JP2773058B2 - コラーゲンをベースとした生物材料と、その利用 - Google Patents

コラーゲンをベースとした生物材料と、その利用

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコーラーゲンをベースとした生物材料とその
利用に関するものである。
表皮細胞の培養に関する分野は過去20年間に大きく進
歩し、細胞の大量培養が可能になり（参考文献1,2）、
表皮の増殖と最終分化とを調節する因子に関する重要な
情報が得られている。また、表皮の増殖と分化とを同時
に調節する各種の系が開発されてきた（参考文献2,3,
4）。真皮−表皮の相互作用の研究ではこれらの生命現
象の調節機構がさらに調べられ、皮膚に類似した組織を
再合成するためのより複雑な代用真皮（substitutes de
rmique）を用いた細胞培養が行われている（参考文献５
〜13）。しかし、代用真皮に対する表皮ケラチン細胞の
固定能力は低いため、インビトロでの基底膜（membranc
e basale）形成が多くの研究の対象となってきた。コラ
ーゲン上の培地中に人間のケラチン細胞を分散させてほ
ぼ完全な基底膜を再生するというテーマに関する唯一の
報告（参考文献14、15）は長期培養（40から60日）に関
するものである。本出願人は表皮ケラチン細胞培養にお
けるIV型コラーゲンの役割について報告した（参考文献
22、23、24）。
また、互いに緊密に連結し且つ重なりあった２層のコ
ラーゲン、すなわち繊維質コラーゲンの多孔性層とコラ
ーゲンフィルムとからなる内蔵手術用パッチは既に実現
されている（ヨーロッパ特許第EP−Ａ−0,357,755
号）。このコラーゲンは特にIII型＋Ｉ型またはIV型で
ある。
本発明の目的は分化表皮細胞を含む生物材料、特に皮
膚に非常に近い構造を有する生物材料を提供することに
ある。
本発明はの他の目的は薬理学、毒物学、美容学で使用
される生物材料および／または傷口、火傷の保護あるい
は瘢痕形成で使用される生物材料を提供することにあ
る。
本出願人は、驚くべきことに、IV型コラーゲンのマト
リックスを用いると、それが支持体または代用真皮の役
目をして表皮細胞、特にケラチン細胞の培養が可能にな
り、しかも、基底膜および角質細胞に類似したものが形
成されて皮膚に類似した一般構造を有する生物材料が短
期間で得られるということを見出した。
本発明は、IV型コラーゲンをベースにした支持体また
は代用真皮と、この支持体または代用真皮上で表皮細胞
を増殖させて得られる分化細胞よりなる上皮（epitheli
um epidermique）とが互いに密接に結合したものから成
るコラーゲンをベースとした生物材料を提供する。
上記の支持体または代用真皮は多孔質格子状のＩ型コ
ラーゲン＋III型コラーゲンの下部層を備えているのが
有利である。
使用するコラーゲンは架橋することができ、または、
適当な天然コラーゲンと架橋コラーゲンとの混合物でも
よい。
IV型コラーゲンは胎盤由来のものをヨーロッパ特許公
開第EP−Ａ−0,214,035号に記載の方法に従って調製し
たものにすることができる。
コロニー形成に用いる表皮細胞はケラチン細胞、特に
正常な成人のケラチン細胞（kerationocytes humains n
ormaux d′ adulte、KHNA）が好ましい。
本発明の生物材料の上皮組織は特に以下のような特徴
を有している： （ａ）培養６日後には、真皮−表皮結合部分に良好なア
ンカー構造が再生される。すなわち、良く個別化された
多数のヘミデスモソーム（hemidesmosomes）（アンカー
プラーク（plaqued′ancrage）と、それに入り込んだト
ノフィラメント（tonofilaments）、稠密な基底下部プ
ラーク（plaque dense sousbasale）、アンカーフィラ
メント）と、IV型コラーゲン表面とラミナデンサ（lami
na densa）に類似した細胞膜との間に形成される細胞外
物質の規則正しい帯状の堆積物が再生される。
（ｂ）下記３種類の細胞群により構成される： −基底細胞（cellules basales）層、 −デスモソーム（desmosomes）により互いに結合され
た多数の中間細胞層、このうち一番外側の層はケラトヒ
アリン粒子を含む。
−角質層。
本発明の他の目的は上記生物材料の薬理学試験、毒物
学試験および美容学試験へ応用すること、特にインビト
ロ評価用キットの形で応用することにある。
本発明のさらに他の目的は上記生物材料を傷や火傷の
