JPWO2014027693A1 - 被覆細胞の製造方法、及び細胞の三次元構造体の製造方法 - Google Patents

Abstract

細胞の三次元構造体を簡単かつ効率よく製造可能な、被覆細胞の製造方法等の提供。少なくとも２つの開口部と開口部間を連通する流路とを有するデバイス１１において、流路に細胞を導入すること、及び細胞が導入された流路に送液手段１２を用いて細胞外マトリックス成分を含む液体を導入することを含み、液体の導入は、流路内に層流が形成され、細胞の表面に細胞外マトリックス成分を含有する被膜が形成されるように送液手段１２を制御して行う、細胞表面が細胞外マトリックス成分含有被膜で被覆された被覆細胞を製造する方法。

Description

本発明は、被覆細胞の製造方法、細胞の三次元構造体の製造方法、被覆細胞自動製造システム、及び細胞の三次元構造体自動製造システムに関する。

近年、新たな医療として再生医療が注目され、骨や軟骨、皮膚等の構造が比較的単純な組織については、実用化され臨床応用の段階まで進んでいる。しかしながら、腎臓や肝臓等といった組織は複雑な三次元構造を有し、かつ多種の細胞が組織化されている。このため、上記のような皮膚等の比較的構造が単純な組織とは異なり、細胞を培養することのみで組織化することが困難であり、まだ基礎研究の段階である。

細胞を液体培地内で培養した場合、細胞は二次元（すなわち、平面方向）に増殖するものの、三次元（すなわち、高さ方向）には増殖し難いため、細胞を液体培地内で培養するのみでは三次元的な組織化を実現することは困難である。このため、細胞を三次元組織化する方法として様々な方法が提案されている（例えば、特許文献１〜３、及び非特許文献１〜４）。特許文献１及び非特許文献１には、まず細胞を二次元培養して二次元の細胞シートを形成し、得られた細胞シートを重ね合わせることによって細胞シートを重層化し、三次元組織を得る方法が開示されている。特許文献２には、細胞層と細胞外マトリックス成分含有層とを交互に形成することによって三次元組織を得る方法が開示されている。特許文献３には、細胞外マトリックス成分と細胞とを含む細胞培養液を循環培養する経路内にメッシュ部材と液流制御部材とが配設されたリアクターを用いて三次元組織を形成する方法が開示されている。非特許文献２には、空隙の多い繊維構造を有するハイドロゲル内で細胞を培養し、ハイドロゲル繊維の三次元ネットワークを利用して三次元組織を得る方法が開示されている。非特許文献３及び４には、マイクロ流路内に細胞を含むハイドロゲルを導入し、細胞を三次元培養する方法が開示されている。

ＷＯ２００６／０９３１５３号 特開２００７−２２８９２１号公報 特開２０１０−１７２２４７号公報

T. Sanagawa et al., Biomaterials, 2010, 31, (７) 1646-1654 A. Horii et al., PLoS ONE, 2007, (2) e190 W. Tan et al., Biomaterials, 2004, 25, (7-8) 1355-1364 Y. Ling et al., Lab Chip, 2007, 7, 756-762

しかしながら、特許文献１及び２、非特許文献１及び２の方法では、例えば、極めて煩雑であったり、三次元構造体を得るのに多大な労力や時間を要する等といった問題がある。特許文献３の方法は、同文献に開示された特別な装置が必要であるという問題等がある。また、非特許文献３及び４の方法では、複数種類の細胞が組織化された三次元構造体を製造することが困難であるという問題がある。このため、細胞の三次元構造体を簡単かつ効率よく製造可能な新たな方法が求められている。

そこで、本発明は、細胞の三次元構造体を簡単かつ効率よく製造可能な、被覆細胞の製造方法、細胞の三次元構造体の製造方法、被覆細胞自動製造システム、及び細胞の三次元構造体自動製造システムを提供する。

本発明は、一態様において、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイスにおいて、前記流路に細胞を導入すること、及び前記細胞が導入された流路に送液手段を用いて細胞外マトリックス成分を含む液体を導入することを含み、前記液体の導入は、前記流路の少なくとも一部に層流が形成され、前記層流が前記細胞に接触するように前記送液手段を制御して行う、細胞表面が細胞外マトリックス成分含有被膜で被覆された被覆細胞を製造する方法に関する。

本発明は、その他の態様において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を調製すること、及び前記被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された細胞の三次元構造体を形成することを含み、前記被覆細胞の調製は、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイスにおいて、前記流路に細胞を導入すること、及び前記細胞が導入された流路に送液手段を用いて細胞外マトリックス成分を含む液体を導入することを含み、前記液体の導入は、前記流路の少なくとも一部に層流が形成され、前記層流が前記細胞に接触するように前記送液手段を制御して行う、細胞の三次元構造体の製造方法に関する。

本発明は、さらにその他の態様において、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイスにおいて、前記流路に細胞を導入して細胞層を形成すること、前記細胞層上に細胞外マトリックスを形成されるように送液手段を制御して、前記細胞層が形成された流路に細胞外マトリックス成分を含む液体を導入すること、及び前記細胞外マトリックス成分を含む液体が導入された流路に、細胞を導入して前記細胞外マトリックス上に細胞層を１層以上積層することを含み、細胞の三次元構造体の製造方法に関する。

本発明は、さらにその他の態様において、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイス、前記デバイスの流路に、細胞外マトリックス成分を含有する液体を導入するための送液手段、及び前記流路の少なくとも一部に層流が形成されるように、前記細胞外マトリックス成分を含有する液体を前記流路に導入するように前記送液手段を制御する制御部を備える被覆細胞自動製造システムに関する。

本発明は、さらにその他の態様において、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイス、前記デバイスの流路に、細胞外マトリックス成分を含有する液体を導入するための送液手段、及び前記流路に前記細胞外マトリックス成分を含有する層が形成されるように、前記細胞外マトリックス成分を含有する液体を前記流路に導入するように前記送液手段を制御する制御部を備える、細胞の三次元構造体自動製造システムに関する。

本発明によれば、細胞の三次元構造体を簡単かつ効率よく製造可能な、被覆細胞の製造方法、細胞の三次元構造体の製造方法、被覆細胞自動製造システム、及び細胞の三次元構造体自動製造システムを提供できる。

図１は、実施形態１の被覆細胞自動製造システムの概略構成図である。 図２Ａは、実施形態１におけるデバイスの斜視図である。 図２Ｂは、実施形態１におけるデバイスのI-I断面図である。 図２Ｃは、実施形態１におけるデバイスの側面図である。 図３は、実施形態１における被覆細胞自動製造システムの動作例を説明するためのフローチャートである。 図４は、実施形態２の細胞の三次元構造体自動製造システムの概略構成図である。 図５Ａは、実施形態２におけるデバイスの斜視図である。 図５Ｂは、実施形態２におけるデバイスのII-II断面図である。 図５Ｃは、実施形態２におけるデバイスのIII-III断面図である。 図６は、実施形態２における細胞の三次元構造体自動製造システムの動作例を説明するためのフローチャートである。 図７は、実施形態３の細胞の三次元構造体自動製造システムの概略構成図である。 図８Ａは、実施形態４におけるデバイスの上面図である。 図８Ｂは、実施形態４におけるデバイスのIV-IV断面図である。 図９Ａは、実施形態４におけるその他の例のデバイスの上面図である。 図９Ｂは、実施形態４におけるその他の例のデバイスのV-V断面図である。 図１０は、実施形態５の細胞の三次元構造体自動製造システムの概略構成図である。 図１１Ａは、実施形態５におけるデバイスの斜視図である。 図１１Ｂは、実施形態５におけるデバイスのVI-VI断面図である。 図１１Ｃは、実施形態５におけるデバイスの上面図である。 図１２は、実施例１にて得られた三次元構造体の顕微鏡写真である。 図１３は、実施例２にて得られた三次元構造体の顕微鏡写真である。 図１４Ａは、実施形態６におけるデバイスの斜視図である。 図１４Ｂは、実施形態６におけるデバイスの上面図である。 図１４Ｃは、実施形態６におけるデバイスのVIII-VIII断面図である。

本発明は、流路を有するデバイス内で細胞表面に細胞外マトリックス成分含有被膜を形成することにより、被覆細胞を簡単かつ効率よく製造することができ、細胞の三次元構造体をより簡単かつ効率よく製造できるという知見に基く。また、本発明は、細胞の被覆を流路を有するデバイス内で行うことにより、被覆細胞の製造過程における被覆細胞回収率及び／又は細胞の生存率を向上できるという知見に基く。また、本発明は、流路を有するデバイス内で細胞の三次元構造体の形成を行うことにより、細胞の三次元構造体を簡単かつ効率よく製造できるという知見に基く。

［細胞の三次元構造体］
本明細書において「細胞の三次元構造体」とは、細胞と細胞外マトリックスとの集合体によって構成されるものであって、細胞が細胞外マトリックスを介して少なくとも２層以上積層されたものをいう。また、細胞の三次元構造体は、基板に接着することなく細胞同士が接着し、成育する細胞が存在する細胞の構造体を含みうる。細胞の三次元構造体において含まれる細胞の種類は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。

［被覆細胞］
本明細書において「被覆細胞」とは、細胞外マトリックス成分を含む被膜（以下、「細胞外マトリックス被膜」ともいう）と細胞とを含み、その細胞表面が該被膜によって被覆されている細胞をいう。細胞としては、一又は複数の実施形態において、例えば、繊維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、神経膠細胞、平滑筋細胞、幹細胞、表皮細胞、骨格筋細胞、免疫細胞、及びがん細胞等が挙げられる。幹細胞としては、一又は複数の実施形態において、例えば、組織幹細胞、及び胚性幹細胞等が挙げられる。細胞は、１種類でもよいし、２種類以上を用いてもよい。

［細胞外マトリックス］
本明細書において「細胞外マトリックス」とは、生体内で細胞の外の空間を充填し、骨格的役割、足場を提供する役割、及び／又は、生体因子を保持する役割等の機能を果たす物質を含むものをいい、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養において骨格的役割、足場を提供する役割及び／又は生体因子を保持する役割等の機能を果たしうる物質を含んでいてもよい。細胞外マトリックス成分としては、上記機能を果たしうる物質であればよく、一又は複数の実施形態において、例えば、第１物質と、前記第１物質と相互作用する第２物質（以下、「第２物質」ともいう）との組み合わせが挙げられる。第１物質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、ＲＧＤ配列を有する第１物質、及び正の電荷を有する第１物質が挙げられる。第２物質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、ＲＧＤ配列を有する第１物質と相互作用する第２物質、及び負の電荷を有する第２物質が挙げられる。

