がこれと相互作用する高分子またはタンパク質であればよい。ＲＧＤ配列を有する物質と相互作用を有する物質との組み合わせとしては、例えば、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε－ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ結合コラーゲン又はＲＧＤ結合ゼラチンとコラーゲン又はゼラチン等が挙げられる。中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε－ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、又はラミニンとゼラチンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチンとゼラチンである。なお、ＲＧＤ配列を有する物質及び相互作用を有する物質は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
　（正の電荷を有する物質）
　正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、ポリ（α－リジン）、ポリ（ε－リジン）等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＤＡ）、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
　（負の電荷を有する物質）
　負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β－ラクトグロブリン、チログロブリン、α－ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ（βリジン）等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
　正の電荷を有する物質と負の電荷を有する物質との組み合わせとしては、例えば、ε－ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ε－ポリリジンとポリスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、好ましくはε－ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩である。ポリスルホン酸塩としては、例えば、ポリスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）等が挙げられる。なお、正の電荷を有する物質及び負の電荷を有する物質は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。
　以下に、細胞に、まずＲＧＤ配列を有する物質を含有する溶液Ａと接触させた後、ＲＧＤ配列を有する物質に相互作用を有する物質を含有する溶液Ｂと接触させ、例にとり、被覆細胞の調製方法を説明する。
　まず、細胞を溶液Ａと接触させる。これにより、細胞表面にＲＧＤ配列を有する物質を含む膜が形成され、細胞表面がＲＧＤ配列を有する物質を含む膜によって被覆される。細胞と溶液Ａとの接触は、例えば、溶液Ａを細胞に塗布又は添加すること、溶液Ａに細胞を浸漬させること、溶液Ａを細胞に滴下又は噴霧すること等により行うことができる。中でも、操作が容易であるという理由から、溶液Ａに細胞を浸漬させることにより、細胞と接触させることが好ましい。
　接触条件は、一又は複数の実施形態において、接触方法、ＲＧＤ配列を有する物質及び又は細胞の種類、及び含有液の濃度等に応じて適宜決定できる。接触時間は、一又は複数の実施形態において、３０秒～２４時間、１分～６０分、１分～１５分、１分～１０分、又は１分～５分が好ましい。接触時の雰囲気温度及び又は含有液の温度は、一又は複数の実施形態において、４～６０℃、２０～４０℃、又は３０～３７℃が好ましい。
　溶液Ａは、ＲＧＤ配列を有する物質を含んでいればよく、好ましくはＲＧＤ配列を有する物質と溶媒又は分散媒体（以下、「溶媒」ともいう）とを含む。溶液Ａにおける、ＲＧＤ配列を有する物質の含有量は、一又は複数の実施形態において、０．０００１～１質量％、０．０１～０．５質量％、又は０．０２～０．１質量％が好ましい。溶媒としては、一又は複数の実施形態において、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、グリシルグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、又はＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、３～１１、６～８、又は７．２～７．４が好ましい。
　溶液Ａは、一又は複数の実施形態において、塩、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、生理活性ペプチド、又は医薬組成物等をさらに含有してもよい。医薬組成部としては、例えば、疾患の治療剤、予防剤、抑制剤、抗菌剤、又は抗炎症剤等が挙げられる。塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、コハク酸ナトリウム等が挙げられる。塩は、一種類でもよいし二種類以上含有していてもよい。溶液Ａ及び溶液Ｂの双方が塩を含有していてもよいし、いずれか一方が塩を含有していてもよい。溶液Ａ中の塩濃度は、特に制限されないが、例えば、１×１０-6Ｍ～２Ｍであり、好ましくは１×１０-4Ｍ～１Ｍ、より好ましくは１×１０-4Ｍ～０．０５Ｍである。