保護および治癒へ応用することにある。
以下、本発明の生物材料の調製法と、インビドロおよ
びインビボでの試験方法を用いて本発明をより詳細に説
明する。
各種コラーゲンの調製 コラーゲンIV（天然または酸化物）の調製はヨーロッ
パ特許第EP−Ａ−0214035号に記載の方法に従って行
う。
コラーゲンＩとIIIは公知の任意の手法で調製するこ
とができる。
代用真皮の調製 代用真皮は凍結乾燥した酸化コラーゲンＩ＋IIIと、
これを覆ったコラーゲンIVと酸化コラーゲンIVとの混合
物の層とで構成される。この代用真皮を調製するため
に、0.01N塩酸を用いて調製した濃度10mg/mlのコラーゲ
ンＩおよびIIIの溶液に過ヨウ素酸溶液を添加した（最
終濃度0.002M）。酸化コラーゲンはリン酸塩（Na2HP
O4）で沈澱させて回収した。沈澱物をリン酸塩緩衝液
（Na2HPO4）で数回洗浄し、ナイロン布で濾過して回収
する。得られた生成物をフィルム状にし、凍結乾燥し、
圧縮した。過ヨウ素酸を用いた酸化をすると、架橋コラ
ーゲンのマトリックスが形成された（アメリカ合衆国特
許第US−4,931,546号）。
0.01N塩酸を用いて調製した濃度20mg/mlのコラーゲン
IV溶液に過ヨウ素酸溶液を添加して（最終濃度0.02
M）、酸化コラーゲンIV（IVox）の溶液を調製した。２
時間インキュベートした後、このIVoxコラーゲンを0.01
N塩酸を用いて透析した。
10mg/mlのコラーゲンIVの調節物と10mg/mlの酸化コラ
ーゲンIVの調節物との混合物（IV:IVox＝4:1）を海綿状
のコラーゲンＩ＋IIIの表面上に堆積させた後、乾燥さ
せた。γ線照射（25kgray）により滅菌して代用真皮を
得た。
KHNA（正常な成人のケラチン細胞）の培養 形成外科手術の際に採取した正常な成人の皮膚標本を
標準的なトリプシン処理して人間の表皮細胞の懸濁液を
調製した。この細胞を、グリーン（H.Green）の方法
（参考文献１）に従って調製したγ線照射済みの栄養供
給用細胞層3T3上で増殖させた。
培地はDMEM［ギブコ研究所（Gibco Laboratories）,G
rand Island,NY,USA）］およびHAM F12（ギブコ研究
所）（3:1）に下記を添加した完全培地である： 10％の牛胎児血清［ベーリンガーマンハイム社（Boeh
ringer Mannheim）Meylan,France）］ 1.8×10-4Ｍのアデニン［以下は全てシグマ社（SIGMA
USA）より購入した完全培地］ ５μg/mlのインシュリン ２×10-9Ｍのトリヨードチロニン ５μg/mlのトランスフェリン 0.4μg/mlのヒドロコルチゾン 10-10Ｍのコレラ毒素および 1ng/mlの表皮増殖因子。
融合では、ケラチン細胞をトリプシン処理し、液体窒
素中で保存した。直径1.6cmの代用真皮標本を24穴の培
養プレート［ファルコン社（Falcon）］に入れ、加圧し
てプラスチック材に密着させた。懸濁液状のケラチン細
胞を代用真皮標本上に直接接種し、培地と接触させた
（１cm2あたり５×104個の細胞を接種し、４日間で集密
状態−細胞が増殖し、培養基質を覆った状態−になるよ
うにした）。これを37℃で濃度５％の二酸化炭素雰囲気
下で培養し、培地を２日毎に交換した。表皮細胞が集密
状態になった時点で、得られた代用皮膚を取り出し、顕
微鏡観察またはハツカネズミへ移植した。プレートに入
れてから５日経過後に代用真皮を鉄製の格子上にのせて
培養ケラチン細胞が空気／液体境界面へくるようにし
た。その後、培養ケラチン細胞は空気に曝され且つ代用
真皮を介して栄養供給された。
代用真皮の上部はコラーゲンIV−IVox型の層である。
この生物材料の表皮細胞増殖能力を調べるために、６穴
のプレート内に作った類似した透明なコラーゲンIV−IV
ox層上でKHMAを培養して、顕微鏡で直接観察した。細胞
は懸濁液状で完全培地または血清を抜いた培地中でコラ
ーゲン層上に接種した。血清抜きの培地はDMEMとHAM F1
2（1:1）［ギブコ社（Gibco）に以下のものを加えたも
のである： 0.5μg/mlのハイドロコルチゾン ５μg/mlのインシュリン ３×10-8Ｍの亜セレン酸塩［シグマ社（SIGMA）］ ５μg/mlのトランスフェリン 1mg/mlのアルブミン（メリュー研究所（Institut Mer
ieux）Lyon、France） ５μg/mlのフィブロネクチン（メリュー研究所（Inst
itut Merieux） 高密度の接種（１cm2あたりの細胞数が105、５×1
04、３×104）は完全培地で行い、低密度の接種（１cm2
