JP2006136212A

JP2006136212A - 細胞培養用担体

Info

Publication number: JP2006136212A
Application number: JP2004326414A
Authority: JP
Inventors: Katsuya Sadamori; 克也貞森; Yoshiaki Shiba; 良昭芝
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-11-10
Filing date: 2004-11-10
Publication date: 2006-06-01

Abstract

【課題】細胞の付着性を向上し、通常の播種方法を用いても、全てのマイクロキャリアに、必要細胞数の細胞をほぼ均一に付着させる。
【解決手段】表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養用担体１であって、生体適合性材料からなる略球体状の基材２の表面に複数の窪み３を形成してなる細胞培養用担体１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞培養用担体に関するものである。

従来、動物細胞を大量に培養する方法として、マイクロキャリアを用いる培養法が知られている（非特許文献１，２参照。）。
マイクロキャリアとは、付着性動物細胞を付着・増殖させるための微小粒子をいい、通常、直径約１００〜３００μｍ、表面積約３０００〜６０００ｃｍ^２／ｇの球状粒子であり、デキストラン、ゼラチンあるいはポリスチレン等の素材により構成されている。マイクロキャリアの表面には細胞が付着しやすいように、コラーゲン、ゼラチンまたはジメチルアミノエチル等の荷電基が付与されている。マイクロキャリアの比重は１．０３〜１．０５であり、水より僅かに重いだけなので、自然浮遊性を備えている。したがって、少し攪拌しただけで浮遊状態になる。
エイ．エル．ヴァンウェゼル（A.L.van Wezel）著, 「ネイチャー（Nature）」，第２１６巻, （英国），１９６７年，ｐ６４〜６５大石、「動物細胞培養技術と物質生産」、株式会社シーエムシー出版、１９８６年、ｐ．１８７−１９０

マイクロキャリアを用いる培養法では、培養開始時にマイクロキャリアに細胞を付着させる操作が極めて重要である。付着依存性細胞の最大増殖量は、細胞が付着し得る面積、つまり、マイクロキャリアの総表面積で規制される。このため、細胞が十分に付着したマイクロキャリアと、細胞が全く付着していないか、付着していても増殖に必要な数の細胞が付着していないマイクロキャリアとが混在している状態で培養が行われると、期待される細胞量が得られないという不都合がある。したがって、全てのマイクロキャリアに必要細胞数の細胞をほぼ均一に付着させることが必要である。

しかしながら、マイクロキャリアは球状粒子であるため、通常の播種方法、例えば、静置状態でディッシュ内に単層になる量のマイクロキャリアと細胞とを混合する播種方法や、低速回転での連続攪拌による播種方法では、付着率を向上することができないという問題点がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞の付着性を向上し、通常の播種方法を用いても、全てのマイクロキャリアに、必要細胞数の細胞をほぼ均一に付着させることができる細胞培養用担体を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養用担体であって、生体適合性材料からなる略球体状の基材の表面に複数の窪みを形成してなる細胞培養用担体を提供する。
本発明によれば、基材の表面に形成された窪みに細胞が捕集され、付着性細胞の付着率が向上する。したがって、静置状態でディッシュ内に単層になる量のマイクロキャリアと細胞とを混合する播種方法や、低速回転での連続攪拌による通常の播種方法によっても、十分な細胞数の細胞を各マイクロキャリアに付着させることができる。

また、基材の表面に窪みを設けることにより、基材の表面積が増大するので、最大増殖量を増加させることができる。さらに、細胞を付着させた細胞培養用担体は、培養時に培地内において浮遊させられるが、その際に他の細胞培養用担体と接触あるいは衝突しても、窪みに捕集されている細胞に対してはその衝撃が緩和される。したがって、細胞の健全性を損なうことなく、効率的に細胞を培養することができる。

