JP6041199B2 - 三次元細胞培養体の製造方法 - Google Patents
三次元細胞培養体の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6041199B2 JP6041199B2 JP2012203154A JP2012203154A JP6041199B2 JP 6041199 B2 JP6041199 B2 JP 6041199B2 JP 2012203154 A JP2012203154 A JP 2012203154A JP 2012203154 A JP2012203154 A JP 2012203154A JP 6041199 B2 JP6041199 B2 JP 6041199B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- medium
- coated
- substance
- cell culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/52—Fibronectin; Laminin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本開示は、一又は複数の態様において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を播種すること、前記播種した被覆細胞を培地中で培養すること、及び前記培地の少なくとも一部を5日以上継続使用することを含む、細胞層が少なくとも2層以上積層された三次元細胞培養体の製造方法(以下、「本開示の第1の製造方法」ともいう)に関する。本開示の第1の製造方法によれば、一又は複数の実施形態において、高い活性を示す三次元細胞培養体を提供できる。
本開示は、一又は複数の態様において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を播種すること、及び前記播種した被覆細胞を培地中で培養すること、を含み、前記被覆細胞の培養は、前記被覆細胞を、細胞1×104個あたり70μL以上の培地中で培養することを含む、細胞層が少なくとも2層以上積層された三次元細胞培養体の製造方法(以下、「本開示の第2の製造方法」ともいう)に関する。
RGD配列を有する物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Arg−Gly−Asp」(RGD)配列をするタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「RGD配列を有する」とは、元来RGD配列を有するものでもよいし、RGD配列が化学的に結合されたものでもよい。RGD配列を有する物質は、生分解性であることが好ましい。
相互作用する物質とは、RGD配列を有する物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び又はファンデルワールス力等により、化学的及び又は物理的にRGD配列を有する物質と相互作用する物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する物質は、生分解性であることが好ましい。
正の電荷を有する物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムc、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、ポリ(α−リジン)、ポリ(ε−リジン)等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(PDDA)、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
負の電荷を有する物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ(βリジン)等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。
本開示は、少なくとも2層以上積層された細胞と、細胞外マトリックス成分を含む三次元細胞培養体であって、本開示の第1又は第2の製造方法により製造される三次元細胞培養体に関する。本開示の三次元細胞培養体は、一又は複数の実施形態において、高い活性を示すことができる。本開示の三次元細胞培養体における細胞、及び細胞外マトリックス成分は、上述のとおりである。
本開示は、一又は複数の態様において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を播種すること、前記播種した被覆細胞を培地中で培養すること、及び前記培地の少なくとも一部を5日以上継続使用することを含む、被覆細胞の培養方法に関する。また、本開示は、一又は複数の態様において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を播種すること、及び前記播種した被覆細胞を培地中で培養することを含み、前記被覆細胞の培養は、前記被覆細胞を、細胞1×104個あたり70μL以上の培地中で培養することを含む、被覆細胞の培養方法に関する。本開示の被覆細胞の培養方法における培養条件等は上記の通りである。
本開示は、一又は複数の態様において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を播種すること、前記播種した被覆細胞を培地中で培養すること、及び前記培地の少なくとも一部を5日以上継続使用することを含む、細胞層が少なくとも2層以上積層された三次元細胞培養体の製造方法に関する。また、本開示は、一又は複数の態様において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を播種すること、及び前記播種した被覆細胞を培地中で培養することを含み、前記被覆細胞の培養は、前記被覆細胞を、細胞1×104個あたり70μL以上の培地中で培養することを含む、細胞層が少なくとも2層以上積層された三次元細胞培養体の培養方法に関する。本開示の三次元細胞培養体の培養方法における培養条件等は上記の通りである。