あたりの細胞数が８×103）は血清を抜いた培地で行っ
た。
表皮細胞の分化 組織学用に、上記標本をブヨンの固定培地に固定し、
アルコール中で脱水し、次いで、パラフィンとメタクリ
レートで包んだ。切片をHES（ヘマトキシリン−エオシ
ン−サフラン）で着色した。アビジン−ビオチン−アル
カリ性ホスファターゼを用いる方法または間接免疫蛍光
法によって、パラフィンを除去した切片または凍結させ
た切片に対して免疫組織学的考察を行った。
表皮の分化を３種類のモノクロナル抗体、すなわち、
抗ケラチン抗体KL1［イムノテック社（Immunotech）Mar
seille、France］と、ヒトのプロフィラグリン／フィラ
グリンに対するモノクロナル抗体AKH1［バイオメディカ
ル社（BiomedicalTech.Inc.）Soughton,USA］と、イン
ボルクリンに対する兎のポリクロナル抗体［バイオメデ
ィカル社（Biomedical Tech. Inc.）］を用いて検討した。ヒトのクラスＩ抗原のマー
カーとしてはβ−２マイクログロブリンに対するマウス
のモノクロナル抗体（Immunotech）を使用した（参考文
献16および17）。
透過型電子顕微鏡用に、サンプルを１％のグルタルア
ルデヒド、0.5％のパラホルムアルデヒド、0.1Mのリン
酸塩バッファー中に固定し、１％の四酸化オスミウムで
予備固定し、アルコール中で脱水し、エポキシ中に包埋
した。極薄切片をジェオル社の透過型電子顕微鏡JEOL12
00EXを用いて観察し、撮影した（参考文献18）。
無胸腺マウスへの移植 接合法は前記の参考文献19に記載の方法によった。こ
の方法は、簡単に説明すると、17匹の先天性無胸腺マウ
ス（Swiss nu/nu,Iffa Credo,Lyon,France）（６〜10週
齢）をソジウムペントバルビタールで麻酔し、各固体に
対して、筋膜上の血管新生組織を完全に残しながら表皮
と真皮とを慎重に採取し、背中側面に直径1.5cmの円形
の接合部位をつくる。
移植片の端部を接合部分のマウスの皮膚の下側に挿入
し、ワセリンを含ませたガーゼおよびプラスチック製カ
プセルで覆い（17匹のうち４匹）、４個所を十字に縫合
して固定し、包帯で保護する。別の７匹についてはプラ
スチック製カプセルを省略し、伸縮性の包帯で接合片を
移植部位に固定する。変形例として、残りの６匹につい
ては、プラスチック製カプセルの代わりにシリコン製移
植チャンバー（Renner GmbH,Darmstadt,RFA）を用い、
これを移植片の上にのせ、9mmのクリップで固定した。1
4、20または30日後に、包帯、カプセルおよびガーゼを
除去し、接合片を外科的に切り取って光学顕微鏡および
電子顕微鏡で観察した。
基底膜の観察 基底膜の形成は凍結切片に対して間接蛍光免疫法と透
過型電子顕微鏡を使用して検討した。
表皮−真皮結合部の上記３種類の構成要素は、ラミニ
ンに対する抗体［パスツール研究所（Institut Pasteu
r）］、コラーゲンIVに対する抗体［パスツール研究所
（Institut Pasteur）］またはヒトコラーゲンIV（HEY
L）に対するマウスのモノクロナル抗体およびBP（Bullo
us Pemphigoid）患者の血清を用いて検出した。
結果 代用真皮 代用真皮は、厚さ400ミクロンの多孔性（孔径50〜100
ミクロン）繊維質コラーゲンＩ＋III層と、これを覆う
厚さ10〜20ミクロンのコラーゲンIV/IVoxの稠密層とで
構成されている。
この代用真皮を多重層の上皮で覆うことによって、支
持体なしで容易に取り扱うことができるようになる。
コラーゲンIVに対する抗体を用いた間接免疫蛍光法に
より、コラーゲンＩ＋III層の表面に薄い層があり、こ
の層中には細いフィラメントが存在し、コラーゲンIVが
わずかにＩ＋IIIの層内に入り込んでいることが明らか
になった。
インビトロでのKHNAの増殖と分化 KHNAは迅速にコラーゲンに付着し、拡大し、分化して
集密上皮を形成する。接種細胞数を105、５×104、３×
104個／cm2とした場合に、それぞれ３、４および５日後
に集密状態となる。血清を除いた培地では８×103個／c
m2の接種で13日後に集密状態となった。
組織学的手法および電子顕微鏡によって、表皮細胞の
分化は接種後６〜25日目で発生することが分かる。14日
後に培養細胞を組織学的に調べると、十分に器官形成さ
れた基底細胞の層と、多数の偏平な無核細胞で構成され
る複数層からなる上部基底細胞とで形成された多層構造
の上皮が存在することが分かる。ケラトヒアリン顆粒は
無核細胞層の下側にある細胞の細胞質内に散在している
のが観察される。培養細胞を空気に曝すと、厚い角質層
が観察される。錯角化症状が観察されることもある。
培養開始６日後には、はっきりとした核、細胞小器
官、中間フィラメントおよびトノフィラメントを有する
立方体の小さな細胞で構成される基底細胞層が電子顕微
鏡下で観察される。この層は上部基底層で被われてい
る。この上部基底層は多数の器官と中間フィラメントと
を有するが、ケラトヒアリン顆粒は有していない大型の
細胞で形成されている。培養をさらに続けると積層構造
が増加する。これらの細胞層は明確な構造を有するデス
モソームと狭い細胞間間隙とを介して密接している。散
在するケラトヒアリン顆粒は球状をしており、上部の中
間細胞層内に見られる。その後は積層構造は大幅には増
加しないが、無核の細胞と少量の落屑とが観察できる。
インビボでのケラチン細胞の分化 マウスの表皮細胞の移動を抑制するプラスチック製ま
たはシリコン製の移植チャンバー内に移植片を維持した
場合には、明確な積層構造のみの表皮が観察される。14
日目には代用真皮のコラーゲンＩ＋III層に炎症性の細
胞および繊維芽細胞が浸透し始める。30日後は、コラー
ゲンＩ＋III繊維は一部を残して多数の繊維芽細胞およ
び幾らかの単核細胞によって浸食されているのが観察さ
れる。コラーゲンＩ＋III層が減衰すると、殆ど影響を
受けていないコラーゲンの領域またはヒトのコラーゲン
繊維が点在する再編成組織が不均一に生じる。コラーゲ
ンIV/IVox層はほとんどがもとのままで浸食を受けな
い。従って、コラーゲンIV/IVoxは密閉条件下では減衰
に対する抵抗性があるものと見られる。代用真皮を非密
閉条件下で接合した場合にはコラーゲンはより急速に減
衰して行く。接合後２週間以内に、上皮に顆粒層と角質
層が形成される。この接合表皮は、培養上皮や代用皮膚
を接合した場合に一般に見られる肥大性（hypertrophiq
ue）（参考文献20、21）を示すことはない。
接合２週間後には、上部の活性のある層とわずかにオ
ルトケラトースを有する角質層との内に多数のケラトヒ
アリン顆粒が観察される。20日後には、基底細胞層内お
よび僅かではあるが上部基底層内にβ２マイクログロブ
リンが見られる。30日後には、基底細胞層と上部基底細
胞層がはっきりしてくる。
14日後には、KL1抗体による着色が表皮層全体に渡っ
て観察された。基底細胞層は20日後には部分的に陰性を
示し始める。プロフィラグリン／フィラグリンによるラ
ベル化は、正常なヒトの皮膚で観察した場合と同様に、
顆粒層に限られる。インボルクリンの発言は14、20およ
び30日後に基底膜の上部で見られる。しかし、30および
55日後ではこの発現は中間層およびマルピーギ小体上部
にほぼ限定され、30日後では顆粒層に限定される。
真皮−表皮結合の研究 インビトロ試験 培養６日の電子顕微鏡観察では、コラーゲンIV/IVox
層と基底細胞の間の結合部にヘミデスモソーム型の構造
が多数観察される。真皮−表皮の結合部位は隆起のない
線状構造である。中間フィラメントが入り込んだ基底細
胞の細胞膜に沿った電子密度の高い細胞間プラークと、
稠密な下部基底層とが見られる。アンカーフィラメント
も確認することができる。フィルムの表面には緻密な線
と被膜に類似した電子密度の高い帯とが見える。これは
発生途中段階でのヒトの胎児の皮膚での真皮−表皮結合
部に類似している。
免疫蛍光法では培養６日目からBP抗原が発現する。こ
の段階では検出されないラミニンは12日目から検出でき
る。２種の抗原ラベルが基底細胞の下面に不連続的蛍光
として観察される。コラーゲンIVの抗体を用いた免疫蛍
光反応ではコラーゲンIV/IVox層全体に蛍光が見られ
る。
インビボ試験 移植後30および55日後には、コラーゲンIV/IVox層が
より薄く見えるため、インビトロ培養の場合よりも基底
膜の微細構造が明瞭である。十分に分化した多数のヘミ
デスモソームおよびラミナデンサが観察される。場所に
よっては、コラーゲンIV/IVox層が表皮細胞によって浸
食され、部分的に減衰している。これらの部分では30日
後の観察でラミナデンサの下にアンカーフィラメントが
見られる。55日後、ラミナデンサの下側の結合組織はよ
り組織化され、アンカーフィラメントの構造もより明確
になる。光学顕微鏡では、真皮−表皮結合部位はわずか
に波打った形状を示し、電子顕微鏡では基底細胞の真皮
−表皮境界面はその底部で波状の細胞膜を形成してい
る。
本発明で得られる表皮の品質は、ヒトおよび動物の生
検法で用いる通常の手法に従って毒物学、薬理学、美容