上記発明においては、前記基材が、ポリスチレン、ポリプロピレンまたはポリウレタンのような合成高分子化合物、ガラス、または、ハイドロキシアパタイトまたはリン酸カルシウム等のセラミックスからなることが好ましい。
また、前記基材の粒径が、１００〜１００００μｍであることが好ましく、前記窪みの深さが基材の粒径の１０分の１程度であることが好ましい。

このようにすることで、細胞の高い付着性を確保して、効率的に細胞を培養することが可能となる。また、窪みの深さを制限することで、表面に近い位置に細胞を配置して、細胞に対する酸素や栄養分の供給を十分に行うことができ、細胞を十分に増殖させることができる。

さらに、基材の表面にコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ゼラチン、ＥＨＳ(Engelbreth-Holm-Swarm) ゲル、プロテオグリカンまたはＲＧＤペプチド(Arg-Gly-Asp)からなるコーティングが施されていることが好ましい。
また、基材の表面に、正または負の電荷が付与されていることが好ましく、その場合には、基材の表面にジメチルアミノプロピル基、ジエチルアミノエチル基またはトリメチルー２−ヒドロキシアミノプロピル基が付着されていることが好ましい。
このようにすることで、細胞の付着性をさらに向上することができるという利点がある。

本発明によれば、細胞の付着性を向上して、通常の播種方法を用いても、全てのマイクロキャリアに、必要細胞数の細胞をほぼ均一に付着させることができ、細胞を効率的に培養することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る細胞培養用担体１について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞培養用担体１は、マイクロキャリアであって、図１に示されるように、合成高分子、例えば、ポリスチレンからなる略球形の基材２の表面に複数の凹部（窪み）３を備えている。凹部３は、基材２の表面の全面にわたって、ほぼ均一に形成されている。凹部３の形状は、特に制限されるものではなく、定型または不定形の形状でよい。基材２の直径は、約１００μｍ〜１００００μｍであり、表面の凹部３の深さは基材２の直径の約１０分の１に設定されている。

本実施形態に係る細胞培養用担体１は、粒径が大きい場合には、例えば、公知の方法により球状粒子状に形成されたマイクロキャリアの基材２の表面に、切削加工を施すことにより形成する。なお、製造方法は特に制限されるものではなく、凹部３の形成される箇所に繊維状または半球状の樹脂を埋め込んで整形した基材２を加熱して樹脂を溶解・除去することにより、基材２の表面に凹部３を形成してもよい。また、他の任意の物理的あるいは化学的処理により凹部３を形成することにしてもよい。

このように構成された本実施形態に係る細胞培養用担体１の作用および効果について以下に説明する。
本実施形態に係る細胞培養用担体１を用いて細胞を培養するには、まず、通常の播種方法を用いて細胞を細胞培養用担体１に付着させる。通常の播種方法は、例えば、静置状態でディッシュ内に単層になる量の細胞培養用担体１と細胞とを混合する播種方法や、低速回転での連続攪拌による播種方法でよい。

細胞培養用担体１が単なる球状粒子である場合、細胞はその表面に付着し難く、全ての細胞培養用担体１に均一に細胞を付着させることができないが、本実施形態に係る細胞培養用担体１によれば、表面に設けた凹部３に細胞が捕集される。したがって、全ての細胞培養用担体１にほぼ均一に細胞を付着させることができる。

また、本実施形態に係る細胞培養用担体１は、球状粒子からなる基材２の表面に複数の凹部３を設けることにより、その表面積が、単なる球状粒子の場合よりも増大している。したがって、付着可能な細胞数も増加しており、さらに多くの細胞を培養することが可能となる。

次いで、本実施形態に係る細胞培養用担体１を任意の培養容器内に貯留した培地内に複数投入し、所定の培養条件下に配することにより培養する。所定の培地は、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）、抗生剤を８４：１５：１の配合比率で混合したものである。なお、この配合比率は任意であり、また、ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。また、ＦＢＳがなくてもよい。さらに、所定の培養条件は、例えば、温度３７℃±０．５℃、湿度１００％、ＣＯ_２濃度５％である。