［細胞外マトリックス被膜］
本明細書において「細胞外マトリックス被膜」とは、細胞外マトリックスを形成しうる成分を含む被膜のことをいい、一又は複数の実施形態において、例えば、細胞外マトリックスを形成しうる成分によって形成することができる。形成作業の容易性、厚みの調整の容易性、及び細胞培養効率の観点から、細胞外マトリックス被膜は、第１物質を含む膜と、第２物質を含む膜とを含むことが好ましく、隣接する被覆細胞間の接着性向上の観点から、これらの膜が交互に積層されていることがより好ましい。第１物質を含む膜は、実質的に第１物質からなる膜であることが好ましく、第２物質を含む膜は、実質的に第２物質からなる膜であることが好ましい。本明細書において「実質的に第１物質（第２物質）からなる膜」とは、第１物質（第２物質）からなる膜に含まれる主成分が第１物質（第２物質）であることをいい、例えば、第１物質（第２物質）からなる膜における第１物質（第２物質）の含有量が、一又は複数の実施形態において、例えば、６０重量％以上であり、好ましくは７０重量％以上、より好ましくは８０重量％以上である。

（ＲＧＤ配列を有する第１物質）
ＲＧＤ配列を有する第１物質とは、細胞接着活性を担うアミノ酸配列である「Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ」（ＲＧＤ）配列を有するタンパク質又は高分子をいう。本明細書において「ＲＧＤ配列を有する」とは、元来ＲＧＤ配列を有するものでもよいし、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたものでもよい。ＲＧＤ配列を有する第１物質は、生分解性であることが好ましい。

ＲＧＤ配列を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、従来公知の接着性タンパク質、又はＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質等が挙げられる。接着性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、又はコラーゲン等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、グロブリン、プロテオグリカン、酵素、又は抗体等が挙げられる。

ＲＧＤ配列を有する高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ＲＧＤ配列を有する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、例えば、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリアミド、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、又はポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。

ＲＧＤ配列を有する第１物質は、これらの中でも、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、キチン、又はキトサンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、又はＲＧＤ配列を結合させたゼラチンである。

（相互作用する第２物質）
ＲＧＤ配列を有する第１物質と相互作用する第２物質とは、ＲＧＤ配列を有する第１物質と相互作用するタンパク質若しくは高分子をいう。本明細書において「相互作用する」とは、一又は複数の実施形態において、例えば、静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、電荷移動相互作用、共有結合形成、タンパク質間の特異的相互作用、及び/又はファンデルワールス力等により、化学的及び/又は物理的に第１物質と第２物質とが結合、接着、吸着又は電子の授受が可能な程度に近接することを意味する。相互作用する第２物質は、生分解性であることが好ましい。

第１物質と相互作用するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、コラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、又は抗体等が挙げられる。第１物質と相互作用する高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、天然由来高分子、又は合成高分子が挙げられる。第１物質と相互作用する天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、エラスチン、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はデキストラン硫酸等の糖、及びヒアルロン酸等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、一又は複数の実施形態において、例えば、α−ポリリジン又はε−ポリリジン等のポリリジン、ポリグルタミン酸、又はポリアスパラギン酸等が挙げられる。第１物質と相互作用する合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のＲＧＤ配列を有するポリマー又は共重合体が挙げられる。ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレングリコール−グラフト−ポリアクリル酸、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−ポリアクリル酸）、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリエチレンオキサイド、ポリε−カプロラクタム、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸メチル−γ−ポリメタクリル酸オキシエチレン）等が挙げられる。

第２物質は、これらの中でも、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、又はエラスチンが好ましく、より好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、又はコラーゲン、さらに好ましくはゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、又はヒアルロン酸である。

第１物質と第２物質との組み合わせは、特に制限されず、相互作用する異なる物質の組み合わせであればよく、いずれか一方がＲＧＤ配列を含む高分子又はタンパク質であり、他方がこれと相互作用する高分子またはタンパク質であればよい。第１物質と第２物質との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、例えば、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、フィブロネクチンとコラーゲン、ラミニンとゼラチン、ラミニンとコラーゲン、ポリリジンとエラスチン、ビトロネクチンとコラーゲン、ＲＧＤ結合コラーゲン又はＲＧＤ結合ゼラチンとコラーゲン又はゼラチン等が挙げられる。中でも、フィブロネクチンとゼラチン、フィブロネクチンとε−ポリリジン、フィブロネクチンとヒアルロン酸、フィブロネクチンとデキストラン硫酸、フィブロネクチンとヘパリン、又はラミニンとゼラチンが好ましく、より好ましくはフィブロネクチンとゼラチンである。なお、第１物質及び第２物質は、それぞれ一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。

（正の電荷を有する第１物質）
正の電荷を有する第１物質とは、正の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。正の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、塩基性コラーゲン、塩基性ゼラチン、リゾチーム、シトクロムｃ、ペルオキシダーゼ、又はミオグロビン等が挙げられる。正の電荷を有する高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリアミノ酸、キチン又はキトサン等の糖等が挙げられる。ポリアミノ酸としては、ポリ（α−リジン）、ポリ（ε−リジン）等のポリリジン、ポリアルギニン、又はポリヒスチジン等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、又はこれらの共重合体、ポリエステル、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリアリルアミンハイドロクロライド、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。

（負の電荷を有する第２物質）
負の電荷を有する第２物質とは、負の電荷を有するタンパク質又は高分子をいう。負の電荷を有するタンパク質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、水溶性タンパク質が好ましい。水溶性タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、例えば、酸性コラーゲン、酸性ゼラチン、アルブミン、グロブリン、カタラーゼ、β−ラクトグロブリン、チログロブリン、α−ラクトアルブミン、又は卵白アルブミン等が挙げられる。負の電荷を有する高分子としては、天然由来高分子及び合成高分子が挙げられる。天然由来高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、水溶性ポリペプチド、低分子ペプチド、ポリ（βリジン）等のポリアミノ酸、又はデキストラン硫酸等が挙げられる。合成高分子としては、一又は複数の実施形態において、例えば、直鎖型、グラフト型、くし型、樹状型、又は星型等のポリマー又は共重合体が挙げられる。前記ポリマー又は共重合体としては、一又は複数の実施形態において、例えば、ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボネート、及びこれらの共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミドメチルプロパンスルホン酸、末端カルボキシ化ポリエチレングリコール、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩、ポリアリルアミン塩、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、又はポリアミドアミンデンドリマー等が挙げられる。

正の電荷を有する第１物質と負の電荷を有する第２物質との組み合わせとしては、一又は複数の実施形態において、例えば、ε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、ε−ポリリジンとポリスルホン酸塩、キトサンとデキストラン硫酸、ポリアリルアミンハイドロクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリスチレンスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩等が挙げられ、好ましくはε−ポリリジン塩とポリスルホン酸塩、又はポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドとポリアクリル酸塩である。なお、正の電荷を有する第１物質及び負の電荷を有する第２物質は、それぞれ、一種類ずつでもよいし、相互作用を示す範囲で二種類以上をそれぞれ併用してもよい。

［被覆細胞の製造方法］
本発明は、一態様において、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイスにおいて、前記流路に細胞を導入すること、及び前記細胞が導入された流路に送液手段を用いて細胞外マトリックス成分を含む液体を導入することを含み、前記液体の導入は、前記流路の少なくとも一部に層流が形成され、前記層流が前記細胞に接触するように前記送液手段を制御して行う、細胞表面が細胞外マトリックス成分含有被膜で被覆された被覆細胞を製造する方法（以下、「本発明の被覆細胞の製造方法」ともいう）に関する。

本発明の被覆細胞の製造方法は、流路の少なくとも一部に層流が形成されるように細胞外マトリックス成分を含む液体を導入することによって、従来手作業で行われていた細胞外マトリックス被膜の形成を、例えば、自動制御されたポンプ等を用いて自動で行うことができるという知見に基く。本発明の被覆細胞の製造方法によれば、流路内で細胞外マトリックス被膜を形成することから、被覆細胞を簡単かつ効率よく製造することができる。また、本発明の被覆細胞の製造方法によれば、細胞の被覆を流路内で行うことにより、例えば、細胞外マトリックス被膜形成時における遠心分離処理を除くことができることから、好ましくは被覆細胞の製造過程における細胞の生存率及び／又は被覆細胞の製造効率を向上できる。

本明細書において「層流」とは、流路内を流れる液体の流線が管軸と平行である流れをいう。本発明の被覆細胞の製造方法によれば、細胞が導入された流路の少なくとも一部に層流が形成されるように送液手段を制御して、細胞外マトリックス成分を含む液体を流路に導入することから、簡単かつ効率よく細胞表面に細胞外マトリックス被膜を形成することができる。流路の少なくとも一部に細胞外マトリックス成分を含む液体の層流が形成されるように該液体を導入し、その層流を細胞に接触させることにより、例えば、細胞と細胞及び/又は流路の壁面との接着、ならびに、細胞が流路の外部に流出することを抑制しつつ、細胞表面に一様な細胞外マトリックス成分を含む被膜が形成することができる。

送液手段を、流路の底面近傍で層流が形成され、かつ、流路の底面付近における液体の流れの方向が導入口となる開口部から排出口となる開口部に向かう一方向の流れとなるように制御し、細胞外マトリックス成分を含む液体を流路に導入することが好ましい。

流路内に一様な層流が形成されやすく、被膜形成時に流路内の細胞が外部に流出することを抑制する点から、細胞外マトリックス成分を含む液体が流路の底面に対して略平行に導入されるように制御されていることが好ましい。本明細書において「液体が流路の底面に対して略平行に導入される」とは、例えば、流路に導入される際の液体の流れの方向が、底面に対して略平行であることをいう。具体例を挙げると、図２Ａに示すように、流路１８の側面に形成された連通部１９とデバイスの側面に形成された導入口１６とが同じ高さとなるように配置され、導入部１６と連通部１９との間を通る液体の流れ方向が、流路１８の底面に対して略平行であることが挙げられる。その他の例としては、図８Ａ又は９Ａに示すように、流路４８の構造をチャンバー４８ａと、導入口となる開口部４６とチャンバー４８ａとを接続する導入部４８ｂとを有する構造とし、その導入部４８ｂの底面をチャンバー４８ａの底面と略平行となるようにし、導入部４８ｂを通る液体の流れ方向がチャンバー４８ａの平面と略平行であることが挙げられる。