学の評価試験に適用可能なものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チオリエ，ジェローム フランス国 69009 リヨン ケ ジャ イール 41 (72)発明者 デュマ，アンリ フランス国 69005 リヨン アヴニュ ドゥ ムニヴァル 10 バティマン 11―アー (72)発明者 タルディ，ミッシェル フランス国 69005 リヨン リュ ジ ョリオ―キューリー 165 ビス (56)参考文献 特開 昭62−246371（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−270162（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−8974（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−15041（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−129563（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500435（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61L 27/00 A61L 15/00 - 15/04

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】代用真皮を形成するIV型コラーゲンをベー
    スとした支持体と、表皮細胞をインビトロで成長させ、
    増殖させた後に上記支持体上で培養させて得られる多層
    構造の上皮とが互いに密接に結合したもので構成され
    る、コラーゲンをベースとした生物材料。
  2. 【請求項２】代用真皮を形成する支持体が、他の型のコ
    ラーゲンからなる下層を少なくとも一つさらに有する請
    求項１に記載の生物材料。
  3. 【請求項３】上記下層がコラーゲンＩ＋IIIで構成され
    る請求項２に記載の生物材料。
  4. 【請求項４】表皮細胞がケラチン細胞である請求項１〜
    ３のいずれか一項に記載の生物材料。
  5. 【請求項５】コラーゲンが天然物、架橋コラーゲンまた
    はこれらの混合物である請求項１〜４のいずれか一項に
    記載の生物材料。
  6. 【請求項６】毒物学、薬理学または美容学のインビトロ
    評価試験で用いられる請求項１〜５のいずれか一項に記
    載の生物材料。
  7. 【請求項７】傷口および火傷の保護または瘢痕形成剤に
    用いられる請求項１〜５のいずれか一項に記載の生物材
    料。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012133629A1 (ja) 2011-03-29 2012-10-04 国立大学法人大阪大学 人工皮膚モデルの製造方法、及び人工皮膚モデル
WO2014038599A1 (ja) 2012-09-04 2014-03-13 国立大学法人大阪大学 人工皮膚組織、人工皮膚モデル及びそれらの製造方法
WO2021039833A1 (ja) 2019-08-29 2021-03-04 国立大学法人愛媛大学 培養組織の製造方法、及び外用剤

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5763255A (en) * 1994-04-25 1998-06-09 Becton Dickinson And Company Inducing epithelial cell differentiation with dried native fibrillar collagen
JP3377354B2 (ja) * 1995-12-25 2003-02-17 株式会社メニコン 人工皮膚
FR2744133A1 (fr) * 1996-01-30 1997-08-01 Imedex Procede de culture de cellules a potentiel angiogenique pour induire la morphogenese vasculaire desdites cellules, modeles in vitro de morphogenese vasculaire ainsi obtenus, et leurs applications notamment au criblage de drogues