　ついで、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜の形成に使用されなかった物質を除去する。除去は、例えば、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による除去は、例えば、溶液Ａに細胞を分散させた状態で遠心分離し、ついで上澄みを除去することにより行うことができる。遠心分離条件は、細胞の種類、細胞の濃度、及び溶液Ａに含まれる含有物の組成によって適宜決定できる。
　上記除去に加えて、洗浄操作を行うことが好ましい。洗浄は、例えば、遠心分離又は濾過等により行うことができる。遠心分離による洗浄は、例えば、上澄みを除去された細胞に溶媒を添加し、遠心分離及び上澄みの除去をすることにより行うことができる。洗浄に用いる溶媒は、溶液Ａの溶媒と同じであることが好ましい。
　ついで、ＲＧＤ配列を有する物質を含む膜で被覆された細胞を溶液Ｂと接触させる。これにより、ＲＧＤ配列を有する物を含む膜表面に相互作用をする物質を含む膜が形成され、ＲＧＤ配列を有する物を含む膜で被覆された細胞表面が相互作用をする物質を含む膜によって被覆される。溶液Ｂとの接触は、ＲＧＤ配列を有する物質に代えて相互作用する物質を使用する以外は、溶液Ａとの接触と同様に行うことができる。
　溶液Ａ又は溶液Ｂと細胞との接触とを交互に繰り返し行うことにより、細胞表面全体に、ＧＤ配列を有する物質を含む膜と相互作用をする物質を含む膜とが交互に積層された細胞外マトリックス成分を含む被膜を形成することができる。溶液Ａ又は溶液Ｂと細胞との接触を行う回数は、例えば、形成する細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚み等に応じて適宜決定できる。
　［人工皮膚モデル］
　本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示の製造方法により製造される人工皮膚モデルに関する。本開示の人工皮膚モデルは、細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、前記基底層上に形成された表皮層とを有し、前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む。本開示の人工皮膚モデルによれば、例えば、実際の皮膚に近い環境で、被検物質の薬効試験、免疫応答、薬理試験及び安全性試験等の評価を行うことができる。また、本開示の人工皮膚モデルは、例えば、火傷や創傷の治療のための被覆材として用いることもできる。
　表皮層において、例えば、隣接する表皮細胞間にタイトジャンクションが形成されていることが好ましい。表皮層においてタイトジャンクションが形成されていることにより、例えば、ＴＥＲを測定することによる表皮層のバリア機能等を評価することができる。
　本開示の人工皮膚モデルは、真皮組織層に形成された組織付属器官を含むことが好ましい。これにより、実際の皮膚により近い環境、被検物質の薬効試験、薬理試験及び又は安全性試験等の評価を行うことができる。
　真皮組織層において積層される細胞の数は、特に制限されず、ヒト等の皮膚とより同等の性質・機能を発揮させる観点から、３層以上、５層以上、６層以上、又は１０層以上である。積層される細胞数の上限は特に制限されないが、例えば、１００層以下、５０層以下、４０層以下、３０層以下、又は２０層以下等である。
　［評価方法］
　本発明は、さらにその他の態様として、本開示の人工皮膚モデルを用いた被検物質の皮膚に対する刺激性を評価する方法に関する。本開示の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の皮膚に近い環境で被検物質の評価を行うことができるという効果を奏しうる。また、本開示の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用なツールとなりうる。
　本開示の評価方法は、例えば、被検物質を前記人工皮膚モデルと接触させること、及び、被検物質の接触による免疫応答を測定することにより行うことができる。応答の測定は、例えば、ＴＥＲを測定すること等によって行うことができる。被検物質は、評価対象となる物質のことをいい、例えば、無機化合物及有機化合物等が挙げられる。
　［評価キット］
　本発明は、さらにその他の態様として、被検物質の刺激性の評価キットに関する。本開示の評価キットは、本開示の人工皮膚モデルを含む。本開示の評価キットによれば、例えば、本開示の評価方法をより簡便に行うことができる。
　評価キットは、所定の検査に用いる試薬、材料、用具、及び装置、並びに、その評価についての説明書（取扱説明書）の少なくとも１つを含む製品をさらに含んでいてもよい。
　［人工皮膚モデル製造キット］
　本発明は、さらにその他の態様として、人工皮膚モデル製造用キットに関する。本開示の人工皮膚モデル製造用キットは、例えば、細胞外マトリックス成分を含む被膜の形成に用いる試薬、及び本開示の人工皮膚モデルの製造方法が記載された説明書を含むことが好ましい。本開示の人工皮膚モデル製造用キットによれば、より簡便に本開示の人工皮膚モデルを製造することができる。
　本開示の人工皮膚モデル製造用キットは、さらに、真皮組織層が形成された基材を含んでいてもよい。これにより、真皮組織層が形成された基材を含むことにより、例えば、より簡便に短時間で本開示の人工皮膚モデルを製造することができ、さらには組織付属器官を形成するまでの時間を短縮できる。