HepG2細胞をプラスチックシャーレ上からトリプシン処理によって回収した。回収した細胞を1×107cell/mlの濃度で0.2mg/mlのフィブロネクチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った(FN浸漬操作)。ついで、上澄みを除き、50 mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液を加え、細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行った(洗浄操作)。上澄みを除き、0.2mg/mlのゼラチンを含む50mM Tris-HCl(pH=7.4)溶液に細胞を分散させ、転倒混和によって緩やかに撹拌しながら、1分間分散状態を保った後、2,500rpmの回転数で1分間の遠心分離を行い(G浸漬操作)、ついで洗浄操作を行った。そして、FN浸漬操作、洗浄操作、G浸漬操作、及び洗浄操作をこの順番で行った。FN浸漬操作及びG浸漬操作は洗浄操作とそれぞれセットで1ステップとし、最終的に、FN浸漬操作を5回、G浸漬操作を4回、計9ステップ行うことによってFN-Gコート細胞を準備した(細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚み:8nm)。
(実施例1)
24ウェル培養プレートに配置したトランスウェル(コーニング社製;ポアサイズ:0.4μm、表面積:0.33cm2)のメンブレンフィルタ上に、7×105個のHepG2被覆細胞を播種し、10重量%ウシ胎仔血清を含むEagle's MEM培地2.5mLを添加して37℃で1日培養した。前記被覆細胞を播種したトランスウェルを6ウェル培養プレートに配置し、10重量%ウシ胎仔血清を含むEagle's MEM培地12mLを添加して培地交換を行うことなく37℃で8日間培養を行い、三次元細胞培養体を製造した(培養中の培地量:細胞1×104個あたり170μL)。
6ウェル培養プレートに配置後、2日おきに培地交換を行いながら培養を行った以外は実施例1と同様に三次元細胞培養体を製造した。なお、培地交換はウェルに含まれる培地のほぼ全量を除去し、新たな培地を添加することにより行った(培養中の培地量:細胞1×104個あたり170μL)。
トランスウェルを24ウェル培養プレート配置したまま播種1日後の培地交換、さらに2日おきに培地交換を行いながら培養を行った以外は実施例1と同様に三次元細胞培養体を製造した。なお、培地交換はウェルに含まれる培地のほぼ全量を除去し、新たな培地を添加することにより行った(培養中の培地量:細胞1×104個あたり36μL)。
培地交換前にインサート内部と外部のそれぞれの溶液の吸光度(560nm)を測定した。その結果を図1に示す。図1A〜Cは、インサート内部と外部のそれぞれの溶液の吸光度を示すグラフであって、図1Aが培養3日目の培地交換前の溶液の吸光度、図1Bが培養7日目の培地交換前の溶液の吸光度、図1Cが培養9日目の溶液の吸光度をそれぞれ示す。図1に示すように、比較例1(24ウェル)は、培養3日目、7日目及び9日目インサート内側の溶液及び外側の溶液のいずれも、実施例1及び2と比較して吸光度が低く、培地が消耗していることが予測された。また、培養7日目及び9日目において、比較例1のインサート外側の溶液の吸光度が、実施例1及び2のインサート内側の溶液の吸光度よりも低かったことから、培地全体にわたって消耗しているものと考えられた。これに対し、実施例1及び2はインサート内側と外側とで吸光度の差が低く、特に実施例2ではほとんど差が見られなかった。
9日間培養後のサンプルからRNAを抽出し、リアルタイムPCRによってCYP1A1、CYP1A2、ALB(アルブミン)及びCYP3A4の遺伝子発現量を測定した。その結果を、比較例1の遺伝子発現量を1とした場合の相対値として図2に示す。図2に示すように、実施例1及び2のサンプルは、比較例1のサンプルと比較してCYP活性及びアルブミン産生量が高かった。この結果により、実施例1及び2の方法により三次元細胞培養体を製造することによって、より活性の高い三次元細胞培養体が得られることが示唆された。
実施例3として、6ウェルに代えて100mm dishを使用した以外は実施例1と同様の条件で被覆細胞の培養を行った(培養中の培地量:細胞1×104個あたり1mL)。また、実施例4として、実施例1と同様の条件で被覆細胞の培養を行った。実施例5として、6ウェルに代えて24ウェルを使用した以外は実施例1と同様の条件で被覆細胞の培養を行った(培養中の培地量:細胞1×104個あたり36μL)。実施例3〜5で得られた三次元細胞培養体につき遺伝子の発現量の評価を行った。その結果を、比較例1と同様の条件で行った場合(従来法)の遺伝子発現量を1とした場合の相対値として図3に示す。
実施例6として、実施例1と同様の条件で被覆細胞の培養を行った。参考例としては、インサートを使用することなく、7×105個の細胞をそのままウェルに播種した以外は実施例1と同様の条件で被覆細胞の培養を行った。実施例6で得られた三次元細胞培養体及び参考例の細胞につき遺伝子の発現量の評価を行った。その結果を、比較例1と同様の条件で行った場合(従来法)の9日間培養後のサンプルの遺伝子発現量を1とした場合の相対値として図4に示す。
実施例3〜5で得られた三次元細胞培養体の形態についての評価を行った。図3に示すように、実施例3及び4で得られた三次元細胞培養体は、従来法の三次元細胞培養体よりも高い活性を示し、実施例5で得られた三次元細胞培養体は、従来法の三次元細胞培養体と略同程度の活性を示した。また、実施例3〜5で得られた三次元細胞培養体の顕微鏡写真の一例を図5に示す。図5に示すように、6ウェルで培養した実施例3及び100mm dishで培養した実施例4の三次元細胞培養体は、24ウェルで培養した実施例5と比較して厚み及び層数が大きかった。