FR2792728B1 (fr) * 1999-04-20 2003-05-09 Oreal Procede d'evaluation de l'effet d'un produit sur la lipogenese de l'epiderme
US20020095157A1 (en) 1999-07-23 2002-07-18 Bowman Steven M. Graft fixation device combination
US6179840B1 (en) 1999-07-23 2001-01-30 Ethicon, Inc. Graft fixation device and method
FR2799650B1 (fr) 1999-10-14 2001-12-07 Oreal Procede pour limiter la penetration dans la peau et/ou les fibres keratiniques d'un agent cosmetique et/ou pharmaceutique actif
US6309454B1 (en) 2000-05-12 2001-10-30 Johnson & Johnson Medical Limited Freeze-dried composite materials and processes for the production thereof
CA2365376C (en) 2000-12-21 2006-03-28 Ethicon, Inc. Use of reinforced foam implants with enhanced integrity for soft tissue repair and regeneration
US6599323B2 (en) * 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
US20040078090A1 (en) 2002-10-18 2004-04-22 Francois Binette Biocompatible scaffolds with tissue fragments
US7824701B2 (en) 2002-10-18 2010-11-02 Ethicon, Inc. Biocompatible scaffold for ligament or tendon repair
US8197837B2 (en) 2003-03-07 2012-06-12 Depuy Mitek, Inc. Method of preparation of bioabsorbable porous reinforced tissue implants and implants thereof
US8226715B2 (en) 2003-06-30 2012-07-24 Depuy Mitek, Inc. Scaffold for connective tissue repair
US10583220B2 (en) 2003-08-11 2020-03-10 DePuy Synthes Products, Inc. Method and apparatus for resurfacing an articular surface
US7316822B2 (en) 2003-11-26 2008-01-08 Ethicon, Inc. Conformable tissue repair implant capable of injection delivery
US7901461B2 (en) 2003-12-05 2011-03-08 Ethicon, Inc. Viable tissue repair implants and methods of use
US11395865B2 (en) 2004-02-09 2022-07-26 DePuy Synthes Products, Inc. Scaffolds with viable tissue
US8137686B2 (en) 2004-04-20 2012-03-20 Depuy Mitek, Inc. Nonwoven tissue scaffold
US8221780B2 (en) 2004-04-20 2012-07-17 Depuy Mitek, Inc. Nonwoven tissue scaffold