　本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関する。
〔Ａ１〕細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織。
〔Ａ２〕細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織の製造方法。
〔Ａ３〕前記真皮組織層の形成は、前記被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含む、〔Ａ２〕記載の製造方法。
〔Ａ４〕前記表皮層の形成は、前記基底層上に、表皮細胞と樹状細胞とを配置することを含む、〔Ａ２〕又は〔Ａ３〕に記載の製造方法。
〔Ａ５〕前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にＩＶ型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、〔Ａ２〕から〔Ａ４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ６〕前記被覆細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された線維芽細胞を含む、〔Ａ２〕から〔Ａ５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ７〕〔Ａ２〕から〔Ａ６〕のいずれかに記載の製造方法により製造される人工皮膚組織。
〔Ａ８〕細胞外マトリックス成分と前記細胞外マトリックス成分を介して積層された細胞とを含む真皮組織層と、
前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
前記真皮組織層が、樹状細胞とリンパ管とを含む、人工皮膚組織。
〔Ａ９〕前記真皮組織層における樹状細胞と真皮組織層を形成する樹状細胞以外の細胞との比が１：９９～５０：５０である、〔Ａ８〕記載の人工皮膚組織。
〔Ｂ１〕細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚モデルの製造方法。
〔Ｂ２〕前記真皮組織層の形成は、前記被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含む、〔Ｂ１〕記載の製造方法。
〔Ｂ３〕前記表皮層の形成は、前記基底層上に、表皮細胞と樹状細胞とを配置することを含む、〔Ｂ１〕又は〔Ｂ２〕に記載の製造方法。
〔Ｂ４〕前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にＩＶ型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、〔Ｂ１〕から〔Ｂ３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ｂ５〕前記被覆細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された線維芽細胞である、〔Ｂ１〕から〔Ｂ４〕のいずれかに記載の製造方法。
　以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明する。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。
　［被膜の厚みの測定方法］
　細胞表面に形成された被膜の厚みは、別途、基材上に被膜の形成を行い、水晶発振子マイクロバランス（QCM）測定法を用い、行った処理（ステップ）数と形成される厚みとを測定し、その結果から細胞表面への被膜形成時に行ったステップの回数に応じて算出した。QCM測定法を用いた測定は以下のように行った。QCM水晶センサをピランハ溶液で１分間洗浄してから、0.2 mg/mlフィブロネクチン（以下、「FN」ともいう）のTris-HCl(pH=7.4)溶液に３７℃で１分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ１）。ついで0.2 mg/mlゼラチン（以下、「Ｇ」ともいう）のTris-HCl(pH=7.4)溶液に３７℃で１分間浸漬し、Tris-HCl(pH=7.4)溶液で洗浄して風乾した後、振動数シフトを測定した（ステップ２）。このステップ１及び２を交互に繰り返すことによりQCM水晶センサに被膜を形成すると共に、振動数シフトの測定を行った。得られた振動数シフトに基づき、ステップの回数とそれにより形成される被膜の厚みとを得た。
　（実施例１）
　［被覆細胞の作製］
　ヒト線維芽細胞（正常ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）、Cambrex社製）を1×106cell/mlの濃度で0.2mg/mlのフィブロネクチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（FN浸漬操作）。ついで、上澄みを除き、50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った（洗浄操作）。上澄みを除き、0.2mg/mlのゼラチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行い（G浸漬操作）、ついで洗浄操作を行った。そして、FN浸漬操作、洗浄操作、Ｇ浸漬操作、及び洗浄操作をこの順番で行った。FN浸漬操作及びＧ浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで１ステップとし、最終的に、FN浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことによってNHDF被覆細胞を作製した（コーティング層の厚み：6nm）。