細胞外マトリックス成分を含む液体の導入は、流路内に一様な層流が形成されやすく、被膜形成時に流路内の細胞が外部に流出することを抑制する点から、流路におけるレイノルズ数（Ｒｅ）が、一又は複数の実施形態において、例えば、２００以下、好ましくは１００以下、より好ましくは１０〜１００となるように制御することが好ましい。なお、レイノルズ数（Ｒｅ）は、下記式により定義される。
Ｒｅ＝Ｕ・ｄ／ν＝Ｕ・ｄ／（μ／ρ）
上記式において、Ｕは平均流速（ｍ／ｓ）、ｄは代表寸法（但し、円管の場合は直径）（ｍ）、νは動粘性係数（ｍ²／ｓ）、μは粘性係数（Ｐａ・ｓ）、ρは密度（ｋｇ／ｍ³）を示す。

流路の形状は、底面近傍で層流が形成され、かつ、底面付近において流れの方向が導入口側となる開口部から排出口側となる開口部に向かう一方向の流れとなる形状であることが好ましい。流路の長さ方向の断面形状は、一又は複数の実施形態において、例えば、矩形、凹形状（Ｕ字形状）、及びＴ字形状等が挙げられ、流路内に一様な層流が形成されやすく、被膜形成時に流路内の細胞が外部に流出することを抑制する点から、凹形状又はＴ字形状が好ましい。本明細書において「流路の長さ方向の断面形状が凹形状である」とは、例えば、流路の中央部が下方向に湾曲又は屈折していることをいい、図２Ａに示すように、略平行に向かい合う平板で構成される底部と、底部の両端に位置し、かつ、前記底部を構成する平板に対して略垂直方向に位置し、略平行に向かい合う平板で構成される屈折部とを有する形状等が挙げられる。本明細書において「流路の長さ方向の断面形状がＴ字形状である」とは、例えば、図８Ａ又は９Ａに示すように、液体の流れ方向に対して平行方向の断面が矩形であるチャンバーと、チャンバーの両側面の上部にそれぞれ形成された導入部及び排出部とを有し、導入部と排出部との底面がそれぞれチャンバーの底面と平行である形状等が挙げられる。

デバイスは、溝部が形成された部材と基板とを接合することによって上記流路が形成されたデバイスであってもよいし、一体成型されたデバイスであってもよい。溝部は、上述の流路形状となるように形成されている。デバイスが、溝部が形成された部材と基板とを接合したデバイスである場合、部材と基板とは剥離可能な状態で接合されていることが好ましい。被覆細胞の回収を容易に行うことができる点から、部材と基板とが剥離可能な状態で接合されて流路が形成されたデバイスであることが好ましい。

デバイスの材質は、特に限定されるものではないが、一又は複数の実施形態において、例えば、透明な材料（透明性材料）が使用でき、具体例として、ガラス、シリコン樹脂（ＰＤＭＳ）、メタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン樹脂（ＰＳ）、ポリカーボネート樹脂（ＰＣ）、シリコーンハイドロゲル、ポリオレフィン、及びオレフィンポリマー樹脂等が挙げられる。中でも、好ましくは医療用途に適合する材料であり、より好ましくはＦＤＡで認可されている材料である。

細胞外マトリックス成分を含む被膜の形成において、異なる種類の液体を導入するタイミングとしては、一又は複数の実施形態において、例えば、導入した液体に含まれる被膜成分を含む被膜が細胞表面に形成された後であって、細胞がその他の細胞及び/又は流路の壁面と接着する前であればよい。また、被覆細胞の回収は、被覆細胞が隣接する細胞及び/又は流路の壁面と接着する前に行うことが好ましい。

細胞外マトリックス成分を含む液体の導入としては、一又は複数の実施形態において、例えば、第１物質を含む第１液（以下、「第１液」ともいう）と、第２物質を含む第２液（以下、「第２液」ともいう）とを導入することが挙げられ、好ましくは第１液と第２液とを交互に導入する。第１液と第２液とを交互に導入することにより、細胞の表面に第１物質を含む被膜と第２物質を含む被膜とを含む細胞外マトリックス被膜を形成することができる。より好ましくは、第１液と第２液とを交互に導入することを１セットとして、これを２回以上繰返し行うことが好ましい。

第１液は、第１物質を含み、好ましくは第１物質と溶媒又は分散媒体（以下、「溶媒」ともいう）とを含む。第１液における第１物質の含有量は、一又は複数の実施形態において、例えば、０．０００１〜１質量％が好ましく、より好ましくは０．０１〜０．５質量％、さらに好ましくは０．０２〜０．１質量％である。溶媒としては、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び緩衝液等の水性溶媒が挙げられる。緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、又はＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。溶媒のｐＨは、特に制限されず、一又は複数の実施形態において、例えば、３〜１１であり、好ましくは６〜８、より好ましくは７．２〜７．４である。

第２液は、第２物質を含み、好ましくは第２物質と溶媒とを含む。第２液は、第１物質に代えて第２物質を含む以外は、第１液と同様の組成とすることができる。

第１液及び第２液は、さらに必要に応じて、例えば、塩、細胞成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、生理活性ペプチド、疾患の治療剤、予防剤、抑制剤、抗菌剤、又は抗炎症剤等の医薬組成物等を含有してもよい。塩としては、一又は複数の実施形態において、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、コハク酸ナトリウム等が挙げられる。塩は、一種類でもよいし二種類以上含有していてもよい。第１液及び第２液の双方が塩を含有していてもよいし、いずれか一方が塩を含有していてもよい。第１液中の塩濃度は、特に制限されないが、一又は複数の実施形態において、例えば、１×１０^-6Ｍ〜２Ｍであり、好ましくは１×１０^-4Ｍ〜１Ｍ、より好ましくは１×１０^-4Ｍ〜０．０５Ｍである。

本発明の被覆細胞の製造方法は、一又は複数の実施形態において、第１液の導入後及び/又は第２液の導入後に洗浄液を導入することを含むことが好ましく、より好ましくは第１液及び第２液の導入後の双方に洗浄液を導入する。これにより、被膜の形成に用いられなかった第１物質又は第２物質を除去することができ、効率よく所望の被膜を形成することができる。洗浄液の導入は、第１液及び第２液の導入と同様に、流路内に層流が形成されるように行うことが好ましく、より好ましくは流路内に層流が形成されるように制御された送液手段を用いて行われる。洗浄液としては、一又は複数の実施形態において、例えば、第１液又は第２液に用いた溶媒が使用でき、好ましくは洗浄液の導入前に導入された液（第１液又は第２液）に用いられた溶媒と同じ溶媒である。

細胞外マトリックス成分を含む液体の導入は、一又は複数の実施形態において、細胞表面に、例えば、厚みが１ｎｍ〜１×１０³ｎｍの細胞外マトリックス被膜が形成されるように行うことが好ましく、より好ましくは２ｎｍ〜１×１０²ｎｍであり、被覆細胞がより密に積層された三次元構造体が得られるという理由から、３ｎｍ〜１×１０²ｎｍがさらに好ましい。細胞外マトリックス成分を含む被膜の厚みは、一又は複数の実施形態において、例えば、細胞外マトリックス成分を含む液体を導入する回数、及び流量等によって適宜制御することができる。細胞外マトリックス成分を含む液体の導入は、細胞表面に、１層の細胞外マトリックス被膜が形成されるように行ってもよいし、２層以上（例えば、３、５、７、９、１１、１３、１５層又はそれ以上の多層）の細胞外マトリックス被膜が形成されるように行ってもよい。

［被覆細胞自動製造システム］
本発明は、さらにその他の態様において、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイス、前記デバイスの流路に、細胞外マトリックス成分を含有する液体を導入するための送液手段、及び前記流路内において細胞表面に前記細胞外マトリックス成分を含有する被膜が形成されるように、前記細胞外マトリックス成分を含有する液体を前記流路に導入するように前記送液手段を制御する制御部を備える、被覆細胞自動製造システム（以下、「本発明の被覆細胞自動制御システム」ともいう）に関する。本発明の被覆細胞自動製造システムによれば、流路内で細胞外マトリックス被膜を形成することから、被覆細胞を簡単かつ効率よく製造することができる。本発明の被覆細胞自動制御システムによれば、本発明の被覆細胞の製造方法を容易に行うことができる。

制御部は、流路内において細胞表面に細胞外マトリックス成分を含有する被膜が形成されるように、流路に細胞外マトリックス成分を含有する液体を導入するように送液手段の制御を行う。制御部は、一又は複数の実施形態において、例えば、流路内に層流が形成されるように、細胞外マトリックス成分を含有する液体が導入されるように送液手段を制御する。

制御部は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分を含有する液体として、第１液及び第２液をそれぞれ流路に導入するように送液手段の制御を行ってもよい。

制御部は、一又は複数の実施形態において、細胞外マトリックス成分を含む液体の導入に加えて、洗浄液を流路内に導入するように送液手段の制御を行ってもよい。洗浄液の導入は、制御部において、細胞外マトリックス成分を含有する液体と同様に、流路内に層流が形成されるように送液手段を制御することが好ましい。

デバイスは、送液手段に接続可能な開口部（導入口）と、廃液溜めに接続可能な開口部（排出口）と、これらの開口部間を連通する流路とを備える。開口部は、一又は複数の実施形態において、例えば、デバイスの側面に形成することができ、好ましくは向い合う側面にそれぞれ形成されている。導入口及び排出口の数は、特に制限されず、それぞれ１個であってもよいし、２個以上であってもよい。導入口及び排出口の数は同一であってもよいし、異なっていてもよく、例えば、導入口を１個とし、排出口を２個以上としてもよい。流路の形状、最大径等は上記の通りである。

本発明の被覆細胞自動制御システムは、一又は複数の実施形態において、さらに、例えば、細胞外マトリックス成分を含む液体、及び/又は洗浄液を収納するための収納部、及び排出された液体を回収するための廃液回収部等を備えてもよい。