FR2889808B1 (fr) 2005-08-17 2011-07-22 Oreal Utilisation de l'acide 8-hexadecene-1,16-dicarboxylique comme agent de soin destine a favoriser la cohesion de la couche cornee
JP2007313333A (ja) * 2007-06-08 2007-12-06 Kao Corp 再構成皮膚の構築方法
FR3054449B1 (fr) 2016-07-29 2018-08-31 L'oreal Equivalent de peau a compartiments dermiques juxtaposes distincts
FR3071512B1 (fr) 2017-09-28 2022-02-25 Oreal Signatures moleculaires de trois sous-populations de fibroblastes dermiques et equivalent de derme comprenant une de ces sous-populations
FR3111904B1 (fr) 2020-06-30 2022-10-21 Oreal Bioencre pour bioimpression d’un modèle de jonction dermo-épidermique invaginée
EP4159250A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-05 Korea University Research and Business Foundation Method of enhancing structural integrity of epidermis in culture of reconstructed human skin

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4604346A (en) * 1984-10-09 1986-08-05 Massachusetts Institute Of Technology Skin-equivalent prepared by the use of punch biopsy
JPH0655218B2 (ja) * 1986-01-14 1994-07-27 株式会社アドバンス 人工基底膜及びその製造方法
JPS62246371A (ja) * 1986-04-19 1987-10-27 株式会社　高研 人工皮膚及びその製造方法
FR2612938B1 (fr) * 1987-03-26 1989-06-23 Cird Procede d'obtention d'un equivalent de peau et equivalent de peau correspondant
FR2612939B1 (fr) * 1987-03-26 1989-06-23 Cird Equivalent de peau
US4876332A (en) * 1987-10-08 1989-10-24 Regents Of The Univeristy Of Minnesota Polypeptides with type IV collagen activity
FR2628634B1 (fr) * 1988-03-15 1990-07-13 Imedex Patch de chirurgie viscerale
JPH04129563A (ja) * 1990-09-19 1992-04-30 Terumo Corp 人工皮膚及びその製造方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012133629A1 (ja) 2011-03-29 2012-10-04 国立大学法人大阪大学 人工皮膚モデルの製造方法、及び人工皮膚モデル
US10073085B2 (en) 2011-03-29 2018-09-11 Osaka University Method for producing artificial skin model, and artificial skin model
WO2014038599A1 (ja) 2012-09-04 2014-03-13 国立大学法人大阪大学 人工皮膚組織、人工皮膚モデル及びそれらの製造方法
WO2021039833A1 (ja) 2019-08-29 2021-03-04 国立大学法人愛媛大学 培養組織の製造方法、及び外用剤

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