　NHDFに代えてヒト末梢血単球由来樹状細胞（以下、「MoDC」ともいう）を用いた以外は、NHDF被覆細胞の作製と同様にFN浸漬操作を５回、Ｇ浸漬操作を４回、計９ステップ行うことによってMoDC被覆細胞を作製した（コーティング層の厚み：6nm）。
　［皮膚モデルの作製］
　まず、２４ウェル培養プレートに配置したトランスウェル（コーニング社製；ポアサイズ：0.4μm、表面積：0.33cm2）のメンブレンフィルタ上に、5×105個のNHDF被覆細胞と5×104個のMoDC被覆細胞を混合して播種し、10重量％ウシ胎仔血清を含むEagle's MEM培地を添加して37℃で1日培養した。これにより樹状細胞を含み、NHDFが6層積層された真皮組織層（厚み：30μm）が得られた。
　得られた真皮組織層の表面に、0.2mg/mLのコラーゲンIVのトリス溶液を添加し、１時間インキュベートすることにより、真皮組織層の上にコラーゲンIVを含む基底層を形成した（厚み：2.4nm）。ついで、基底層の表面にケラチノサイト（以下、「KC」ともいう）を1.8×105個播種し、37℃で２日間培養した。ついで、培地を角化培地（重層化培地）に交換し、セルカルチャーインサートのメンブレンフィルタが角化培地の気液界面に位置するようにセルカルチャーインサートを配置した。その状態で37℃で７日間気液培養することにより分化誘導を行い、人工皮膚モデルを作製した。
　なお、上記人工皮膚モデルの作製において、MoDC被覆細胞は緑色蛍光色素（商品名：Cell TrackerTM Green Fluorescent Probe、製品コード：PA-3011）で着色したものを、NHDF被覆細胞は赤色蛍光色素（商品名：Cell TrackerTM Orange Fluorescent Probe、製品コード：PA-3012）で着色したものを、KCは青色蛍光色素（商品名：Cell TrackerTM Blue）で着色したものをそれぞれ使用した。
　得られた人工皮膚モデル（ＫＣ分化誘導4日後）及び分化誘導前（KC播種２日後）の三次元培養体の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像の一例を図１に示す。図１Ａは人工皮膚モデルのCLSM画像であり、図１Bは分化誘導前の三次元培養体のCLSM画像である。図１Ａ及びＢにおいて赤で染色された細胞がNHDFであり、青で染色されたのがＫＣであり、緑で染色されたのがMoDCである。
　図１Ａに示すように、本開示の方法によって真皮層に樹状細胞が導入された人工皮膚モデルを作成することができた。樹状細胞が接着している様子も観察され、真皮層内で生存していることが示唆された。
　（実施例２）
　第１の三次元培養層上に、MoDC被覆細胞5×104個とHUVEC被覆細胞5×104個とをそれぞれ播種した以外は、実施例1と同様にして人工皮膚モデルを作製した。すなわち、まず2.5×105個のNHDF被覆細胞を播種し、20%FBS含有DMEMを添加して1日培養して第１の三次元培養層（NHDF：3層）を形成後、その上にMoDC被覆細胞5×104個とHUVEC被覆細胞5×104個と播種し、20%FBS含有DMEMを添加して1日培養後、2.5×105個のNHDF被覆細胞を播種することによって真皮組織層を作製し、上記と同様の手順で基底層及び表皮層を形成した。なお、HUVEC被覆細胞は、NHDFに変えてヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を用いた以外は、実施例１の被覆細胞の作製と同様の手順で作製した。　
　得られた人工皮膚モデルの共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像の一例を図２に示す。図２ＡはKC分化誘導1日後の画像であり、図２ＢはKC分化誘導２日後の画像であり、図２CはKC分化誘導５日後の画像であり、図２DはKC分化誘導６日後の画像である。図２Ａ～Ｄにおいて赤で染色された細胞がNHDFであり、青で染色されたのがHUVECであり、緑で染色されたのがMoDCである。
　図２に示すように、本開示の方法によって真皮層に樹状細胞と毛細血管網とが導入された人工皮膚モデルを作成することができた。毛細血管網の共存下においても樹状細胞が生存していることが示唆された。
　（参考例１）
　［免疫応答評価］
　実施例１と同様に樹状細胞を含む真皮組織層を作製した。作製した真皮組織層の培地を10％FBS含有DMEMに変更した(インサート内：30μl、インサート外：1ml)。インサート内にはリポ多糖(LPS、sigma製)を添加し、24時間インキュベート後、インサート外の培地を全て回収し、Enzyme-Linked ImmunoAorbent Assay(ELISA (R&D,D6056))によってインターロイキン(IL)-6を定量した。リポ多糖の濃度は、0、1、10、100又は1000ng/mとした。その結果を図３に示す。
　「NHDF被覆細胞とMoDC被覆細胞との混合物」に代えて「NHDF被覆細胞のみ」を使用した以外は、実施例１と同様にして真皮組織層（樹状細胞なし）を作製した。得られた真皮組織層を用いて上述と同様の免疫応答評価を行った。