［細胞の三次元構造体の製造方法］
第１の製造方法
本発明は、さらにその他の態様において、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を調製すること、及び前記被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された細胞の三次元構造体を形成することを含み、前記被覆細胞の調製は、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイスにおいて、前記流路に細胞を導入すること、及び前記細胞が導入された流路に送液手段を用いて細胞外マトリックス成分を含む液体を導入することを含み、前記液体の導入は、前記流路内に層流が形成され、前記細胞の表面に前記細胞外マトリックス成分を含有する被膜が形成されるように前記送液手段を制御して行う、細胞の三次元構造体の製造方法（以下、「本発明の細胞の三次元構造体の第１の製造方法」ともいう）に関する。

被覆細胞の調製は、本発明の被覆細胞の製造方法と同様にして行うことができる。

被覆細胞の培養は、一又は複数の実施形態において、例えば、被覆細胞を一定時間インキュベーションすることにより行うことができる。このインキュベーションにより、細胞外マトリックス成分を含む被膜を介して隣接する被覆細胞が互いに接着し、被覆細胞が三次元に積層されるとともに、隣接する被覆細胞同士の間隔が密になり、緻密な構造の三次元構造体が形成される。被覆細胞の培養は流路内で行ってもよいし、他の基材等に播種して行ってもよい。

第２の製造方法
本発明は、さらにその他の態様において、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイスにおいて、前記流路に細胞を導入して細胞層を形成すること、前記細胞層上に細胞外マトリックスを形成されるように送液手段を制御して、前記細胞層が形成された流路に細胞外マトリックス成分を含む液体を導入すること、及び前記細胞外マトリックス成分を含む液体が導入された流路に、細胞を導入して前記細胞外マトリックス上に細胞層を１層以上積層することを含む、細胞の三次元構造体の製造方法（以下、「本発明の細胞の三次元構造体の第２の製造方法」ともいう）に関する。

細胞層の形成は、一又は複数の実施形態において、流路内に導入された細胞を培養することにより行うことができる。細胞の培養は、一又は複数の実施形態において、例えば、流路に細胞を播種し、一定時間インキュベーションすることにより行うことができる。

細胞外マトリックス成分を含む液体の導入は、流路内の細胞へのダメージを軽減し、流路内の細胞が外部に流出することを抑制する点から、流路内に一様な層流が形成されるように制御されていることが好ましい。

細胞層の形成後及び/又は細胞外マトリックスの形成後に洗浄液を導入することが好ましく、より好ましくは細胞層の形成後と細胞外マトリックスの形成後との双方に洗浄液を導入することができる。これにより、細胞外マトリックスの形成に用いられなかった細胞外マトリックス成分や、細胞層の形成に用いられなかった細胞等を除去することができ、効率よく所望の細胞層及び/又は細胞外マトリックスを形成することができる。洗浄液の導入は、流路内に層流が形成されるように制御された送液手段を用いて行われることが好ましい。洗浄液は、本発明の被覆細胞の製造方法と同様である。

細胞外マトリックス成分を含む液体の導入としては、一又は複数の実施形態において、例えば、第１液と第２液とを導入することが挙げられ、好ましくは第１液と第２液とを交互に導入する。第１液と第２液とを交互に導入することにより、細胞層上に第１物質と第２物質とを含む細胞外マトリックスを形成することができる。より好ましくは、第１液と第２液とを交互に導入することを１セットとして、これを２セット、又は３セット以上繰返し行うことが好ましい。第１液及び第２液は、本発明の被覆細胞の製造方法と同様である。

第１液の導入後及び/又は第２液の導入後に洗浄液を導入することを含むことが好ましく、より好ましくは第１液及び第２液の導入後の双方に洗浄液を導入する。これにより、細胞外マトリックスの形成に用いられなかった第１物質又は第２物質を除去することができ、効率よく所望の被膜を形成することができる。洗浄液の導入は、第１液及び第２液の導入と同様に、流路内に層流が形成されるように行うことが好ましく、より好ましくは流路内に層流が形成されるように制御された送液手段を用いて行われる。洗浄液は、本発明の被覆細胞の製造方法と同様である。

［細胞の三次元構造体自動製造システム］
本発明はさらにその他の態様において、少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイス、前記デバイスの流路に、細胞外マトリックス成分を含有する液体を導入するための送液手段、及び前記流路内に前記細胞外マトリックス成分を含有する層が形成されるように、前記細胞外マトリックス成分を含有する液体を前記流路に導入するように前記送液手段を制御する制御部を備える、細胞の三次元構造体自動製造システム（以下、「本発明の細胞の三次元構造体自動製造システム」ともいう）に関する。本発明の細胞の三次元構造体自動製造システムによれば、本発明の三次元構造体の製造方法を容易に行うことができる。

制御部は、流路内の細胞層上に細胞外マトリックスが形成されるように、流路に細胞外マトリックス成分を含有する液体を導入するように送液手段の制御を行う。制御部は、一又は複数の実施形態において、例えば、流路内に層流が形成されるように、細胞外マトリックス成分を含有する液体が導入されるように送液手段を制御してもよい。

制御部は、細胞外マトリックス成分を含有する液体として、第１液及び第２液をそれぞれ流路に導入するように送液手段の制御を行ってもよい。

制御部は、細胞外マトリックス成分を含む液体の導入に加えて、洗浄液を流路内に導入するように送液手段の制御を行ってもよい。制御部は、制御部において、細胞外マトリックス成分を含有する液体と同様に、流路内に層流が形成されるように、洗浄液が流路に導入されるように送液手段を制御してもよい。

デバイスは、送液手段に接続可能な開口部（導入口）と、廃液溜めに接続可能な開口部（排出口）と、これらの開口部間を連通する流路とを備える。開口部は、一又は複数の実施形態において、例えば、デバイスの上面に形成することができ、好ましくは向い合う側面にそれぞれ形成されている。導入口及び排出口の数は、特に制限されず、それぞれ１個であってもよいし、２個以上であってもよい。導入口及び排出口の数は同一であってもよいし、異なっていてもよく、例えば、導入口を１個とし、排出口を２個以上としてもよい。流路の長さ方向の断面形状は、一又は複数の実施形態において、例えば、矩形形状、凹形状等が挙げられる。流路の水平方向の断面形状は、一又は複数の実施形態において、例えば、直線形状、Ｙ字形状、Ｘ字形状等が挙げられる。

デバイスは、溝部が形成された部材と基板とを接合することによって上記流路が形成されたデバイスであってもよいし、一体成型されたデバイスであってもよい。

流路の幅方向（ｙ軸方向）の断面形状は、特に制限されるものではないが、一又は複数の実施形態において、例えば、矩形、円形、及び楕円形等が挙げられる。流路の幅方向の断面形状が矩形である場合、流路の隅部に細胞塊等が形成されることを抑制する点から、隅部の形状は曲面であってもよい。

以下に、本発明を好適な実施形態を示しながら詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施形態に限定されないことはいうまでもない。以下の説明において参照する各図は、説明の便宜上、本発明の実施形態の構成部材のうち、本発明を説明するために必要な主要部材のみを簡略化して示したものである。従って、本発明は以下の各図に示されていない任意の構成部材を備え得る。

（実施形態１）
図１は、実施形態１の被覆細胞自動製造システムの概略構成図であり、図２Ａは、実施形態１において使用するデバイスの斜視図、図２ＢはI-I断面図、図２Ｃは側面図である。本実施形態１の被覆細胞自動製造システムは、細胞外マトリックス成分を含む液体として第１液と第２液とを用い、これらを導入後に洗浄液を導入可能なように構成されている。

図１に示されているように、被覆細胞自動製造システムは、デバイス１１と、送液手段１２と、制御部１３と、容器１４と、廃液溜め１５とを備える。容器１４と送液手段１２、送液手段１２とデバイス１１、デバイス１１と廃液溜め１５とはそれぞれチューブを介して接続されている。制御部１３は送液手段１２に接続され、送液手段１２を制御可能なように構成されている。

デバイス１１の一例としては、図２に示されているような構造のデバイスが挙げられる。図２は、流路の長さ方向（ｘ軸方向）の断面（I-I断面）の形状が凹形状であるデバイスの一例である。

デバイス１１は、２つの開口部１６，１７と、流路１８と、開口部１６，１７と流路１８とを接続する連通部１９，２０とを備える。開口部１６，１７は、デバイス１１の向い合う側面にそれぞれ形成され、一方の開口部１６は送液手段１２に接続して導入口となり、他方の開口部１７は廃液溜め１５に接続して排出口１７となりうる。流路１８は、開口部１６と開口部１７との間を連通するようにデバイス１１内に形成され、流路１８の底面部１０１において細胞外マトリックス成分を有する被膜の形成が行われる。

連通部１９，２０は、流路１８内に一様な層流が形成されやすく、かつ、細胞が流路１８外に流出されることを抑制する点から、その管軸が流路１８の底面の面方向に対して略平行であることが好ましい。導入口１６及び排出口１７の高さ（流路１８の底面からの高さ）は、流路１８の高さ等に応じて適宜決定できるが、流路１８内において層流が形成されやすく、かつ、細胞が流路１８外に流出されることを抑制する点から、略同じであることが好ましい。

流路１８の底面の長さ（図２Ａ及びＢにおけるｘ）は、流路１８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、５ｍｍ〜１０ｃｍである。流路１８の底面の幅（図２Ａにおけるｙ）は、流路１８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、５ｍｍ〜１０ｃｍである。流路１８の高さ（図２Ａ及びＢにおけるｚ）は、流路１８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、５ｍｍ〜１２ｃｍである。開口部１６，１７の底面からの高さ（図２Ａ及びＣにおけるｕ）は、流路１８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、５ｍｍ〜１０ｃｍである。流路１８の底面部１０１の高さ（図Ａ及びＢにおけるｓ）は、流路１８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、５０μｍ〜１０ｍｍである。流路１８の底面部１０１の長さ（図２Ａ及びＢにおけるｔ）は、流路１８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、３ｍｍ〜８ｃｍである。連通部１９（図２Ａにおけるｖ）の長さは、流路１８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、１ｍｍ〜２ｃｍである。連通部１９の径は、特に制限されるものではなく、流路１８の大きさ等に応じて適宜決定できるが、デットボリュームを低減する点から、できる限り小さいことが好ましく、例えば、５０μｍ〜１０ｍｍである。デバイス１１の大きさは、特に制限されるものではなく、デバイス１１に形成される流路１８の大きさに応じて適宜決定できる。