実施例7として、実施例3と同様の条件(培養中の培地量:細胞1×104個あたり1mL、2日目以降培地交換なし)で被覆細胞の培養を27日間行った。培養9日目、18日目及び27日目のサンプルについて、リアルタイムPCRによってCYP1A1、及びALBの遺伝子発現量を測定した。その結果を、従来法(培地量:細胞1×104個あたり36μL、2日目以降2日おきに培地交換)で9日間培養後のサンプルの遺伝子発現量を1とした場合の相対値として図6に示す。図6AがALBの発現量を示すグラフであり、図6BがCYP1A1の発現量を示すグラフである。図6に示すとおり、ALB及びCYP1A1のいずれも、27日の培養期間において高い発現量が維持された。これにより、27日間培地交換することなく培地を継続使用して被覆細胞を培養した場合であっても、三次元細胞培養体の活性が維持され、高い活性が維持された三次元細胞培養体が得られることが確認できた。
Claims (3)
- 細胞層が少なくとも2層以上積層された三次元細胞培養体の製造方法であって、
細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を播種すること、
前記播種した被覆細胞を培地中で培養すること、及び
前記培地の少なくとも一部を8日以上継続使用すること、を含む、製造方法。 - 前記被覆細胞の培養は、前記被覆細胞を、細胞1×104個あたり70μL以上の培地中で培養することを含む、請求項1記載の製造方法。
- 細胞層が少なくとも2層以上積層された三次元細胞培養体の製造方法であって、
細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を播種すること、及び前記播種した被覆細胞を培地中で培養すること、を含み、
前記被覆細胞の培養は、前記被覆細胞を、細胞1×104個あたり170μL以上の培地中で培養することを含む、製造方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012203154A JP6041199B2 (ja) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | 三次元細胞培養体の製造方法 |
PCT/JP2013/074743 WO2014042225A1 (ja) | 2012-09-14 | 2013-09-12 | 三次元細胞培養体の製造方法 |
US14/427,536 US20150247118A1 (en) | 2012-09-14 | 2013-09-12 | Method for producing 3d cell culture |
EP13837501.9A EP2896687B1 (en) | 2012-09-14 | 2013-09-12 | Method for producing 3d cell culture |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012203154A JP6041199B2 (ja) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | 三次元細胞培養体の製造方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014057527A JP2014057527A (ja) | 2014-04-03 |
JP2014057527A5 JP2014057527A5 (ja) | 2015-06-18 |
JP6041199B2 true JP6041199B2 (ja) | 2016-12-07 |
Family
ID=50278333
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012203154A Expired - Fee Related JP6041199B2 (ja) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | 三次元細胞培養体の製造方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150247118A1 (ja) |
EP (1) | EP2896687B1 (ja) |
JP (1) | JP6041199B2 (ja) |
WO (1) | WO2014042225A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016027853A1 (ja) * | 2014-08-22 | 2016-02-25 | 国立大学法人大阪大学 | 被覆細胞、その製造方法及び被覆細胞を用いた三次元組織体の製造方法 |
WO2022073090A1 (pt) * | 2020-10-06 | 2022-04-14 | Janaina De Andrea Dernowsek Ltda | Método para a produção de uma composição de proteínas de matriz extracelular e produto obtido por tal método |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0304799D0 (en) * | 2003-03-03 | 2003-04-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel method |
JP4919464B2 (ja) | 2006-03-02 | 2012-04-18 | 国立大学法人大阪大学 | 三次元組織の製造方法およびそれに用いる細胞外マトリックスの製造方法。 |
GB0916370D0 (en) * | 2009-09-18 | 2009-10-28 | Avecia Biolog Ltd | Compositions |
JP2012029684A (ja) * | 2010-06-30 | 2012-02-16 | Cell Aid Kenkyusho:Kk | 細胞の製造方法 |
JP5850419B2 (ja) * | 2010-11-11 | 2016-02-03 | 国立大学法人大阪大学 | 細胞の三次元構造体、及び、これを製造する方法 |
-
2012
- 2012-09-14 JP JP2012203154A patent/JP6041199B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-09-12 US US14/427,536 patent/US20150247118A1/en not_active Abandoned