細胞培養用担体１は、１．０３〜１．０５の比重を有しており、水より僅かに重いだけなので、自然浮遊性を備え、僅かに攪拌しただけで浮遊状態になる。したがって、細胞が十分に付着した細胞培養用担体１が培地内を浮遊する間に細胞が増殖し、十分な細胞数まで成長することになる。

この場合において、本実施形態に係る細胞培養用担体１によれば、培地内を浮遊する間に、他の細胞培養用担体１と接触あるいは衝突することがあるが、細胞は基材２の表面に設けられた凹部３に捕集されているため、その凹部３内に配されている細胞については、衝突による衝撃が軽減される。したがって、培養中においても細胞が健全な状態に維持されることになる。

さらに、本実施形態に係る細胞培養用担体１によれば、基材２の表面の比較的浅い凹部３に細胞が捕集されるので、細胞は十分に外側に露出しており、培地からの栄養分や酸素の供給を十分に行うことができる。また、細胞からの老廃物も円滑に培地内に放出して、新鮮な培地を細胞に接触させておくことができる。したがって、細胞の効率的な成長を促進することができる。

なお、本実施形態においては、細胞培養用担体１の基材２をポリスチレンにより構成したが、これに代えて、ポリプロピレンまたはポリウレタンのような合成高分子化合物、ガラス、または、ハイドロキシアパタイトまたはリン酸カルシウム等のセラミックスを採用してもよい。これらの材質により構成しても、上記実施形態と同様の作用効果を奏する。
また、凹部３の形状も特に限定されるものではなく、例えば、図３に示されるように、連続的な溝３′により構成した細胞培養用単体１′を採用してもよい。

さらに、凹部３または溝３′を有する基材２の表面に、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ゼラチン、ＥＨＳ(Engelbreth-Holm-Swarm) ゲル、プロテオグリカンまたはＲＧＤペプチド(Arg-Gly-Asp)からなるコーティングを施してもよい。これにより、細胞の付着性をさらに向上することができる。
また、基材２の表面を正電荷または負電荷に帯電させることにしてもよい。この場合には、基材２の表面にジメチルアミノプロピル基、ジエチルアミノエチル基またはトリメチルー２−ヒドロキシアミノプロピル基等の荷電基を付与することにすればよい。

本発明の一実施形態に係る細胞培養用担体を示す正面図である。図１の細胞培養用担体を示す縦断面図である。図１の細胞培養用担体の変形例を示す正面図である。

符号の説明

１，１′ 細胞培養用担体
２基材
３凹部（窪み）
３′ 溝（窪み）

Claims

表面に細胞を付着させ、該細胞を増殖させる細胞培養用担体であって、
生体適合性材料からなる略球体状の基材の表面に複数の窪みを形成してなる細胞培養用担体。
前記基材が、ポリスチレン、ポリプロピレンまたはポリウレタンのような合成高分子化合物、ガラス、または、ハイドロキシアパタイトまたはリン酸カルシウム等のセラミックスからなる請求項１に記載の細胞培養用担体。
前記基材の粒径が、１００〜１００００μｍである請求項１または請求項２に記載の細胞培養用担体。
前記窪みの深さが、基材の粒径の１０分の１程度である請求項３に記載の細胞培養用担体。
基材の表面にコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリジン、ゼラチン、ＥＨＳ(Engelbreth-Holm-Swarm) ゲル、プロテオグリカンまたはＲＧＤペプチド(Arg-Gly-Asp)からなるコーティングが施されている請求項１から請求項４のいずれかに記載の細胞培養用担体。
基材の表面に、正または負の電荷が付与されている請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞培養用担体。
基材の表面にジメチルアミノプロピル基、ジエチルアミノエチル基またはトリメチルー２−ヒドロキシアミノプロピル基が付着されている請求項６に記載の細胞培養用担体。