流路１８の幅方向（ｙ軸方向）の断面形状は、特に制限されるものではないが、例えば、矩形、円形、及び楕円形等が挙げられる。流路１８の幅方向の断面形状が矩形である場合、流路１８の隅部に細胞塊等が形成されることを抑制する点から、隅部の形状は曲面であってもよい。

デバイス１１が、図２Ａに示すように、溝部が形成された部材と基板とを接合したデバイスである場合、部材と基板とは剥離可能な状態で接合されていることが好ましい。被覆細胞の回収を容易に行うことができる点から、部材と基板とが剥離可能な状態で接合されて流路が形成されたデバイスであることが好ましい。

制御部１３は、送液手段１２を制御可能なように構成されている。制御部１３は予め設定されたプログラムに基き、流路１８に液体を導入し、流路１８内において細胞のコーティングが行われるように送液手段１２を制御可能である。

送液手段１２は、制御部１３によって制御可能であり、例えば、ポンプとバルブとで構成されている。

図３に、被覆細胞自動製造システムの動作例を示すフローチャートを示す。図３に示す例は、細胞外マトリックス成分を含む液体として第１液と第２液とを用い、洗浄液、第１液、洗浄液及び第２液の順番でこれらを流路に導入し、これを９セット行うことによって細胞の表面に細胞外マトリックス被膜を形成し、被覆細胞の製造を行う一例である。

まず、制御部１３は、流路１８内に層流が形成されるように予め設定された条件で、細胞が導入された流路１８に、洗浄液が導入されるように送液手段１２を動作させる（ｓ１０１）。洗浄液の導入後、制御部１３は、流路１８内に層流が形成され、かつ、流路１８内の細胞の表面に第１物質を含む被膜が形成されるように予め設定された条件で、流路１８に第１液が導入されるように送液手段１２を動作させる（ｓ１０２）。制御部１３は、流路１８内に層流が形成されるように予め設定された条件で、流路１８に洗浄液が導入されるように送液手段１２を動作し（ｓ１０３）、ついで、流路１８内に層流が形成され、かつ、流路１８内の細胞の表面に第２物質を含む被膜が形成されるように予め設定された条件で、流路１８に第２液が導入されるように送液手段１２を動作させる（ｓ１０４）。制御部１３は、このｓ１０１〜ｓ１０４を１セットとし、これが計９セット行われるように送液手段１２を繰返し動作させる。そして、制御部２３は、流路１８内に層流が形成されるように予め設定された条件で、流路１８に洗浄液が導入されるように送液手段１２を動作し（ｓ１０３）、これにより、細胞表面に細胞外マトリックス被膜が自動的に形成される。

以下に、実施形態１の被覆細胞自動製造システムを用いて被覆細胞を製造する方法について、細胞外マトリックス成分を含む液体として第１液と第２液とを用い、これらを導入後に洗浄液を導入する場合を例にとり説明する。

まず、流路１８内に細胞を含む液体を導入する。細胞の導入は、例えば、媒体に分散させた細胞を流路に導入することにより行うことができる。媒体としては、例えば、培地、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ等が使用できる。培地は、細胞の種類に応じて適宜決定でき、例えば、Ｅａｇｌｅ'ｓ ＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＤＭＩ、ＧｌｕｔａＭａｘ培地、無血清培地等が挙げられる。細胞を含む液体は、送液手段を用いて導入してもよいし、シリンジ等を用いて行ってもよい。

ついで、制御部１３を駆動させて、予め与えられたプログラムにしたがい、送液手段１２を用いて洗浄液、第１液、及び第２液の導入を行う。制御部１３は、流路１８内において層流が形成され、かつ細胞表面に第１物質を含む被膜及び第２物質を含む被膜が交互に形成されるように予め設定されたプログラムにしたがい、送液手段１２を制御する。

第１液の流速は、流路１８の大きさ及び第１物質の種類等に応じて適宜決定でき、流路１８内に層流が形成される流速が挙げられ、例えば、１００μＬ／分〜１０ｍＬ／分であり、流路１８内に一様な層流が形成されやすく、細胞が流路１８の外に排出されることを抑制する点から、１００μＬ／分〜１０００μＬ／分が好ましい。第１液を導入する時間は、細胞の表面に第１物質を含む膜が形成されるために十分な時間が挙げられ、例えば、３０秒〜２４時間であり、好ましくは１分〜６０分、より好ましくは１分〜１５分、さらに好ましくは１分〜１０分、さらにより好ましくは１分〜５分である。第２液の流速及び第２液を導入する時間は、流路１８の大きさ及び第２物質の種類等に応じて適宜決定でき、例えば、第１液と同様とすることができる。洗浄液の流速及び第２液を導入する時間は、流路１８の大きさ及び洗浄液の種類等に応じて適宜決定でき、例えば、第１液と同様とすることができる。

第１液、第２液、及び洗浄液の導入は、洗浄液、第１液、洗浄液、及び第２液の順番でこれを繰返し行うようにプログラムされていることが好ましい。異なる種類の液を導入する間隔は、流路１８に細胞が接着しない程度の範囲で設定されていればよく、例えば、０秒〜３０分であり、好ましくは０秒〜１０分である。

第１液、第２液、及び洗浄液を導入する回数は、細胞表面に形成する細胞外マトリックス被膜の厚み等に応じて適宜決定することができ、例えば、洗浄液、第１液、洗浄液及び第２液を１セットとして、２セット、３セット、４セット、又は５セット以上行うことが好ましい。

上記のようにして、細胞表面に、例えば、厚みが１ｎｍ〜１×１０³ｎｍ、好ましくは２ｎｍ〜１×１０²ｎｍの細胞外マトリックス被膜が形成された被覆細胞を得ることができる。被覆細胞における細胞外マトリックス被膜の厚みは、被覆細胞がより密に積層された三次元構造体が得られるという理由から、３ｎｍ〜１×１０²ｎｍがより好ましい。細胞外マトリックス被膜は、１層以上であり、２層以上（例えば、３、５、７、９、１１、１３、１５層又はそれ以上の多層）であることが好ましい。

上記のようにして製造された被覆細胞の回収は、特に制限されず、例えば、導入口及び/又は排出口となりうる開口部を通じて行ってもよい。また、デバイスとして基板と溝部が形成された部材とを接合することによって流路が形成されたデバイスを使用し、被覆細胞の製造後に基板から上記部材を剥離して、基板上の被覆細胞を回収してもよいし、又は、被覆細胞の製造後にデバイスを反転させて、上記デバイスから基板を剥離して上記部材の溝部（流路）内から被覆細胞を回収してもよい。

上記のようにして得られた被覆細胞は、三次元に積層して培養することによって、例えば、人工血管、及び人工肝臓等の人工組織を作成することができる。また、被覆細胞を積層して得られた三次元構造体は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、被検物質の薬効試験、薬理試験及び安全性試験等の評価等に用いることができる。

被覆細胞の培養は、例えば、基材上に被覆細胞を播種し、一定時間インキュベーションすることにより行う。このインキュベーションにより、細胞外マトリックス成分を含む被膜を介して隣接する被覆細胞が互いに接着し、被覆細胞が三次元に積層されるとともに、隣接する被覆細胞同士の間隔が密になり、緻密な構造の三次元構造体が形成される。インキュベーションの条件は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定できる。インキュベーション温度は、例えば、４〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。インキュベーション時間は、例えば、１時間〜１６８時間、好ましくは３時間〜２４時間、より好ましくは３時間〜１２時間である。培地は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定でき、上記の培地が使用できる。

（実施形態２）
図４は、実施形態２の細胞の三次元構造体自動製造システムの概略構成図であり、図５Ａは、実施形態２において使用するデバイスの斜視図、図５ＢはII-II断面図、図５ＣはIII-III断面図である。本実施形態２の細胞の三次元構造体自動製造システムは、細胞外マトリックス成分を含む液体として第１液と第２液とを用い、これらを導入後に洗浄液を導入可能なように構成されている。また、これらの図面において、実施形態１で説明した構成と同じ構成には同一の符号を付してそれらの説明を省略する。

図４に示されているように、細胞の三次元構造体自動製造システムは、デバイス２１と、送液手段１２と、制御部２３と、容器１４と、廃液溜め１５とを備え、容器１４と送液手段１２、送液手段１２とデバイス２１、デバイス２１と廃液溜め１５とはそれぞれチューブを介して接続されている。制御部２３は送液手段１２に接続され、送液手段１２を制御可能なように構成されている。

デバイス２１の一例としては、図５に示されているような構造のデバイスが挙げられる。図５は、流路の長さ方向の断面形状が四角形、水平方向の断面形状がＹ字形状であるデバイスの一例である。

デバイス２１は、３つの開口部２６，２７，２７’と、流路２８とを備える。開口部２６，２７，２７’は、デバイス２１の上面にそれぞれ形成され、開口部２６は送液手段１２に接続して導入口となり、開口部２７，２７’は廃液溜め１５に接続して排出口となる。流路１８は、開口部２６から導入された液体が開口部２７又は開口部２７’に排出可能なようにデバイス２１内に形成されている。

デバイス２１は、図５Ａに示すように、溝部が形成された部材と基板とを接合することによって上記流路が形成されたデバイスであってもよいし、一体成型されたデバイスであってもよい。デバイス２１が、溝部が形成された部材と基板とを接合したデバイスである場合、部材と基板とは剥離可能な状態で接合されていることが好ましい。細胞の培養及び/又は形成された三次元構造体の回収を容易に行うことができる点から、部材と基板とが剥離可能な状態で接合されて流路が形成されたデバイスであることが好ましい。

図５Ａ〜Ｃに示す構成のデバイス２１において、開口部（導入口）２６から分岐部までの長さ（図５Ｃにおけるａ）は、所望の三次元構造体のサイズに応じて適宜決定でき、例えば、３〜５０ｍｍである。分岐部から開口部（排出口）２７までの長さ（図５Ｃにおけるｂ）は、所望の三次元構造体のサイズに応じて適宜決定でき、例えば、３〜５０ｍｍである。分岐部から開口部（排出口）２７’までの長さ（図５Ｃにおけるｃ）は、所望の三次元構造体のサイズに応じて適宜決定でき、例えば、０．５〜１０ｍｍである。分岐部から開口部（排出口）２７までの長さと分岐部から開口部（排出口）２７’までの長さとは同じであってもよいし、異なっていてもよい。流路２８の幅（図５Ｃにおけるｄ）は、所望の三次元構造体のサイズに応じて適宜決定でき、例えば、３〜５０ｍｍである。流路２８の高さ（図５Ｂにおけるｅ）は、所望の三次元構造体のサイズに応じて適宜決定でき、例えば、１００〜５００μｍである。デバイス２１の大きさは、特に制限されるものではなく、デバイス２１に形成される流路２８の大きさに応じて適宜決定できる。

制御部２３は、送液手段１２を制御可能なように構成されている。制御部２３は予め設定されたプログラムに基き、流路２８に液体を導入し、流路２８内の細胞層上に細胞外マトリックスが形成されるように送液手段１２を制御可能である。

図６に、細胞の三次元構造体自動製造システムの動作例を示すフローチャートを示す。図６に示す例は、細胞外マトリックス成分を含む液体として第１液と第２液とを用い、洗浄液、第１液、洗浄液及び第２液の導入を９セット行うことによって細胞外マトリックスを形成し、細胞層を５層積層させる一例である。

まず、流路２８内の細胞層の有無を確認し(ｓ２０１)、細胞層がないと判断された場合は、流路２８内に細胞層を形成する（ｓ２０２）。ついで、制御部２３は、予め設定された条件で流路２８に洗浄液が導入されるように送液手段１２を動作させる（ｓ２０３）。なお、流路内２８内に細胞層があると判断された場合は細胞層を形成することなく、洗浄液の導入が行われる。その後、制御部２３は、第１液、洗浄液、及び第２液が流路２８に導入されるように送液手段１２を動作させる（ｓ２０４〜２０６）。送液手段１２は、流路２８内に層流が形成され、かつ、流路２８内の細胞層上に第１物質又は第２物質を含む層が形成されるように予め設定された条件で第１液及び第２液の導入が行われるように制御される。このｓ２０３〜ｓ２０６を１セットとし、これが計９セット行われるように送液手段１２を繰返し動作させる。９セット終了後、流路２８内に洗浄液が導入されるように送液手段１２を動作させる（ｓ２０８）。これにより、細胞層上に細胞外マトリックスが自動的に形成される。細胞外マトリックスを形成後、流路２８内に積層された細胞層の数が５層であれば、動作を終了する。流路２８内に積層された細胞層の数が５層未満であれば、細胞層が５層になるまで細胞層の形成（ｓ２０２）及び細胞外マトリックスの形成（ｓ２０３〜ｓ２０８）を繰返し行う。

上記の実施形態２では、導入口の数が１個、排出口の数が２個であり、排出口の数が導入口の数よりも多かったが、本発明はこれに限定されず、例えば、導入口及び排出口の数は同一であってもよいし、導入口の数が排出口の数よりも多くてもよい。導入口及び排出口の数は、特に限定されず、例えば、１個、２個、又は３個以上である。また、上記の実施形態２では、開口部（導入口、排出口）がデバイスの上面に形成されているが、本発明はこれに限定されず、デバイスの側面に形成されていてもよい。

以下に、図４に示す細胞の三次元構造体自動製造システムを用いて細胞の三次元構造体を製造する方法について、細胞外マトリックス成分を含む液体として第１液と第２液とを用い、これらを導入後に洗浄液を導入する場合を例にとり説明する。

まず、流路２８内に細胞を導入して細胞層を形成する。細胞の導入は、例えば、媒体に分散させた細胞を流路２８に導入することにより行うことができる。

細胞層の形成は、流路２８内で細胞を培養することにより行うことができる。細胞の培養は、例えば、流路２８内に細胞を播種し、一定時間インキュベーションすることにより行う。このインキュベーションにより、播種された細胞が二次元（平面方向）に増殖して単層の細胞層が形成される。インキュベーションの条件は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定できる。インキュベーション温度は、例えば、４〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃、より好ましくは３０〜３７℃である。インキュベーション時間は、例えば、１時間〜１６８時間、好ましくは３時間〜２４時間、より好ましくは３時間〜１２時間である。培地は、特に制限されず、細胞に応じて適宜決定でき、例えば上述した培地が使用できる。導入する細胞は、１種類であってもよいし、複数種類であってもよい。

ついで、制御部２３を駆動させて、予め与えられたプログラムにしたがい、送液手段１２を用いて洗浄液、第１液、及び第２液の導入を行う。制御部２３は、流路２８内の細胞層上に細胞外マトリックスが形成されるように予め設定されたプログラムにしたがい、送液手段１２を制御する。

第１液の流速は、流路２８の大きさ及び第１物質の種類等に応じて適宜決定でき、例えば、１００μＬ／分〜１０ｍＬ／分であり、流路２８内の細胞層表面に一様な細胞外マトリックスが形成されやすく、細胞が流路２８の外に排出されることを抑制する点から、１００μＬ／分〜１０００μＬ／分が好ましい。第１液を導入する時間は、細胞層上に第１物質を含む層が形成されるために十分な時間が挙げられ、例えば、３０秒〜２４時間であり、好ましくは１分〜６０分、より好ましくは１分〜１５分、さらに好ましくは１分〜１０分、さらにより好ましくは１分〜５分である。第２液の流速及び第２液を導入する時間は、流路２８の大きさ及び第２物質の種類等に応じて適宜決定でき、例えば、第１液と同様とすることができる。洗浄液の流速及び第２液を導入する時間は、流路２８の大きさ及び洗浄液の種類等に応じて適宜決定でき、例えば、第１液と同様とすることができる。

第１液、第２液、及び洗浄液の導入は、洗浄液、第１液、洗浄液、及び第２液の順番でこれを繰返し行うようにプログラムされていることが好ましい。第１液、第２液、及び洗浄液を導入する回数は、細胞層表面に形成する細胞外マトリックスの厚み等に応じて適宜決定することができ、例えば、洗浄液、第１液、洗浄液及び第２液を１セットとして、２セット、３セット、４セット、又は５セット以上行うことが好ましい。

細胞層上に細胞外マトリックスを形成した後、流路２８内に細胞を導入し、細胞層表面に形成された細胞外マトリックス上に細胞層を形成する。細胞の導入及び細胞層の形成は、上述の通りである。導入する細胞は、流路内の細胞と同じ種類の細胞であってもよいし、異なる種類の細胞であってもよい。細胞の導入は、手動で行ってもよいし、制御部２３を用いて行ってもよい。また、細胞の導入に先立ち、洗浄液を流路２８に導入し、細胞外マトリックス形成に用いられなかった第１液又は第２液を流路２８から除去してもよい。

上記の細胞層の形成と、細胞外マトリックスの形成とを繰返し行うことにより、細胞が三次元に積層された三次元構造体を形成することができる。積層する細胞の数は特に制限されないが、例えば、３層以上であり、好ましくは４層以上、５層以上、６層以上又は７層以上である。積層する細胞の上限は特に制限されないが、例えば、１００層以下、５０層以下、４０層以下、２０層以下又は１０層以下である。

上記のようにして形成された三次元構造体は、流路２８内で配置された状態で使用してもよいし、流路２８から回収して使用してもよい。

上記のようにして得られた三次元構造体は、例えば、動物組織の代替組織として使用することができ、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、被検物質の薬効試験、薬理試験、及び安全性試験等の評価等に用いることができる。

（実施形態３）
図７は、実施形態３の細胞の三次元構造体自動製造システムの概略構成図である。また、図７において、実施形態１及び２で説明した構成と同じ構成には同一の符号を付してそれらの説明を省略する。

図７に示されているように、細胞の三次元構造体自動製造システムは、デバイス３１と、送液手段１２と、制御部３３と、容器１４と、廃液溜め１５とを備え、容器１４と送液手段１２、送液手段１２とデバイス３１、デバイス３１と廃液溜め１５とはそれぞれチューブを介して接続されている。制御部３３は送液手段１２に接続され、送液手段１２を制御可能なように構成されている。

デバイス３１は、３つの開口部３６，３６’，３７と、流路３８とを備え、水平方向の断面形状がＹ字形状であるデバイスの一例である。開口部３６，３６’，３７は、デバイス３１の上面にそれぞれ形成され、開口部３６，３６’は送液手段１２に接続して導入口となり、開口部３７は廃液溜め１５に接続して排出口となる。流路３８は、開口部３６，３６’から導入された液体が開口部３７に排出可能なようにデバイス３１内に形成されている。デバイス３１は、導入口及び排出口の数が異なる以外は、実施形態２のデバイス２１と同様である。

以下に、図７に示す細胞の三次元構造体自動製造システムを用いて細胞の三次元構造体を製造する方法について、第１及び第２の細胞層では開口部３６及び開口部３６’から同じ種類の細胞を導入し、第３の細胞層では開口部３６及び開口部３６’から種類の異なる細胞をそれぞれ導入して異なる種類の細胞層が流路３８内で接するように形成された三次元構造体を製造する場合を例にとり説明する。

まず、開口部３６，３６’を通じて流路３８内に細胞を導入して第１の細胞層を形成する。細胞の導入は、実施形態２と同様に行うことができる。

ついで、制御部３３を駆動させて、予め与えられたプログラムにしたがい、送液手段１２を用いて洗浄液、第１液、及び第２液の導入を行う。開口部３６及び３６’からの洗浄液、第１液、及び第２液の導入は、実施形態２と同様に行うことができ、一様な細胞外マトリックスを形成する点から、開口部３６と開口部３６’とにおいて、導入される液体の流量、流速及び/又はレイノルズ数を略同じとすることが好ましい。

そして、上記と同様にして、第２の細胞層、及び細胞外マトリックスを形成した後、開口部３６，３６’を通じて異なる種類の細胞を導入し、第３の細胞層を形成する。このように、開口部３６と開口部３６’とで異なる種類の細胞を導入することによって、流路３８において異なる種類の細胞で構成された細胞層が隣接して形成される。これにより、例えば、細胞層間の相互作用等を評価することができる。

（実施形態４）
図８Ａは、実施形態１にかかる被覆細胞自動製造システムに用いられうるデバイスの上面図、図８ＢはIV-IV断面図である。図８Ａ及びＢに示すデバイス４１は、流路の長さ方向（ｘ軸方向）の断面（IV-IV断面）形状がＴ字形状であるデバイスの一例である。

デバイス４１は、２つの開口部４６，４７と、流路４８とを備える。開口部４６、４７は、デバイス４１の上面にそれぞれ形成され、開口部４６は送液手段１２に接続して導入口となり、開口部４７は廃液溜め１５に接続して排出口となる。流路４８は、チャンバー４８ａと、導入部４８ｂと、排出部４８ｃとにより形成され、流路４８は、開口部４６から導入部４８ｂを通じてチャンバー４８ａに導入された液体が、排出部４８ｃを通じて開口部４７に排出可能なようにデバイス４１内に形成されている。導入部４８ｂの数は、特に制限されないが、チャンバー４８内に細胞が一様に配置されやすい点から、複数であることが好ましく、例えば、２，３，４，５又は６個とすることができる。排出部４８ｃの数は、特に制限されないが、チャンバー４８内に細胞が一様に配置されやすい点から、複数個であることが好ましく、例えば、２，３，４，５又は６個とすることができる。開口部４６，４７の形状は、特に制限されず、円、及び矩形等が挙げられる。開口部４６，４７には、スリット状の切り込みが形成されていてもよい。

図８Ａ及びＣに示す構成のデバイス４１において、チャンバー４８ａ内で一様な層流が形成されやすい点から、導入部４８ｂの高さがチャンバーａの高さよりも低いことが好ましく、例えば、チャンバー４８ａの高さの半分程度の高さとすることがより好ましい。チャンバー４８ａ内で一様な層流が形成されやすく、チャンバー４８ａからの細胞の排出を抑制する点から、排出部４８ｃの高さが導入部４８ｂの高さよりも低いことが好ましく、例えば、導入部４８ｂの高さの半分程度の高さとすることがより好ましい。チャンバー４８ａの高さは、流路４８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、１．５〜２ｍｍである。導入部４８ｂの高さは、流路４８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、０．７〜１ｍｍである。排出部４８ｃの高さは、流路４８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、０．３〜０．５ｍｍである。チャンバー４８ａの幅は、流路４８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、５ｍｍ〜１０ｃｍである。チャンバー４８ａの長さは、流路４８内に層流が形成されるサイズが挙げられ、例えば、５ｍｍ〜１０ｃｍである。

図９Ａ及びＢに本実施形態４のデバイスのその他の例を示す。図９Ａは、デバイスの上面図、図９ＢはV-V断面図である。図９Ａ及びＢに示すように、チャンバー４８ａの底面に、開口部４６から開口部４７に向かう方向に対して直交する方向にストライプ状に突起が形成されていてもよい。

（実施形態５）
図１０は、実施形態５の細胞の三次元構造体自動製造システムの概略構成図である。また、図１０において、実施形態１〜３で説明した構成と同じ構成には同一の符号を付してそれらの説明を省略する。実施形態５の細胞の三次元構造体自動製造システムは、例えば、実施形態２の細胞の三次元構造体自動製造システムと同様にして細胞の三次元構造体を製造することができる。

図１０に示されているように、細胞の三次元構造体自動製造システム６は、デバイス６１と、送液手段１２と、制御部６３と、容器１４と、廃液溜め１５とを備え、容器１４と送液手段１２、送液手段１２とデバイス３１、デバイス３１と廃液溜め１５とはそれぞれチューブを介して接続されている。制御部６３は送液手段１２に接続され、送液手段１２を制御可能なように構成されている。

デバイス６１の一例としては、図１１Ａ〜Ｃに示されているような構造のデバイスが挙げられる。図１１Ａは、実施形態５にかかる被覆細胞自動製造システムに用いるデバイスの斜視図、図１１ＢはVII-VII断面図、図１１ＣはVI-VI断面図である。図１１Ａ〜Ｃに示すデバイス６１は、流路の長さ方向の断面（VII- VII断面）形状が凹形状であるデバイスの一例である。

デバイス６１は、２つの開口部６６，６７と、流路６８とを備え、水平方向の断面形状がＹ字形状であるデバイスの一例である。開口部６６，６７は、デバイス６１の上面にそれぞれ形成され、開口部６６は送液手段１２に接続して導入口となり、開口部６７は廃液溜め１５に接続して排出口となる。流路６８は、開口部６６から導入された液体が開口部６７に排出可能なようにデバイス６１内に形成されている。

（実施形態６）
図１４Ｂは、実施形態１にかかる被覆細胞自動製造システムに用いられうるデバイス７１の斜視図、図１４Ｂは上面図、図１４ＣはVIII-VIII断面図である。

デバイス７１は、２つの開口部７６，７７と、流路７８とを備える。開口部７６、７７は、デバイス７１の側面にそれぞれ形成され、開口部７６は送液手段１２に接続して導入口となり、開口部７７は廃液溜め１５に接続して排出口となる。流路７８は、チャンバー７８ａと、導入部７８ｂと、排出部７８ｃとにより形成され、流路７８は、開口部７６から導入部７８ｂを通じてチャンバー７８ａに導入された液体が、排出部７８ｃを通じて開口部７７に排出可能なようにデバイス７１内に形成されている。

開口部７６（又は導入部７８ｂ）及び開口部７７（又は排出部７８ｃ）は、チャンバー７８ａ内における上昇流を低減し、チャンバー７８ａ内における細胞の移動を低減する点から、チャンバー７８ａの上部に位置することが好ましい。また、開口部７６（又は導入部７８ｂ）及び開口部７７（又は排出部７８ｃ）の中心（又は中心軸）のチャンバー７８ａの底面からの高さは、チャンバーの高さに応じて適宜決定でき、一又は複数の実施形態において、例えば、０．１〜２０ｍｍであり、流路加工を容易にし、及び流路内の詰まりを防ぐ点から、０．３〜１０ｍｍが好ましい。導入部７８ｂとチャンバー７８ａの接続部分には、チャンバー７８ａ内における細胞の移動を低減し、チャンバー７８ａ内に細胞をより沈降させやすくする点から、排出部７８ｃに向かって突出した凸部７８ｄが形成されている。また排出部７８ｃとチャンバー７８ａとの接続部分には、チャンバー７８ａ内における液体の移動距離をより長くし、チャンバー７８ａ内に細胞をより沈降させやすくする点から、導入部７８ｂに向かって突出した凸部７８ｅが形成されている。凸部７８ｄ，７８ｅの形状は、特に限定されず、半月状等が挙げられる。チャンバー７８ａの水平方向の断面形状は、特に限定されず、円、及び矩形等が挙げられる。チャンバー７８ａが円形の底面の場合、チャンバー７８ａからマイクロピペット等を用いて細胞を回収する際に細胞が端に移動しにくくなり、細胞を回収しやすくなる利点がある。

導入部７８ｂ及び排出部７８ｃは、流路７８内に一様な層流が形成されやすく、かつ、細胞がチャンバー７８ａから排出部７８ｃに流出することを抑制する点から、それらの中心軸がチャンバー７８ａの底面の面方向に対して略平行であることが好ましい。導入部７８ｂの中心軸と排出部７８ｃの中心軸とは、チャンバー７８ａ内において一様な層流が形成されやすくする点から、略平行であることが好ましい。導入部７８ｂの中心軸と排出部７８ｃの中心軸とは同一軸上にあってもよい。

チャンバー７８ａの高さは、一又は複数の実施形態において、例えば、０．１〜１０ｍｍであり、チャンバー７８ａの加工を容易にし、細胞外マトリックス成分を含む液体を減少させ、かつ細胞操作を容易にする点から、０．５〜３ｍｍが好ましい。チャンバー４８ａの径は、一又は複数の実施形態において、例えば、１〜５０ｍｍである。

デバイス７１は、溝部が形成された部材と基板とを接合することによって上記流路が形成されたデバイスであってもよいし、一体成型されたデバイスであってもよい。デバイス７１が、溝部が形成された部材と基板とを接合したデバイスである場合、部材と基板とは剥離可能な状態で接合されていることが好ましい。細胞の培養及び/又は形成された三次元構造体の回収を容易に行うことができる点から、部材と基板とが剥離可能な状態で接合されて流路が形成されたデバイスであることが好ましい。

上記の実施形態１〜６は例示に過ぎず、本発明は上記の実施形態１〜６に限定されず、適宜変更することができる。

以下に、実施例を用いて本発明をさらに説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定して解釈されない。

なお、本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
50mM Tris-HCl(pH7.4)：HCl（Nacalai Tesque社製）でpH7.4に調整した50mM Trisを、0.2μm γ-raysterile filter（倉敷紡績株式会社製）で滅菌濾過したもの
ＢＦＮ：Fibronectin from bovine plasma（SIGMA製）
ＢＦＮ溶液：0.2mg BFN/1ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)
ＤＭＥＭ：10% FBS（GIBCO社製）を含むDulbecco's eagle's medium（SIGMA社製）
Gelatin溶液：0.2mg Gelatin/1ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)を、0.2μm γ-ray sterile filter（倉敷紡績株式会社製）で滅菌濾過したもの

（実施例１）
三次元構造体自動製造システムを用いて流路内において細胞の積層を行った。

［積層用流路の作製］
材料としてはＰＤＭＳ（商品名：ＴＳＥ３０３２、モメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズジャパン合同会社）を使用し、ＴＳＥ３０３２のＡ液とＢ液とを１０：１の比で混合し、デシケーター内で脱泡してＰＤＭＳ混合液を得た。得られた混合液を鋳型に流し込み、この液体を７０℃で１時間オーブン内で硬化させた。硬化後の流路を鋳型から取り出し、スライドガラス（松浪ガラス社製）に貼り合わせることによって積層用流路Ａを作製した。得られた積層用流路Ａは、図５Ａ〜Ｃに示す構造であった。積層部Ａの長さ（図５Ｃにおけるａ）は7mm、積層部Ｂ及びＣの長さ（図５Ｃにおけるｂ及びｃ）は10mm、流路の幅（図５Ｃにおけるｄ）は2mm、流路の高さ（図５Ｂにおけるｅ）は100〜500μmとした。

また、図５Ａ〜Ｃに示す流路構造となるようにアクリル樹脂（三菱レイヨン社製）を切削し、流路が切削されたアクリル樹脂とスライドガラス（松浪ガラス社製）とを、上記の混合液ＰＤＭＳで貼り合わせることによって積層用流路Ｂを得た。

［三次元構造体自動製造システムを用いた細胞の積層］
まず、自動積層に先立ち、流路内にBFN膜及び細胞層の積層を行った。積層用流路Ａを１８０℃で２時間乾熱滅菌し、乾熱滅菌した積層用流路Ａを、クリーンベンチ（HITACHI社製）内で、直径３ｍｍの培養用シャーレ（IWAKI社製）において50mM Tris-HCl(pH7.4)で洗浄した。流路内の溶液を除去した後、ＢＦＮ溶液を添加し、１５分間浸漬した。これにより流路上にＢＦＮ膜を形成させた。ついで、流路内の溶液を除去した後、50mM Tris-HCl(pH7.4)での洗浄及び流路内の溶液の除去を行い、細胞分散液を流路内に導入して細胞を播種した。30分間静置した後、シャーレ内をDMEMで満たし、5%CO₂、37℃に保たれたインキュベーター（アステック社製）内に一晩置き、細胞を接着させた。なお、細胞分散液は以下の手順で調製した。まず、C2C12細胞を、100mmの培養シャーレ（TPP社製）に入れた10mlのDMEM中で十分に培養した。ついで、15mlの遠沈管（住友ベークライト社製）に移し、遠心機（KUBOTA社製）を用いて100rpmで3分間遠心した。沈殿させた細胞を回収し、1mlのDMEM内に分散させて細胞分散液を得た。

次に、クリーンベンチ内で、細胞を接着させた流路、バルブ、ポンプ、コントローラ、積層に用いる溶液を入れる容器、及び廃液容器を接続した。接続に用いるチューブ及び溶液を入れる容器は、予め100%エタノール（Nacalai Tesque社製）を用いて滅菌し、滅菌後しばらく放置して乾燥させたものを使用した。細胞を接着させた流路からDMEMを除去し、50mM Tris-HCl(pH7.4)、BFN溶液を50mM Tris-HCl(pH7.4)で4倍希釈した溶液、及びGelatin溶液を上記容器に入れた後、コントローラの電源を入れ、BFN及びGelatinを含む被膜の自動形成を行った。

被膜の自動形成は、下記表１に示す順番で送液されるように設定されたプログラムを用いて行い、これを４回繰り返し行った後、350μlの50mM Tris-HCl(pH7.4)を送液した。コントローラを止め、流路からチューブを外し、流路内の溶液を除去した。そして、流路内に上記の細胞分散液を導入して細胞を播種し、30分間静置した後、シャーレ内をDMEMで満たし、5%CO₂、37℃に保たれたインキュベーター内に一晩置き、細胞を接着させた。これにより、C2C12細胞が２層積層された三次元構造体が得られた。得られた三次元構造体の顕微鏡写真を図１２に示す。三次元構造体自動製造システムを用いて、図１２に示すような複数の細胞層が積層された三次元構造体を作製できた。

（実施例２）
被覆細胞自動製造システムを用いて流路内において細胞外マトリックス成分含有被膜で被覆された細胞を作製した。

［被覆用流路の作製］
被覆用流路は、図２Ａに示す流路構造とした以外は、実施例１の［積層用流路の作製］における積層用流路Ａと同様に作製した。流路の大きさは、ｘ（底面横）：10mm、ｙ（底面縦）：10mm、ｚ（高さ）：12mm、ｓ：5mm、ｔ：6〜8mm、ｕ（底面からの流入口及び排出口の高さ）：10mmとした。

［細胞分散液の調製］
3T3細胞を、100mmの培養シャーレ（TPP社製）に入れた10mlのDMEM中で十分に培養した。ついで、15mlの遠沈管（住友ベークライト社製）に移し、遠心機（KUBOTA社製）を用いて100rpmで3分間遠心した。上清を1mlほど残して除去し、残した上清で沈殿した細胞を分散させて細胞分散液を得た。

［被覆細胞自動製造システムを用いた被覆細胞の作製］
まず、被覆用流路、及び被覆に用いる溶液を入れる容器（被覆液用容器）を、30分〜1時間殺菌灯をつけたクリーンベンチ内に置き殺菌した。次に、クリーンベンチ内で、バルブ、ポンプ、コントローラ、及び被覆液用容器を図１に示すように接続した。被覆液用容器に100%エタノールを入れ、コントローラの電源を入れしばらく運転を行い、被覆液用容器及びチューブの滅菌を行った。滅菌が終了後、被覆液用容器からエタノールを除去し、容器に液がない状態で再度運転を行いチューブ及び流路のエタノールを除去した。しばらく放置して乾燥させた後、被覆液用容器に50mM Tris-HCl(pH7.4)を入れてしばらく運転を行い、ついで容器から50mM Tris-HCl(pH7.4)を除去した。50mM Tris-HCl(pH7.4)、BFN溶液を50mM Tris-HCl(pH7.4)で4倍希釈した溶液、及びGelatin溶液をそれぞれ別の被覆液用容器に入れ、被覆用流路に細胞分散液を配置し、図１に示すように流路にチューブを接続した後、コントローラの電源を入れ、細胞への被覆を行った。

被覆は、下記表２に示す順番で送液されるように設定されたプログラムを用いて行い、これを４回繰り返し行った後、350μlの50mM Tris-HCl(pH7.4)を導入することにより行った。コントローラを止め、流路に接続したチューブを外し、流路をスライドガラスから剥がし取り、ピペットマンを用いてスライドガラス上の被覆細胞を100μlのDMEMでピペッティングして回収した。得られた被覆細胞の顕微鏡写真を図１３に示す。被覆細胞自動製造システムを用いて、図１３に示すように、細胞表面がBFN膜及びGelatin膜によって被覆された被覆細胞が得られた。

（実施例３）
Cell Traker Redで染色した細胞を用いた以外は実施例２と同様にして、細胞表面がBFN膜及びGelatin膜によって被覆された被覆細胞を調製した。
参考例として、被覆細胞自動製造システムを用いることなく、手動で行った以外は実施例３と同様にして被覆細胞を調製した。具体的には、Adv. Mater. 2011, 23, 3506-3510に開示された方法に基き、遠心チューブを用いて、BFN溶液の添加及び除去(ＢＦＮ膜形成)、50mM Tris-HCl(pH7.4)の添加及び遠心分離（洗浄操作）、Gelatin溶液の添加及び除去（Gelatin膜形成）、及び洗浄操作を繰返し行った。ＢＦＮ溶液及びGelatin溶液を添加する回数は、実施例３と同様にした。

得られた実施例３及び参考例の被覆細胞それぞれについて、共焦点蛍光顕微鏡（オリンパス社製）を用いて蛍光強度分布を求め、その平均値を高さ位置に対してプロットし、そのデータ点をガウス関数近似によって半値全幅を得ることにより、被覆細胞の厚みを近似した。その結果、実施例３で得られた被覆細胞の厚み（半値全幅）は、参考例の被覆細胞とほとんど変わらなかった。よって、本発明の方法により、手動で行う場合と同程度の厚みを有する細胞外マトリックス成分含有被膜の形成を確認できた。

本発明は、例えば、化粧品、医薬、製薬等の分野において有用である。

Claims (11)

1. 細胞表面が細胞外マトリックス成分含有被膜で被覆された被覆細胞を製造する方法であって、
   少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイスにおいて、
   前記流路に細胞を導入すること、及び
   前記細胞が導入された流路に送液手段を用いて細胞外マトリックス成分を含む液体を導入することを含み、
   前記液体の導入は、前記流路の少なくとも一部に層流が形成され、前記層流が前記細胞に接触するように前記送液手段を制御して行う、被覆細胞の製造方法。
2. 前記液体の導入は、ＲＧＤ配列を有する第１物質を含む第１液と、前記第１物質と相互作用する第２物質を含む第２液とが交互に導入されるように送液手段を制御して行う、請求項１記載の製造方法。
3. 前記第１液及び第２液の導入を少なくとも２回以上繰返し行うことを含む、請求項２記載の製造方法。
4. 前記第１液の導入後及び/又は第２液の導入後に洗浄液を導入することを含む、請求項２又は３に記載の製造方法。
5. 前記第１物質は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、ポリリジン、エラスチン、ＲＧＤ配列を結合させたコラーゲン、ＲＧＤ配列を結合させたゼラチン、キチン、及びキトサンからなる群から選択され、
   前記第２物質は、ゼラチン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、グロブリン、アルブミン、ポリグルタミン酸、コラーゲン、及びエラスチンからなる群から選択される、請求項２から４のいずれかに記載の製造方法。
6. 前記細胞の導入は、細胞を媒体に分散させた状態で流路に導入することを含む、請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
7. 前記細胞は、繊維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、神経膠細胞、平滑筋細胞、幹細胞、表皮細胞、骨格筋細胞、免疫細胞、及びがん細胞からなる群から選択される、請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
8. 細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を調製すること、及び
   前記被覆細胞を培養し、前記被覆細胞が積層された細胞の三次元構造体を形成することを含み、
   前記被覆細胞の調製は、
   少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイスにおいて、
   前記流路に細胞を導入すること、及び
   前記細胞が導入された流路に送液手段を用いて細胞外マトリックス成分を含む液体を導入することを含み、
   前記液体の導入は、前記流路の少なくとも一部に層流が形成され、前記層流が前記細胞に接触するように前記送液手段を制御して行う、細胞の三次元構造体の製造方法。
9. 少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイスにおいて、
   前記流路に細胞を導入して細胞層を形成すること、
   前記細胞層上に細胞外マトリックスを形成されるように送液手段を制御して、前記細胞層が形成された流路に細胞外マトリックス成分を含む液体を導入すること、及び
   前記細胞外マトリックス成分を含む液体が導入された流路に、細胞を導入して前記細胞外マトリックス上に細胞層を１層以上積層することを含む、細胞の三次元構造体の製造方法。
10. 少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイス、
    前記デバイスの流路に、細胞外マトリックス成分を含有する液体を導入するための送液手段、及び
    前記流路の少なくとも一部に層流が形成されるように、前記細胞外マトリックス成分を含有する液体を前記流路に導入するように前記送液手段を制御する制御部を備える、被覆細胞自動製造システム。
11. 少なくとも２つの開口部と前記開口部間を連通する流路とを有するデバイス、
    前記デバイスの流路に、細胞外マトリックス成分を含有する液体を導入するための送液手段、及び
    前記流路に前記細胞外マトリックス成分を含有する層が形成されるように、前記細胞外マトリックス成分を含有する液体を前記流路に導入するように前記送液手段を制御する制御部を備える、細胞の三次元構造体自動製造システム。