- 2013-09-12 WO PCT/JP2013/074743 patent/WO2014042225A1/ja active Application Filing
- 2013-09-12 EP EP13837501.9A patent/EP2896687B1/en not_active Not-in-force
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2896687A4 (en) | 2016-03-02 |
US20150247118A1 (en) | 2015-09-03 |
EP2896687A1 (en) | 2015-07-22 |
EP2896687B1 (en) | 2019-06-26 |
JP2014057527A (ja) | 2014-04-03 |
WO2014042225A1 (ja) | 2014-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8137964B2 (en) | Method of producing three-dimensional tissue and method of producing extracellular matrix used in the same | |
JP5850419B2 (ja) | 細胞の三次元構造体、及び、これを製造する方法 | |
WO2012133629A1 (ja) | 人工皮膚モデルの製造方法、及び人工皮膚モデル | |
Yang et al. | Studies on bone marrow stromal cells affinity of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) | |
WO2017146124A1 (ja) | 立体的細胞組織の製造方法 | |
Ryu et al. | Nanothin coculture membranes with tunable pore architecture and thermoresponsive functionality for transfer-printable stem cell-derived cardiac sheets | |
AU2003277040A1 (en) | Programmable scaffold and methods for making and using the same | |
JP6608281B2 (ja) | 薬剤候補化合物のスクリーニングに用いる心筋組織チップの製造方法 | |
JP6519050B2 (ja) | 人工皮膚組織、人工皮膚モデル及びそれらの製造方法 | |
Kotobuki et al. | Proliferation and harvest of human mesenchymal stem cells using new thermoresponsive nanocomposite gels | |
Qiu et al. | A simple method for cell sheet fabrication using mica surfaces grafted with peptide detergent A6K | |
JP6041199B2 (ja) | 三次元細胞培養体の製造方法 | |
JP6341553B2 (ja) | 三次元組織体及びその製造方法 | |
JP7256818B2 (ja) | 心筋細胞のシート化方法 | |
US20040072338A1 (en) | Carrier for cell culture | |
WO2015025958A1 (ja) | ペースメーカー組織片の製造方法 | |
JP6426327B2 (ja) | 接着状態の細胞培養物の改変方法 | |
JP5884218B2 (ja) | 腫瘍組織モデルの製造方法 | |
JP6315604B2 (ja) | 人工皮膚モデルの製造方法、及び人工皮膚モデル | |
JPWO2014027693A1 (ja) | 被覆細胞の製造方法、及び細胞の三次元構造体の製造方法 | |
JP2015144622A (ja) | 人工皮膚モデルの製造方法、及び人工皮膚モデル | |
WO2023120573A1 (ja) | 立体的細胞組織の培養方法 | |
JP2013233113A (ja) | 物理的負荷への耐性が向上した細胞の製造方法 | |
WO2024064792A2 (en) | Fully defined matrices for organoid culture | |
Matsusaki et al. | Cell surface engineering using a layer-by-layer nanofilm for biomedical applications |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150428 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150428 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150428 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160322 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20160512 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160720 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20161013 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161027 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6041199 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |