MX2015002819A - Dispositivos y metodos para el cultivo de celulas. - Google Patents

Dispositivos y metodos para el cultivo de celulas.

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Abstract

Se proporcionan dispositivos y métodos para el cultivo celular. Los dispositivos puede comprender un cuerpo tridimensional que tiene múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia del cuerpo tridimensional hacia un interior del cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área superficial de las múltiples superficies bidimensionales.

Description

DISPOSITIVOS Y MÉTODOS PARA EL CULTIVO DE CÉLULAS La presente divulgación se refiere generalmente a los dispositivos y métodos para el cultivo de células.
Existen varios métodos actuales para el cultivo de células eucarióticas. Algunos de estos métodos han sido desarrollados para el cultivo de un número relativamente pequeño de células, y otros han sido desarrollados para la producción y cosecha de proteínas secretadas por las células en medios circundantes. Algunos sistemas, sin embargo, han sido desarrollados para escalamiento comercial del cultivo celular para producir grandes cantidades de las células.
El método más común para el cultivo de las células eucarióticas es por extensión en matraces o bandejas bidimensionales, tales como NUNCL0N™A CELL FACTORY, que incluye pilas de matraces de cultivo celular. Este método tiene varios defectos, incluyendo la incapacidad para supervisar y controlar de forma continua los parámetros ambientales tales como OD, pH y alimentar los ingredientes/retirar los productos de residuo; baja eficiencia en términos de área superficial a las relaciones de volumen; la necesidad de incubadoras de gran volumen; la necesidad de manipulación laboriosa de los matraces de cultivo; y largos periodos de tiempo para la siembra y cultivo, que puede ser costoso y perjudicial para la viabilidad de la célula.
Además, las células pueden cultivarse en matrices tridimensionales. Dichas matrices pueden incluir fibra tejida/no tejida porosa y materiales similares a una esponja que pueden colocarse en un lecho compacto dentro de un biorreactor. Estos portadores se utilizan principalmente para la producción y la colección de proteínas secretadas, mientras que las células permanecen unidas a la matriz, en lugar de para el cultivo de células que son retiradas en última instancia y utilizadas como agentes terapéuticos. Ejemplos de dichos portadores son FIBRA-CELL® DISKS (New-Brunswick) y portadores de cerámica porosos. Véase Wang, G., W. Zhang, et al., "Modified CelliGen-packed bed bioreactors for hybridoma cell cultures . " Cytotechnology 9(1-3): 41-9 (1992); y Tim ins, N. E., A. Scherberich, et al., "Three-dimensional cell culture and tissue engineering in a T-CUP (tissue culture under perfusi n) . " Tissue Eng 13 (8): 2021-8 (2007).
El cultivo en matrices tridimensionales, sin embargo, puede tener algunos inconvenientes. Por ejemplo, puede ser relativamente difícil remover las células de los matrices y los procesos de remosión pueden dañar las células. La producción usando dichos dispositivos puede ser difícil porque las células dañadas no se pueden unir nuevamente de forma fácil a las superficies del sistema de cultivo. Las diferencias en el tipo y las propiedades de los materiales utilizados en los matrices y matraces también pueden causar variación en las interacciones de la célula.
Finalmente, las células pueden cultivarse en un biorreactor utilizando microportadores no porosos en suspensión o en un lecho fluidizado. Este método permite el crecimiento de la célula en una monocapa sobre la superficie de los microportadores. Usar este método, sin embargo, requiere la separación de los portadores de los medios por sedimentación o filtración, que no son procesos sencillos y pueden no resultar en altas tasas de recuperación celular. Además, los microportadores tienen desviaciones en las superficies en una escala celular, que resulta en un ambiente de cultivo que es diferente de los sistemas de cultivo bidimensional.
La presente divulgación proporciona dispositivos y métodos para el cultivo bidimensional de células eucarióticas.
De acuerdo con diferentes modalidades, se proporciona un dispositivo para cultivo celular. El dispositivo puede comprender un cuerpo tridimensional que comprende múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia del cuerpo tridimensional hacia un interior del cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento de una sola capa de las células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o todo el área de la superficie de las múltiples superficies bidimensionales, y en donde el cuerpo tridimensional tiene una dimensión máxima que oscila de aproximadamente 1 m a aproximadamente 50 mm. En contraste con los métodos convencionales para el cultivo bidimensional de las células (donde las células crecen en un contenedor que proporciona la superficie bidimensional), los dispositivos descritos en el presente documento se introducen en un recipiente que contiene medios de crecimiento celular. Por ejemplo, los dispositivos descritos en el presente documento pueden formar parte de un sistema para el cultivo celular como se describe a continuación. Por lo tanto, en algunas modalidades, los dispositivos están inmersos en el medio de cultivo dentro de un contenedor adecuado. Para proporcionar un crecimiento bidimensional de las células en monocapas, los dispositivos descritos en el presente documento permiten las condiciones de crecimiento controlados para producir células que tienen las características asociadas con las células que crecen en un entorno bidimensional.
De acuerdo con diversas modalidades, se proporciona un sistema de cultivo celular. El sistema puede comprender un contenedor y un grupo de cuerpos tridimensionales. Cada cuerpo tridimensional puede comprender múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia del cuerpo tridimensional hacia un interior de cada cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área de la superficie de las múltiples superficies bidimensionales, y en donde el cuerpo tridimensional tiene una dimensión máxima que oscila de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 50 mm.
De acuerdo con diversas modalidades, se proporciona un método para cultivar células. El método puede comprender el seleccionar un grupo de células eucarióticas y contactar las células eucarióticas con al menos un cuerpo tridimensional, el al menos un cuerpo tridimensional que tiene múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia del cuerpo tridimensional hacia un interior de cada cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área de la superficie de las múltiples superficies bidimensionales, y en donde el cuerpo tridimensional tiene una dimensión máxima que oscila de aproximadamente 1 m a aproximadamente 50 mm.
De acuerdo con ciertas modalidades, se proporciona un dispositivo de cultivo celular. El dispositivo puede comprender un cuerpo tridimensional que comprende múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia del cuerpo tridimensional hacia un interior de cada cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área de la superficie de las múltiples superficies bidimensionales, y en donde el cuerpo tridimensional tiene una proporción de área superficial a volumen de entre aproximadamente 3 cm2/cm3 y aproximadamente 1,000 cm2/cm3.
De acuerdo con diversas modalidades, se proporciona un dispositivo de cultivo celular. El dispositivo puede comprender un cuerpo tridimensional que comprende una hoja de material formado en una configuración sustancialmente en espiral. La hoja de material puede comprender al menos dos de las superficies bidimensionales, en donde las superficies bidimensionales pueden estar configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área superficial de las múltiples superficies bidimensionales, y en donde el cuerpo tridimensional tiene una proporción de área superficial a volumen de entre aproximadamente 3 cm2/cm3 y aproximadamente 1,000 cm2/cm3.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1A es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. IB es una vista en sección transversal del dispositivo de la Fig.1A.
La Fig. 2A es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 2B es una vista en perspectiva lateral del dispositivo de la Fig.2A.
La Fig. 2C es una vista de la parte superior del dispositivo de la Fig.2A.
La Fig. 2D es una vista en sección transversal del dispositivo de la Fig.2A.
La Fig. 3A es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 3B es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 4D es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 4B es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 5 es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 6 es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 7 es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 8A es una vista en perspectiva de un dispositivo para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 8B es una vista en sección transversal del dispositivo de la Fig.8A.
La Fig. 9 es una vista en perspectiva de un sistema para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades.
La Fig. 10 es una gráfica de barras que muestra los resultados de cultivo celular en matraces o utilizando los dispositivos de cultivo bidimensional de la presente divulgación, tal como se describe en el Ejemplo 1.
La Fig. 11 es una gráfica de barras que muestra el número de duplicación de la población de células cultivadas en los matraces o utilizando los dispositivos de cultivo bidimensional de la presente divulgación, tal como se describe en el Ejemplo 1.
La Fig. 12 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para células cultivadas utilizando los dispositivos de cultivo bidimensional, a diferentes velocidades medias de mezclado (RPM) como se describe en el Experimento 1.
La Fig. 13 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para células cultivadas utilizando los dispositivos de cultivo bidimensional, como se describe en el Experimento 1.
La Fig. 14 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para células cultivadas utilizando diversos dispositivos de cultivo bidimensional recubiertos, como se describe en el Experimento 1.
La Fig. 15 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para células cultivadas utilizando un medio de cultivo preincubado de los dispositivos de cultivo bidimensionales, como se describe en el Experimento 1.
La Fig. 16 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para células cultivadas utilizando diversos dispositivos de cultivo bidimensional recubiertos con o sin tratamiento de superficie por plasma de los dispositivos, como se describe en el Experimento 1.
La Fig. 17 es una gráfica de barras que ilustra la comparación de PDD (duplicación de la población por día) entre matraces de 175 cm2 y portadores 2D, como se describe en el Experimento 3.
DESCRIPCIÓN DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS Ahora, se hará referencia detalladamente a ciertas modalidades ejemplares de acuerdo con la presente divulgación, ciertos ejemplos de los cuales son ilustrados en los dibujos adjuntos. Siempre que sea posible, se utilizará los mismos números de referencia a través de los dibujos para referirse a la misma parte o partes similares.
En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario.
También en esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye," asi como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no son limitantes. Cualquier rango descrito en el presente documento se entenderá que incluye los extremos y todos los valores entre los extremos.
Los dispositivos de la presente divulgación permiten el crecimiento bidimensional de las células eucarióticas. "Crecimiento bidimensional" se entenderá que incluye el crecimiento de las células eucarióticas a lo largo de una superficie en donde la mayoría del crecimiento celular está en una monocapa. Una "mayoría del crecimiento celular en una monocapa" se entenderá que incluye el crecimiento celular de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos 95% o al menos el 99% de las células en una monocapa. "Crecimiento bidimensional" puede incluir el crecimiento a lo largo de algo plano (es decir, superficies planas) y/o crecimiento a lo largo de superficies que tienen algún grado de curvatura, como se describe en más detalle a continuación. Por lo tanto, una "superficie bidimensional" se entenderá que incluye una superficie que es plana y/o una superficie que tiene alguna curvatura. Además, como se utiliza en el presente documento la frase "crecimiento tridimensional" se refiere al crecimiento bajo condiciones que son compatibles con el crecimiento celular en una estructura que permite el contacto de célula a célula en tres dimensiones.
Permitiendo un crecimiento bidimensional, los dispositivos de la presente divulgación proporcionan un área de superficie alta para las relaciones del volumen, permitiendo así el crecimiento de grandes cantidades de células en volúmenes bajos, en comparación con el crecimiento bidimensional en matraces. Además, los dispositivos de la presente divulgación pueden configurarse para facilitar la extracción de las células después del crecimiento y/o la transferencia de células a otros entornos para almacenamiento, uso comercial (por ejemplo, como agentes terapéuticos), o para el crecimiento de células adicionales. Además, los dispositivos descritos en el presente documento pueden configurarse para permitir el crecimiento celular de alta calidad que es al menos tan bueno como el alcanzado utilizando sistemas de cultivo celular estándar en términos de viabilidad, unión, y/o mantenimiento o control celular de otras propiedades de la célula.
Los dispositivos de la presente divulgación pueden utilizarse para cultivar una variedad de diferentes tipos de células eucarióticas. Los dispositivos son adecuados para el crecimiento de células madre, células dependientes de anclaje, células mesenquimales y las células adherentes.
Como se utiliza en el presente documento la frase "células adherentes" se refiere a las células que son dependientes de anclaje, es decir, requieren una unión a una superficie con el fin de crecer in vitro. Las células adherentes adecuadas pueden incluir células mesenquimales del estroma, que son una población heterogénea de células obtenidas de, por ejemplo, médula ósea, tejido adiposo, placenta y sangre, y que pueden o no ser capaces de diferenciarse en distintos tipos de células (por ejemplo células endoteliales reticulares, fibroblastos, adipocitos, células precursoras osteogénicas) dependiendo de la influencia de diversos factores bioactivos.
El crecimiento eficiente de diversos tipos de células adherentes puede ser altamente dependiente del entorno o las interacciones experimentadas por las células durante el crecimiento. Por ejemplo, las células adherentes pueden ponerse inadvertidamente en contacto con otras células adherentes. Si una monocapa de células inadvertidamente contacta otra monocapa de células, las dos monocapas pueden adherirse entre si. Dicha interacción entre monocapas de diferentes dispositivos puede resultar en una unión de los dispositivos entre si. La interacción puede ser mediada por una matriz extracelular secretada por las células. Porque los dispositivos descritos en el presente documento pueden limitar tales interacciones célula a célula no deseadas, acumulación o agregación puede ser generalmente limitada. Además, los dispositivos presentes pueden proporcionar un suministro eficiente de los nutrientes, medio y gases a través de un cultivo para proporcionar un entorno estable para el crecimiento de monocapas de células adherentes y una cosecha eficiente de las células. Los dispositivos también pueden promover un crecimiento más consistente de las células mediante la limitación de las subpoblaciones de células que crecen bajo condiciones tridimensionales en comparación con las condiciones bidimensionales.
En un aspecto, los dispositivos descritos en el presente documento pueden configurarse para limitar el contacto entre las superficies configuradas para el crecimiento celular. Como tal, los dispositivos pueden ser generalmente circulares, redondos o arqueados para minimizar generalmente el contacto entre las superficies de los dispositivos adyacentes. Dispositivos individuales pueden ser diseñados para contactar dispositivos adyacentes sobre un área relativamente pequeña. Dicho contacto limitado entre dispositivos puede proporcionar superficies crecientes que las células de crecimiento sujetas a interacciones relativamente pequeñas con otras células que crecen en otros dispositivos. Varios dispositivos en un único recipiente de incubación pueden por lo tanto proporcionar un entorno de crecimiento más eficiente, controlado y estable para las células adherentes.
En algunas modalidades, los dispositivos descritos en el presente documento pueden ser generalmente circulares en sección transversal. Por ejemplo, la forma exterior de los dispositivos puede ser esféricos, cilindricos y otros volúmenes generalmente redondeados. Dichos dispositivos pueden proporcionar áreas de contacto de menos de aproximadamente 10% en relación con el área de superficie exterior total del dispositivo. En otras modalidades, un área de contacto puede ser menos de aproximadamente 5%, 2% ó 1% del área de la superficie total. También se pueden utilizar otras formas si puede minimizar lo suficiente el contacto entre los dispositivos adyacentes.
Los métodos de crecimiento celular descritos en el presente documento también pueden ser configurados para el uso con los dispositivos descritos en el presente documento. Los recipientes configurados para resistir generalmente la unión celular pueden utilizarse con estos dispositivos. Por ejemplo, pueden utilizarse recipientes formados a partir de o recubiertos con vidrio o plásticos conocidos por limitar la adhesión celular. Dichos recipientes pueden estimular el crecimiento adecuado de monocapas de células adherentes en los dispositivos descritos en el presente documento. Dichos recipientes también pueden limitar posibles interacciones celulares no deseadas, que pueden resultar en adherencias de célula a célula involuntarias como se describió anteriormente.
De acuerdo con diferentes modalidades, se proporcionan dispositivos para el cultivo celular. Los dispositivos puede comprender un cuerpo tridimensional que comprende múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia del cuerpo tridimensional hacia un interior del cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área superficial de las múltiples superficies bidimensionales. En algunas modalidades, las múltiples superficies bidimensionales pueden o no pueden mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área de la superficie de las múltiples superficies bidimensionales. "Múltiples" superficies bidimensionales significa "más de una" superficie bidimensional e incluye al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o al menos diez superficies bidimensionales. También se contemplan más de diez superficies bidimensionales, tales como, por ejemplo, 50, 100, 500 o más superficies. Una "mayoría del área superficial" se entiende que incluye al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% del área superficial. En varias modalidades, los dispositivos tienen una dimensión máxima de menos de aproximadamente 50 mm y/o un área de superficie a la relación del volumen entre aproximadamente 3 cm2/cm3 y aproximadamente 1,000 cm2/cm3. "Dimensión máxima" se entiende que incluye la altura exterior más grande, anchura, longitud, espacio diagonal, distancia al vértice, diámetro transversal, diámetro, alcance en sección transversal o cualquier otra dimensión espacial exterior más grande del cuerpo tridimensional.
Los dispositivos de cultivo celular de la presente divulgación pueden tener un número de diferentes formas y configuraciones, pueden formarse a partir de cualquiera de un número de materiales adecuados y pueden incluir una variedad de tratamientos superficiales y/o recubrimientos para facilitar el crecimiento celular. Las Figs. 1A-8B, ilustran los dispositivos de cultivo celular de acuerdo con varias modalidades, que están descritas en más detalle a continuación. Además, la Fig. 9 ilustra un sistema de cultivo celular ejemplar incluyendo un contenedor y un grupo de dispositivos de cultivo celular. Se apreciará que los dispositivos y sistemas mostrados en las figuras y descritas más adelante son ejemplares, y varias características de las diferentes modalidades descritas en el presente documento pueden ser combinadas o intercambiadas.
La Fig. 1 es una vista en perspectiva de un dispositivo (10) para el cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades; y la Fig. IB es una vista en sección transversal del dispositivo (10) de la Fig.1A. Como se muestra, el dispositivo (10) incluye múltiples superficies bidimensionales (12) que se extienden desde el exterior del dispositivo (10) hacia un interior del dispositivo (10). Como se muestra, las superficies están formadas por un grupo de costillas (14) que están espaciadas para formar aberturas (16), que pueden ser de un tamaño que permita el flujo de células y medio de cultivo durante el uso. El dispositivo (10) también puede incluir uno o más planos laterales que se extienden de un eje central del dispositivo (10) y que se extiende generalmente perpendicular a las costillas (14).
En algunas modalidades, un diámetro exterior del dispositivo (10) puede oscilar desde aproximadamente 1 mm a aproximadamente 50 mm. En otras modalidades, el diámetro exterior puede oscilar desde aproximadamente 2 mm a aproximadamente 20 mm y aproximadamente 4 mm a aproximadamente 10 mm. Dependiendo del tamaño total del dispositivo (10), las costillas (14) y las aberturas (16) pueden ser de tamaño variado. Por ejemplo, las costillas (14) pueden oscilar en un grosor de aproximadamente 0.1 m a aproximadamente 2 mm y de aproximadamente 0.2 m a aproximadamente 1 mm. En particular, las costillas (14) pueden ser de aproximadamente 0.5 mm, aproximadamente 0.6 mm o aproximadamente de 0.7 mm de grosor. Las aberturas (16) pueden oscilar en un grosor de aproximadamente 0.01 mm a aproximadamente 1 mm y de aproximadamente 0.1 mm a aproximadamente 0.5 mm. En particular, las aberturas (16) pueden ser de aproximadamente 0.3 mm, de aproximadamente 0.4 mm o aproximadamente de 0.5 mm de grosor.
En la modalidad mostrada en las Figs. 1?-1B, las costillas (14) son substancialmente planas y se extienden paralelamente a otra del centro del dispositivo a la periferia del dispositivo. Estas costillas, sin embargo, pueden incluir una variedad de configuraciones. Por ejemplo, las Figs.2A-2D ilustran un dispositivo (20) que tiene múltiples superficies bidimensionales (22) formadas por las costillas (24) en una configuración diferente. La Fig. 2A es una vista en perspectiva del dispositivo (20) para el cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades; la Fig.2B es una vista en perspectiva lateral del dispositivo de la Fig.2A; la Fig. 2C es una vista de la parte superior del dispositivo de la Fig.2A; y la Fig. 2D es una vista en sección transversal del dispositivo de la Fig.2A. El dispositivo (20) de las Figs. 2A-2D es similar al dispositivo (10) de las Figs.1A-1B, pero las costillas (24) del dispositivo (20) son conformadas para formar aberturas (26) que están espaciadas alrededor de la circunferencia del dispositivo (20). Las aberturas (26) pueden ser generalmente en forma de cuña. Las costillas (24) se pueden extender en general radialmente desde un eje central del dispositivo (20) a una superficie periférica del dispositivo (20). El dispositivo (20) también puede incluir uno o más planos laterales que se extienden de un eje central del dispositivo (20) y que se extiende generalmente perpendicular a las costillas (24). Además, el dispositivo (20) incluye una abertura (36) que se extiende a través del centro del dispositivo y que forma superficies adicionales (32), que pueden mantener el crecimiento en una sola capa de las células eucarióticas.
Como se describió anteriormente para el dispositivo (10), las dimensiones del dispositivo (20) pueden ser de tamaño variado. Por ejemplo, un diámetro exterior del dispositivo (20) puede oscilar desde aproximadamente 1 mm a aproximadamente 50 mm. En otras modalidades, el diámetro exterior puede oscilar desde aproximadamente 2 m a aproximadamente 20 mm y aproximadamente 4 mm a aproximadamente 10 mm. Dependiendo del tamaño total del dispositivo (20), las costillas (24) y las aberturas (26) pueden ser de tamaño variado. Por ejemplo, las costillas (24) pueden oscilar en un grosor de aproximadamente 0.1 mm a aproximadamente 2 mm y de aproximadamente 0.2 mm a aproximadamente 1 mm. En particular, las costillas (24) pueden ser de aproximadamente 0.5 mm, aproximadamente 0.6 mm o aproximadamente de 0.7 mm de grosor. Como se muestra en las Figs.2A - 2C, las aberturas (26) pueden oscilar en grosor de un grosor mínimo generalmente ubicado alrededor de un eje central que se extiende a través del dispositivo (20) o la abertura (36), con un grosor máximo generalmente ubicado alrededor de una periferia del dispositivo (20). Un grosor mínimo de las aberturas (26) puede oscilar de aproximadamente 0.01 mm a aproximadamente 1 mm y de aproximadamente 0.1 mm a aproximadamente 0.5 mm. Específicamente, el grosor mínimo de las aberturas (26) puede ser de aproximadamente 0.3 mm, aproximadamente 0.4 mm o aproximadamente 0.5 mm. Además, la abertura (36) puede oscilar en diámetro de aproximadamente 0.1 mm a aproximadamente 5 mm y de aproximadamente 0.5 mm a aproximadamente 2 mm. Más concretamente, la abertura (36) puede tener un diámetro de aproximadamente 0.8 mm, aproximadamente 1 mm o aproximadamente 1.2 mm.
Como se muestra, los dispositivos (10), (20) son sustancialmente esféricos y tienen un diámetro (18) que constituye la dimensión más grande de los dispositivos. Los dispositivos descritos en el presente documento pueden tener una variedad de diferentes formas y configuraciones, mientras los dispositivos proporcionan superficies bidimensionales para la unión y el crecimiento en una sola capa sobre al menos una mayoría de o toda el área superficial de las múltiples superficies bidimensionales (12), (22).
Los dispositivos de cultivo celular de la presente divulgación pueden incluir una variedad de formas y configuraciones. Por ejemplo, aunque los dispositivos descritos anteriormente respecto a las Figs. 1A-2D son substancialmente esféricos, otras formas convenientes pueden ser utilizadas. Por ejemplo, las Figs. 3A-3B son vistas en perspectiva de los dispositivos (10'), (20') para el cultivo celular bidimensional. Los dispositivos (10'), (20') son similares a los dispositivos (10), (20) de las Figs. 1A-2D salvo que los dispositivos (10'), (20') tienen formas sustancialmente ovoides, pero igualmente proporcionan múltiples superficies bidimensionales (12'), (22') formadas por las costillas (14'), (24') o aberturas (36'). Además, pueden utilizarse otras formas convenientes, incluyendo otras formas poliédricas y/o poliédricas irregulares.
Como se señaló anteriormente, los dispositivos de la presente divulgación pueden incluir múltiples superficies bidimensionales configuradas para mantener el crecimiento en una sola capa de las células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área superficial de las múltiples superficies bidimensionales. En ciertas modalidades, las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener el crecimiento en una sola capa sobre sustancialmente toda su área superficial. Por ejemplo, las Figs. 4A-4B son vistas en perspectiva de los dispositivos para el cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades, que están configuradas para mantener el crecimiento en una sola capa sobre sustancialmente toda su área superficial. Los dispositivos (10"), (20") de las Figs. 4A-4B son similares a otros dispositivos descritos anteriormente y comprenden superficies (12*), (22') formadas por las costillas (14'), (24'). Sin embargo, los dispositivos (10"), (20") tienen aberturas (16'), (26') con superficies (12'), (22') que forman suaves curvas a lo largo de sus áreas enteras, así eliminando o reduciendo áreas de curvatura afilada donde puede ocurrir el crecimiento tridimensional. Por ejemplo, como se muestra, los dispositivos (10"), (20") tienen superficies inferiores suavemente curvadas (40), (42), opuestas a las curvas más afiladas, como se ilustra con respecto a los dispositivos de las Figs.1A-2D En varias modalidades, la curvatura especifica y la configuración de las múltiples superficies bidimensionales pueden ser modificadas, por ejemplo, para proporcionar áreas de superficie más altas y/o para controlar el crecimientocelular. Por ejemplo, la Fig.5 es una vista en perspectiva de un dispositivo (50) para cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades. El dispositivo (50) incluye costillas (54) que se extienden desde una periferia del dispositivo (50) hacia un interior del dispositivo para formar aberturas (56) y múltiples superficies bidimensionales (52) para el crecimiento de una sola capa. Como se muestra, las costillas (54) y las superficies (52) son curvas. La forma curvada de las superficies (52) puede aumentar aún más el área superficial de las múltiples superficies bidimensionales (52), en comparación con las superficies planas, de este modo proporcionando un área adicional para la unión celular y el crecimiento de monocapa.
La Fig. 6 es una vista en perspectiva de un dispositivo (60) para el cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades. Como se muestra, el dispositivo (60) incluye costillas (64) que se extienden desde el interior del dispositivo (60) hacia una periferia del dispositivo (60). Las costillas (64), pueden incluir una configuración en espiral que se extiende al menos parcialmente a lo largo de un diámetro del dispositivo (60) para formar al menos dos superficies bidimensionales (62), (62') para el crecimiento bidimensional de las células eucarióticas. Como se muestra, las costillas se extienden desde una porción del núcleo (68) hacia la periferia del dispositivo (60).
En cada una de las modalidades descritas anteriormente, las múltiples superficies bidimensionales se extienden de un núcleo interior. De acuerdo con otras modalidades, sin embargo, las superficies pueden extenderse hacia adentro dentro de ser dirigidas hacia un núcleo central. Por ejemplo, la Fig.7 ilustra otro dispositivo (70), de acuerdo con algunas modalidades. El dispositivo (70) incluye al menos una hoja de material en forma de una pared sustancialmente en forma de espiral (74) con una abertura (76) y que tiene al menos una primera superficie (72) y una segunda superficie (72') configuradas para permitir el crecimiento bidimensional de las células eucarióticas. Será apreciado, sin embargo, que pueden utilizarse otras formas, y el dispositivo (70) no necesita ser un espiral continuo, y puede incluir otras configuraciones.
También se contempla que un dispositivo (90) puede incluir uno o más componentes desmontables, como se muestra en las Figs.8A, 8B. Por ejemplo, el dispositivo (90) puede incluir uno o más discos desmontables (92). Cada disco (92) puede incluir uno o más conectores (94) configurados para acoplarse a otro elemento estructural del dispositivo (90). Como tal, una pluralidad de discos (92) pueden acoplarse juntos para formar un montaje (96). El montaje (96) puede incluir cualquier número de discos (92) o conectores de diferentes formas o tamaños, incluyendo las modalidades mostradas en las Figs.1 -7.
El disco (92) puede tener cualquier forma y puede incluir un acoplador hembra (no mostrado), configurado para acoplarse al conector (94). El acoplamiento entre el disco (92) y el conector (94) puede ser permanente o desmontable. En otras modalidades, una pluralidad de discos (92) pueden acoplarse a un solo conector (94) configurado para recibir la pluralidad de discos (92) y mantener una distancia adecuada entre la pluralidad de discos (92).
Los distintos dispositivos de cultivo celular descritos anteriormente se pueden formar en una variedad de formas. Mientras que muchas modalidades representan los dispositivos como redondos, los dispositivos también pueden ser cúbicos, rectangulares, o una combinación de las formas lineales y arqueadas. Además, puede utilizarse estabilidad adicional, conectividad u otras características estructurales con estos dispositivos. Por ejemplo, un miembro similar roscado puede acoplar múltiples dispositivos juntos, un miembro adhesivo puede acoplar un dispositivo a una pared o un recipiente de incubación, o un miembro de flotación puede permitir que un dispositivo permanezca flotante en un fluido para limitar que las células se pongan en contacto involuntariamente con otras superficies. Dichos miembros pueden mejorar el manejo utilizando téenicas manuales o automatizadas. Por ejemplo, el material magnético puede ser incorporado en los dispositivos para ayudar en la colección y etapas de procesamiento. Los dispositivos también pueden configurarse para la exposición continua a un liquido de incubación o la exposición intermitente al liquido.
Los dispositivos de cultivo celular descritos en el presente documento pueden ser producidos usando una variedad de diferentes materiales adecuados. Generalmente, los dispositivos se pueden producir mediante el uso de materiales que tienen una amplia gama de atributos seleccionados para permitir el cultivo celular para propósitos farmacéuticos. En varias modalidades, los materiales pueden ser USP clase 6 (Convención de Farmacopea de Estados Unidos clase VI) aprobado, puede soportar altas temperaturas y son esterilizables en autoclave, son susceptible al tratamiento corona o plasma para mejorar la unión celular, puede soportar una amplia gama de pHs, no filtra las sustancias nocivas durante el proceso de crecimiento de la célula y/o puede estar expuesto a tensiones enzimáticas y físicas para retirar las células sin ser degradada o dejar residuos no deseados en el producto. Además, el material usado para producir cualquiera de los dispositivos descritos en el presente documento puede ser sólido o tener un hueco o interior poroso. Además, los dispositivos descritos en el presente documento pueden ser producidos de una sola pieza de material, o de dos o más piezas que están unidas una a la otra (por ejemplo, por un enlace químico o físico). El material puede ser rígido o flexible según lo requiera la aplicación.
El material usado para producir cualquiera de los dispositivos del cultivo celular descritos en el presente documento puede incluir metales (por ejemplo titanio), óxidos metálicos (por ejemplo, películas de óxido de titanio), vidrio, borosilicato, fibras de carbono, cerámica, materiales biodegradables (por ejemplo, colágeno, gelatina, PEG, hidrogeles), y/o polímeros. Los polímeros adecuados pueden incluir poliamidas, tales como GRILAMID ® TR 55 (EMS-grivory); policarbonato LEXAN ® (Sabic) y Macrolon® (Bayer); Polisulfonas tales como RADEL® PPSU (Solvay) y UDEL® PSU (Solvay); poliésteres tal como TRITAN® (Polyone) y PBT® HX312C; Poliacetales tales como CELON® (Ticana) y cloruro de polivinilo.
En algunas modalidades, al menos parte de los dispositivos se puede formar usando un polímero poliestireno. El poliestireno puede ser modificado aún más utilizando la descarga de corona, plasma gas (botellas de cultivo rotatorias y tubos de cultivo), u otros procesos similares. Estos procesos pueden generar iones de oxígeno altamente energéticos que se injertan sobre las cadenas de poliestireno superficiales de manera que la superficie se convierte en hidrofílica y cargada negativamente cuando se añade el medio (Hudis, 1974; Amstein y Hartman, 1975; Ramscy et. al., 1984). Además, cualquiera de los dispositivos se puede producir al menos en parte de las combinaciones de los materiales. Los materiales de los dispositivos pueden ser recubiertos o tratados adicionalmente para mantener la unión de la célula. Dicho recubrimiento y/o pretratamiento puede incluir el uso de colágeno I, colágeno IV, gelatina, poli-D-lisina, fibronectina, laminina, amina y carboxilo.
En algunas modalidades, se seleccionan los materiales utilizados para producir los dispositivos para permitir la unión directa de las células eucarióticas. Los dispositivos descritos en el presente documento pueden ser producidos usando una variedad de procesos de producción adecuados. Por ejemplo, en algunas modalidades, los dispositivos pueden ser producidos mediante moldeo por inyección usando, por ejemplo, uno o más materiales poliméricos.
Además, las propiedades de los materiales y la curvatura sobre la mayor parte o toda el área de la superficie de las superficies bidimensionales pueden seleccionarse para controlar ciertas propiedades biológicas. Por ejemplo, el material puede seleccionarse para tener ciertos módulos elásticos y curvatura para producir las propiedades biológicas deseadas. Por ejemplo, un módulo elástico adecuado pueden estar entre 0.1-100 kPa.
En varias modalidades, los dispositivos tienen un tamaño seleccionado para facilitar la colección (por ejemplo, por filtración, sacando con pala, retirando el medio) y minimizar el espacio vacio entre los dispositivos. Por ejemplo, los cuerpos tridimensionales pueden tener una dimensión máxima entre aproximadamente 1 mm y 50 mm, entre 1 mm y 20 mm o entre aproximadamente 2 mm y 10 mm. En ciertas modalidades, los dispositivos son esféricos y tienen un diámetro máximo que está entre aproximadamente 1 mm y 50 mm, entre aproximadamente 1 mm y 20 mm, o entre aproximadamente 2 mm y 10 mm.
En ciertas modalidades, los dispositivos están configurados para prevenir el daño a o la extracción de las células de las superficies bidimensionales durante el cultivo. Por ejemplo, como se muestra en las Figs.1A-8B, los dispositivos pueden incluir aberturas (16), (26), (16') (26') y (76) y las superficies bidimensionales se encuentran dentro de las aberturas. En varias modalidades, las múltiples superficies bidimensionales están espaciadas una de la otra en una distancia seleccionada para prevenir el contacto de objetos adyacentes al cuerpo tridimensional con las células que crecen en las múltiples superficies bidimensionales. Específicamente, las aberturas (16), (26), (16'), (26') ó (76) pueden ser del tamaño de manera que las superficies bidimensionales no serán contactadas por dispositivos adyacentes dentro de un sistema de cultivo y/o no serán contactadas por la pared de un contenedor o recipiente de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento en monocapa de las células a lo largo de las superficies bidimensionales no será perturbado por contacto mecánico. Además, las superficies bidimensionales pueden estar espaciadas lo suficientemente lejos una de la otra para prevenir el contacto entre las células en las superficies adyacentes.
En varias modalidades, los dispositivos de cultivo celular de la presente divulgación pueden configurarse para proporcionar una relación área superficial deseada a volumen. Por ejemplo, la relación área superficial a volumen de cualquiera de los dispositivos de cultivo celular descritos en el presente documento puede estar entre aproximadamente 3 cm2/cm3 y 30 cm2/cm3, entre aproximadamente 5 cm2/cm3 y 20 cm2/cm3, o entre aproximadamente 10 cm2/c 3 y 15 cm2/c 3. En otras modalidades, la relación área superficial a volumen puede variar hasta aproximadamente 50, 100, 200, 500 o 1,000 cm2/cm3.
En varias modalidades, los dispositivos divulgados en el presente documento pueden estar recubiertos con uno o más recubrimientos. Los recubrimientos adecuados pueden seleccionarse para controlar la unión celular o los cambios a la biología celular. Los recubrimientos adecuados pueden incluir, por ejemplo, péptidos, proteínas, carbohidratos, ácido nucleico, lípidos, polisacáridos, glicosaminoglicanos, proteoglicanos, hormonas, moléculas de matriz extracelular, moléculas de adhesión de la célula, polímeros naturales, enzimas, anticuerpos, antígenos, polinucleótidos, factores de crecimiento, polímeros sintéticos, polilisina, fármacos y/u otras moléculas o combinaciones o fragmentos de éstos.
Además, en varias modalidades, las superficies de los dispositivos descritos en el presente documento pueden ser tratadas o de lo contrario alteradas. Para controlar la unión celular y otras propiedades biológicas. Opciones para el tratamiento de las superficies incluyen tratamiento químico, tratamiento de plasma y/o tratamiento corona.
Además, en varias modalidades, los materiales pueden ser tratados para introducir grupos funcionales en o sobre el material, incluyendo grupos que contienen hidrocarburos, oxigeno, nitrógeno. Además, en varias modalidades, el material puede ser producido o alterado para tener una textura para facilitar la unión celular o controlar otras propiedades celulares. Por ejemplo, en algunas modalidades, los materiales utilizados para producir los dispositivos de cultivo celular tienen una rugosidad a escala nanométrica o micrométrica que facilita la unión celular y/o controla otras propiedades celulares.
De acuerdo con diversas modalidades, se proporciona un sistema de cultivo celular. El sistema puede comprender un contenedor y un grupo de cuerpos tridimensionales. Los cuerpos tridimensionales pueden comprender múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia de cada cuerpo tridimensional hacia un interior del cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área superficial de las múltiples superficies bidimensionales.
La Fig. 9 es una vista en perspectiva de un sistema (100) para el cultivo celular bidimensional, de acuerdo con ciertas modalidades. Como se muestra, el sistema (100) incluye un contenedor (110) y uno o más dispositivos para cultivo celular (110) que pueden ser colocados dentro del contenedor (100) junto con medios (120) y/u otros materiales para permitir el crecimiento bidimensional de las células en la superficie del contenedor (110).
Como se muestra, el contenedor (100) incluye un matraz de cultivo celular común que tiene una abertura (130) para la introducción de células, dispositivos de cultivo celular (110), medios, y/u otros materiales. Será apreciado, sin embargo, que pueden seleccionarse otros contenedores. Por ejemplo, el contenedor puede ser mucho más grande, por ejemplo, seleccionado para sostener decenas, cientos, miles, cientos de miles o millones de dispositivos de cultivo celular. El tamaño especifico y la configuración pueden seleccionarse basado en la cantidad de células que se van a cultivar y/u otros criterios, tales como la necesidad de sistemas integrados para controlar las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH, los niveles de gas circundante, etc.
En varias modalidades, el sistema puede incluir un contenedor biorreactor tal como un reactor de lecho compacto, reactor fluidizado o reactor de suspensión. Por ejemplo, el sistema puede incluir uno o más de los dispositivos para permitir el crecimiento bidimensional, que luego se puede colocar en el contenedor de un biorreactor. Ejemplos de tales biorreactores incluyen, pero no se limitan a, un biorreactor de flujo de pistón, un biorreactor de tanque agitado continuo, un biorreactor de lecho estacionario (biorreactor de lecho compacto) y un biorreactor de lecho fluidizado.
Un ejemplo de un biorreactor adecuado es el biorreactor Celligen (Nuevo Brunswick Scientific), que es capaz de una expansión de las células adherentes bajo condiciones controladas (por ejemplo, los niveles de pH, temperatura y oxigeno) y con una perfusión constante del medio de crecimiento celular.
Además, los cultivos celulares pueden ser monitoreados por los niveles de concentración de glucosa, lactato, glutamina, glutamato y amonio. La tasa de consumo de glucosa y la tasa de formación de lactato de las células adherentes permiten medir la tasa de crecimiento celular y determinar el tiempo de cosecha.
Otros biorreactores tridimensionales que pueden ser utilizados incluyen, pero no se limitan a, un biorreactor de tanque agitado continuo, donde un medio de cultivo se alimenta continuamente en el biorreactor y el medio utilizado es continuamente sacado, para mantener un estado estable de tiempo constante dentro del biorreactor. El biorreactor de tanque agitado puede utilizarse con lecho fluidizado (portadores suspendidos) o una cesta de lecho fibrosa (que está disponible por ejemplo en New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ), un biorreactor de lecho estacionario, un biorreactor de levantamiento por aire, donde el aire es alimentado normalmente en la parte inferior de un tubo de tiro central fluyendo arriba mientras que forma burbujas y desengrana gas de escape en la parte superior de la columna, un biorreactor con espumas poliactivas [como se describe en Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84 : 205-214, (2003)], una estructura porosa en un biorreactor de perfusión de flujo Radial [como se describe en Itagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93 (5) : 947-954 (2006)], un biorreactor de flujo radial con estructura o portadores, un biorreactor de fibra hueco y microportadores. Otros biorreactores, que pueden utilizarse con los dispositivos y sistemas descritos actualmente, se describen en las Patentes de los Estados Unidos Números 6,277,151; 6,197,575; 6,139,578; 6,132,463; 5,902,741; y 5,629,186.
La presente divulgación también proporciona métodos de cultivo celular usando cualquiera de los dispositivos o sistemas presentados en el presente documento. De acuerdo con diversas modalidades, el método puede comprender el seleccionar un grupo de células eucarióticas y contactar las células eucarióticas con al menos un cuerpo tridimensional, el al menos un cuerpo tridimensional que tiene múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia del cuerpo tridimensional hacia un interior de cada cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o toda el área de la superficie de las múltiples superficies bidimensionales. En varias modalidades, los dispositivos tienen una dimensión máxima de menos de aproximadamente 50 mm y/o un área de superficie a la relación del volumen entre aproximadamente 3 cm2/cm3 y aproximadamente 1,000 cm2/cm3.
Además, será apreciado que varias etapas de procesamiento pueden ser realizadas para controlar o mejorar la unión y el crecimiento de las células. Por ejemplo, las células pueden ponerse en contacto con los cuerpos tridimensionales mediante la colocación de las células y los cuerpos dentro de un contenedor o recipiente de cultivo junto con medios de cultivo. Además, las células y/o los medios pueden ser mezclados o de otra manera hechos para moverse mediante, por ejemplo, girar el contenedor, agitar los medios de cultivo (por ejemplo, mediante agitación) y el suministro de fluido que fluye dentro y fuera del contenedor.
Los ejemplos no limitantes de los medios base útiles en el cultivo utilizando los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento incluyen Medio Mínimo Esencial Eagle, ADC-1, LPM (libre de Albúmina de Suero Bovino) , FIO (HAM) , F12 (HAM) , DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, Medio BGJ (con y sin Modificación Fitton-Jackson), Medio Basal de Eagle (BME-con la adición de base de sal de Earle), Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM-sin suero) , Yamane, IMEM-20, Medio de Eagle de Modificación Glasgow (GMEM), Medio Leibovitz L-15, Medio 5A McCoy, Medio MI 99 (M199E-con base de sal de Earle), Medio MI 99 (M199H-con base de sal de Hank), Medio Mínimo Esencial Eagle (MEM-E-con base de sal de Earle), Medio Mínimo Esencial Eagle (MEM-NAA con aminoácidos no esenciales), entre otros numerosos, que incluyen el medio 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB75261, MAB 8713, DM 145, de Williams G., Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153. Un medio preferido para usarse en la invención es DMEM. Estos y otros medios útiles están disponibles de GIBCO, Grand Island, N.Y., Estados Unidos y Biological Industries, Bet HaEmek, Israel, entre otros. Un número de estos medios se resume en métodos en Methods in Enzymology , Volume LVIII, "Cell Culture" , pp. 62 12, editado por William B. Jakoby e Ira H. Pastan, publicado por Academic Press, Inc.
El medio podrá completarse con suero tal como suero fetal de bovino o humano o de otras especies, y opcional o alternativamente, factores de crecimiento, vitaminas (por ejemplo ácido ascórbico), citocinas, sales (por ejemplo B-glicerofosfato), esteroides (por ejemplo, dexametasona) y hormonas por ejemplo, la hormona del crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, Interleucina 3, interleucina 6, Interleucina 7, factor estimulante de colonias de macrófagos, ligando c-kit/factor de célula madre, ligando de la osteoprotegerina, insulina, factores de crecimiento similares a la insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento derivado de plaquetas y la proteína morfogenética ósea en concentraciones de entre picogramo/mL a los niveles de miligramo/mL.
Después del crecimiento de las células utilizando los dispositivos y sistemas descritos en el presente documento, las células pueden ser cosechadas en una variedad de diferentes maneras. Por ejemplo, las células pueden ser cosechadas por lavado con medios adecuados y/o por cosecha basada en vibraciones , como se describe a continuación.
Además se reconoce que se pueden agregar componentes adicionales al medio de cultivo. Dichos componentes pueden ser antibióticos, antimicóticos, albúmina, aminoácidos y otros componentes conocidos en la téenica para el cultivo celular.
EJEMPLO 1: Se evaluó la idoneidad del cultivo celular utilizando diversos portadores, como se describe en el presente documento. Las células PD051010 p.3/2 frescas o congeladas fueron cultivadas con DMEM completo en una incubadora humidificada. Se cultivaron las células con portadores moldeados por inyección producidos de diversos materiales poliméricos o matraces, como se identifica más adelante. El material, forma y configuración, tratamientos de superficie y textura de la superficie fueron variadas, como se describe en detalle más adelante y/o indicados en las figuras. Se midió la tasa de crecimiento y la eficiencia de unión de las células utilizando diferentes portadores, y los resultados se sintetizan más adelante.
La Fig. 10 es una gráfica de barras que muestra los resultados del cultivo celular en matraces de 175 cm o utilizando los dispositivos de cultivo bidimensional de la presente divulgación. La Fig.11 es una gráfica de barras que muestra el número de duplicación de la población de las células cultivadas en los matraces de 175 cm o utilizando los dispositivos de cultivo bidimensional de la presente divulgación. Los resultados mostrados en las Figs.10-11 se basan en el cultivo de células PD051010 p.3/2 frescas utilizando dispositivos de cultivo celular formados de LEXAN© moldeado por inyección con una textura de superficie lisa y que tiene una configuración como se muestra en las Figs. 1A-1B. Como se muestra en las figuras, la cantidad de células obtenidas y el número de duplicación celular fueron similares utilizando los dispositivos de cultivo celular en lugar de matraces.
La Fig. 12 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para las células cultivadas utilizando los dispositivos de cultivo bidimensional. Los resultados mostrados en la Fig.12 se basan en el cultivo de células PD051010 p.3/2 congeladas utilizando dispositivos de cultivo celular formados de LEXAN® moldeado por inyección con una textura de superficie rugosa y que tiene una configuración como se muestra en las Figs.1A-1B. La Fig. 13 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para las células cultivadas utilizando los dispositivos de cultivo bidimensional. Los resultados mostrados en la Fig.13 se basan en el cultivo de células PD051010 p.3/2 congeladas utilizando dispositivos de cultivo celular formados de GRILAMID® moldeado por inyección con una textura de superficie rugosa y que tiene una configuración como se muestra en las Figs. 1A-1B.
La Fig. 14 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para las células cultivadas utilizando diferentes dispositivos de cultivo bidimensional recubiertos. Los resultados mostrados en la Fig. 14 se basan en el cultivo de células PD051010 p.3/2 congeladas utilizando dispositivos de cultivo celular formados de LEXAN® o GRILAMID® moldeado por inyección (como se indica en la figura) con una textura de superficie lisa y que tiene una configuración como se muestra en las Figs.2A-2D. Además, como se muestra, la Fig.14 demuestra el efecto del tratamiento de la superficie utilizando proteínas de medio de crecimiento y/o polilisina en los portadores de LEXAN® o GRILAMID®. Como se muestra, el tratamiento de polilisina y el tratamiento de la proteína de medio de crecimiento generalmente incrementan la eficiencia de la unión celular.
La Fig. 15 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para las células cultivadas utilizando dispositivos de cultivo bidimensional recubiertos. Los resultados mostrados en la Fig. 15 se basan en el cultivo de células PD051010 p.3/2 congeladas utilizando dispositivos de cultivo celular formados de GRILAMID® moldeado por inyección con una superficie rugosa que fue preincubada con proteínas de medio de crecimiento y que tiene una configuración como se muestra en las Figs. 1A-1B.
La Fig. 16 es una gráfica de barras que ilustra la eficiencia de unión celular para las células cultivadas utilizando diversos dispositivos de cultivo bidimensional recubiertos con o sin tratamiento de superficie por plasma de los dispositivos. Los resultados mostrados en la Fig.16 se basan en el cultivo de células PD051010 p.3/2 congeladas utilizando dispositivos de cultivo celular formados de LEXAN® o GRILAMID® moldeado por inyección (como se indica en la figura) con una textura de superficie lisa y que tiene una configuración como se muestra en las Figs.2A-2D. Además, como se muestra, la Fig.16 demuestra el efecto del tratamiento de la superficie utilizando proteínas de medio de crecimiento y/o tratamiento por plasma en los portadores de LEXAN® o GRILAMID®. Como se muestra, el tratamiento por plasma y el tratamiento de la proteína de medio de crecimiento generalmente incrementan la eficiencia de la unión celular.
EJEMPLO 2: En este experimento, las células cultivadas en los dispositivos de cultivo bidimensionales fueron cosechadas utilizando un método de cosecha basado en vibración como se describe en el documento PCT/IB2012/000933, presentado el 15 de abril del 2012. Los dispositivos de cultivo bidimensionales fueron preparados suspendiendo 220 de los dispositivos en el medio mínimo esencial de Dulbeco ("DMEM") y sembrándolos con células estro ales adherentes derivadas de la placenta humana en una concentración de 3,000 células por cm. Los dispositivos fueron incubados durante la noche con una mezcla suave para permitir que las células se unieran a los dispositivos. Después de la incubación durante la noche 90-100 de los dispositivos sembrados se transfirieron a un matraz giratorio de 250 mL que contiene 150 mL de DMEM completo e incubado en tres días a 37°C y CO2 al 5%.
Después del crecimiento de tres días, las células fueron cosechadas de los dispositivos mediante vibración de la siguiente manera. Los matraces giratorios y tubos se retiraron de la incubadora y diez de los dispositivos de cultivo fueron retirados para una tinción celular. La eficiencia de cosecha se determinó mediante la tinción celular y conteo celular. El medio de cultivo fue desechado y los dispositivos restantes se lavaron dos veces con PBS y colocados en un contenedor lleno con 800 mL de solución TrypLE precalentada. Los dispositivos fueron después sometidos a vibración durante 5 segundos a 5 Hz, 5 minutos a 1 Hz, y 30 segundos a 5 Hz (todo en una amplitud de 25 mm). Después de la vibración, un adicional de diez dispositivos fueron retirados de la tinción celular. A los dispositivos restantes se les agregó 200 mL de FBS y el medio fue trasladado a botellas de centrifuga de 2,500 mL. Las células fueron centrifugadas a 1,200 RPM durante 10 minutos a 4°C, el sedimento celular fue suspendido nuevamente, y los conteos celulares fueron realizados.
La cosecha por vibración mostró ser un medio efectivo de recuperación de células de estos dispositivos, con 7.8 x 106 células que fueron recuperadas. Se demostró que las células tienen 95% de viabilidad por la exclusión de colorante azul de tripano.
EJEMPLO 3: En otro experimento, Placenta (PD020112), Adiposa (PLA25) y Médula ósea (BM122) MSC fueron sembrados en matraces de 175 cm2, 0.5xl06 células/matraz, en un medio de crecimiento DMEM completo (DMEM As22320 Cat. No.041-96417A GIBCO, 10% FBS cat. No. S0115 BIOCHROM, 1% L-glutamina Cat. no. G7513 SIGMA). Las células se incubaron en incubadora humidificada de 37 °C durante 4 dias. Cada tipo de célula fue cosechada usando TrypLE (GIBCO Cat no.12563-029). Cada tipo de célula después fue sembrada en ambos matraces 175 cm2 y en portadores 2D, en DMEM completo, por duplicado. Después, las células 0.5xl06 fueron sembradas en matraces y las células lxlO6 fueron sembradas en 90 portadores 2D, en viales de 20 mL. Los matraces fueron incubados en incubadora a 37°C. Los viales portadores 2D fueron rodados durante 24 horas para la unión y después transferidos a matraces giratorios de 250 mL con cesta. Los giradores se colocaron en el agitador con incubadora de 37° C durante otros 3 días, en velocidad de agitación de 40 RPM. Después de la duración total de crecimiento de 4 días las células fueron cosechadas de los matraces y de los portadores 2D por TrypLE y contados por contador celular Casy.
La Fig. 17 muestra una gráfica de barras de la comparación de PDD (duplicación de la población por día) entre matraces de 175 cm2 y portadores 2D. Los PDD calculados muestras tasas de crecimiento comparable de la Placenta, médula ósea y las células adiposas entre portadores 2D y matraces.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo de cultivo celular, que comprende: un cuerpo tridimensional que comprende múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia del cuerpo tridimensional hacia un interior del cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o todas las áreas superficiales de las múltiples superficies bidimensionales, y en donde el cuerpo tridimensional tiene: (a) una dimensión máxima que oscila de aproximadamente 1 m a aproximadamente 50 mm; o (b) una relación de área superficial a volumen entre aproximadamente 3 cm2/cm3 y aproximadamente 1,000 cm2/cm3.
2. Un sistema de cultivo celular, que comprende: un contenedor; y un grupo de cuerpos tridimensionales, cada cuerpo tridimensional comprende: múltiples superficies bidimensionales que se extienden hacia adentro de una periferia del cuerpo tridimensional hacia un interior de cada cuerpo tridimensional, en donde las múltiples superficies bidimensionales están configuradas para mantener un crecimiento en una sola capa de células eucarióticas sobre al menos una mayoría de o todas las áreas superficiales de las múltiples superficies bidimensionales, y en donde cada cuerpo tridimensional tiene: (a) una dimensión máxima que oscila de aproximadamente 1 rom a aproximadamente 50 mm; o (b) una relación de área superficial a volumen entre aproximadamente 3 cm2/cm3 y aproximadamente 1,000 cm2/cm3.
3. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1 o el sistema de conformidad con la reivindicación 2, en donde las múltiples superficies bidimensionales: (a) comprenden una pluralidad de costillas que se extiende desde el interior del cuerpo tridimensional hacia la periferia del cuerpo tridimensional; (b) comprenden una pluralidad de costillas que se extienden sustancialmente paralelas entre sí de un interior del cuerpo tridimensional hacia la periferia del cuerpo tridimensional; (c) (i) tienen una forma curva y/o comprenden al menos una costilla de forma espiral que se extiende desde el interior del cuerpo tridimensional hacia la periferia del cuerpo tridimensional; o (ii) son substancialmente planas sobre al menos una porción de su área superficial; y/o (d) comprenden una pluralidad de costillas que se extienden desde un núcleo central hacia una periferia del cuerpo tridimensional.
4. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 o el sistema de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 3, en donde el cuerpo tridimensional comprende al menos una de una forma sustancialmente esférica, una forma sustancialmente elipsoidal y una forma poliédrica irregular.
5. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, ó 3-4 o el sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el material que forma las múltiples superficies bidimensionales comprende un material seleccionado de por lo menos uno de metales, vidrio, borosilicato, fibras de carbono, cerámica, colágeno, gelatina, hidrogeles y polímeros.
6. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, ó 3-5 o el sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde el material que forma las múltiples superficies bidimensionales comprende al menos un polímero, opcionalmente en donde el polímero es: (a) seleccionado de una poliamida, un policarbonato, una polisulfona, un poliéster, un poliacetal y cloruro de polivinilo; (b) una poliamida, o (c) un policarbonato.
7. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, ó 3-6 o el sistema de conformidad con las reivindicaciones 2-6, en donde las múltiples superficies bidimensionales comprenden además al menos un recubrimiento seleccionado para facilitar la unión y el crecimiento de las células eucarióticas, opcionalmente en donde al menos un recubrimiento es seleccionado de una proteina y polilisina.
8. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-7 o el sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en donde las múltiples superficies bidimensionales han sido sujetas a un tratamiento de superficie por plasma.
9. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-8 o el sistema de conformidad con las reivindicaciones 2-8, en donde las múltiples superficies bidimensionales comprenden un módulo y curvatura seleccionados para facilitar el crecimiento de las células eucarióticas.
10. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-9 o el sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en donde las células eucarióticas comprenden al menos una de células madre, células dependientes de anclaje, células mesenquimales, y células estromales.
11. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3-10 o el sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en donde la relación del área superficial de las múltiples superficies bidimensionales al volumen del cuerpo tridimensional está entre aproximadamente 3 cm2/cm3 y aproximadamente 1,000 cm2/cm3, opcionalmente en donde la relación del área superficial de las múltiples superficies bidimensionales al volumen del cuerpo tridimensional está entre aproximadamente 10 cm2/cm3y aproximadamente 15 cm2/cm3.
12. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en donde el cuerpo tridimensional tiene una dimensión máxima entre 1 mm y 20 mm.
13. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, ó 3-11 o el sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en donde el cuerpo tridimensional tiene una dimensión máxima entre aproximadamente 2 mm y 10 mm, opcionalmente en donde el dispositivo es substancialmente esférico, y la dimensión máxima es un diámetro.
14. Un método de cultivo celular, que comprende: seleccionar un grupo de células eucarióticas; y poner en contacto las células eucarióticas con al menos un cuerpo tridimensional como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-11 y 13.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde poner en contacto las células eucarióticas con al menos un cuerpo tridimensional comprende: (a) colocar las células y al menos un cuerpo tridimensional en un contenedor; (b) que comprende además suministrar medios de cultivos a las células; y/o (c) que comprenden además provocar un movimiento de al menos un cuerpo tridimensional, opcionalmente en donde provocar un movimiento comprende: (i) girar o sacudir un contenedor en el cual está contenido al menos un cuerpo tridimensional; o (ii) proporcionar un flujo de medios en un contenedor en el cual está contenido un cuerpo tridimensional.
16. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde dicho al menos un cuerpo tridimensional es inmerso dentro del medio de cultivo dentro de un contenedor adecuado que está configurado para resistir la adhesión celular.
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