　図３は、LPSの添加量と、真皮組織層からのIL-6の産生量との関係を示すグラフの一例である。図３に示すように、樹状細胞を含む真皮組織層及び樹状細胞を含まない真皮組織層のいずれも、LPSの添加量の増加に伴ってIL-6の産生量が増加した。また、樹状細胞を含む真皮組織層は、樹状細胞を含まない真皮組織層と比較してIL-6の産生量が大幅に向上した。
　（実施例４）
　［皮膚モデルの作製］
　まず、実施例１と同様にして作製した真皮組織層を、コラーゲンIV/５０mM Tris HCｌ溶液(pH7.4)に20分間浸漬し、真皮組織層にコラーゲンIVをコートした。KCを1.8×105個播種し接着培地で２日間培養後、角化培地（重層化培地）で７日間気液界面にさらすことにより分化誘導を行い、人工皮膚モデルを作製した。
　作製した人工皮膚モデルを用いて、上記参考例と同様にして免疫応答評価を行った。その結果を図４に示す。図４は、LPSの添加量と、真皮組織層からのIL-6の産生量との関係を示すグラフの一例である。図４に示すように、表皮層を有する人工皮膚モデルは、LPSの添加量によってIL-6の産生量に変化は見られなかった。実施例４の人工皮膚モデルは、表皮層の細胞間に形成されたタイトジャンクションによって物理的なバリア機能が発揮し、LPSが透過しなかったことが予測される。
　（参考例２）
　NHDF被覆細胞を播種し培養してNHDFを４層積層した後、その上にヒト皮膚微小血管内皮細胞(NHDMEC)被覆細胞を播種し培養してNHDMECを1層積層した。ついでその上にNHDF被覆細胞を播種し培養してNHDFを４層積層し、2.3mlの10%FBS含有DMEMで3日間培養した後、MoDCを5.0×104個播種し、2.3mlの10%FBS含有DMEMで1日間培養した。これにより、真皮組織層を形成した。得られた真皮組織層が配置されたインサート内にLPSを1μg/ml添加し、共焦点レーザー顕微鏡で30時間観察を行った。
　その結果を図５に示す。図５は、LPS添加30時間後の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像の一例である。図５に示すように、LPS添加後、樹状細胞がNHDMECと重なっている様子が観察された。詳細は不明ではあるが、生体内において、樹状細胞は抗原によって活性化させることによってリンパ管に移行することが知られている。このため、参考例２の真皮組織層においても生体内と同様の機構が起こっていることが示唆された。また、生体内では、活性化した樹状細胞においてCCケモカインレセプター７が発現し、一方リンパ管ではそのリガンドであるＣＣケモカインリガンド21,19を産生することが報告されている。したがって、参考例２の真皮組織層においても、リンパ管が産生するこれらのサイトカインによって、樹状細胞がNHDMECへと誘導されたと考える。
　本開示によれば、被検物質の透過性や、それに伴う微小応答等が評価可能な人工皮膚モデルを提供できる。本開示は、例えば、化粧品、医薬、製薬等の分野において有用である。

Claims (9)

  1. 細胞外マトリックス成分と積層された細胞とを含む真皮組織層と、
    前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
    前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
    前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織。
  2. 細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、
    前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを接触させ、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲンを含む基底層を形成すること、及び
    前記基底層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成すること、を含み、
    前記真皮組織層及び前記表皮層の少なくとも一方が、樹状細胞を含む、人工皮膚組織の製造方法。
  3. 前記真皮組織層の形成は、前記被覆細胞と、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された樹状細胞とを培養することを含む、請求項２記載の製造方法。
  4. 前記表皮層の形成は、前記基底層上に、表皮細胞と樹状細胞とを配置することを含む、請求項２又は３に記載の製造方法。
  5. 前記基底層の形成は、前記真皮組織層上にＩＶ型コラーゲン層とラミニン層とが交互に形成されるように、前記真皮組織層にＩＶ型コラーゲン又はラミニンを接触させることを含む、請求項２から４のいずれかに記載の製造方法。
  6. 前記被覆細胞は、細胞外マトリックス成分を含む被膜で表面が被覆された線維芽細胞を含む、請求項２から５のいずれかに記載の製造方法。
  7. 請求項２から６のいずれかに記載の製造方法により製造される人工皮膚組織。
  8. 細胞外マトリックス成分と前記細胞外マトリックス成分を介して積層された細胞とを含む真皮組織層と、
    前記真皮組織層上に形成されたＩＶ型コラーゲンを含む基底層と、
    前記基底層上に形成された表皮層とを有し、
    前記真皮組織層が、樹状細胞とリンパ管とを含む、人工皮膚組織。
  9. 前記真皮組織層における樹状細胞と真皮組織層を形成する樹状細胞以外の細胞との比が１：９９～５０：５０である、請求項８記載の人工皮膚組織。
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